Dankie dat u Nature besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte ondersteuning vir CSS. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n nuwer weergawe van die blaaier gebruik (of die versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer afskakel). Terselfdertyd, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons webwerwe sonder style en JavaScript vertoon.
Genoomvolgordebepaling het die veld van aansteeklike siektenavorsing herleef, wat siekte-epidemiologie, patogenese, gasheer-patogeen-interaksies en die evolusionêre proses wat op patogene afgedwing word, aan die lig gebring het. Die Mycobacterium tuberculosis-kompleks (MTBC) beskou Mycobacterium bovis as een van sy dierlike aanpasbare lede wat tuberkulose (TB) in landdiere veroorsaak, en is 'n tipiese model van bakteriële evolusie. Soos ander MTBC-lede, word Mycobacterium bovis aanvaar as 'n streng gekloonde, stadig ontwikkelende patogeen, en daar is duidelik geen teken van rekombinasie of horisontale geenoordrag nie. In hierdie werk pas ons vergelykende genomika toe op 'n volledige genoomvolgorde (WGS) datastel wat bestaan uit 70 beeste M. van verskillende stambome (Europa en Afrika) om insig te verkry in die genetiese diversiteit van beeste M. Evolusionêre krag. Drie verskillende metodes word gebruik om die tekens van reorganisasie te skat. Wêreldwyd is 'n klein aantal rekombinasiegebeurtenisse geïdentifiseer en bevestig deur twee onafhanklike metodes met soliede ondersteuning. Nietemin, in vergelyking met mutasies, het rekombinasie 'n swakker effek op die diversiteit van M. bovis (algehele r/m = 0.037). Die verskil r/m gemiddelde wat verkry is in die klonale kompleks van Mycobacterium bovis in ons datastel, stem ooreen met die algemene konsep dat die graad van rekombinasie baie kan verskil tussen die afstammelinge wat aan dieselfde taksonomiese spesie toegeken word. Gebaseer op hierdie werk kan rekombinasie in Mycobacterium bovis nie uitgesluit word nie, dus behoort dit die onderwerp van verdere pogings in toekomstige vergelykende genomika-navorsing te wees, waarin WGS van groot datastelle van verskillende epidemiologiese scenario's regoor die wêreld van kritieke belang is. 'n Bykomende analise is toe uitgevoer op die kleiner Mycobacterium bovis datastel (n = 42) van die multi-gasheer TB-prevalensie, en meer as 1 800 loci is geïdentifiseer, waarvan ten minste een stam 'n enkelnukleotiedpolimorfisme (SNP) getoon het. Die meeste (87,1%) is in die koderingsgebied geleë, en die globale verhouding van nie-sinonieme veranderinge (dN/dS) van sinonieme veranderinge oorskry 1,5, wat aandui dat positiewe seleksie 'n belangrike evolusionêre krag is wat op M. bovis uitgeoefen word. 'n Hoër proporsie SNP's is opgespoor in gene ryk aan funksionele kategorieë van "lipiedmetabolisme", "selwand en sellulêre prosesse", en "intermediêre metabolisme en respirasie", wat hul potensiaal in die biologie en evolusie van Mycobacterium bovis se belangrikheid openbaar. 'n Nadere kyk na die gene in die MTBC-voorouers wat geneig is tot horisontale geenoordrag en ingesluit is in die 3R (DNA-herstel, replikasie en rekombinasie) stelsel, toon die globale gemiddelde negatiewe waarde van Taijima se D-neutrale toets, wat dui op vorige selektiewe skandering. Die onlangse bottelnek na bevolkingsuitbreiding is steeds die belangrikste evolusionêre dryfveer vir die verpligte patogeen Mycobacterium bovis om die gasheer te beveg.
Die Mycobacterium tuberculosis-kompleks (MTBC) is een van die suksesvolste taksa van bakteriële patogene en 'n tipiese geval van bakteriële evolusie. Die lede daarvan toon verbasend hoë nukleotiedidentiteit op genomiese vlak (> 99%)1,2. Verskillende MTBC-ekotipes kan tuberkulose (TB), wat 'n aansteeklike granulomateuse siekte is, in 'n wye reeks gasheerspesies veroorsaak, van mikro-soogdiere tot mense3,4,5. Tans sluit die kompleks mense [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] en dier-aangepaste patogene (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" en "dassie")5,6 in. M. canettii (ook bekend as "Nodobacter glabrata") Die gemiddelde nukleotiedidentiteit met die voorgenoemde mikobakterieë is 98%, en vergelykende genomika-werk het getoon dat M. canettii en die res van MTBC onlangs van die gemeenskaplike voorouer afgewyk het.7 In die lig van hierdie konsep noem sommige outeurs M. canettii Lid van MTBC 8.
MTBC word sistematies beskryf as 'n streng klonale kompleks, en die populasiestruktuur daarvan word duidelik beheer deur verminderde diversiteit, knelpunte, selektiewe skandering en genetiese drywing9,10. As ons aanvaar dat komplekse streng klonale evolusie, soos ontbrekende polimorfismes, nie deur rekombinasie herstel kan word nie. Gebaseer op hierdie uitgangspunt, is die opeenvolgende gebeurtenisse van die genomiese skrapping van die differensiële streek (RD) en TbD1 (Mtb-spesifieke skrapping 1-streek) voorgestel as molekulêre merkers van MTBC-evolusie2,5,11. Vergelykende genomika en volledige genoomvolgordebepaling (WGS) werk ondersteun die verdeling van mens-aangepaste lede in nege afstammelinge (Mycobacterium tuberculosis L1 tot L4, L7 en L8; en Mycobacterium africanum L5, L6 en L9), afstammelinge L2 tot L4 het die skrapping van die TbD1-streek2,11,12,13 gedeel. Daarbenewens word voorgestel dat lede wat aan diere aangepast is, 'n gemeenskaplike voorouer deel, wat gedefinieer word deur klade-spesifieke delesies in RD7, RD8, RD9 en RD102, 5 en 14.
Horisontale geenoordrag (HGT) en rekombinasiegebeurtenisse word as skaars beskou en kom voor in die voorouers van MTBC, eerder as die verskillende geskiedenis van die hele MTBC-lid15,16,17. Twee vroeë verslae deur Hughes en medewerkers (2002) en Gutacker en medewerkers (2006) het voorgestel dat rekombinasiegebeurtenisse kan help om polimorfismes te vorm wat spesifieke loki in M. tuberculosis-stamme merk18,19. Die redes vir die ooglopende gebrek aan rekombinasie in MTBC is: (1) die meganiese proses en verlies aan vermoë van HGT; (2) die seldsaamheid van HGT-gebeurtenisse; (3) daar is geen kans op rekombinasiegebeurtenisse in die MTBC-nis14,17. Onlangs het sommige studies oor die volledige genoomvolgordebepaling (WGS) wat op MTBC-stam 20 en Mycobacterium bovis 21 toegepas is, bewyse van rekombinasie gelewer, die eerste wat toon dat MTBC-stamme dikwels klein DNS-fragmente uitruil, maar as gevolg van beperkte nukleotiedvolgordevariasie word hierdie gebeurtenisse steeds nie opgemerk nie.
Mycobacterium bovis is die mees algemeen herwonne MTBC-lid van vee (hoofsaaklik beeste), hoewel dit ook van vrylopende en omheinde wilde diere geïsoleer kan word4,22,23,24. M. bovis het ontwikkel in vyf hoofklonale komplekse [Europese 1 (Eu1), Europese 2 (Eu2), Europese 3 (Eu3), Afrika 1 (Af1) en Afrika 2 (Af2)], volgens die spoligotiperingsprofiel, spesifieke delesies en enkelnukleotiedpolimorfismes (SNP's) 25, 26, 27, 28, 29 in spesifieke gene. Hierdie klonale komplekse demonstreer die diverse struktuur van die Mycobacterium bovis-populasie en die assosiasie daarvan met geografiese streke. Daarbenewens het die onlangse WGS-werk wat deur Zimpel en medewerkers (2020) uitgevoer is, 'n filogenie ontwerp gebaseer op die SNP van Mycobacterium bovis, met meer as 1 900 genome, wat aandui dat daar ten minste vier verskillende afstammelinge is (genaamd Lb1 tot Lb1 tot Lb4). Hulle is nie heeltemal in ooreenstemming met die voorheen gedefinieerde klonale kompleks nie, hoewel geografiese spesifisiteit ook bevestig kan word30. Hierdie outeurs het differensiële analise van filogenie en molekulêre datering uitgevoer, maar het nie rekombinasie bestudeer nie30.
Vorige werk met behulp van verskillende molekulêre tegnieke, soos spoligotipering, MIRU-VNTR (micobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), en onlangse SNP-tipering het 'n sekere vlak van genetiese diversiteit onder M. bovis-stamme aan die lig gebring 31,32,33, 34,35. Die differensiasie van genetiese variasie het 'n belangrike instrument geword in die studie van siekte-epidemiologie, wat nuttig is vir 'n diepgaande begrip van patogenese, virulensie en siekte-oordrag. Die opkoms van die WGS-metode bied die moontlikheid om die evolusionêre dryffaktore wat deur die Mycobacterium bovis-genoom opgelê word in die proses van aanpassing en volharding by verskillende gashere en epidemiologiese scenario's te openbaar.
In hierdie werk gebruik ons vergelykende genomiese analise op verskeie Mycoplasma bovis-datastelle (n=70), insluitend isolate van verskillende klonale komplekse, om insigte te verkry in die evolusionêre proses van Mycoplasma bovis, veral om filogenetiese verwantskappe en rekombinasiegebeurtenisse op te los. As aanvulling tot hierdie analise is 'n subdatastel van M. bovis-isolate (n = 42) verkry uit 'n goed gekarakteriseerde multi-gasheer tuberkulose-gebied in Portugal 31,36 verder ondersoek om nie-identiteit af te lei. Die balans tussen die relatiewe verhouding van sin (dN) tot sinonieme (dS) nukleotiedsubstitusies, sowel as die evolusionêre bydrae van spesifieke genome wat in die literatuur genoem word, is 37,38 verkry deur MTBC-voorouers deur HGT, en kodeer vir 3R (DNA-herstel, replikasie en rekombinasie) stelselgeenkomponente 39. Kies gene wat deur HGT verkry is omdat hulle antieke polimorfismes kan verteenwoordig, dus word verwag dat hulle 'n hoër proporsie sinonieme veranderinge kan bevat. Die gene wat in die 3R-stelsel ingesluit is, is gekies omdat vorige werk oor M. tuberculosis-stamme algemene negatiewe/suiweringseleksies aangedui het wat op hierdie gene werk, en hulle mag 'n belangrike rol in evolusie speel 39. Nog 'n doel van hierdie werk is om die bestaan van reorganisasiegebeurtenisse af te lei. Om hierdie rede, aangesien ons datastel van Portugal slegs die genome van Europese kloonkompleks 2 en die stamme wat nie die kloonkompleks toegeken het nie, bevat, het ons besluit om publiek beskikbare genoomdata in te sluit om uiteindelik 'n verteenwoordiger van alle kloonkomplekse te verkry, en die robuustheid en breedte van resultate te verbeter.
42 nuut gesekwensieerde Mycoplasma bovis-genome van die Portugese endemiese multi-gasheer tuberkulose-toneel (besonderhede hieronder), voorheen gekarakteriseer vanuit 'n epidemiologiese perspektief36, is die middelpunt van hierdie werk. Aangesien die datastel van Portugal slegs verteenwoordigers van die Europese 2 kloonkomplekse en stamme sonder aangewese komplekse bevat, is publiek beskikbare heelgenoom-volgordebepalingsdata bygevoeg om die datastel uit te brei wat alle verteenwoordigers van die M. bovis-kloonkomplekse insluit. Daarom is drie heelgenoom-volgordebepalingsdatabronne in hierdie werk gebruik: volledige/konsep-genoomsamestelling, tot 10 steiers gestoor in NCBI (Nasionale Sentrum vir Biotegnologie-inligting) (n = 15 isolate); gestoor in SRA (Die Illumina fastq-lêer van die volgorde-leesargief) verteenwoordig die komplekse diversiteit van M. bovis-klone (n = 12 isolate)30; en 42 nuut gesekwensieerde genome van Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) is uitgesluit van die NCBI-soektog. M. bovis AF2122/97 word gewoonlik as 'n verwysingsgenoom gebruik om in die datastel ingesluit te word. As gevolg van die openbare onbeskikbaarheid van die hele genoomvolgorde wat deur die African 1-kloneringskompleks verteenwoordig word, en die klein aantal genome van verteenwoordigende stamme van Af2 en Eu1, is die oorspronklike volgordebepalingsdata wat deur SRA verskaf is, in hierdie gevalle gebruik. Die werk van Zimpel en sy medewerkers (2020) het gehelp om die genoom van die bogenoemde kloneringskompleks te identifiseer en het gehelp om Mycobacterium bovis te selekteer vir insluiting in die datastel. Vir Eu3 word slegs een tipe genoom beskryf (Branger et al., 2020), dus is die genoom wat ons insluit 'n aparte verteenwoordiger van die Eu3-kompleks.
Wêreldwyd sluit hierdie datastel 70 beeste M. bovis in wat uit 8 gasheerspesies geïsoleer is, versprei in 12 lande van 1985 tot 2016. 36 spesies word as Eu2 aangewys, 7 spesies is Eu1, 1 spesie is Eu3, 3 spesies is Af1, 4 spesies is Af2 en 19 kan nie aan enige klonale kompleks toegeskryf word nie (besonderhede hieronder). Die gedetailleerde inligting (insluitend die toetredingsnommer) van Mycobacterium bovis wat in hierdie studie gebruik is, word in Tabel 1 en Aanvullende Tabel 1 getoon.
42 nuut gesekwensieerde hele genome van Mycobacterium bovis van Portugal se dieretuberkulose-brandpunte en versprei vir meer as 12 jaar, is die middelpunt van hierdie studie, aangesien potensiële wild-vee-siektestelsels gereeld gemonitor is 31,36 (Aanvullende Fig. 1). Volgens daaropvolgende prosedures is hierdie stamme van 2003 tot 2015 van beeste (n = 14), rooiherte (n = 16) en wildevarke (n = 12) geïsoleer: versamel en hanteer diere in ooreenstemming met die aanbevole protokolriglyne. Die weefselmonsters is in die OIE Terrestrial Animal Handbook en word ingeënt op Stonebrink en Löwenstein-Jensen piruvaat vaste medium en vloeibare medium. Die kulture word by 37 °C geïnkubeer en groei word een keer per week vir ten minste 12 weke nagegaan. Die kolonies word direk in 'n gliseroloplossing by -80ºC gestoor. In die Mycobacterium-selektiewe medium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) is die oorspronklike geargiveerde monsters deur 'n enkele in vitro-gang in vitro gelei om die DNS van die WGS-program te verkry. Hiervoor is die bevrore kultuurvoorraadoplossing verryk met 5% natriumpiruvaat en 10% ADS (50 g albumien, 20 g glukose, 8.5 g natriumchloried in 1 L water) op Middlebrook 7H9 by 37°C Retrain. Na 4 weke van groei is die medium hernu en die kultuur is gereeld gemonitor totdat groei waargeneem is. Die selle is deur sentrifugering geoes, die pellet is hersuspendeer in 500 µL fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS), vir 30 minute by 99 °C verhit, gesentrifugeer, en die supernatant is by -20 °C gestoor tot WGS. Alle prosedures word in vlak 3 bioveiligheidsfasiliteite uitgevoer.
Die WGS gepaarde-ent genoombiblioteek word voorberei deur die unieke indeks van elke DNS-monster te gebruik, en gebruik Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 monsters) en HiSeq (2 × 150 pb) (twee isolate) tegnologie (Eurofins Genomics, Duitsland) vir volgordebepaling. Gebruik die Illumina Genome Analyzer met dubbel-ent module-aanhegting volgens die vervaardiger se instruksies om die genomiese DNS te volgordebepaal, en gebruik die Nextera XT DNA Library Prep Kit van Illumina om die biblioteek te konstrueer.
Met inagneming van die data wat uit die SRA (n = 12) herwin is, kan die identifikasie van die kloonkompleks as die metadata van die ooreenstemmende publikasie 30, 41, 43 gebruik word. Wanneer die volledige genoom oorweeg word, behalwe vir Mycobacterium bovis AF2122/97 en Mycobacterium bovis 3601, wat onderskeidelik erkende lede van die Eu1- en Eu3-klonale kompleks 25, 29 is, is dit dieselfde as die volledige genoom van Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI-toegangsnommer NC_000962.3). Genoombelyning word uitgevoer met behulp van MAFFT (veelvuldige belyningsprogram van aminosuur- of nukleotiedvolgorde, weergawe 7.458) en parameter -addfragments48. Soek dan na die afwesigheid van verskillende klonale komplekse en/of die teenwoordigheid van SNP-kenmerke.
Die nuut gesekwensieerde Mycobacterium bovis (n = 42) en die oorspronklike lesings van die saamgestelde genoomkonsep (n = 3) belyn die kompleks met die verwysingsgenoom Mycobacterium tuberculosis H37Rv deur die vSNP-pyplyn en die teenwoordigheid van die delesie en/of SNP-kenmerke van verskillende klone. 'n Soektog is uitgevoer.
Versamel inligting oor die gebrek aan kenmerke en/of die teenwoordigheid/afwesigheid van SNP en spoligotiperingsprofiele om genomiese data aan die ooreenstemmende klonale kompleks toe te ken. Vir die vier konsep-samestellings kan die spoligotiperingsprofiel nie afgelei word nie, daarom word hulle ingesluit in die "geen kompleksiteit"-groep.
Die bioinformatika-werkvloei wat deur hierdie werk gevolg word, begin vanaf de novo-samestelling en kartering na 'n verwysingsstrategie, met die doel om rekombinasiegebeurtenisse en spesifieke genoompolimorfismes te ondersoek. Figuur 1 verskaf 'n vloeidiagram van die stappe wat gevolg word. Vir rekombinasie-analise word alle genome gebruik om die robuustheid van afleidings en verwante aanwysers te verhoog.
Om foute in die generering van genoom-konsensusreekse te verminder, het ons eers de novo-samestelling verkry, en toe kern veelvuldige belynings verkry. Die Unicycler-pyplyn is tans beskikbaar by https://github.com/rrwick/Unicycler49 en word gebruik om de novo-samestelling van 54 gesekwensieerde genome (42 nuut gesekwensieerde en 12 fastq-lêers herwin van SRA) uit te voer. Kortliks, voor die samestelling van nuuts af, is leeskwaliteitsanalise uitgevoer in FastQC weergawe 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), en Trimmomatic weergawe 0.36 (opsie "sny Adapters en ander beligtingspesifieke reekse van lesings" en "Sny basisse van die einde van die lesing, indien laer as die drempelkwaliteit van 20" toegepas word) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Daarna is SPAdes optimizer49 gebruik vir genoomsamestelling, en Pilon weergawe 1.1851 is gebruik vir optimalisering na samestelling. 'n Konserwatiewe oorbruggingsmodus is gekies om verkeerde samestelling te vermy, en die k-mer-grootte is gesoek en geselekteer tussen 20% en 95% van die leeslengte. Volg die SPAdes-riglyne en oorweeg die leesgrootte, verwyder contigs kleiner as 300 bp, en stel 'n 20-lesingsdieptedekkingsafsnypunt van 52 vas. In die de novo-samestellingsstrategie is genomiese streke soos die hoogs herhalende prolien-glutamaat (PE) en prolien-prolienglutamaat (PPE) paraloge nie verwyder nie.
Die kwaliteit van die de novo-samestelling word beoordeel deur die QUAST-pyplyn (http://quast.sourceforge.net/quast.html), wat die hernuwing van die contig en die M. bovis AF2122/97-verwysingsgenoom (NCBI-toegangsnommer LT708304.1) Kartering vergemaklik (sien Aanvullende Tabel 1 vir kwaliteitsparameters).
Met behulp van die vSNP-pyplyn (https://github.com/USDA-VS/vSNP) word die FASTQ-lêer van die nuut gesekwensieerde M. bovis van Illumina-sekwensiebepaling vergelyk met die M. bovis AF2122/97-verwysingsgenoom (LT708304.1)). Volgens die beste praktyk-aanbevelings van die Genome Analysis Toolkit (GATK) [53, 54, 55] word standaardfilterparameters of variantmassatellings vir herkalibrasie toegepas. Die resultate word gefiltreer met behulp van die laagste SAMtools-massatelling van 150 en AC = 2. Gebruik ook Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) om die lesings na te gaan om kontaminasie uit te sluit. Die vSNP-pyplyn wat gebruik word om strategieë vir volgordebepaling in ons werk te karteer, ondersoek 'n reeks gedefinieerde SNP's en teikens, en sluit ook gemengde infeksiescenario's uit. Die geleesde genoomdekking is beter as 99% (Aanvullende Tabel 1).
Om karteringsfoute en verkeerde SNP's te vermy, filter 'n variant in die volgende gevalle uit: (1) dit word ondersteun deur minder as 20 lesings, (2) dit word gevind met 'n frekwensie van minder as 0.9, (3) dit is in ten minste een stamme, maar daar is ten minste gapings in 'n ander stam. Die geïntegreerde genomika-kyker (IGV) weergawe 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 is gebruik om SNP's en posisies met karterings- of belyningsprobleme visueel te verifieer. Aangesien die prolien-glutamaat (PE) en prolien-prolienglutamaat (PPE) gene hoogs gedupliseer is en deel is van 'n multi-geenfamilie, word hulle maklik misverstaan deur Illumina-volgordebepaling en -wankartering, dus word hulle verkies. Die mikobakteriese bioinformatika-werkvloei het lede van die tuberkulosekompleks verwyder wanneer die strategie van kartering na volgordebepaling gebruik word om SNP's te bevestig. Daarom het ons PE/PPE-gene en indels uit die analise uitgefiltreer.
Volgens Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) word alle SNP's in funksionele kategorieë verdeel. Die SnpEff-pyplyn (https://pcingola.github.io/SnpEff/) word gebruik om SNP-gevolge (sinonieme of nie-sinonieme veranderinge) af te lei. 'n Nuwe databasis van die Mycobacterium bovis AF2122/97-genoom (LT708304.1) is geskep.
Die kerngenoom-veelvuldige belyning is uitgevoer met behulp van Parsnp v1.2, tans beskikbaar by https://github.com/marbl/parsnp57, met behulp van 69 volledige genome/konsep-samestellings (met opsie -c) en M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) word as verwysing gebruik. Vier kern-veelvuldige belynings is uitgevoer: slegs die lede van die Eu2-kloneringskompleks (n = 37), insluitend al die lede van die Europese kloneringskompleks (n = 44), insluitend die aansluitingspunt van die Europese en Afrika-kloneringskompleks (n = 51), en sluit alle Mycobacterium bovis in hierdie studie in (n = 70).
Die kernbelyning wat deur Parsnp gegenereer word, word gebruik om die maksimum waarskynlikheid (ML) filogenetiese boom af te lei deur gebruik te maak van CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 met behulp van RAxML, en om 1000 begeleide replikasies uit te voer.
Drie verskillende algoritmes en bioinformatika-instrumente word gebruik om die teenwoordigheid van rekombinasiegebeurtenisse parallel te kontroleer: SplitsTree4-sagteware, Gubbins (onbevooroordeelde afstamming deur rekombinasie in nukleotiedvolgordes) pyplyn, en RDP4 (rekombinasie-opsporingsprogram, weergawe beta 4.101) sagteware.
Die gesplete ontbindingsmetode wat in SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 geïmplementeer is, word gebruik om die wortellose filogenetiese netwerk te bereken, met behulp van die Phi-toets vir statistiese verifikasie, en die betekenisdrempel is p = 0.05. Die kern multi-belyningsanalise van Parsnp word as invoer gebruik, en die gesplete ontbinding as 'n netwerkstandaard word gerealiseer.
Gubbins-pyplyn v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) loop met standaardparameters as 'n ander manier om die impak van rekombinasie op Mycobacterium bovis te evalueer. Die algoritme wat in die pyplyn geïmplementeer is, rekonstrueer die relevante kloonlyn. Die volledige genoom/konsep-samestelling van ons datastel en die verwysingsgenoom (bees AF2122/97, LT708304.1) is onderling; en skandeer die posisie van die SNP op elke tak van die boom om die SNP-groep op te spoor wat die rekombinasiegebeurtenis verteenwoordig. Die nul van die tak. Neem aan dat daar geen rekombinasiegebeurtenis is nie, wat beteken dat die SNP's wat op die tak voorkom, eweredig versprei moet wees. Die kern veelvuldige belyning van Parsnp en die beste ML-boom van RAxML word as invoerlêers gebruik.
Laastens, om die reorganisasiegebeurtenis wat deur die Gubbins-pyplyn voorgestel word, te bevestig, word die ses algoritmes wat in RDP467 geïmplementeer is (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 en SiScan66) toegepas op Parsnp se kern veelvuldige belyning onder standaardinstellings. Ons het bepaal dat ten minste drie van die algoritmes wat in RDP4 geïmplementeer is, konsekwent 'n belangrike sein moet demonstreer om elke rekombinasiegebeurtenis te verifieer.
Aangesien beide Gubbins- en RDP-sagteware na rekombinasieseine soek deur die kern veelvuldige belynings in 'n venster van tot 500 bp na te gaan, en te bevestig dat die insluiting van PE/PPE-gene tydens de novo-samestelling nie met die gevindde rekombinasieseine sal inmeng nie, word verdere analise gedoen deur homolineariteit te kontroleer. Kontroleer die omgewing van die geen wat die rekombinasiegebeurtenis identifiseer. Die sinlineêre kaart wat die volledige genoom gebruik, is gekonstrueer met behulp van MAUVE-multi-genoombelyning (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) om plaaslike genoomtranslokasies of inversies uit te sluit. Daarbenewens is die hele genoom gebruik om homolineariteitsanalise op die aminosuurvolgorde uit te voer deur die SyntTax-webbediener (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
'n Meer diepgaande analise van die genoomdatastel wat verkry is van die Portugese multi-gasheer tuberkulosestelsel, is om die polimorfisme van die gene wat in die literatuur genoem word, na te gaan. Hierdie gene is 37, 38 en die geen wat 3R kodeer, wat deur die MTBC-voorouers verkry is deur HGT (DNA-herstel, replikasie en rekombinasie) stelselkomponente 39. Gebruik ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) en gebruik DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) om geendiversiteit en nukleotieddiversiteit (π) en Tajima se D-neutrale toetsparameterinvoer te bereken.
'n Maksimum waarskynlikheid (ML) filogenetiese boom gebaseer op 69 Mycoplasma bovis-isolate en verwysingsgenome is verkry (Figuur 2A). In vergelyking met enkelgeen-gebaseerde bome of multi-lokus-gebaseerde bome, maak hierdie strategie die generering van kragtiger bome moontlik wat nie die veranderlikheid van die hele genoom vasvang nie en dus 'n laer vermoë toon om tussen spesies te onderskei 68,69. Die topologiese struktuur van die ML-boom is gewoonlik in ooreenstemming met die komplekse klassifikasie van klone. Die genoom van Eu2 is in 'n tak gegroepeer, en die genoom van Af1 is ook saamgegroepeer (Figuur 2A). Die resultaat is ook in ooreenstemming met die bekende evolusionêre verwantskap van Mycobacterium bovis, dit wil sê, daar is 'n groot verskil tussen die Eu1-lid en die groep wat uit alle ander klonale komplekse en genome bestaan, maar die klonale kompleks 30 word nie gespesifiseer nie. Die klein teenstrydigheid tussen die klonale kompleks en die verwantskap wat op die filogenetiese boom waargeneem word, kan verklaar word deur die feit dat die klonale kompleks beskryf word op grond van spesifieke genomiese streke, terwyl die filogenetiese boom gebaseer is op veelvuldige belynings van kerngenome wat die hele genoom verteenwoordig.
Die maksimum waarskynlikheid filogenetiese boom (GTR) word gekonstrueer gebaseer op die kerngenoombelyning van die Mycobacterium bovis-genoom voor (A) en na (B) verwydering van die rekombinasieplek. Die takkleure verteenwoordig die Mycobacterium bovis-kloonkompleks: Europa 1 is pers, Europa 2 is rooi, Europa 3 is blou, Afrika 1 is oranje, en Afrika 2 is groen. Die boom is gewortel en volgens skaal geteken, en die taklengte word gemeet as 'n plaasvervanger vir elke plek.
Die Mycobacterium tuberculosis-kompleks word beskryf as klonaal ontwikkel, en die meeste van die bewyse wat oor die jare opgehoop is, ondersteun die idee dat voortdurende HGT- en rekombinasiegebeurtenisse nie op die waarneembare vlak van MTBC sal plaasvind nie15,17,18.
Vorige werk het getoon dat daar beperkte rekombinasie tussen MTBC-stamme kan wees20,21, terwyl ander nie daarin geslaag het om meetbare rekombinasiegebeurtenisse70,71 te identifiseer nie. Bespreek hierdie kwessie weer met die fokus op Mycobacterium bovis, wat verskil van die vorige werk wat slegs Mycobacterium tuberculosis70,71 oorweeg het; of beskou MTBC as 'n geheel, met byna geen M. bovis wat20 verteenwoordig nie; of oorweeg slegs beperkende beesfraksies. Die mikobakterieë-datastel, in hierdie werk, is daar 'n totaal van 70 stamme, wat alle klonale komplekse verteenwoordig, wat gebruik word om vir rekombinasie te sif. Die datastel word geskaal volgens vier kumulatiewe vlakke: (1) Eu2-lede, (2) alle Europese kloonkomplekslede (dws Europa), (3) Europese en Afrika-kloonkompleks (Eu + Af) en (4) die hele dataversameling (insluitend genome wat nie ingesluit is in enige kloonkomplekse wat reeds beskryf is nie).
Om hierdie hipotese verder te bestudeer, is 'n gesplete-ontbindingsnetwerk uitgevoer om die afwesigheid van rekombinasiegebeurtenisse tussen genome te bepaal, omdat hierdie metode die voorvaderlike verwantskap tussen individue kan visualiseer en teenstrydige filogenetiese seine kan vertoon. Al vier datastelle in die analise het die bestaan van lusse in die netwerk bevestig (dit wil sê gebiede wat nie in 'n enkele boom konvergeer nie), maar die Phi-toets het geen statistiese ondersteuning nie (Eu2, p = 0.0956; Europa, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; die hele datastel p = 0.2451), wat swak bewyse bied vir die bestaan van reorganisasiegebeurtenisse (Figuur 3A-D).
In Europa 2 genome (n = 37) (A), Europese genome (n = 44) (B), Europese en Afrika-genome (n = 51) (C) en die hele datastel (n = 70) (D).
Na hierdie analise, en met inagneming van die sikliese waarnemings in alle netwerke, is die rekonstruksie-algoritme wat in die Gubbins-pyplyn geïmplementeer is, toegepas om die klonale afstamming te rekonstrueer en die beraming van die effek van die rekombinasie op die M. bovis-genoom aan te vul. Lei die kumulatiewe aantal rekombinasiegebeurtenisse af, waarvan die meeste in terminale takke (dit wil sê in 'n enkele genoom) plaasgevind het (Tabel 2). Hierdie aanwysers toon die konsekwentheid van die hele datastel en dui aan dat die frekwensie van rekombinasiegebeurtenisse 200 tot 300 keer dié van mutasies is. Sodra die rho/theta-parameter wat die relatiewe tempo's van rekombinasie en puntmutasies op die tak verteenwoordig, tussen 0.0037 en 0.0056 blyk te wees (Tabel 3). Onlangs het die gepubliseerde werk van die 38 M. bovis-stam 'n hoër rho/theta-waarde (rho/theta = 0.1) getoon as dié wat in hierdie datastel verkry is, maar die werk van Patané en kollegas het verwysingsgebaseerde samestelling gebruik om rekombinasieparameters af te lei. 'n Prosedurele detail, as gevolg van die samestellingsprosedure, is geassosieer met die oorvloed van vermeende rekombinasiegebeurtenisse in die terminale tak.
Vervolgens verteenwoordig die r/m-parameter die diversiteitsverhouding van rekombinasie en mutasie-inleiding, en die gemiddelde waarde daarvan is tussen 0.025 en 0.037, wat aandui dat rekombinasie, in vergelyking met mutasies, 'n laer algehele impak op die genetiese diversiteit van M. bovis het (Tabel 3). Vir uitgebreide vergelyking is 'n soortgelyke metode gebruik om die r/m-parameter vir die MTBC-datastel wat uit 23 genome bestaan, te skat, wat 'n gemiddelde waarde van 0.48620 toon, terwyl dit vir Patané en kollegas se 38 M. bovis-datastel bewys het dat die gemiddelde waarde 0.98 is. In die eerste studie is slegs twee van die 23 genome ingesluit in die werk van M. bovis (M. bovis BCG en die verwysingsstam), dus kan die verkrygde waarde bevooroordeeld wees as gevolg van die ooruitdrukking van die M. tuberculosis-genoom. In die tweede verslag is die geanaliseerde Mycobacterium bovis-populasies hoofsaaklik van die Verenigde State en veeggashere herwin. In teenstelling hiermee word meer geografiese liggings en gasheerspesies in ons datastel verteenwoordig, en genome wat in verskillende klonale komplekse met verskillende populasiegenetiese eienskappe gegroepeer is, word ook gebruik, wat 'n dieper en breër populasiekennis verkry. Die verskil r/m gemiddelde waarde wat met ons datastel verkry is, stem ooreen met die konsep dat die mate van rekombinasie baie verskil tussen die afstammelinge wat aan dieselfde taksonomiese spesie toegeken word, dus dui hierdie resultate daarop dat die M. bovis kloonkompleks rekombinasieverskille kan toon. Die impak is ook soos voorgestel deur Didelot & Maiden72. Nietemin sal die aansienlike uitbreiding van hierdie datastel deur 'n groter aantal M. bovis-genome in te sluit, verdere verduideliking van hierdie punt moontlik maak. Beide die r/m- en rho/theta-parameters toon variasie tussen takke, en hierdie resultaat stem ooreen met verslae oor ander bakteriese spesies72,73.
Laastens, om die reorganisasiegebeurtenisse wat deur die Gubbins-pyplyn geïdentifiseer is, te bevestig, is ses verskillende algoritmes in die RDP4-sagteware gebruik om onafhanklik verskillende kern-multi-vergelykings te toets. Wêreldwyd is minder as die helfte van die gebeurtenisse wat deur Gubbins geïdentifiseer is, deur RDP4 bevestig (Tabelle 4 en 5). As die hele datastel in ag geneem word, is drie rekombinasiegebeurtenisse bevestig, twee wat interne nodusse betrek en die ander wat 'n enkele genoom in 'n terminale tak betrek, waarvoor klonale komplekse nie toegeken kon word nie (Tabelle 4 en 5). Die identifisering van gebeurtenisse in terminale takke kan aandui dat die rekombinasie steeds aan die gang is in kontemporêre M. bovis-stamme of dat die resultaat verkeerd geplaas is70. In hierdie hipotetiese rekombinasiegebied het ongeveer 20% van die posisies ongedefinieerde nukleotiede (N), wat dus die rekombinasiesein beïnvloed (Aanvullende Figuur 2). Daarbenewens beïnvloed hierdie gebied die rrs-geen, wat kodeer vir die 16S ribosomale RNA wat na verwagting hoogs gekonserveerd sal wees, dus kan hierdie vermeende rekombinasiesein die gevolg wees van volgordebepalingsfoute of wanbelyning. Toe is die volledige genoombelyning tussen Mb0003 en Mycobacterium bovis AF2122/97 uitgevoer, en die bestaan van ongedefinieerde nukleotiede en SNP's is bevestig, dus was die moontlike probleme wat verband hou met die verkeerde belyning nie te wyte aan die biologiese inligting wat in hierdie werk geïmplementeer is nie. Dit het verskyn nadat die program aangeleer is.
Geen gapings of ongedefinieerde nukleotiede is in die rekombinasiestreke van die interne nodusse gevind nie (Figure 4 en 5). Wat hierdie gebeurtenisse betref, bevat een slegs die Eu2-genoom en beïnvloed die pks12-geen, wat kodeer vir 'n moontlike poliketied-sintase; terwyl die ander in die Eu1-genoom geregistreer is en die narX-geen beïnvloed wat kodeer vir 'n moontlike nitraatreduktase (Tabel 4). Oor die algemeen toon die rekombinasie-analise dat daar 'n beperkte aantal rekombinasiefragmente met statistiese ondersteuning is, en die afgeleide aanwysers dui daarop dat die rekombinasie 'n lae impak op die M. bovis-afstamming het. Die rekombinasiesein word verwag om laag te wees, maar dit is belangrik om die ware evolusiesein van die agtergrondgeraas te onderskei, wat 'n uitdagende taak is. Om die geraassein wat deur verwysingsgebaseerde samestelling en wanpassingsprobleme 70, 71 ingebring word, te verminder, is al die res behalwe die volledige genoom van nuuts af saamgestel, en die samestellingskwaliteit is nagegaan en verseker deur QUAST-pyplynanalise (Aanvullende Tabel 1). Daarbenewens is 'n reeks aanvullende ontledings uitgevoer om die robuustheid en akkuraatheid van die algehele opname te verseker. Daarom is die volgordebepalingskwaliteit van narX- en pks12-gene geëvalueer deur leeskartering teen Mycobacterium bovis AF2122/97. Die aanbevole SNP-posisie in die rekombinasiegebied is bevestig deur die kriteria wat in die metode-afdeling genoem word, toe te pas (ten minste 20 lesings en 0.9 veranderingsfrekwensie). Die polimorfisme van die narX-geen is volledig bevestig in die twee genome (Mb1792361 en Mb7240415; 2.3%) en die genome van die pks12-genoom: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 en Mb12-gene. Vir die genoom Mb2043 voldoen ses van die agt posisies egter nie aan die leesdieptekriterium nie, omdat die SNP deur 'n maksimum van 17 lesings ondersteun word, wat onder die vasgestelde afsnywaarde van 20 is. Daarom kan die rekombinasie van ses genome (8.6%) by hierdie genoomplek bevestig word (Figure 4 en 5).
Die gedetailleerde visualisering van die rekombinasiegebiedbelyning van die Mycobacterium bovis-datastel beïnvloed die narX-geen wat kodeer vir 'n moontlike nitraatreduktase. Geen gapings of ongedefinieerde nukleotiede is gevind in die rekombinasiegebied van die interne nodusse nie. Hierdie spesifieke gebeurtenis is geregistreer in die Eu1-genoom. Die volgordebepalingskwaliteit van die narX-geen is geëvalueer deur die lesings van Mycobacterium bovis AF2122/97 te plot. Bevestig die aanbevole SNP-ligging in die rekombinasiegebied deur die kriteria wat in die metode-afdeling genoem word, toe te pas (ten minste 20 lesings en 0.9 veranderingsfrekwensie). Die polimorfisme van die narX-geen is volledig bevestig in die genome van Mb1792361 en Mb7240415 (2.3%).
Gedetailleerde visualisering van die rekombinasiegebiedbelyning van die Mycoplasma bovis-datastel wat die pks12-geen beïnvloed. Geen gapings of ongedefinieerde nukleotiede is gevind in die rekombinasiegebied van die interne nodusse nie. Wat die gebeurtenis betref wat die pks12-geen beïnvloed wat kodeer vir moontlike poliketied-sintase, bevat dit slegs die Eu2-genoom. Die volgordebepalingskwaliteit van pks12 is geëvalueer deur die leeskartering van Mycobacterium bovis AF2122/97. Bevestig die aanbevole SNP-ligging in die rekombinasiegebied deur die kriteria wat in die metode-afdeling genoem word, toe te pas (ten minste 20 lesings en 0.9 veranderingsfrekwensie). Die polimorfismes van die genome Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 en Mb1960 is volledig bevestig.
PE- en PPE-gene het herhalende streke wat maklik deur Illumina-volgordebepaling en -wankartering verkeerd gelees kan word, daarom word hulle gewoonlik slegs uit die bioinformatika-werkvloei van M. tuberculosis-lede verwyder wanneer die kartering-na-volgorde-strategie gebruik word. Die afleiding van rekombinasiegebeurtenisse wat in hierdie werk toegepas word, is gebaseer op de novo-samestelling sonder om PE/PPE uit te filter. Ons glo dat deur die implementering van drie verskillende komplementêre metodes en algoritmes deur SplitsTree, Gubbins-pyplyn en RDP4-sagteware, die toegepaste strategieë robuust is vir die verwerking en filter van die herorganiseerde streke wat deur foutseine veroorsaak word. Om egter die inmenging van die PE/PPE-geen op die Gubbins- en RDP4-sagteware uit te sluit om SNP-groepe te identifiseer, en dus die identifisering van die rekombinasiestreke wat voorgestel word om die narX- en pks12-gene te beïnvloed, is die omgewing van hierdie gene ondersoek (Aanvullende Fig. 3-5). In M. bovis AF2122/97 word die narX-geen geskei deur narK2 en Mb1764c, terwyl pks12 omring word deur Mb2075c en Mb2073c (Aanvullende Figuur 3-5). Die kaart wat gegenereer is met behulp van die MAUVE-sinlynkaart van die volledige genoom verskaf inligting oor geenvolgordebewaring en herrangskikking, wat vier kollineêre blokke toon, en geen tekens van genoomtranslokasie of inversie nie. Daarbenewens het die komplementasie-analise met die aminosuurvolgorde die homologie in al die volledige genome bewys, en geen PE/PPE is gevind in die aangrensende streke van narX of pks12 nie. Vir narX het een genoom (Mb0030) 'n laer sinoniemetelling omdat die narX-geen as twee fragmente (fragmente 1891 en 1890) geïdentifiseer is. Vir pks12, as gevolg van ooreenkomste, het Mb0030 en Mb003 laer sinlineariteittellings getoon, terwyl pks12 onderskeidelik in twee en drie fragmente geïdentifiseer is, wat verskillende domeine van die proteïen verteenwoordig (Aanvullende Figuur 3-5). Met inagneming van hierdie inligting, en Gubbins en RDP4 sagteware wat albei analise uitvoer, kontroleer die kern veelvuldige belyning van die maksimum 500 bp in die venster, en het ons bevestig dat die PE/PPE geen nie sal inmeng met die rekombinasie sein wat narX en pks12 beïnvloed nie.
Alhoewel die rekombinasieseine wat in hierdie datastel opgespoor is, as residueel beskou kan word, is dit waar dat rekombinasie in M. bovis nie uitgesluit kan word nie, dus moet dit steeds die onderwerp van verdere analise wees, waarin hele genome uit verskillende epidemiologiese scenario's tot Belangrik georden word.
Die vergelyking van die ML filogenetiese bome wat voor en na rekombinasiekorreksie verkry is (Figuur 2A, B) het nie tot beduidende veranderinge in die afgeleide filogenetiese verwantskap gelei nie, en die M. bovis-stamme is in dieselfde groep gegroepeer.
Nadat 42 nuut gesekwensieerde M. bovis-lesings met die verwysingsgenoom van M. bovis AF2122/97 gekarteer is, is 'n SNP-belyning met 1816 polimorfiese posisies verkry. Die meeste SNP's (87.1%) is in die koderingsgebied geleë, en die geaffekteerde gene word gekarakteriseer volgens die funksionele kategorieë wat in Bovilist getoon word (Figuur 6A, B). Met inagneming van die totale aantal gene in elke funksionele kategorie, het die gene in die "lipiedmetabolisme"-kategorie meer SNP's getoon, gevolg deur "selwand en selprosesse" en "intermediêre metabolisme en respirasie", wat onthul dat hulle in M. bovis-evolusie is.
Hiërargiese analise van die M. bovis-datastel van Portugal (n = 42). Die totale aantal geregistreerde SNP's en geaffekteerde gene vir elke funksionele kategorie (A). Die totale aantal sinonieme en nie-sinonieme veranderinge geregistreer per funksiekategorie (B).
Op 'n wêreldwye skaal is die gemiddelde dN/dS-verhouding beter as 1.5, wat aandui dat die wêreldwye evolusionêre druk is om van die voorvaderlike toestand ontslae te raak en 'n positiewe (gediversifiseerde of gerigte) en/of ontspanne suiweringskeusescenario verteenwoordig. In die kategorieë van "virulensie, ontgifting, aanpassing", "invoegvolgordes en fage", en "regulerende proteïene", is meer as twee derdes van SNP's nie-sinoniem (Figuur 6B).
In alle kategorieë is daar gene met veelvuldige SNP's, wat lei tot 'n gemiddelde mutasiekoers (dit wil sê die gemiddelde SNP per geen) groter as 1 (Figuur 6A). Pks12 (Mb2074c) met 15 SNP's en fas (Mb2553c) met 8 SNP's het hoër mutasiewaardes. Beide hierdie gene is betrokke by vetsuurmetabolisme. Die pks-geen kodeer vir poliketiedsintase (PKS), wat 'n multifunksionele ensiem is wat betrokke is by mikobakteriële selwandlipiedbiosintese74,75. Hierdie geen kodeer vir 'n multifunksionele polipeptied wat betrokke is by die sintese van mikoketides74,76. Die fas-geen is betrokke by die sintese van mikoliensuur. Beide hierdie gene speel 'n belangrike rol in die biosintese van die selwand in kontak met die gasheer.
Om die evolusie van Mycobacterium bovis verder te bestudeer, is twee stelle spesifieke gene geanaliseer. Voorheen gepubliseerde werke wat volgordesamestelling en filogenetiese metodes gebruik het, het gene geïdentifiseer wat deur MTBC-voorouers deur HGT verkry is voor diversifikasie37,38. Hierdie gene word in Aanvullende Tabel 2 gelys. Die SNP-verspreiding van 'n totaal van 77 gene wat moontlik met HGT verband hou, is geanaliseer, en 26 polimorfiese plekke is geïdentifiseer, wat in die meeste gevalle (78%) tot nie-sinonieme (NS) veranderinge gelei het (Aanvullende Tabel 2). Vorige werk aan die MTBC-genoom het getoon dat die vermeende HGT-streek 'n hoër NS SNP-verhouding toon in vergelyking met die res van die genoom. As 'n mens dink dat hierdie rekombinasiestreke deur MTBC-voorouers verkry is, en daarom antieke polimorfismes oorverteenwoordig, word verwag dat die proporsie sinonieme veranderinge hoër sal wees, omdat NS-substitusies na verwagting deur negatiewe seleksie uitgeskakel sal word as gevolg van aminosuurveranderinge wat die funksie van die proteïen kan verander. Daarom dui ons resultate daarop dat die funksionele gevolge moontlik voortspruit uit die vervanging van HGT-agtige gene, wat hul belangrikheid vir waardevolle aanpasbare genetiese diversiteit weerspieël.
Parallel met hierdie analise is die gene wat kodeer vir die komponente van die 3R (DNA-herstel, replikasie en rekombinasie) stelsel deeglik ondersoek in ooreenstemming met die lys wat voorheen deur dos Vultos en medewerkers (2008)39 gepubliseer is. Die uitruil van identiese DNA-fragmente kan nie direk waargeneem word nie, alhoewel dit 'n gereelde proses kan wees wanneer nou verwante bakterieë betrokke is, soos in die geval van hierdie datastel; boonop kan hierdie proses die sleutel tot DNA-herstelmetodes72 wees, dus speel dit 'n rol in homoloë rekombinasie. 'n Totaal van 26 polimorfiese posisies, versprei deur 54 gene, is geïdentifiseer (Aanvullende Tabel 3). In hierdie stel gene het NS-veranderinge ongeveer 65% van die gevolge uitgemaak, wat ooreenstem met vorige verslae oor Mycobacterium tuberculosis-stamme.
Plasingstyd: 21 Okt-2021