شكرًا لزيارتك Nature. إصدار المتصفح الذي تستخدمه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام إصدار أحدث من المتصفح (أو إيقاف تشغيل وضع التوافق في Internet Explorer). ولضمان استمرار الدعم، سنعرض المواقع بدون أنماط أو JavaScript.
لقد أنعش تسلسل الجينوم مجال أبحاث الأمراض المعدية، كاشفًا عن علم الأوبئة والأمراض، والتسبب في المرض، وتفاعلات المضيف مع العامل الممرض، والعملية التطورية المفروضة على العامل الممرض. يعتبر مجمع المتفطرة السلية (MTBC) المتفطرة البقرية أحد أعضائه التكيفية الحيوانية التي تسبب مرض السل (TB) في الثدييات الأرضية، وهو نموذج نموذجي لتطور البكتيريا. ومثل أعضاء MTBC الآخرين، يُفترض أن المتفطرة البقرية هي عامل ممرض مستنسخ تمامًا وبطيء التطور، ومن الواضح أنه لا توجد أي علامة على إعادة التركيب أو النقل الأفقي للجينات. في هذا العمل، نطبق علم الجينوم المقارن على مجموعة بيانات تسلسل الجينوم الكامل (WGS) المكونة من 70 بقرة من سلالات مختلفة (أوروبا وأفريقيا) لاكتساب رؤى حول التنوع الجيني للماشية من النوع M. القوة التطورية. تُستخدم ثلاث طرق مختلفة لتقدير علامات إعادة التنظيم. عالميًا، تم تحديد عدد قليل من أحداث إعادة التركيب الجيني وتأكيدها من خلال طريقتين مستقلتين مدعومتين بدليل قوي. ومع ذلك، بالمقارنة مع الطفرات، فإن لإعادة التركيب الجيني تأثير أضعف على تنوع المتفطرة البقرية (r/m الكلي = 0.037). يتوافق متوسط فرق r/m المُحصّل في المُركّب النسيلي للمتفطرة البقرية في مجموعة بياناتنا مع المفهوم العام القائل بأن درجة إعادة التركيب الجيني قد تختلف اختلافًا كبيرًا بين السلالات المُنسوبة إلى نفس النوع التصنيفي. بناءً على هذا العمل، لا يُمكن استبعاد إعادة التركيب الجيني في المتفطرة البقرية، لذا ينبغي أن يكون موضوعًا لمزيد من الجهود في أبحاث الجينوم المُقارنة المستقبلية، حيث يُعدّ التسلسل الجينومي الشامل (WGS) لمجموعات البيانات الكبيرة من سيناريوهات وبائية مُختلفة حول العالم أمرًا بالغ الأهمية. أُجري تحليل إضافي على مجموعة بيانات أصغر حجمًا لبكتيريا المتفطرة البقرية (عددها 42) من بيانات انتشار السل متعدد المضيفات، وتم تحديد أكثر من 1800 موضع، أظهرت سلالة واحدة على الأقل منها تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP). يقع معظمها (87.1%) في منطقة الترميز، وتتجاوز النسبة الإجمالية للتغيرات غير المترادفة (dN/dS) للتغيرات المترادفة 1.5، مما يشير إلى أن الانتقاء الإيجابي قوة تطورية مهمة تُمارس على المتفطرة البقرية. وُجدت نسبة أعلى من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في الجينات الغنية بالفئات الوظيفية لـ"استقلاب الدهون"، و"جدار الخلية والعمليات الخلوية"، و"الأيض والتنفس الوسيط"، مما يكشف عن إمكاناتها في بيولوجيا وتطور أهمية المتفطرة البقرية. إن إلقاء نظرة فاحصة على الجينات الموجودة في أسلاف MTBC المعرضة لنقل الجينات الأفقي والمدرجة في نظام 3R (إصلاح الحمض النووي والتضاعف وإعادة التركيب) يكشف عن القيمة السلبية المتوسطة العالمية لاختبار Taijima المحايد D، والذي يشير إلى المسح الانتقائي السابق. لا يزال الاختناق الأخير بعد التوسع السكاني هو العامل التطوري الرئيسي الدافع لممرض Mycobacterium bovis الإلزامي لمحاربة المضيف.
يُعدّ مُركّب المتفطرة السُلية (MTBC) أحد أنجح فصائل مُسببات الأمراض البكتيرية، ويُمثّل حالةً نموذجيةً للتطور البكتيري. تُظهر أعضاؤه تطابقًا نيوكليوتيديًا عاليًا بشكلٍ مُفاجئ على المستوى الجينومي (أكثر من 99%)1،2. يُمكن أن تُسبّب أنماط MTBC البيئية المختلفة مرض السل، وهو مرض حبيبي مُعْدٍ، في مجموعة واسعة من أنواع العوائل، من الثدييات الدقيقة إلى البشر3،4،5. حاليًا، يشمل المُركّب البشر [M. السل (المتفطرة السلية، المتفطرة الأفريقية) ومسببات الأمراض المتكيفة مع الحيوانات (المتفطرة البقرية، المتفطرة الرأسية، المتفطرة الزعنفية، المتفطرة الدقيقة، المتفطرة المونجية، المتفطرة الميسانية، المتفطرة السورية، "عصية الشمبانزي" و"الداسي") 5،6. بكتيريا السل كانيتي (المعروفة أيضًا باسم "نودوباكتر غلابراتا"): يبلغ متوسط نسبة التطابق النوكليوتيدي مع المتفطرات المذكورة 98%، وقد أظهرت دراسات الجينوم المقارنة أن بكتيريا السل كانيتي وبقية بكتيريا السل قد انفصلت مؤخرًا عن السلف المشترك.7 بناءً على هذا المفهوم، يُطلق بعض الباحثين على بكتيريا السل كانيتي اسم 8 من بكتيريا السل كانيتي.
يُوصف مرض السل الرئوي (MTBC) منهجيًا بأنه مُركب استنساخي صارم، ويخضع تركيبه السكاني بوضوح لانخفاض التنوع، والاختناقات، والمسح الانتقائي، والانحراف الجيني9،10. بافتراض استحالة استعادة التطور الاستنساخي الصارم المُعقد، مثل تعدد الأشكال المفقودة، عن طريق إعادة التركيب. بناءً على هذه الفرضية، اقتُرحت الأحداث المتتالية لحذف المنطقة التفاضلية (RD) وTbD1 (منطقة الحذف 1 الخاصة بـ Mtb) كعلامات جزيئية لتطور مرض السل الرئوي (MTBC)2،5،11. يدعم علم الجينوم المقارن وتسلسل الجينوم الكامل (WGS) تقسيم الأعضاء المُتكيّفة مع البشر إلى تسع سلالات (المتفطرة السلية من L1 إلى L4، L7، وL8؛ والمتفطرة الأفريقية من L5، L6، وL9)، بينما تشترك السلالات من L2 إلى L4 في حذف منطقة TbD12،11،12،13. بالإضافة إلى ذلك، يقترح أن الأعضاء المتكيفين مع الحيوانات يشتركون في سلف مشترك، والذي يتم تحديده من خلال الحذف الخاص بالفصيلة في RD7 وRD8 وRD9 وRD102 و5 و14.
يُعتبر نقل الجينات الأفقي (HGT) وإعادة التركيب الجيني أمرًا نادرًا، ويحدث في أسلاف السل الرئوي المكتسب (MTBC)، وليس في التاريخ المختلف لعضو السل بأكمله. 15،16،17. أشار تقريران سابقان لهيوز وزملاؤه (2002) وغوتاكر وزملاؤه (2006) إلى أن عمليات إعادة التركيب الجيني قد تُسهم في تشكيل تعدد الأشكال الذي يُميز مواقع جينية محددة في سلالات المتفطرة السلية. 18،19. أما أسباب النقص الواضح في إعادة التركيب الجيني في السل الرئوي المكتسب (MTBC) فهي: (1) العملية الميكانيكية وفقدان قدرة نقل الجينات الأفقي؛ (2) ندرة عمليات نقل الجينات الأفقي؛ (3) انعدام احتمالية حدوث عمليات إعادة التركيب الجيني في بيئة السل الرئوي المكتسب. (14،17). في الآونة الأخيرة، قدمت بعض دراسات تسلسل الجينوم الكامل (WGS) المطبقة على سلالة MTBC 20 وMycobacterium bovis 21 دليلاً على إعادة التركيب، وهي الأولى التي تُظهر أن سلالات MTBC غالبًا ما تتبادل أجزاء صغيرة من الحمض النووي، ولكن بسبب التباين المحدود في تسلسل النوكليوتيدات، فإن هذه الأحداث لا تزال غير ملحوظة.
تُعد بكتيريا المتفطرة البقرية أكثر أنواع بكتيريا المتفطرة البقرية شيوعًا في التعافي من الماشية (وخاصةً الأبقار)، مع إمكانية عزلها أيضًا من الحيوانات البرية التي تعيش في نطاق حر أو مسيج. تطورت بكتيريا المتفطرة البقرية إلى خمسة مجمعات استنساخية رئيسية [الأوروبية 1 (Eu1)، والأوروبية 2 (Eu2)، والأوروبية 3 (Eu3)، والأفريقية 1 (Af1)، والأفريقية 2 (Af2)]، وفقًا لملف النمط الجيني، والحذف المحدد، وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) 25، 26، 27، 28، 29 في جينات محددة. تُظهر هذه المجمعات الاستنساخية البنية المتنوعة لسلالة المتفطرة البقرية وارتباطها بالمناطق الجغرافية. بالإضافة إلى ذلك، صممت دراسة WGS الحديثة التي أجراها زيمبل وزملاؤه (2020) شجرة نشوء وتطور بناءً على تعدد أشكال النوكليوتيدات الأحادية (SNP) لبكتيريا المتفطرة البقرية، مع أكثر من 1900 جينوم، مما يشير إلى وجود أربعة سلالات مختلفة على الأقل (من Lb1 إلى Lb1 إلى Lb4). وهذه السلالات لا تتوافق تمامًا مع المركب النسيلي المُعرّف سابقًا، على الرغم من إمكانية تأكيد الخصوصية الجغرافية أيضًا. أجرى هؤلاء الباحثون تحليلًا تفاضليًا لشجرة النشوء والتطور والتأريخ الجزيئي، لكنهم لم يدرسوا إعادة التركيب.
أظهرت الدراسات السابقة، باستخدام تقنيات جزيئية مختلفة، مثل تحديد النمط الجيني، وتقنية MIRU-VNTR (تكرار المتفطرات المتخللة بوحدة متغيرة)، وتقنية تحديد النمط الجيني الحديث للنوكليوتيدات المفردة (SNP)، مستوى معينًا من التنوع الجيني بين سلالات المتفطرة البقرية 31،32،33،34،35. وقد أصبح تمييز التباين الجيني أداةً مهمةً في دراسة وبائيات الأمراض، مما يُسهم في فهمٍ متعمقٍ لكيفية تطور المرض، وضراوته، وانتقاله. ويتيح ظهور طريقة WGS إمكانية الكشف عن العوامل التطورية الدافعة التي يفرضها جينوم المتفطرة البقرية في عملية التكيف والاستمرار مع مختلف العوائل والظروف الوبائية.
في هذا العمل، نستخدم التحليل الجينومي المقارن على مجموعات بيانات مختلفة من Mycoplasma bovis (n=70)، بما في ذلك العزلات من مجمعات استنساخية مختلفة، للحصول على رؤى حول العملية التطورية لـ Mycoplasma bovis، وخاصة لحل العلاقات التطورية وأحداث إعادة التركيب. كمكمل لهذا التحليل، تم استكشاف مجموعة بيانات فرعية من عزلات M. bovis (n = 42) التي تم الحصول عليها من منطقة مرض السل متعدد المضيفين الموصوفة جيدًا في البرتغال 31،36 بشكل أكبر لاستنتاج عدم الهوية التوازن بين النسبة النسبية لاستبدالات النوكليوتيدات الحسية (dN) إلى المرادفة (dS)، بالإضافة إلى المساهمة التطورية للجينومات المحددة المذكورة في الأدبيات، وهي 37،38 تم الحصول عليها من قبل أسلاف MTBC من خلال HGT، وتشفير مكونات جين النظام 3R (إصلاح الحمض النووي والتضاعف وإعادة التركيب) 39. اختر الجينات التي تم الحصول عليها من خلال HGT لأنها قد تمثل تعدد الأشكال القديمة، لذلك من المتوقع أنها قد تحتوي على نسبة أعلى من التغييرات المرادفة. تم اختيار الجينات المدرجة في نظام 3R لأن الدراسات السابقة على سلالات المتفطرة السلية أشارت إلى انتقاءات سلبية/تنقية عامة تؤثر على هذه الجينات، وقد تلعب دورًا مهمًا في التطور 39. ويهدف هذا العمل أيضًا إلى استنتاج وجود أحداث إعادة تنظيم. لهذا السبب، ونظرًا لأن مجموعة بياناتنا من البرتغال لا تحتوي إلا على جينومات مجمع الاستنساخ الأوروبي 2 والسلالات التي لم تُحدد مجمع الاستنساخ، فقد قررنا تضمين بيانات الجينوم المتاحة للجمهور للحصول على صورة تمثيلية لجميع مجمعات الاستنساخ، وتحسين دقة النتائج وشموليتها.
يُركّز هذا العمل على 42 جينومًا مُسلسلًا حديثًا لميكوبلازما البقر من مشهد السل متعدد العوائل المتوطن في البرتغال (التفاصيل أدناه)، والتي وُصفت سابقًا من منظور وبائي36. ونظرًا لأن مجموعة البيانات من البرتغال لا تحتوي إلا على مُمثلين لمجمعي النسيلتين الأوروبيين والسلالات دون مُركبات مُحددة، فقد أُضيفت بيانات تسلسل الجينوم الكامل المتاحة للجمهور لتوسيع مجموعة البيانات التي تشمل جميع مُمثلي مُجمعات نسيلة ميكوبلازما البقر. لذلك، استُخدمت ثلاثة مصادر لبيانات تسلسل الجينوم الكامل في هذا العمل: تجميع الجينوم الكامل/مسودة، ما يصل إلى 10 هياكل مُخزنة في المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) (عدد = 15 عينة)؛ والمُخزنة في SRA (ملف Illumina fastq لأرشيف قراءة التسلسل) الذي يُمثل التنوع المُعقد لنسيلات ميكوبلازما البقر (عدد = 12 عينة)30؛ و42 جينومًا مُسلسلًا حديثًا من البرتغال. تم استبعاد المتفطرة البقرية BCG (عصية كالميت-غيران) من بحث المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI). عادةً ما يُستخدم المتفطرة البقرية AF2122/97 كجينوم مرجعي يُدرج في مجموعة البيانات. ونظرًا لعدم توفر تسلسل الجينوم الكامل الذي يمثله مركب الاستنساخ الأفريقي 1 للعامة، وقلة عدد الجينومات من السلالات الممثلة لسلالات Af2 وEu1، فقد استُخدمت بيانات التسلسل الأصلية التي قدمتها SRA في هذه الحالات. وقد ساعد عمل زيمبل وزملائه (2020) في تحديد الجينوم من مركب الاستنساخ المذكور، وساعد في اختيار المتفطرة البقرية لإدراجها في مجموعة البيانات. أما بالنسبة لمركب Eu3، فقد وُصف نوع واحد فقط من الجينوم (برانغر وآخرون، 2020)، لذا فإن الجينوم الذي نُدرجه هو ممثل منفصل لمركب Eu3.
عالميًا، تشمل مجموعة البيانات هذه 70 نوعًا من بكتيريا المتفطرة البقرية (Mycobacterium bovis) معزولة من 8 أنواع عوائل، موزعة في 12 دولة بين عامي 1985 و2016. 36 نوعًا منها مُصنّفة ضمن Eu2، و7 أنواع ضمن Eu1، ونوع واحد ضمن Eu3، و3 أنواع ضمن Af1، و4 أنواع ضمن Af2، و19 نوعًا لا تُنسب إلى أي مُركّب استنساخي (التفاصيل أدناه). المعلومات التفصيلية (بما في ذلك رقم الانضمام) لبكتيريا المتفطرة البقرية المستخدمة في هذه الدراسة مُوضّحة في الجدول 1 والجدول التكميلي 1.
42 جينومًا كاملاً مُتسلسلًا حديثًا لبكتيريا المتفطرة البقرية من بؤر السل الحيوانية في البرتغال، موزعة منذ أكثر من 12 عامًا، هي محور هذه الدراسة، حيث رُصدت أنظمة أمراض الحياة البرية والثروة الحيوانية المحتملة بانتظام 31،36 (الشكل التكميلي 1). ووفقًا للإجراءات اللاحقة، عُزلت هذه السلالات من الماشية (ن = 14)، والأيل الأحمر (ن = 16)، والخنزير البري (ن = 12) من عام 2003 إلى عام 2015: اجمع الحيوانات وتعامل معها وفقًا لإرشادات البروتوكول الموصى بها. توجد عينات الأنسجة في دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان للحيوانات البرية، وقد تم تطعيمها على وسط صلب وسائل من بيروفات ستونبرينك ولوينشتاين-جينسن. تُحضن المزارع عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ويُفحص نموها مرة واحدة أسبوعيًا لمدة 12 أسبوعًا على الأقل. تُخزن المستعمرات مباشرة في محلول جلسرين عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. في وسط Mycobacterium الانتقائي (Middlebrook 7H9، BD Diagnostics)، مُرّت العينات الأصلية المؤرشفة عبر ممر واحد في المختبر للحصول على الحمض النووي لبرنامج WGS. ولهذا الغرض، أُثري محلول المزرعة المجمد بنسبة 5% بيروفات الصوديوم و10% ADS (50 غ ألبومين، 20 غ جلوكوز، 8.5 غ كلوريد صوديوم في لتر واحد من الماء) على Middlebrook 7H9 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد 4 أسابيع من النمو، جُدّد الوسط، ورُصدت المزرعة بانتظام حتى لوحظ النمو. جُمعت الخلايا بالطرد المركزي، وأُعيد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من محلول ملحي فوسفاتي منظم (PBS)، وسُخّنت عند درجة حرارة 99 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وطُردت مركزيًا، وخُزن السائل العلوي عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى برنامج WGS. تُنفّذ جميع الإجراءات في مرافق السلامة البيولوجية من المستوى 3.
أُعِدَّت مكتبة جينوم WGS ثنائية النهاية باستخدام الفهرس الفريد لكل عينة من الحمض النووي، وباستخدام تقنيتي Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 عينة) وHiSeq (2 × 150 pb) (عزلتين) (من Eurofins Genomics، ألمانيا) للتسلسل. وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، استخدم جهاز تحليل الجينوم Illumina المزود بملحق وحدة ذي طرفين لتسلسل الحمض النووي الجينومي، واستخدم مجموعة تحضير مكتبة Nextera XT DNA من Illumina لإنشاء المكتبة.
مع الأخذ في الاعتبار البيانات المسترجعة من SRA (عددها 12)، يمكن استخدام تحديد مُركب الاستنساخ كبيانات وصفية للمنشور المقابل 30، 41، 43. عند دراسة الجينوم الكامل، باستثناء Mycobacterium bovis AF2122/97 وMycobacterium bovis 3601، وهما عضوان مُعترف بهما في مُركب Eu1 وEu3 النسيلي 25، 29 على التوالي، فإنه يُطابق الجينوم الكامل لـ Mycobacterium tuberculosis H37Rv (رقم دخول NCBI NC_000962.3). تُجرى محاذاة الجينوم باستخدام MAFFT (برنامج محاذاة متعددة لتسلسل الأحماض الأمينية أو النوكليوتيدات، الإصدار 7.458) والمُعامل -addfragments48. بعد ذلك، ابحث عن غياب مُركبات استنساخية مُختلفة و/أو وجود سمات SNP.
تم تسلسل Mycobacterium bovis حديثًا (n = 42) والقراءات الأصلية لمسودة الجينوم المجمعة (n = 3) بحيث تتوافق المجمع مع الجينوم المرجعي Mycobacterium tuberculosis H37Rv من خلال خط أنابيب vSNP ووجود ميزات الحذف و/أو SNP للاستنساخات المختلفة وتم إجراء بحث.
اجمع معلومات من غياب السمات و/أو وجود/غياب أنماط النوكليوتيدات أحادية النوكليوتيدات (SNPs) وأنماط التكاثر الجينومي (spoligotyping) لتعيين البيانات الجينومية للمركب النسيلي المقابل. بالنسبة لمجموعات المسودة الأربع، لا يمكن استنتاج نمط التكاثر الجينومي (spoligotyping)، لذا تُدرج ضمن مجموعة "بدون تعقيد".
يبدأ سير عمل المعلوماتية الحيوية الذي يتبعه هذا العمل من التجميع والتخطيط المبدئي وصولاً إلى استراتيجية مرجعية، بهدف استكشاف أحداث إعادة التركيب وتعدد أشكال الجينوم المحددة. يوضح الشكل 1 مخططًا انسيابيًا للخطوات المتبعة. لتحليل إعادة التركيب، تُستخدم جميع الجينومات لزيادة دقة الاستدلالات والمؤشرات ذات الصلة.
لتقليل الأخطاء في توليد تسلسلات توافق الجينوم، حصلنا أولًا على تجميع جديد، ثم على محاذاة متعددة للجينومات. يتوفر خط أنابيب Unicycler حاليًا على الرابط https://github.com/rrwick/Unicycler49، ويُستخدم لإجراء تجميع جديد لـ 54 جينومًا متسلسلًا (42 جينومًا متسلسلًا حديثًا و12 ملفًا من ملفات fastq المستردة من SRA). باختصار، قبل التجميع من الصفر، أُجري تحليل جودة القراءة في FastQC الإصدار 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC)، وTrimmomatic الإصدار 0.36 (يُطبّق خيار "قطع المحولات وتسلسلات الإضاءة الأخرى من القراءات" و"قطع القواعد من نهاية القراءة، إذا كانت الجودة أقل من حد 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. بعد ذلك، استُخدم مُحسِّن SPAdes49 لتجميع الجينوم، واستُخدم Pilon الإصدار 1.1851 لتحسين ما بعد التجميع. اختُير وضع جسر مُحافظ لتجنب التجميع غير الصحيح، وتم البحث عن حجم k-mer واختياره بين 20% و95% من طول القراءة. اتبع إرشادات SPAdes وخذ بعين الاعتبار حجم القراءة، واحذف الأجزاء المتجاورة التي يقل حجمها عن 300 زوج قاعدي، وحدد حد تغطية عمق القراءة 20 وهو 52. في استراتيجية التجميع الجديدة، لم تتم إزالة المناطق الجينومية مثل نظائر البرولين-غلوتامات (PE) والبرولين-غلوتامات البرولين (PPE) المتكررة للغاية.
يتم تقييم جودة التجميع الجديد من خلال خط أنابيب QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html)، والذي يسهل تجديد الخريطة الجينية المرجعية لـ M. bovis AF2122/97 (رقم الوصول NCBI LT708304.1) (انظر الجدول التكميلي 1 لمعلمات الجودة).
بمساعدة خط أنابيب vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP)، يُقارن ملف FASTQ لجينوم M. bovis المُتسلسل حديثًا من تسلسل Illumina مع جينوم M. bovis المرجعي AF2122/97 (LT708304.1). وفقًا لتوصيات أفضل الممارسات لمجموعة أدوات تحليل الجينوم (GATK) 53، 54، 55، تُطبق معلمات التصفية القياسية أو درجات كتلة المتغيرات لإعادة المعايرة. تُرشح النتائج باستخدام أقل درجة كتلة SAMtools وهي 150 وAC = 2. كما يُستخدم Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) للتحقق من القراءات واستبعاد التلوث. يفحص خط أنابيب vSNP المستخدم لربط استراتيجيات التسلسل في عملنا سلسلة من SNPs والأهداف المحددة، ويستبعد أيضًا سيناريوهات العدوى المختلطة. تغطية الجينوم المقروءة أفضل من 99% (الجدول التكميلي 1).
لتجنب أخطاء رسم الخرائط و SNPs الخاطئة، قم بتصفية المتغير في الحالات التالية: (1) يدعمه أقل من 20 قراءة، (2) يوجد بتردد أقل من 0.9، (3) يوجد في سلالة واحدة على الأقل، ولكن على الأقل توجد فجوات في سلالة أخرى. تم استخدام عارض الجينوم المتكامل (IGV) الإصدار 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 للتحقق بصريًا من SNPs والمواقع ذات مشاكل رسم الخرائط أو المحاذاة. نظرًا لأن جينات البرولين-غلوتامات (PE) والبرولين-غلوتامات البرولين (PPE) مكررة للغاية وتشكل جزءًا من عائلة متعددة الجينات، فمن السهل إساءة فهمها من خلال تسلسل Illumina وخطأ رسم الخرائط، لذلك فهي مفضلة. أزال سير عمل المعلوماتية الحيوية للبكتيريا الفطرية أعضاء مجمع السل عند استخدام استراتيجية رسم الخرائط للتسلسل لتأكيد SNPs. لذلك، قمنا بتصفية جينات PE/PPE والحذف والإدراج من التحليل.
وفقًا لموقع Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/)، تُقسّم جميع تعددات النوكليوتيدات أحادية الشكل (SNPs) إلى فئات وظيفية. يُستخدم خط أنابيب SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) لاستنتاج نتائج تعددات النوكليوتيدات أحادية الشكل (SNPs) (التغيرات المترادفة وغير المترادفة). أُنشئت قاعدة بيانات جديدة لجينوم Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
أُجريت عملية محاذاة الجينوم الأساسي المتعددة باستخدام Parsnp v1.2، المتوفر حاليًا على الرابط https://github.com/marbl/parsnp57، باستخدام 69 جينومًا/مسودة تجميعية كاملة (مع الخيار -c)، واستُخدمت M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) كمرجع. أُجريت أربع عمليات محاذاة متعددة للجينوم الأساسي: فقط أعضاء مجمع الاستنساخ Eu2 (ن = 37)، بما في ذلك جميع أعضاء مجمع الاستنساخ الأوروبي (ن = 44)، بما في ذلك نقطة التقاء مجمع الاستنساخ الأوروبي والأفريقي (ن = 51)، وتشمل جميع أنواع Mycobacterium bovis في هذه الدراسة (ن = 70).
يتم استخدام المحاذاة الأساسية التي تم إنشاؤها بواسطة Parsnp لاستنتاج شجرة النشوء والتطور ذات الاحتمالية القصوى (ML) باستخدام CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 باستخدام RAxML، وإجراء 1000 تكرار موجه.
يتم استخدام ثلاث خوارزميات وأدوات معلوماتية حيوية مختلفة للتحقق من وجود أحداث إعادة التركيب بالتوازي: برنامج SplitsTree4، وخط أنابيب Gubbins (السلالة غير المتحيزة من خلال إعادة التركيب في تسلسلات النوكليوتيدات)، وبرنامج RDP4 (برنامج الكشف عن إعادة التركيب، الإصدار التجريبي 4.101).
تُستخدم طريقة التحليل المنقسم المُطبّقة في SplitsTree4 الإصدار 4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 لحساب الشبكة التطورية عديمة الجذور، باستخدام اختبار فاي للتحقق الإحصائي، وعتبة الدلالة هي p = 0.05. ويُستخدم تحليل المحاذاة المتعددة الأساسي لـ Parsnp كمدخل، ويُطبّق التحليل المنقسم كمعيار للشبكة.
يتم تشغيل خط أنابيب Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 باستخدام المعلمات الافتراضية كطريقة أخرى لتقييم تأثير إعادة التركيب على Mycobacterium bovis. تعمل الخوارزمية المطبقة في خط الأنابيب على إعادة بناء سلالة الاستنساخ ذات الصلة. التجميع الكامل للجينوم / المسودة لمجموعة البيانات الخاصة بنا والجينوم المرجعي (bovine bovid AF2122 / 97، LT708304.1) متبادل؛ ومسح موضع SNP على كل فرع من فروع الشجرة للكشف عن مجموعة SNP التي تمثل حدث إعادة التركيب. صفر الفرع افترض أنه لا يوجد حدث إعادة تركيب، مما يعني أنه يجب توزيع SNPs التي تحدث على الفرع بالتساوي. يتم استخدام محاذاة متعددة أساسية من Parsnp وأفضل شجرة ML من RAxML كملفات إدخال.
أخيرًا، لتأكيد حدث إعادة التنظيم المقترح من خلال خط أنابيب غوبينز، تُطبّق الخوارزميات الست المُنفّذة في RDP467 (RDP61، GENECONV62، Bootscan63، Maxchi64، Chimaera65، وSiScan66) على محاذاة Parsnp الأساسية المتعددة ضمن الإعدادات الافتراضية. وقد تبيّن لنا أن ثلاثًا على الأقل من الخوارزميات المُنفّذة في RDP4 يجب أن تُظهر باستمرار إشارة مهمة للتحقق من كل حدث إعادة تركيب.
بما أن كلاً من برنامجي Gubbins وRDP يبحثان عن إشارات إعادة التركيب الجيني من خلال فحص محاذاة النواة المتعددة في نافذة زمنية تصل إلى 500 زوج قاعدي، والتأكد من أن تضمين جينات PE/PPE أثناء التجميع الجديد لن يتداخل مع إشارات إعادة التركيب الجيني المُكتشفة، يُجرى تحليل إضافي باستخدام فحص التجانس الخطي لتحديد موقع الجين المُحدد لحدث إعادة التركيب الجيني. بُنيت خريطة التجانس الخطي باستخدام الجينوم الكامل باستخدام محاذاة MAUVE متعددة الجينوم (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) لاستبعاد انتقالات أو انعكاسات الجينوم المحلية. بالإضافة إلى ذلك، استُخدم الجينوم الكامل لإجراء تحليل التجانس الخطي على تسلسل الأحماض الأمينية من خلال خادم الويب SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
يهدف تحليل أكثر تعمقًا لمجموعة بيانات الجينوم المُستقاة من نظام السل متعدد المضيفات البرتغالي إلى التحقق من تعدد أشكال الجينات المذكورة في المراجع. هذه الجينات هي 37 و38، والجين المُشفِّر لـ 3R المُستقاة من أسلاف MTBC من خلال مكونات نظام HGT (إصلاح الحمض النووي، والتضاعف، وإعادة التركيب) 39. استخدم ClustalX الإصدار 2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) وDnaSP الإصدار 6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) لحساب تنوع الجينات وتنوع النوكليوتيدات (π) ومدخلات معامل اختبار Tajima D المحايد.
تم الحصول على شجرة تطورية ذات احتمالية قصوى (ML) استنادًا إلى 69 عينة وجينومًا مرجعيًا من بكتيريا Mycoplasma bovis (الشكل 2أ). بالمقارنة مع الأشجار أحادية الجين أو متعددة المواقع، تسمح هذه الاستراتيجية بتوليد أشجار أكثر فعالية لا تعكس تباين الجينوم بأكمله، وبالتالي تُظهر قدرة أقل على التمييز بين الأنواع 68،69. عادةً ما يتوافق الهيكل الطوبولوجي لشجرة الاحتمالية القصوى مع التصنيف المعقد للاستنساخات. يتجمع جينوم Eu2 في فرع، ويتجمع جينوم Af1 أيضًا معًا (الشكل 2أ). تتوافق النتيجة أيضًا مع العلاقة التطورية المعروفة لبكتيريا Mycobacterium bovis، أي أن هناك فرقًا كبيرًا بين عضو Eu1 والمجموعة التي تتكون من جميع المعقدات والجينومات الاستنساخية الأخرى، ولكن المركب الاستنساخي 30 غير محدد. يمكن تفسير التناقض البسيط بين المركب الاستنساخي والعلاقة الملحوظة في الشجرة التطورية من خلال حقيقة أن المركب الاستنساخي موصوف على أساس مناطق جينومية محددة، في حين أن الشجرة التطورية تعتمد على محاذاة متعددة من الجينومات الأساسية التي تمثل الجينوم بأكمله.
تُبنى شجرة النشوء والتطور ذات الاحتمالية القصوى (GTR) بناءً على محاذاة الجينوم الأساسي لجينوم المتفطرة البقرية قبل (أ) وبعد (ب) إزالة موقع إعادة التركيب. تُمثل ألوان الفروع مُركب استنساخ المتفطرة البقرية: أوروبا 1 بنفسجي، وأوروبا 2 أحمر، وأوروبا 3 أزرق، وأفريقيا 1 برتقالي، وأفريقيا 2 أخضر. تُرسَم الشجرة وتُرسم وفقًا لمقياس الرسم، ويُقاس طول الفرع كبديل لكل موقع.
يُوصف مجمع المتفطرة السلية بأنه متطور استنساخيًا، ومعظم الأدلة المتراكمة على مر السنين تدعم فكرة أن أحداث HGT وإعادة التركيب المستمرة لن تحدث على المستوى القابل للكشف من MTBC15،17،18.
أظهرت الأعمال السابقة أنه قد يكون هناك إعادة تركيب محدودة بين سلالات MTBC20،21، بينما فشل آخرون في تحديد أحداث إعادة التركيب القابلة للقياس70،71. أعد مناقشة هذه المشكلة مع التركيز على Mycobacterium bovis، وهو ما يختلف عن العمل السابق الذي نظر فقط في Mycobacterium tuberculosis 70،71؛ أو النظر في MTBC ككل، مع عدم وجود M. bovis تقريبًا يمثل 20؛ أو النظر فقط في كسور الماشية التقييدية. تحتوي مجموعة بيانات المتفطرات، في هذا العمل، على ما مجموعه 70 سلالة، تمثل جميع المجمعات الاستنساخية، المستخدمة لفحص إعادة التركيب. يتم قياس مجموعة البيانات وفقًا لأربعة مستويات تراكمية: (1) أعضاء Eu2، (2) جميع أعضاء مجمع الاستنساخ الأوروبي (أي أوروبا)، (3) مجمع الاستنساخ الأوروبي والأفريقي (Eu + Af) و(4) مجموعات البيانات بأكملها (بما في ذلك الجينومات غير المضمنة في أي مجمعات استنساخ موصوفة بالفعل).
لدراسة هذه الفرضية بشكل أعمق، أُجريت شبكة تحلل منقسم لتقييم غياب أحداث إعادة التركيب الجيني بين الجينومات، لأن هذه الطريقة تُمكّن من تصوّر العلاقة السلفية بين الأفراد وعرض إشارات تطورية متضاربة. أكدت مجموعات البيانات الأربع في التحليل وجود حلقات في الشبكة (أي مناطق لا تتقارب في شجرة واحدة)، إلا أن اختبار فاي لا يدعمه إحصائيًا (Eu2، p = 0.0956؛ Europe، p = 0.1637؛ Eu + Af p = 0.2774؛ مجموعة البيانات بأكملها p = 0.2451)، مما يُقدم دليلًا ضعيفًا على وجود أحداث إعادة التنظيم (الشكل 3أ-د).
في أوروبا 2 جينوم (ن = 37) (أ)، الجينومات الأوروبية (ن = 44) (ب)، الجينومات الأوروبية والأفريقية (ن = 51) (ج) ومجموعة البيانات بالكامل (ن = 70) (د).
بعد هذا التحليل، ومع مراعاة الملاحظات الدورية في جميع الشبكات، طُبقت خوارزمية إعادة البناء المُطبقة في خط أنابيب غوبينز لإعادة بناء السلالة الاستنساخية ولتكملة تقدير تأثير إعادة التركيب على جينوم م. بوفيس. استنتج العدد التراكمي لأحداث إعادة التركيب، والتي حدث معظمها في الفروع الطرفية (أي في جينوم واحد) (الجدول 2). تُظهر هذه المؤشرات اتساق مجموعة البيانات بأكملها، وتشير إلى أن تواتر أحداث إعادة التركيب يتراوح بين 200 و300 ضعف تواتر الطفرات. بمجرد أن يبدو أن معامل رو/ثيتا الذي يمثل المعدلات النسبية لإعادة التركيب والطفرات النقطية على الفرع يتراوح بين 0.0037 و0.0056 (الجدول 3). في الآونة الأخيرة، أظهر العمل المنشور لسلالة M. bovis 38 قيمة rho/theta أعلى (rho/theta = 0.1) من تلك التي تم الحصول عليها في هذه المجموعة من البيانات، ولكن عمل Patané وزملائه استخدم التجميع المستند إلى المرجع لاستنتاج معلمات إعادة التركيب، وقد ارتبطت تفاصيل إجرائية، بسبب إجراء التجميع، بوفرة أحداث إعادة التركيب المفترضة في الفرع الطرفي.
بعد ذلك، يمثل معامل r/m نسبة التنوع لإعادة التركيب وإدخال الطفرة، ويتراوح متوسط قيمته بين 0.025 و0.037، مما يشير إلى أنه بالمقارنة مع الطفرات، فإن إعادة التركيب لها تأثير إجمالي أقل على التنوع الجيني لـ M. bovis (الجدول 3)). وللمقارنة الشاملة، تم استخدام طريقة مماثلة لتقدير معامل r/m لمجموعة بيانات MTBC المكونة من 23 جينومًا، والتي تُظهر قيمة متوسطة قدرها 0.48620، بينما بالنسبة لمجموعة بيانات Patané وزملائه البالغ عددها 38 M. bovis، فقد أثبتت أن القيمة المتوسطة هي 0.98. في الدراسة الأولى، تم تضمين جينومين فقط من أصل 23 جينومًا في عمل M. bovis (M. bovis BCG والسلالة المرجعية)، لذلك قد تكون القيمة التي تم الحصول عليها منحازة بسبب الإفراط في التعبير عن جينوم M. tuberculosis. في التقرير الثاني، استُعيدت مجموعات المتفطرة البقرية المُحللة بشكل رئيسي من الولايات المتحدة الأمريكية ومن مُضيفات الماشية. على النقيض من ذلك، تُمثل مجموعة بياناتنا المزيد من المواقع الجغرافية وأنواع المُضيفات، كما تُستخدم الجينومات المُجمّعة في مُركبات استنساخية مُختلفة ذات خصائص وراثية مُختلفة، مما يُحقق معرفة أعمق وأوسع بالمجموعات. تتوافق قيمة متوسط فرق r/m المُستقاة من مجموعة بياناتنا مع مفهوم أن درجة إعادة التركيب تختلف اختلافًا كبيرًا بين السلالات المُنسوبة إلى نفس النوع التصنيفي، لذا تُشير هذه النتائج إلى أن مُركب استنساخ المتفطرة البقرية قد يُظهر اختلافات في إعادة التركيب. يتوافق التأثير أيضًا مع ما اقترحه ديدلوت ومايدن72. ومع ذلك، فإن توسيع مجموعة البيانات هذه بشكل كبير من خلال تضمين عدد أكبر من جينومات المتفطرة البقرية سيُتيح توضيحًا أكبر لهذه النقطة. يُظهر كلٌ من مُعاملي r/m وrho/theta تباينًا بين الفروع، وهذه النتيجة تتوافق مع التقارير المُتعلقة بأنواع بكتيرية أخرى72،73.
أخيرًا، لتأكيد أحداث إعادة التنظيم التي حددها خط أنابيب غوبينز، استُخدمت ست خوارزميات مختلفة في برنامج RDP4 لاختبار مقارنات متعددة أساسية مختلفة بشكل مستقل. عالميًا، تم تأكيد أقل من نصف الأحداث التي حددها غوبينز بواسطة RDP4 (الجدولان 4 و5). بالنظر إلى مجموعة البيانات بأكملها، تم تأكيد ثلاثة أحداث إعادة تركيب، اثنان منها يتعلقان بعقد داخلية والآخر بجينوم واحد في فرع طرفي، حيث لم يكن من الممكن تحديد المركبات الاستنساخية (الجدولان 4 و5). قد يشير تحديد الأحداث في الفروع الطرفية إلى أن إعادة التركيب لا تزال جارية في سلالات M. bovis المعاصرة أو أن النتيجة غير صحيحة70. في منطقة إعادة التركيب الافتراضية هذه، تحتوي حوالي 20% من المواضع على نيوكليوتيدات غير محددة (N)، مما يؤثر على إشارة إعادة التركيب (الشكل التكميلي 2). بالإضافة إلى ذلك، تؤثر هذه المنطقة على جين rrs، الذي يُشفّر الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 16S، والذي يُتوقع أن يكون محفوظًا للغاية، لذا قد تكون إشارة إعادة التركيب المفترضة هذه ناتجة عن أخطاء في التسلسل أو سوء محاذاة. بعد ذلك، أُجريت محاذاة الجينوم الكامل بين Mb0003 وMycobacterium bovis AF2122/97، وتم تأكيد وجود نيوكليوتيدات وSNPs غير محددة، وبالتالي فإن المشاكل المحتملة المتعلقة بالمحاذاة الخاطئة لم تكن ناتجة عن المعلومات البيولوجية المُستخدمة في هذا العمل، بل ظهرت بعد تعلم البرنامج.
لم يتم العثور على فجوات أو نيوكليوتيدات غير محددة في مناطق إعادة التركيب للعقد الداخلية (الشكلان 4 و5). فيما يتعلق بهذه الأحداث، يحتوي أحدها فقط على جينوم Eu2 ويؤثر على جين pks12، الذي يشفر إنزيم بوليكيتيد سينثيز المحتمل؛ بينما تم تسجيل الآخر في جينوم Eu1 ويؤثر على جين narX الذي يشفر إنزيم اختزال النترات المحتمل (الجدول 4). بشكل عام، يُظهر تحليل إعادة التركيب وجود عدد محدود من شظايا إعادة التركيب ذات الدعم الإحصائي، وتشير المؤشرات المستنتجة إلى أن إعادة التركيب لها تأثير منخفض على سلالة M. bovis. من المتوقع أن تكون إشارة إعادة التركيب منخفضة، ولكن من المهم التمييز بين إشارة التطور الحقيقية والضوضاء الخلفية، وهي مهمة صعبة. لتقليل إشارة التشويش الناتجة عن التجميع المرجعي ومشكلات عدم التطابق 70 و71، جُمعت جميع الجينومات المتبقية، باستثناء الجينوم الكامل، من الصفر، وخضعت جودة التجميع للفحص والتأكد من خلال تحليل خط أنابيب QUAST (الجدول التكميلي 1). بالإضافة إلى ذلك، أُجريت سلسلة من التحليلات التكميلية لضمان متانة ودقة المسح الشامل. لذلك، قُيِّمت جودة تسلسل جينات narX وpks12 من خلال رسم خريطة القراءة مقابل Mycobacterium bovis AF2122/97. وتم تأكيد موضع SNP الموصى به في منطقة إعادة التركيب بتطبيق المعايير المذكورة في قسم الطريقة (20 قراءة على الأقل وتردد تغيير 0.9). تم تأكيد تعدد أشكال جين narX بشكل كامل في الجينومين (Mb1792361 وMb7240415؛ 2.3%) وجينومات جينوم pks12: Mb0891، Mb1711، Mb1789، Mb1870، Mb17046، Mb1756، وMb12. ومع ذلك، بالنسبة للجينوم Mb2043، لا تستوفي ستة من المواضع الثمانية معيار عمق القراءة لأن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) مدعوم بـ 17 قراءة كحد أقصى، وهو أقل من القيمة الحدية المحددة وهي 20. وبالتالي، يمكن تأكيد إعادة تركيب ستة جينومات (8.6%) في هذا الموقع من الجينوم (الشكلان 4 و5).
يؤثر التصور التفصيلي لمحاذاة منطقة إعادة التركيب لمجموعة بيانات المتفطرة البقرية على جين narX الذي يُشفِّر إنزيم اختزال النترات المُحتمل. لم يُعثر على أي فجوات أو نيوكليوتيدات غير مُحدَّدة في منطقة إعادة التركيب للعقد الداخلية. هذا الحدث مُسجَّل تحديدًا في جينوم Eu1. قُيِّمت جودة تسلسل جين narX من خلال رسم قراءات المتفطرة البقرية AF2122/97. يُرجى تأكيد موقع SNP المُوصى به في منطقة إعادة التركيب بتطبيق المعايير المذكورة في قسم الطريقة (20 قراءة على الأقل وتردد تغيير 0.9). تم تأكيد تعدد أشكال جين narX تمامًا في جينومي Mb1792361 وMb7240415 (2.3%).
تصوير تفصيلي لمحاذاة منطقة إعادة التركيب لمجموعة بيانات Mycoplasma bovis المؤثرة على جين pks12. لم يُعثر على أي فجوات أو نيوكليوتيدات غير محددة في منطقة إعادة التركيب للعقد الداخلية. فيما يتعلق بالحدث الذي يؤثر على جين pks12 الذي يُشفر إنزيم بوليكيتيد سينثاز، فإنه يحتوي فقط على جينوم Eu2. تم تقييم جودة تسلسل pks12 من خلال رسم خريطة قراءة Mycobacterium bovis AF2122/97. تأكد من موقع SNP الموصى به في منطقة إعادة التركيب بتطبيق المعايير المذكورة في قسم الطريقة (20 قراءة على الأقل وتردد تغيير 0.9). تم تأكيد تعدد أشكال الجينومات Mb0891، Mb1711، Mb1789، Mb1870، Mb1758، Mb2043، وMb1960 بشكل كامل.
تحتوي جينات PE وPPE على مناطق متكررة يسهل قراءتها بشكل خاطئ من خلال تسلسل Illumina ورسم الخرائط الخاطئة، لذلك عادةً ما تُحذف من سير عمل المعلوماتية الحيوية لأعضاء M. tuberculosis فقط عند استخدام استراتيجية رسم الخرائط للتسلسل. يعتمد استنتاج أحداث إعادة التركيب المطبقة في هذا العمل على التجميع الجديد دون تصفية PE/PPE. نعتقد أنه من خلال تطبيق ثلاث طرق وخوارزميات تكميلية مختلفة من خلال SplitsTree وخط أنابيب Gubbins وبرنامج RDP4، فإن الاستراتيجيات المطبقة متينة في معالجة وتصفية المناطق المعاد تنظيمها الناتجة عن إشارات الخطأ. ومع ذلك، من أجل استبعاد تداخل جين PE/PPE مع برنامجي Gubbins وRDP4 لتحديد مجموعات SNP، وبالتالي تحديد مناطق إعادة التركيب المقترحة للتأثير على جيني narX وpks12، تم فحص جوار هذه الجينات (الشكل التكميلي 3-5). في سلالة M. bovis AF2122/97، يُفصل جين narX بواسطة narK2 وMb1764c، بينما يُحاط pks12 بـ Mb2075c وMb2073c (الشكل التكميلي 3-5). تُوفر الخريطة المُولَّدة باستخدام خريطة MAUVE synline للجينوم الكامل معلومات حول حفظ تسلسل الجينات وإعادة ترتيبها، حيث تُظهر أربع كتل متوازية، ولا توجد أي علامات على انتقال الجينوم أو انعكاسه. بالإضافة إلى ذلك، أثبت تحليل التكامل مع تسلسل الأحماض الأمينية التشابه في جميع الجينومات الكاملة، ولم يُعثر على أي PE/PPE في المناطق المجاورة لـ narX أو pks12. بالنسبة لجينوم narX، يمتلك جينوم واحد (Mb0030) درجة ترادف أقل نظرًا لتحديد جين narX على أنه شظيتان (الشظيتان 1891 و1890). بالنسبة لـ pks12، وبسبب أوجه التشابه، أظهر كلٌّ من Mb0030 وMb003 درجات تآزر خطي أقل، بينما تم تحديد pks12 في قطعتين وثلاث قطع على التوالي، تمثل نطاقات مختلفة من البروتين (الشكل التكميلي 3-5). مع الأخذ في الاعتبار هذه المعلومات، وقيام كلٍّ من Gubbins وبرنامج RDP4 بإجراء التحليل، والتحقق من محاذاة النواة المتعددة لأقصى حد 500 زوج قاعدي في النافذة، تأكدنا من أن جين PE/PPE لن يتداخل مع إشارة إعادة التركيب التي تؤثر على narX وpks12.
على الرغم من أن إشارات إعادة التركيب التي تم اكتشافها في مجموعة البيانات هذه قد تعتبر متبقية، فمن الصحيح أنه لا يمكن استبعاد إعادة التركيب في M. bovis، لذلك يجب أن تظل موضوعًا لمزيد من التحليل، حيث يتم تسلسل الجينومات الكاملة من السيناريوهات الوبائية المختلفة إلى أهمية.
لم تؤد مقارنة الأشجار التطورية لـ ML التي تم الحصول عليها قبل وبعد تصحيح إعادة التركيب (الشكل 2أ، ب) إلى تغييرات كبيرة في العلاقة التطورية المستنتجة، وتم تجميع سلالات M. bovis في نفس المجموعة.
بعد ربط 42 قراءة متسلسلة حديثًا من M. bovis مع الجينوم المرجعي لـ M. bovis AF2122/97، تم الحصول على محاذاة SNP تحتوي على 1816 موضعًا متعدد الأشكال. تقع معظم SNPs (87.1%) في منطقة الترميز، وتُصنف الجينات المتأثرة وفقًا للفئات الوظيفية الموضحة في Bovilist (الشكل 6أ، ب). مع الأخذ في الاعتبار العدد الإجمالي للجينات في كل فئة وظيفية، أظهرت الجينات في فئة "استقلاب الدهون" عددًا أكبر من SNPs، تليها "جدار الخلية والعمليات الخلوية" و"الأيض والتنفس الوسيط"، مما يكشف عن وجودها في مرحلة تطور M. bovis.
تحليل هرمي لمجموعة بيانات M. bovis من البرتغال (ن = 42). العدد الإجمالي للنوكليوتيدات أحادية النوكليوتيدات المسجلة والجينات المتأثرة لكل فئة وظيفية (أ). العدد الإجمالي للتغيرات المترادفة وغير المترادفة المسجلة حسب الفئة الوظيفية (ب).
على الصعيد العالمي، متوسط نسبة dN/dS أفضل من 1.5، مما يشير إلى أن الضغط التطوري العالمي يهدف إلى التخلص من الحالة الأصلية، ويمثل خيارًا إيجابيًا (متنوعًا أو موجهًا) و/أو متساهلًا في التنقية. في فئات "الضراوة، وإزالة السموم، والتكيف"، و"تسلسلات الإدخال والعاثيات"، و"البروتينات التنظيمية"، فإن أكثر من ثلثي SNPs غير مترادفة (الشكل 6ب).
في جميع الفئات، توجد جينات ذات تعددات أحادية النوكليوتيدات المفردة (SNPs) متعددة، مما يؤدي إلى معدل طفرة متوسط (أي متوسط تعدد النوكليوتيدات المفردة لكل جين) أكبر من 1 (الشكل 6أ). يمتلك جين Pks12 (Mb2074c) الذي يحتوي على 15 تعددًا أحاديًا للنوكليوتيدات المفردة، وجين fas (Mb2553c) الذي يحتوي على 8 تعددات أحادية النوكليوتيدات المفردة، قيم طفرة أعلى. يشارك كلا الجينين في أيض الأحماض الدهنية. يُشفّر جين pks إنزيم بوليكيتيد سينثاز (PKS)، وهو إنزيم متعدد الوظائف يشارك في تخليق دهون جدار الخلية الفطرية 74،75. يُشفّر هذا الجين بولي ببتيد متعدد الوظائف يشارك في تخليق الميكوكيتيدات 74،76. يشارك جين fas في تخليق حمض الميكوليك. يلعب كلا الجينين دورًا مهمًا في التخليق الحيوي لجدار الخلية عند ملامسته للمضيف.
لدراسة تطور المتفطرة البقرية بمزيد من التفصيل، تم تحليل مجموعتين من الجينات المحددة. حددت أعمال منشورة سابقًا، باستخدام تركيب التسلسل وطرق النشوء والتطور، جينات اكتسبتها أسلاف بكتيريا المتفطرة البقرية من خلال نقل الجينات عالي الجينوم (HGT) قبل التنويع (37،38). هذه الجينات مُدرجة في الجدول التكميلي 2. تم تحليل توزيع SNP لـ 77 جينًا قد تكون مرتبطة بنقل الجينات عالي الجينوم، وتم تحديد 26 موقعًا متعدد الأشكال، والتي أدت في معظم الحالات (78%) إلى تغيرات غير مترادفة (NS) (الجدول التكميلي 2). أظهرت الأعمال السابقة على جينوم MTBC أن منطقة HGT المفترضة تُظهر نسبة SNP أعلى في NS مقارنةً ببقية الجينوم. إذا اعتقدنا أن مناطق إعادة التركيب هذه قد اكتسبتها أسلاف MTBC، وبالتالي، فإنها تُمثل تعدد الأشكال القديمة بشكل مفرط، فمن المتوقع أن تكون نسبة التغيرات المترادفة أعلى، لأنه من المتوقع القضاء على استبدالات NS عن طريق الانتقاء السلبي، لأن تغيرات الأحماض الأمينية قد تُغير وظيفة البروتين. لذلك، تشير نتائجنا إلى أن العواقب الوظيفية قد تنجم عن استبدال الجينات الشبيهة بـ HGT، مما يعكس أهميتها للتنوع الجيني التكيفي القيّم.
بالتوازي مع هذا التحليل، تم فحص الجينات المشفرة لمكونات نظام 3R (إصلاح الحمض النووي، والتضاعف، وإعادة التركيب) بدقة وفقًا للقائمة التي نشرها سابقًا دوس فولتوس وزملاؤه (2008)39. لا يمكن ملاحظة تبادل شظايا الحمض النووي المتطابقة بشكل مباشر، على الرغم من أنها قد تكون عملية متكررة عندما يتعلق الأمر بالبكتيريا وثيقة الصلة، كما هو الحال في مجموعة البيانات هذه؛ بالإضافة إلى ذلك، قد تكون هذه العملية هي المفتاح لطرق إصلاح الحمض النووي72، لذا تلعب دورًا في إعادة التركيب المتماثل. تم تحديد ما مجموعه 26 موضعًا متعدد الأشكال موزعة على 54 جينًا (الجدول التكميلي 3). في هذه المجموعة من الجينات، شكلت تغييرات NS حوالي 65٪ من النتائج، وهو ما يتفق مع التقارير السابقة عن سلالات المتفطرة السلية.
وقت النشر: ٢١ أكتوبر ٢٠٢١