Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη για CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε μια νεότερη έκδοση του προγράμματος περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Ταυτόχρονα, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα εμφανίζουμε ιστότοπους χωρίς στυλ και JavaScript.
Η αλληλούχιση του γονιδιώματος έχει αναζωογονήσει τον τομέα της έρευνας για τις μολυσματικές ασθένειες, αποκαλύπτοντας την επιδημιολογία των ασθενειών, την παθογένεση, τις αλληλεπιδράσεις ξενιστή-παθογόνου και την εξελικτική διαδικασία που επιβάλλεται στα παθογόνα. Το σύμπλεγμα Mycobacterium tuberculosis (MTBC) θεωρεί το Mycobacterium bovis ως ένα από τα προσαρμοστικά μέλη του στα ζώα που προκαλούν φυματίωση (TB) στα χερσαία θηλαστικά και αποτελεί ένα τυπικό μοντέλο βακτηριακής εξέλιξης. Όπως και άλλα μέλη του MTBC, το Mycobacterium bovis θεωρείται ότι είναι ένα αυστηρά κλωνοποιημένο, αργά εξελισσόμενο παθογόνο και προφανώς δεν υπάρχει κανένα σημάδι ανασυνδυασμού ή οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων. Σε αυτή την εργασία, εφαρμόζουμε συγκριτική γονιδιωματική σε ένα σύνολο δεδομένων αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS) που αποτελείται από 70 βοοειδή M. από διαφορετικά γενεαλογικά δέντρα (Ευρώπη και Αφρική) για να αποκτήσουμε γνώσεις σχετικά με τη γενετική ποικιλομορφία των βοοειδών M. Εξελικτική δύναμη. Χρησιμοποιούνται τρεις διαφορετικές μέθοδοι για την εκτίμηση των σημείων αναδιοργάνωσης. Σε παγκόσμιο επίπεδο, ένας μικρός αριθμός συμβάντων ανασυνδυασμού έχει εντοπιστεί και επιβεβαιωθεί από δύο ανεξάρτητες μεθόδους με ισχυρή υποστήριξη. Παρ 'όλα αυτά, σε σύγκριση με τις μεταλλάξεις, ο ανασυνδυασμός έχει ασθενέστερη επίδραση στην ποικιλομορφία του M. bovis (συνολικό r/m = 0,037). Η διαφορά του μέσου όρου r/m που ελήφθη στο κλωνικό σύμπλεγμα του Mycobacterium bovis στο σύνολο δεδομένων μας είναι σύμφωνη με τη γενική ιδέα ότι ο βαθμός ανασυνδυασμού μπορεί να ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των γενεαλογικών γραμμών που αποδίδονται στο ίδιο ταξινομικό είδος. Με βάση αυτή την εργασία, ο ανασυνδυασμός στο Mycobacterium bovis δεν μπορεί να αποκλειστεί, επομένως θα πρέπει να αποτελέσει αντικείμενο περαιτέρω προσπαθειών σε μελλοντική συγκριτική γονιδιωματική έρευνα, στην οποία η WGS μεγάλων συνόλων δεδομένων από διαφορετικά επιδημιολογικά σενάρια σε όλο τον κόσμο είναι κρίσιμη. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μια πρόσθετη ανάλυση στο μικρότερο σύνολο δεδομένων Mycobacterium bovis (n = 42) από την επικράτηση της φυματίωσης πολλαπλών ξενιστών και εντοπίστηκαν περισσότεροι από 1.800 τόποι, εκ των οποίων τουλάχιστον ένα στέλεχος έδειξε έναν πολυμορφισμό ενός νουκλεοτιδίου (SNP). Οι περισσότερες (87,1%) βρίσκονται στην κωδικοποιητική περιοχή και η συνολική αναλογία μη συνώνυμων αλλαγών (dN/dS) των συνώνυμων αλλαγών υπερβαίνει το 1,5, υποδεικνύοντας ότι η θετική επιλογή είναι μια σημαντική εξελικτική δύναμη που ασκείται στο M. bovis. Ένα υψηλότερο ποσοστό SNPs ανιχνεύθηκε σε γονίδια πλούσια σε λειτουργικές κατηγορίες «μεταβολισμού λιπιδίων», «κυτταρικού τοιχώματος και κυτταρικών διεργασιών» και «ενδιάμεσου μεταβολισμού και αναπνοής», αποκαλύπτοντας τις δυνατότητές τους στη βιολογία και την εξέλιξη της σημασίας του Mycobacterium bovis. Μια πιο προσεκτική ματιά στα γονίδια στους προγόνους του MTBC που είναι επιρρεπή σε οριζόντια μεταφορά γονιδίων και περιλαμβάνονται στο σύστημα 3R (επιδιόρθωση, αντιγραφή και ανασυνδυασμός DNA) αποκαλύπτει τη συνολική μέση αρνητική τιμή της ουδέτερης δοκιμασίας D του Taijima, η οποία υποδηλώνει παρελθούσα επιλεκτική σάρωση. Το πρόσφατο σημείο συμφόρησης μετά την επέκταση του πληθυσμού εξακολουθεί να αποτελεί τον κύριο εξελικτικό παράγοντα που οδηγεί το υποχρεωτικό παθογόνο Mycobacterium bovis στην καταπολέμηση του ξενιστή.
Το σύμπλεγμα Mycobacterium tuberculosis (MTBC) είναι ένα από τα πιο επιτυχημένα taxa βακτηριακών παθογόνων και μια τυπική περίπτωση βακτηριακής εξέλιξης. Τα μέλη του εμφανίζουν εκπληκτικά υψηλή νουκλεοτιδική ταυτότητα σε γονιδιωματικό επίπεδο (> 99%)1,2. Διαφορετικοί οικοτύποι MTBC μπορούν να προκαλέσουν φυματίωση (TB), η οποία είναι μια λοιμώδης κοκκιωματώδης ασθένεια, σε ένα ευρύ φάσμα ειδών ξενιστών, από μικροθηλαστικά έως ανθρώπους3,4,5. Επί του παρόντος, το σύμπλεγμα περιλαμβάνει ανθρώπους [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] και παθογόνα προσαρμοσμένα σε ζώα (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" και "dassie")5,6. M. canettii (επίσης γνωστό ως "Nodobacter glabrata") Η μέση νουκλεοτιδική ταυτότητα με τα προαναφερθέντα μυκοβακτήρια είναι 98% και η συγκριτική γονιδιωματική εργασία έχει δείξει ότι το M. canettii και το υπόλοιπο MTBC έχουν πρόσφατα αποκλίνει από τον κοινό πρόγονο.7 Λαμβάνοντας υπόψη αυτήν την έννοια, ορισμένοι συγγραφείς αποκαλούν το M. canettii μέλος του MTBC 8.
Το MTBC περιγράφεται συστηματικά ως ένα αυστηρό κλωνικό σύμπλεγμα και η δομή του πληθυσμού του διέπεται σαφώς από μειωμένη ποικιλομορφία, σημεία συμφόρησης, επιλεκτική σάρωση και γενετική παρέκκλιση9,10. Υποθέτοντας ότι η σύνθετη αυστηρή κλωνική εξέλιξη, όπως οι ελλείποντες πολυμορφισμοί, δεν μπορεί να αποκατασταθεί με ανασυνδυασμό. Με βάση αυτή την προϋπόθεση, τα διαδοχικά γεγονότα της γονιδιωματικής διαγραφής της διαφορικής περιοχής (RD) και της TbD1 (περιοχή ειδικής διαγραφής 1 για το Mtb) έχουν προταθεί ως μοριακοί δείκτες της εξέλιξης του MTBC2,5,11. Η συγκριτική γονιδιωματική και η εργασία αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS) υποστηρίζουν τη διαίρεση των προσαρμοσμένων στον άνθρωπο μελών σε εννέα γενεαλογικές σειρές (Mycobacterium tuberculosis L1 έως L4, L7 και L8 και Mycobacterium africanum L5, L6 και L9), οι γενεαλογικές σειρές L2 έως L4 έχουν κοινή διαγραφή της περιοχής TbD12,11,12,13. Επιπλέον, προτείνεται ότι τα μέλη που είναι προσαρμοσμένα σε ζώα μοιράζονται έναν κοινό πρόγονο, ο οποίος ορίζεται από διαγραφές ειδικές για κάθε κλάδο στις RD7, RD8, RD9 και RD102, 5 και 14.
Τα συμβάντα οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων (HGT) και ανασυνδυασμού θεωρούνται σπάνια και συμβαίνουν στους προγόνους του MTBC, αντί για το διαφορετικό ιστορικό ολόκληρου του μέλους του MTBC15,16,17. Δύο πρώιμες αναφορές των Hughes και συνεργατών (2002) και Gutacker και συνεργατών (2006) υπέδειξαν ότι τα συμβάντα ανασυνδυασμού μπορεί να βοηθήσουν στη διαμόρφωση πολυμορφισμών που σηματοδοτούν συγκεκριμένους τόπους σε στελέχη M. tuberculosis18,19. Οι λόγοι για την προφανή έλλειψη ανασυνδυασμού στο MTBC είναι: (1) η μηχανική διαδικασία και η απώλεια της ικανότητας του HGT· (2) η σπανιότητα των συμβάντων HGT· (3) δεν υπάρχει πιθανότητα συμβάντων ανασυνδυασμού στην εξειδικευμένη περιοχή του MTBC14,17. Πρόσφατα, ορισμένες μελέτες αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS) που εφαρμόστηκαν στο στέλεχος MTBC 20 και στο Mycobacterium bovis 21 παρείχαν στοιχεία ανασυνδυασμού, οι πρώτες που δείχνουν ότι τα στελέχη MTBC συχνά ανταλλάσσουν μικρά θραύσματα DNA, αλλά λόγω της περιορισμένης διακύμανσης της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων, αυτά τα συμβάντα εξακολουθούν να μην παρατηρούνται.
Το Mycobacterium bovis είναι το πιο συχνά ανακτώμενο μέλος MTBC από ζώα (κυρίως βοοειδή), αν και μπορεί επίσης να απομονωθεί από άγρια ζώα ελεύθερης βοσκής και περιφραγμένα ζώα4,22,23,24. Το M. bovis εξελίχθηκε σε πέντε κύρια κλωνικά σύμπλοκα [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) και Africa 2 (Af2)], σύμφωνα με το προφίλ σπολιγοτυποποίησης, συγκεκριμένες διαγραφές και πολυμορφισμούς ενός νουκλεοτιδίου (SNPs)25, 26, 27, 28, 29 σε συγκεκριμένα γονίδια. Αυτά τα κλωνικά σύμπλοκα καταδεικνύουν την ποικιλόμορφη δομή του πληθυσμού Mycobacterium bovis και τη σύνδεσή του με γεωγραφικές περιοχές. Επιπλέον, η πρόσφατη εργασία WGS που πραγματοποιήθηκε από τον Zimpel και τους συνεργάτες του (2020) σχεδίασε μια φυλογένεση βασισμένη στο SNP του Mycobacterium bovis, με περισσότερα από 1.900 γονιδιώματα, υποδεικνύοντας ότι υπάρχουν τουλάχιστον τέσσερις διαφορετικές γενεαλογικές γραμμές (που ονομάζονται Lb1 έως Lb1 έως Lb4), οι οποίες δεν είναι απολύτως συμβατές με το προηγουμένως ορισμένο κλωνικό σύμπλεγμα, αν και μπορεί επίσης να επιβεβαιωθεί η γεωγραφική εξειδίκευση30. Αυτοί οι συγγραφείς πραγματοποίησαν διαφορική ανάλυση φυλογένεσης και μοριακής χρονολόγησης, αλλά δεν μελέτησαν τον ανασυνδυασμό30.
Προηγούμενη εργασία που χρησιμοποίησε διαφορετικές μοριακές τεχνικές, όπως η σπολιγοτυποποίηση, ο MIRU-VNTR (αριθμός επαναλήψεων διασποράς επαναλαμβανόμενης μονάδας-μεταβλητής σε σειρά μυκοβακτηρίων) και η πρόσφατη τυποποίηση SNP αποκάλυψαν ένα ορισμένο επίπεδο γενετικής ποικιλομορφίας μεταξύ των στελεχών του M. bovis 31,32,33, 34,35. Η διαφοροποίηση της γενετικής ποικιλομορφίας έχει γίνει ένα σημαντικό εργαλείο στη μελέτη της επιδημιολογίας των ασθενειών, το οποίο είναι χρήσιμο για την εις βάθος κατανόηση της παθογένεσης, της λοιμογόνου δράσης και της μετάδοσης των ασθενειών. Η εμφάνιση της μεθόδου WGS παρέχει τη δυνατότητα να αποκαλυφθούν οι εξελικτικοί παράγοντες που επιβάλλονται από το γονιδίωμα του Mycobacterium bovis στη διαδικασία προσαρμογής και επιμονής σε διαφορετικούς ξενιστές και επιδημιολογικά σενάρια.
Σε αυτήν την εργασία, χρησιμοποιούμε συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση σε διάφορα σύνολα δεδομένων Mycoplasma bovis (n = 70), συμπεριλαμβανομένων απομονωμένων στελεχών από διαφορετικά κλωνικά σύμπλοκα, για να αποκτήσουμε γνώσεις σχετικά με την εξελικτική διαδικασία του Mycoplasma bovis, ειδικά για την επίλυση φυλογενετικών σχέσεων και συμβάντων ανασυνδυασμού. Ως συμπλήρωμα αυτής της ανάλυσης, ένα υποσύνολο δεδομένων απομονωμένων στελεχών M. bovis (n = 42) που ελήφθησαν από μια καλά χαρακτηρισμένη περιοχή πολλαπλών ξενιστών φυματίωσης στην Πορτογαλία 31,36 διερευνήθηκε περαιτέρω για να συναχθεί η μη ταυτότητα. Η ισορροπία μεταξύ της σχετικής αναλογίας νοηματικών (dN) προς συνώνυμες (dS) υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων, καθώς και της εξελικτικής συμβολής συγκεκριμένων γονιδιωμάτων που αναφέρονται στη βιβλιογραφία, 37,38 λαμβάνονται από προγόνους MTBC μέσω HGT και κωδικοποιούν συστατικά γονιδίων του συστήματος 3R (επιδιόρθωση, αντιγραφή και ανασυνδυασμός DNA) 39. Επιλέξτε γονίδια που λαμβάνονται μέσω HGT επειδή μπορεί να αντιπροσωπεύουν αρχαίους πολυμορφισμούς, επομένως αναμένεται ότι μπορεί να περιέχουν υψηλότερο ποσοστό συνώνυμων αλλαγών. Τα γονίδια που περιλαμβάνονται στο σύστημα 3R επιλέχθηκαν επειδή προηγούμενη εργασία σε στελέχη M. tuberculosis έδειξε γενικές αρνητικές/καθαριστικές επιλογές που λειτουργούν σε αυτά τα γονίδια και μπορεί να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη 39. Ένας άλλος στόχος αυτής της εργασίας είναι να συμπεράνει κανείς την ύπαρξη συμβάντων αναδιοργάνωσης. Για το λόγο αυτό, λαμβάνοντας υπόψη ότι το σύνολο δεδομένων μας από την Πορτογαλία περιέχει μόνο τα γονιδιώματα του ευρωπαϊκού συμπλέγματος κλώνων 2 και τα στελέχη που δεν έχουν αντιστοιχίσει το σύμπλεγμα κλώνων, αποφασίσαμε να συμπεριλάβουμε δημόσια διαθέσιμα δεδομένα γονιδιώματος για να αποκτήσουμε τελικά έναν αντιπροσωπευτικό πίνακα όλων των συμπλεγμάτων κλώνων και να βελτιώσουμε την ευρωστία και το εύρος των αποτελεσμάτων.
42 πρόσφατα αλληλουχηθέντα γονιδιώματα Mycoplasma bovis από την ενδημική πορτογαλική σκηνή φυματίωσης πολλαπλών ξενιστών (λεπτομέρειες παρακάτω), τα οποία είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί από επιδημιολογική άποψη36, αποτελούν το επίκεντρο αυτής της εργασίας. Λαμβάνοντας υπόψη ότι το σύνολο δεδομένων από την Πορτογαλία περιλαμβάνει μόνο εκπροσώπους των 2 ευρωπαϊκών συμπλεγμάτων κλώνων και στελεχών χωρίς καθορισμένα σύμπλοκα, έχουν προστεθεί δημόσια διαθέσιμα δεδομένα αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος για την επέκταση του συνόλου δεδομένων που περιλαμβάνει όλους τους εκπροσώπους των συμπλεγμάτων κλώνων M. bovis. Επομένως, σε αυτή την εργασία χρησιμοποιήθηκαν τρεις πηγές δεδομένων αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος: πλήρης/προσχέδιο συναρμολόγησης γονιδιώματος, έως 10 ικριώματα αποθηκευμένα στο NCBI (Εθνικό Κέντρο Βιοτεχνολογικών Πληροφοριών) (n = 15 απομονωμένα στελέχη), αποθηκευμένα στο SRA (Το αρχείο Illumina fastq του αρχείου ανάγνωσης αλληλουχίας) αντιπροσωπεύει την πολύπλοκη ποικιλομορφία των κλώνων M. bovis (n = 12 απομονωμένα στελέχη)30 και 42 πρόσφατα αλληλουχηθέντα γονιδιώματα από την Πορτογαλία. Το Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) εξαιρέθηκε από την αναζήτηση NCBI. Το M. bovis AF2122/97 χρησιμοποιείται συνήθως ως γονιδίωμα αναφοράς που θα συμπεριληφθεί στο σύνολο δεδομένων. Λόγω της μη δημόσιας διαθεσιμότητας ολόκληρης της αλληλουχίας του γονιδιώματος που αντιπροσωπεύεται από το σύμπλεγμα κλωνοποίησης African 1 και του μικρού αριθμού γονιδιωμάτων από αντιπροσωπευτικά στελέχη Af2 και Eu1, σε αυτές τις περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν τα αρχικά δεδομένα αλληλούχισης που παρείχε η SRA. Το έργο του Zimpel και των συνεργατών του (2020) βοήθησε στην αναγνώριση του γονιδιώματος από το προαναφερθέν σύμπλεγμα κλωνοποίησης και βοήθησε στην επιλογή του Mycobacterium bovis για συμπερίληψη στο σύνολο δεδομένων. Για το Eu3, περιγράφεται μόνο ένας τύπος γονιδιώματος (Branger et al., 2020), επομένως το γονιδίωμα που συμπεριλαμβάνουμε είναι ένας ξεχωριστός εκπρόσωπος του συμπλέγματος Eu3.
Σε παγκόσμιο επίπεδο, αυτό το σύνολο δεδομένων περιλαμβάνει 70 βοοειδή M. bovis που απομονώθηκαν από 8 είδη ξενιστών, τα οποία κατανέμονται σε 12 χώρες από το 1985 έως το 2016. 36 είδη χαρακτηρίζονται ως Eu2, 7 είδη είναι Eu1, 1 είδος είναι Eu3, 3 είδη είναι Af1, 4 είδη είναι Af2 και 19 δεν αποδίδονται σε κανένα κλωνικό σύμπλεγμα (λεπτομέρειες παρακάτω). Οι λεπτομερείς πληροφορίες (συμπεριλαμβανομένου του αριθμού πρόσβασης) του Mycobacterium bovis που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 και στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.
42 πρόσφατα αλληλουχημένα ολόκληρα γονιδιώματα του Mycobacterium bovis από εστίες φυματίωσης ζώων στην Πορτογαλία και κατανεμημένα για περισσότερα από 12 χρόνια αποτελούν το επίκεντρο αυτής της μελέτης, καθώς τα πιθανά συστήματα ασθενειών άγριας ζωής-κτηνοτροφίας παρακολουθούνται τακτικά 31,36 (Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Σύμφωνα με τις επακόλουθες διαδικασίες, αυτά τα στελέχη απομονώθηκαν από βοοειδή (n = 14), ελάφια (n = 16) και αγριόχοιρους (n = 12) από το 2003 έως το 2015: συλλογή και χειρισμός των ζώων σύμφωνα με τις συνιστώμενες οδηγίες πρωτοκόλλου. Τα δείγματα ιστών βρίσκονται στο Εγχειρίδιο Χερσαίων Ζώων του OIE και εμβολιάζονται σε στερεό και υγρό μέσο πυροσταφυλικού οξέος Stonebrink και Löwenstein-Jensen. Οι καλλιέργειες επωάζονται στους 37 °C και η ανάπτυξη ελέγχεται μία φορά την εβδομάδα για τουλάχιστον 12 εβδομάδες. Οι αποικίες αποθηκεύονται απευθείας σε διάλυμα γλυκερόλης στους -80ºC. Στο επιλεκτικό μέσο Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), τα αρχικά αρχειοθετημένα δείγματα διήλθαν μέσω μίας μόνο in vitro διέλευσης in vitro για να ληφθεί το DNA του προγράμματος WGS. Για αυτό, το κατεψυγμένο διάλυμα παρακαταθήκης καλλιέργειας εμπλουτίστηκε με 5% πυροσταφυλικό νάτριο και 10% ADS (50 g αλβουμίνη, 20 g γλυκόζη, 8,5 g χλωριούχο νάτριο σε 1 L νερό) σε Middlebrook 7H9 στους 37°C Retrain. Μετά από 4 εβδομάδες ανάπτυξης, το μέσο ανανεώθηκε και η καλλιέργεια παρακολουθούνταν τακτικά μέχρι να παρατηρηθεί ανάπτυξη. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 500 µL αλατούχο διάλυμα φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS), θερμάνθηκε στους 99 °C για 30 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε και το υπερκείμενο αποθηκεύτηκε στους -20 °C μέχρι το WGS. Όλες οι διαδικασίες διεξάγονται σε εγκαταστάσεις βιοασφάλειας επιπέδου 3.
Η βιβλιοθήκη γονιδιώματος ζευγαρωμένων άκρων WGS παρασκευάζεται χρησιμοποιώντας τον μοναδικό δείκτη κάθε δείγματος DNA και χρησιμοποιεί την τεχνολογία Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 δείγματα) και HiSeq (2 × 150 pb) (δύο απομονωμένα στελέχη) (Eurofins Genomics, Γερμανία) για την αλληλούχιση. Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιήστε τον Αναλυτή Γονιδιώματος Illumina με προσάρτηση μονάδας διπλού άκρου για την αλληλούχιση του γονιδιωματικού DNA και χρησιμοποιήστε το Κιτ Προετοιμασίας Βιβλιοθήκης DNA Nextera XT από την Illumina για την κατασκευή της βιβλιοθήκης.
Λαμβάνοντας υπόψη τα δεδομένα που ανακτήθηκαν από το SRA (n = 12), η ταυτοποίηση του συμπλόκου κλώνου μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μεταδεδομένα της αντίστοιχης δημοσίευσης 30, 41, 43. Όταν εξετάζεται το πλήρες γονιδίωμα, εκτός από τα Mycobacterium bovis AF2122/97 και Mycobacterium bovis 3601, τα οποία είναι αναγνωρισμένα μέλη του κλωνικού συμπλόκου Eu1 και Eu3 25, 29, αντίστοιχα, είναι το ίδιο με το πλήρες γονιδίωμα του Mycobacterium tuberculosis H37Rv (αριθμός πρόσβασης NCBI NC_000962.3). Η ευθυγράμμιση του γονιδιώματος πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας το MAFFT (πρόγραμμα πολλαπλής ευθυγράμμισης αλληλουχίας αμινοξέων ή νουκλεοτιδίων, έκδοση 7.458) και την παράμετρο -addfragments48. Στη συνέχεια, αναζητήστε την απουσία διαφορετικών κλωνικών συμπλόκων ή/και την παρουσία χαρακτηριστικών SNP.
Η πρόσφατα προσδιορισμένη αλληλούχιση του Mycobacterium bovis (n = 42) και οι αρχικές αναγνώσεις του συναρμολογημένου προσχεδίου γονιδιώματος (n = 3) ευθυγραμμίζουν το σύμπλεγμα με το γονιδίωμα αναφοράς Mycobacterium tuberculosis H37Rv μέσω του αγωγού vSNP και την παρουσία χαρακτηριστικών διαγραφής ή/και SNP διαφορετικών κλώνων. Διεξήχθη αναζήτηση.
Συλλέξτε πληροφορίες από την έλλειψη χαρακτηριστικών ή/και την παρουσία/απουσία προφίλ SNP και σπολιγοτυπίας για να αντιστοιχίσετε γονιδιωματικά δεδομένα στο αντίστοιχο κλωνικό σύμπλεγμα. Για τα τέσσερα προσχεδιαζόμενα συγκροτήματα, το προφίλ σπολιγοτυπίας δεν μπορεί να συναχθεί, επομένως περιλαμβάνονται στην ομάδα "χωρίς πολυπλοκότητα".
Η ροή εργασίας βιοπληροφορικής που ακολουθείται από αυτήν την εργασία ξεκινά από τη de novo συναρμολόγηση και τη χαρτογράφηση σε μια στρατηγική αναφοράς, με στόχο την εξερεύνηση συμβάντων ανασυνδυασμού και συγκεκριμένων πολυμορφισμών γονιδιώματος. Το Σχήμα 1 παρέχει ένα διάγραμμα ροής των βημάτων που ακολουθούνται. Για την ανάλυση ανασυνδυασμού, όλα τα γονιδιώματα χρησιμοποιούνται για την αύξηση της ευρωστίας των συμπερασμάτων και των σχετικών δεικτών.
Προκειμένου να μειωθούν τα σφάλματα στη δημιουργία αλληλουχιών συναίνεσης γονιδιώματος, πρώτα πραγματοποιήσαμε de novo συναρμολόγηση και στη συνέχεια πολλαπλές ευθυγραμμίσεις πυρήνα. Ο αγωγός Unicycler είναι προς το παρόν διαθέσιμος στη διεύθυνση https://github.com/rrwick/Unicycler49 και χρησιμοποιείται για την εκτέλεση de novo συναρμολόγησης 54 αλληλουχισμένων γονιδιωμάτων (42 πρόσφατα αλληλουχισμένα και 12 αρχεία fastq που ανακτήθηκαν από το SRA). Εν ολίγοις, πριν από τη συναρμολόγηση από την αρχή, πραγματοποιήθηκε ανάλυση ποιότητας ανάγνωσης στο FastQC έκδοση 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) και στο Trimmomatic έκδοση 0.36 (εφαρμόζονται οι επιλογές "cutting Adapters and other lighting-specific sequences from reads" και "Cut bases from the end of the read, if lower than the threshold quality of 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το SPAdes optimizer49 για τη συναρμολόγηση του γονιδιώματος και το Pilon έκδοση 1.1851 για βελτιστοποίηση μετά τη συναρμολόγηση. Επιλέχθηκε μια συντηρητική λειτουργία γεφύρωσης για την αποφυγή λανθασμένης συναρμολόγησης και το μέγεθος k-mer αναζητήθηκε και επιλέχθηκε μεταξύ 20% και 95% του μήκους ανάγνωσης. Ακολουθήστε τις οδηγίες SPAdes και λάβετε υπόψη το μέγεθος ανάγνωσης, διαγράψτε τις συνεχόμενες γραμμές μικρότερες από 300 bp και καθορίστε ένα όριο κάλυψης βάθους ανάγνωσης 20 στα 52. Στη στρατηγική συναρμολόγησης de novo, οι γονιδιωματικές περιοχές όπως τα εξαιρετικά επαναλαμβανόμενα παράλογα προλίνης-γλουταμινικού (PE) και προλίνης-γλουταμινικού (PPE) δεν αφαιρέθηκαν.
Η ποιότητα της de novo συναρμολόγησης αξιολογείται μέσω του αγωγού QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), ο οποίος διευκολύνει την ανανέωση του contig και τη χαρτογράφηση του γονιδιώματος αναφοράς M. bovis AF2122/97 (αριθμός πρόσβασης NCBI LT708304.1) (βλ. Συμπληρωματικό Πίνακα 1 για παραμέτρους ποιότητας).
Με τη βοήθεια του αγωγού vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), το αρχείο FASTQ του πρόσφατα αλληλουχημένου M. bovis από την αλληλούχιση Illumina συγκρίνεται με το γονιδίωμα αναφοράς M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Σύμφωνα με τις συστάσεις βέλτιστης πρακτικής του Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, εφαρμόζονται τυπικές παράμετροι φίλτρου ή βαθμολογίες μάζας παραλλαγών για επαναβαθμονόμηση. Τα αποτελέσματα φιλτράρονται χρησιμοποιώντας τη χαμηλότερη βαθμολογία μάζας SAMtools 150 και AC = 2. Χρησιμοποιήστε επίσης το Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) για να ελέγξετε τις μετρήσεις για να αποκλείσετε τη μόλυνση. Ο αγωγός vSNP που χρησιμοποιείται για την αντιστοίχιση με στρατηγικές αλληλούχισης στην εργασία μας εξετάζει μια σειρά καθορισμένων SNP και στόχων και επίσης αποκλείει σενάρια μικτής μόλυνσης. Η κάλυψη του γονιδιώματος ανάγνωσης είναι καλύτερη από 99% (Συμπληρωματικός Πίνακας 1).
Για να αποφύγετε σφάλματα χαρτογράφησης και λανθασμένα SNPs, φιλτράρετε μια παραλλαγή στις ακόλουθες περιπτώσεις: (1) υποστηρίζεται από λιγότερες από 20 μετρήσεις, (2) βρίσκεται με συχνότητα μικρότερη από 0,9, (3) βρίσκεται σε τουλάχιστον ένα στέλεχος, αλλά τουλάχιστον υπάρχουν κενά σε ένα άλλο στέλεχος. Το ολοκληρωμένο πρόγραμμα προβολής γονιδιωματικής (IGV) έκδοση 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 χρησιμοποιήθηκε για την οπτική επαλήθευση SNPs και θέσεων με προβλήματα χαρτογράφησης ή ευθυγράμμισης. Δεδομένου ότι τα γονίδια προλίνης-γλουταμινικού (PE) και προλίνης-γλουταμινικού προλίνης (PPE) είναι σε μεγάλο βαθμό διπλά και αποτελούν μέρος μιας οικογένειας πολλαπλών γονιδίων, παρερμηνεύονται εύκολα από την αλληλούχιση και την εσφαλμένη χαρτογράφηση της Illumina, επομένως προτιμώνται. Η ροή εργασίας μυκοβακτηριακής βιοπληροφορικής αφαίρεσε μέλη του συμπλέγματος φυματίωσης κατά τη χρήση της στρατηγικής χαρτογράφησης για την αλληλούχιση για την επιβεβαίωση SNPs. Επομένως, φιλτράραμε τα γονίδια PE/PPE και τα indels από την ανάλυση.
Σύμφωνα με το Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), όλα τα SNPs χωρίζονται σε λειτουργικές κατηγορίες. Ο αγωγός SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) χρησιμοποιείται για την εξαγωγή συμπερασμάτων για τις συνέπειες των SNP (συνώνυμες ή μη συνώνυμες αλλαγές). Δημιουργήθηκε μια νέα βάση δεδομένων για το γονιδίωμα του Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Η πολλαπλή ευθυγράμμιση του κεντρικού γονιδιώματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Parsnp v1.2, το οποίο διατίθεται αυτήν τη στιγμή στη διεύθυνση https://github.com/marbl/parsnp57, χρησιμοποιώντας 69 πλήρη γονιδιώματα/σχεδιαγράμματα (με την επιλογή -c) και το M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) χρησιμοποιείται ως αναφορά. Πραγματοποιήθηκαν τέσσερις πολλαπλές ευθυγραμμίσεις πυρήνα: μόνο τα μέλη του συμπλέγματος κλωνοποίησης Eu2 (n = 37), συμπεριλαμβανομένων όλων των μελών του ευρωπαϊκού συμπλέγματος κλωνοποίησης (n = 44), συμπεριλαμβανομένου του σημείου σύνδεσης του ευρωπαϊκού και αφρικανικού συμπλέγματος κλωνοποίησης (n = 51), και περιλαμβάνουν όλα τα Mycobacterium bovis σε αυτή τη μελέτη (n = 70).
Η ευθυγράμμιση πυρήνα που δημιουργείται από το Parsnp χρησιμοποιείται για την εξαγωγή του φυλογενετικού δέντρου μέγιστης πιθανοφάνειας (ML) χρησιμοποιώντας το CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 χρησιμοποιώντας RAxML και για την εκτέλεση 1000 καθοδηγούμενων αντιγράφων.
Τρεις διαφορετικοί αλγόριθμοι και βιοπληροφορικά εργαλεία χρησιμοποιούνται για τον παράλληλο έλεγχο της παρουσίας συμβάντων ανασυνδυασμού: το λογισμικό SplitsTree4, το λογισμικό Gubbins (αμερόληπτη γενεαλογία μέσω ανασυνδυασμού σε αλληλουχίες νουκλεοτιδίων) και το λογισμικό RDP4 (πρόγραμμα ανίχνευσης ανασυνδυασμού, έκδοση beta 4.101).
Η μέθοδος διαχωριστικής αποσύνθεσης που εφαρμόζεται στο SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό του φυλογενετικού δικτύου χωρίς ρίζες, χρησιμοποιώντας το Phi test για στατιστική επαλήθευση, και το όριο σημαντικότητας είναι p = 0,05. Η βασική ανάλυση πολλαπλής ευθυγράμμισης του Parsnp χρησιμοποιείται ως είσοδος και πραγματοποιείται η διαχωριστική αποσύνθεση ως πρότυπο δικτύου.
Το Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) εκτελείται με προεπιλεγμένες παραμέτρους ως ένας άλλος τρόπος αξιολόγησης της επίδρασης του ανασυνδυασμού στο Mycobacterium bovis. Ο αλγόριθμος που εφαρμόζεται στο pipeline ανακατασκευάζει τη σχετική γενεαλογία κλώνων. Η πλήρης συναρμολόγηση γονιδιώματος/σχεδίου του συνόλου δεδομένων μας και το γονιδίωμα αναφοράς (βοοειδές βοοειδές AF2122/97, LT708304.1) είναι αμοιβαία αλληλένδετα και σαρώνουν τη θέση του SNP σε κάθε κλάδο του δέντρου για να ανιχνεύσουν το σύμπλεγμα SNP που αντιπροσωπεύει το συμβάν ανασυνδυασμού. Το μηδέν του κλάδου. Υποθέστε ότι δεν υπάρχει συμβάν ανασυνδυασμού, πράγμα που σημαίνει ότι τα SNP που εμφανίζονται στο κλάδο θα πρέπει να είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα. Η πολλαπλή στοίχιση πυρήνα από το Parsnp και το δέντρο ML με την καλύτερη βαθμολογία από το RAxML χρησιμοποιούνται ως αρχεία εισόδου.
Τέλος, για να επιβεβαιωθεί το συμβάν αναδιοργάνωσης που προτείνεται από τον αγωγό Gubbins, οι έξι αλγόριθμοι που υλοποιούνται στο RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 και SiScan66) εφαρμόζονται στην πολλαπλή στοίχιση πυρήνα του Parsnp υπό τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις. Διαπιστώσαμε ότι τουλάχιστον τρεις από τους αλγόριθμους που υλοποιούνται στο RDP4 πρέπει να επιδεικνύουν με συνέπεια ένα σημαντικό σήμα για την επαλήθευση κάθε συμβάντος ανασυνδυασμού.
Λαμβάνοντας υπόψη ότι τόσο το λογισμικό Gubbins όσο και το λογισμικό RDP αναζητούν σήματα ανασυνδυασμού ελέγχοντας τις πολλαπλές ευθυγραμμίσεις του πυρήνα σε ένα παράθυρο έως και 500 bp και επιβεβαιώνοντας ότι η συμπερίληψη γονιδίων PE/PPE κατά τη συναρμολόγηση de novo δεν θα επηρεάσει τα σήματα ανασυνδυασμού που βρέθηκαν, γίνεται περαιτέρω ανάλυση με ομογραμμικότητα. Ελέγξτε την εγγύτητα του γονιδίου που προσδιορίζει το συμβάν ανασυνδυασμού. Ο συνγραμμικός χάρτης που χρησιμοποιεί το πλήρες γονιδίωμα κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας την ευθυγράμμιση MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) για να αποκλειστούν οι τοπικές μετατοπίσεις ή αναστροφές γονιδιώματος. Επιπλέον, ολόκληρο το γονιδίωμα χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση ανάλυσης ομογραμμικότητας στην αλληλουχία αμινοξέων μέσω του διακομιστή ιστού SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Μια πιο εις βάθος ανάλυση του συνόλου δεδομένων γονιδιώματος που ελήφθη από το πορτογαλικό σύστημα πολλαπλών ξενιστών φυματίωσης είναι ο έλεγχος του πολυμορφισμού των γονιδίων που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Αυτά τα γονίδια είναι 37,38 και το γονίδιο που κωδικοποιεί το 3R ελήφθη από τους προγόνους MTBC μέσω των συστατικών του συστήματος HGT (επιδιόρθωση, αντιγραφή και ανασυνδυασμός DNA) 39. Χρησιμοποιήστε το ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) και το DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) για να υπολογίσετε την ποικιλομορφία γονιδίων και την ποικιλομορφία νουκλεοτιδίων (π) και την είσοδο παραμέτρων D-neutral test του Tajima.
Ένα φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανοφάνειας (ML) βασισμένο σε 69 απομονωμένα στελέχη και γονιδιώματα αναφοράς Mycoplasma bovis ελήφθη (Σχήμα 2Α). Σε σύγκριση με τα δέντρα που βασίζονται σε ένα μόνο γονίδιο ή τα δέντρα που βασίζονται σε πολλαπλές θέσεις, αυτή η στρατηγική επιτρέπει τη δημιουργία πιο ισχυρών δέντρων που δεν καταγράφουν τη μεταβλητότητα ολόκληρου του γονιδιώματος και επομένως εμφανίζουν χαμηλότερη ικανότητα διάκρισης μεταξύ ειδών 68,69. Η τοπολογική δομή του δέντρου ML είναι συνήθως συνεπής με την σύνθετη ταξινόμηση των κλώνων. Το γονιδίωμα του Eu2 ομαδοποιείται σε έναν κλάδο και το γονιδίωμα του Af1 ομαδοποιείται επίσης (Σχήμα 2Α). Το αποτέλεσμα είναι επίσης συνεπές με τη γνωστή εξελικτική σχέση του Mycobacterium bovis, δηλαδή, υπάρχει μεγάλη διαφορά μεταξύ του μέλους Eu1 και της ομάδας που αποτελείται από όλα τα άλλα κλωνικά σύμπλοκα και γονιδιώματα, αλλά το κλωνικό σύμπλοκο 30 δεν προσδιορίζεται. Η μικρή ασυνέπεια μεταξύ του κλωνικού συμπλέγματος και της σχέσης που παρατηρείται στο φυλογενετικό δέντρο μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι το κλωνικό σύμπλεγμα περιγράφεται με βάση συγκεκριμένες γονιδιωματικές περιοχές, ενώ το φυλογενετικό δέντρο βασίζεται σε πολλαπλές ευθυγραμμίσεις πυρηνικών γονιδιωμάτων που αντιπροσωπεύουν ολόκληρο το γονιδίωμα.
Το φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανοφάνειας (GTR) κατασκευάζεται με βάση την ευθυγράμμιση του κεντρικού γονιδιώματος του γονιδιώματος του Mycobacterium bovis πριν (Α) και μετά (Β) την αφαίρεση της θέσης ανασυνδυασμού. Τα χρώματα των κλαδιών αντιπροσωπεύουν το σύμπλεγμα κλώνων Mycobacterium bovis: η Ευρώπη 1 είναι μοβ, η Ευρώπη 2 είναι κόκκινη, η Ευρώπη 3 είναι μπλε, η Αφρική 1 είναι πορτοκαλί και η Αφρική 2 είναι πράσινη. Το δέντρο έχει ρίζες και σχεδιάζεται σε κλίμακα, και το μήκος του κλαδιού μετριέται ως αντικατάσταση για κάθε θέση.
Το σύμπλεγμα Mycobacterium tuberculosis περιγράφεται ως κλωνικά εξελιγμένο και τα περισσότερα από τα στοιχεία που έχουν συσσωρευτεί με την πάροδο των ετών υποστηρίζουν την ιδέα ότι τα συνεχιζόμενα συμβάντα HGT και ανασυνδυασμού δεν θα εμφανιστούν στο ανιχνεύσιμο επίπεδο του MTBC15,17,18.
Προηγούμενες εργασίες έχουν δείξει ότι μπορεί να υπάρχει περιορισμένος ανασυνδυασμός μεταξύ στελεχών MTBC20,21, ενώ άλλες δεν έχουν καταφέρει να εντοπίσουν μετρήσιμα συμβάντα ανασυνδυασμού70,71. Επανασυζητήστε αυτό το ζήτημα με έμφαση στο Mycobacterium bovis, το οποίο διαφέρει από την προηγούμενη εργασία που εξέτασε μόνο το Mycobacterium tuberculosis70,71· ή εξετάστε το MTBC ως σύνολο, σχεδόν χωρίς M. bovis να αντιπροσωπεύει20· ή λάβετε υπόψη μόνο περιοριστικά κλάσματα βοοειδών. Το σύνολο δεδομένων μυκοβακτηρίων, σε αυτήν την εργασία, υπάρχουν συνολικά 70 στελέχη, που αντιπροσωπεύουν όλα τα κλωνικά σύμπλοκα, που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο ανασυνδυασμού. Το σύνολο δεδομένων κλιμακώνεται σύμφωνα με τέσσερα αθροιστικά επίπεδα: (1) μέλη Eu2, (2) όλα τα μέλη του ευρωπαϊκού συμπλέγματος κλώνων (δηλαδή Ευρώπη), (3) ευρωπαϊκό και αφρικανικό σύμπλεγμα κλώνων (Eu + Af) και (4) ολόκληρες οι Συλλογές δεδομένων (συμπεριλαμβανομένων των γονιδιωμάτων που δεν περιλαμβάνονται σε κανένα σύμπλεγμα κλωνοποίησης που έχει ήδη περιγραφεί).
Για την περαιτέρω μελέτη αυτής της υπόθεσης, πραγματοποιήθηκε ένα δίκτυο split-decomposition για την αξιολόγηση της απουσίας συμβάντων ανασυνδυασμού μεταξύ γονιδιωμάτων, επειδή αυτή η μέθοδος μπορεί να απεικονίσει την προγονική σχέση μεταξύ ατόμων και να εμφανίσει αντικρουόμενα φυλογενετικά σήματα. Και τα τέσσερα σύνολα δεδομένων στην ανάλυση επιβεβαίωσαν την ύπαρξη βρόχων στο δίκτυο (δηλαδή, περιοχές που δεν συγκλίνουν σε ένα μόνο δέντρο), αλλά το τεστ Phi δεν έχει στατιστική υποστήριξη (Eu2, p = 0,0956; Ευρώπη, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; ολόκληρο το σύνολο δεδομένων p = 0,2451), γεγονός που παρέχει ανεπαρκή στοιχεία για την ύπαρξη συμβάντων αναδιοργάνωσης (Σχήμα 3A-D).
Στην Ευρώπη 2 γονιδιώματα (n = 37) (A), ευρωπαϊκά γονιδιώματα (n = 44) (B), ευρωπαϊκά και αφρικανικά γονιδιώματα (n = 51) (C) και ολόκληρο το σύνολο δεδομένων (n = 70) (D).
Μετά από αυτήν την ανάλυση, και λαμβάνοντας υπόψη τις κυκλικές παρατηρήσεις σε όλα τα δίκτυα, ο αλγόριθμος ανακατασκευής που εφαρμόστηκε στον αγωγό Gubbins εφαρμόστηκε για την ανακατασκευή της κλωνικής γενεαλογίας και για να συμπληρώσει την εκτίμηση της επίδρασης του ανασυνδυασμού στο γονιδίωμα του M. bovis. Υπολογίστε τον αθροιστικό αριθμό συμβάντων ανασυνδυασμού, τα περισσότερα από τα οποία εμφανίστηκαν σε τερματικούς κλάδους (δηλαδή, σε ένα μόνο γονιδίωμα) (Πίνακας 2). Αυτοί οι δείκτες δείχνουν τη συνέπεια ολόκληρου του συνόλου δεδομένων και υποδεικνύουν ότι η συχνότητα των συμβάντων ανασυνδυασμού είναι 200 έως 300 φορές μεγαλύτερη από αυτή των μεταλλάξεων. Μόλις η παράμετρος rho/theta που αντιπροσωπεύει τους σχετικούς ρυθμούς ανασυνδυασμού και σημειακών μεταλλάξεων στον κλάδο φαίνεται να είναι μεταξύ 0,0037 και 0,0056 (Πίνακας 3). Πρόσφατα, η δημοσιευμένη εργασία του στελέχους 38 M. bovis κατέδειξε υψηλότερη τιμή rho/theta (rho/theta = 0,1) από αυτή που ελήφθη σε αυτό το σύνολο δεδομένων, αλλά η εργασία του Patané και των συναδέλφων του χρησιμοποίησε συναρμολόγηση βάσει αναφοράς για να συμπεράνει παραμέτρους ανασυνδυασμού. Μια διαδικαστική λεπτομέρεια, λόγω της διαδικασίας συναρμολόγησης, έχει συσχετιστεί με την αφθονία των πιθανών συμβάντων ανασυνδυασμού στον τερματικό κλάδο.
Στη συνέχεια, η παράμετρος r/m αντιπροσωπεύει την αναλογία ποικιλομορφίας ανασυνδυασμού και εισαγωγής μετάλλαξης, και η μέση τιμή της κυμαίνεται μεταξύ 0,025 και 0,037, υποδεικνύοντας ότι σε σύγκριση με τις μεταλλάξεις, ο ανασυνδυασμός έχει χαμηλότερη συνολική επίδραση στη γενετική ποικιλομορφία του M. bovis (Πίνακας 3). Για εκτεταμένη σύγκριση, χρησιμοποιήθηκε μια παρόμοια μέθοδος για την εκτίμηση της παραμέτρου r/m για το σύνολο δεδομένων MTBC που αποτελείται από 23 γονιδιώματα, παρουσιάζοντας μια μέση τιμή 0,48620, ενώ για το σύνολο δεδομένων 38 M. bovis των Patané και συναδέλφων, αποδείχθηκε ότι η μέση τιμή είναι 0,98. Στην πρώτη μελέτη, μόνο δύο από τα 23 γονιδιώματα που συμπεριλήφθηκαν στην εργασία του M. bovis (M. bovis BCG και το στέλεχος αναφοράς), επομένως η ληφθείσα τιμή μπορεί να είναι μεροληπτική λόγω της υπερέκφρασης του γονιδιώματος του M. tuberculosis. Στη δεύτερη αναφορά, οι αναλυθέντες πληθυσμοί Mycobacterium bovis ανακτήθηκαν κυρίως από τις Ηνωμένες Πολιτείες και τα ζώα ξενιστές. Αντίθετα, στο σύνολο δεδομένων μας, αντιπροσωπεύονται περισσότερες γεωγραφικές τοποθεσίες και είδη ξενιστών, και χρησιμοποιούνται επίσης γονιδιώματα ομαδοποιημένα σε διαφορετικά κλωνικά σύμπλοκα με διαφορετικά γενετικά χαρακτηριστικά πληθυσμού, επιτυγχάνοντας έτσι μια βαθύτερη και ευρύτερη γνώση του πληθυσμού. Η μέση τιμή διαφοράς r/m που λαμβάνεται με το σύνολο δεδομένων μας είναι συνεπής με την έννοια ότι ο βαθμός ανασυνδυασμού ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των γενεαλογικών γραμμών που αντιστοιχούν στο ίδιο ταξινομικό είδος, επομένως αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το σύμπλεγμα κλώνων M. bovis μπορεί να παρουσιάζει διαφορές ανασυνδυασμού. Η επίδραση είναι επίσης όπως προτείνεται από τους Didelot & Maiden72. Παρ 'όλα αυτά, η σημαντική επέκταση αυτού του συνόλου δεδομένων με τη συμπερίληψη ενός μεγαλύτερου αριθμού γονιδιωμάτων M. bovis θα επιτρέψει την περαιτέρω διευκρίνιση αυτού του σημείου. Τόσο οι παράμετροι r/m όσο και οι παράμετροι rho/theta παρουσιάζουν μεταβλητότητα μεταξύ των κλάδων, και αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με αναφορές για άλλα βακτηριακά είδη72,73.
Τέλος, προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα συμβάντα αναδιοργάνωσης που εντοπίστηκαν από τον αγωγό Gubbins, χρησιμοποιήθηκαν έξι διαφορετικοί αλγόριθμοι στο λογισμικό RDP4 για να ελεγχθούν ανεξάρτητα διαφορετικές πολλαπλές συγκρίσεις πυρήνα. Σε παγκόσμιο επίπεδο, λιγότερα από τα μισά συμβάντα που εντοπίστηκαν από τον Gubbins επιβεβαιώθηκαν από τον RDP4 (Πίνακες 4 και 5). Λαμβάνοντας υπόψη ολόκληρο το σύνολο δεδομένων, επιβεβαιώθηκαν τρία συμβάντα ανασυνδυασμού, δύο που αφορούσαν εσωτερικούς κόμβους και το άλλο που αφορούσε ένα μόνο γονιδίωμα σε έναν τελικό κλάδο, για τον οποίο δεν μπορούσαν να αντιστοιχιστούν κλωνικά σύμπλοκα (Πίνακες 4 και 5). Η αναγνώριση συμβάντων σε τελικούς κλάδους μπορεί να υποδηλώνει ότι ο ανασυνδυασμός βρίσκεται ακόμη σε εξέλιξη σε σύγχρονα στελέχη M. bovis ή ότι το αποτέλεσμα είναι λανθασμένα τοποθετημένο70. Σε αυτήν την υποθετική περιοχή ανασυνδυασμού, περίπου το 20% των θέσεων έχουν απροσδιόριστα νουκλεοτίδια (N), επηρεάζοντας έτσι το σήμα ανασυνδυασμού (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Επιπλέον, αυτή η περιοχή επηρεάζει το γονίδιο rrs, που κωδικοποιεί το 16S ριβοσωμικό RNA που αναμένεται να είναι ιδιαίτερα συντηρημένο, επομένως αυτό το υποτιθέμενο σήμα ανασυνδυασμού μπορεί να είναι αποτέλεσμα σφαλμάτων αλληλούχισης ή κακής ευθυγράμμισης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ολόκληρη η ευθυγράμμιση του γονιδιώματος μεταξύ Mb0003 και Mycobacterium bovis AF2122/97 και επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη απροσδιόριστων νουκλεοτιδίων και SNPs, επομένως τα πιθανά προβλήματα που σχετίζονται με τη λανθασμένη ευθυγράμμιση δεν οφείλονταν στις βιολογικές πληροφορίες που εφαρμόστηκαν σε αυτή την εργασία. Εμφανίστηκε μετά την εκμάθηση του προγράμματος.
Δεν βρέθηκαν κενά ή απροσδιόριστα νουκλεοτίδια στις περιοχές ανασυνδυασμού των εσωτερικών κόμβων (Σχήματα 4 και 5). Όσον αφορά αυτά τα συμβάντα, το ένα περιέχει μόνο το γονιδίωμα Eu2 και επηρεάζει το γονίδιο pks12, το οποίο κωδικοποιεί μια πιθανή συνθάση πολυκετιδίου, ενώ το άλλο είναι καταχωρημένο στο γονιδίωμα Eu1 και επηρεάζει το γονίδιο narX που κωδικοποιεί μια πιθανή νιτρική αναγωγάση (Πίνακας 4). Γενικά, η ανάλυση ανασυνδυασμού δείχνει ότι υπάρχει περιορισμένος αριθμός θραυσμάτων ανασυνδυασμού με στατιστική υποστήριξη και οι συναγόμενοι δείκτες υποδεικνύουν ότι ο ανασυνδυασμός έχει χαμηλή επίδραση στη γενεαλογία M. bovis. Το σήμα ανασυνδυασμού αναμένεται να είναι χαμηλό, αλλά είναι σημαντικό να διακρίνεται το πραγματικό σήμα εξέλιξης από τον θόρυβο υποβάθρου, κάτι που αποτελεί πρόκληση. Προκειμένου να μειωθεί το σήμα θορύβου που εισάγεται από προβλήματα συναρμολόγησης και αναντιστοιχίας βάσει αναφοράς 70, 71, όλα τα υπόλοιπα εκτός από το πλήρες γονιδίωμα συναρμολογήθηκαν από την αρχή και η ποιότητα συναρμολόγησης ελέγχθηκε και διασφαλίστηκε με ανάλυση αγωγού QUAST (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Επιπλέον, διεξήχθη μια σειρά συμπληρωματικών αναλύσεων για να διασφαλιστεί η αξιοπιστία και η ακρίβεια της συνολικής έρευνας. Συνεπώς, η ποιότητα αλληλούχισης των γονιδίων narX και pks12 αξιολογήθηκε με χαρτογράφηση ανάγνωσης έναντι του Mycobacterium bovis AF2122/97. Η συνιστώμενη θέση SNP στην περιοχή ανασυνδυασμού επιβεβαιώθηκε εφαρμόζοντας τα κριτήρια που αναφέρονται στην ενότητα της μεθόδου (τουλάχιστον 20 αναγνώσεις και συχνότητα αλλαγής 0,9). Ο πολυμορφισμός του γονιδίου narX επιβεβαιώθηκε πλήρως στα δύο γονιδιώματα (Mb1792361 και Mb7240415, 2,3%) και στα γονιδιώματα του γονιδιώματος pks12: γονίδια Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 και Mb12. Ωστόσο, για το γονιδίωμα Mb2043, έξι από τις οκτώ θέσεις δεν πληρούν το κριτήριο βάθους ανάγνωσης, επειδή το SNP υποστηρίζεται από μέγιστο αριθμό 17 αναγνώσεων, το οποίο είναι κάτω από την καθορισμένη τιμή αποκοπής των 20. Επομένως, μπορεί να επιβεβαιωθεί ο ανασυνδυασμός έξι γονιδιωμάτων (8,6%) σε αυτήν τη θέση του γονιδιώματος (Σχήματα 4 και 5).
Η λεπτομερής απεικόνιση της ευθυγράμμισης της περιοχής ανασυνδυασμού του συνόλου δεδομένων Mycobacterium bovis επηρεάζει το γονίδιο narX που κωδικοποιεί μια πιθανή νιτρική αναγωγάση. Δεν βρέθηκαν κενά ή απροσδιόριστα νουκλεοτίδια στην περιοχή ανασυνδυασμού των εσωτερικών κόμβων. Αυτό το συγκεκριμένο συμβάν καταγράφεται στο γονιδίωμα Eu1. Η ποιότητα αλληλούχισης του γονιδίου narX αξιολογήθηκε με την απεικόνιση των αναγνώσεων του Mycobacterium bovis AF2122/97. Επιβεβαιώστε τη συνιστώμενη θέση SNP στην περιοχή ανασυνδυασμού εφαρμόζοντας τα κριτήρια που αναφέρονται στην ενότητα μεθόδου (τουλάχιστον 20 αναγνώσεις και συχνότητα αλλαγής 0,9). Ο πολυμορφισμός του γονιδίου narX επιβεβαιώθηκε πλήρως στα γονιδιώματα των Mb1792361 και Mb7240415 (2,3%).
Λεπτομερής απεικόνιση της ευθυγράμμισης της περιοχής ανασυνδυασμού του συνόλου δεδομένων Mycoplasma bovis που επηρεάζει το γονίδιο pks12. Δεν βρέθηκαν κενά ή απροσδιόριστα νουκλεοτίδια στην περιοχή ανασυνδυασμού των εσωτερικών κόμβων. Όσον αφορά το συμβάν που επηρεάζει το γονίδιο pks12 που κωδικοποιεί πιθανή συνθάση πολυκετιδίων, περιέχει μόνο το γονιδίωμα Eu2. Η ποιότητα αλληλούχισης του pks12 αξιολογήθηκε με τη χαρτογράφηση ανάγνωσης του Mycobacterium bovis AF2122/97. Επιβεβαιώστε τη συνιστώμενη θέση SNP στην περιοχή ανασυνδυασμού εφαρμόζοντας τα κριτήρια που αναφέρονται στην ενότητα μεθόδου (τουλάχιστον 20 αναγνώσεις και συχνότητα αλλαγής 0,9). Οι πολυμορφισμοί των γονιδιωμάτων Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 και Mb1960 έχουν επιβεβαιωθεί πλήρως.
Τα γονίδια PE και PPE έχουν επαναλαμβανόμενες περιοχές που εύκολα διαβάζονται λανθασμένα από την αλληλούχιση και τη λανθασμένη χαρτογράφηση Illumina, επομένως συνήθως διαγράφονται από τη ροή εργασίας βιοπληροφορικής των μελών του M. tuberculosis μόνο όταν χρησιμοποιείται η στρατηγική χαρτογράφησης σε αλληλουχία. Η εξαγωγή συμβάντων ανασυνδυασμού που εφαρμόζεται σε αυτή την εργασία βασίζεται σε de novo συναρμολόγηση χωρίς φιλτράρισμα του PE/PPE. Πιστεύουμε ότι εφαρμόζοντας τρεις διαφορετικές συμπληρωματικές μεθόδους και αλγόριθμους μέσω του λογισμικού SplitsTree, Gubbins pipeline και RDP4, οι στρατηγικές που εφαρμόζονται είναι ανθεκτικές στην επεξεργασία και το φιλτράρισμα των αναδιοργανωμένων περιοχών που προκαλούνται από σήματα σφάλματος. Ωστόσο, προκειμένου να αποκλειστεί η παρεμβολή του γονιδίου PE/PPE στο λογισμικό Gubbins και RDP4 για την αναγνώριση συστάδων SNP και, επομένως, η αναγνώριση των περιοχών ανασυνδυασμού που προτείνεται να επηρεάζουν τα γονίδια narX και pks12, εξετάστηκε η γειτονιά αυτών των γονιδίων (Συμπληρωματικό Σχήμα 3-5). Στο M. bovis AF2122/97, το γονίδιο narX διαχωρίζεται από τα γονίδια narK2 και Mb1764c, ενώ το pks12 περιβάλλεται από τα Mb2075c και Mb2073c (Συμπληρωματικό Σχήμα 3-5). Ο χάρτης που δημιουργείται χρησιμοποιώντας τον χάρτη συνγραμμών MAUVE του πλήρους γονιδιώματος παρέχει πληροφορίες σχετικά με τη διατήρηση και την αναδιάταξη της αλληλουχίας γονιδίων, δείχνοντας τέσσερα συγγραμμικά μπλοκ και κανένα σημάδι μετατόπισης ή αναστροφής του γονιδιώματος. Επιπλέον, η ανάλυση συμπληρωματικότητας με την αλληλουχία αμινοξέων απέδειξε την ομολογία σε όλα τα πλήρη γονιδιώματα και δεν βρέθηκε PE/PPE στις γειτονικές περιοχές του narX ή του pks12. Για το narX, ένα γονιδίωμα (Mb0030) έχει χαμηλότερη βαθμολογία συνωνυμίας επειδή το γονίδιο narX ταυτοποιήθηκε ως δύο θραύσματα (θραύσματα 1891 και 1890). Για το pks12, λόγω ομοιοτήτων, τα Mb0030 και Mb003 εμφάνισαν χαμηλότερες βαθμολογίες συνγραμμικότητας, ενώ το pks12 ταυτοποιήθηκε σε δύο και τρία θραύσματα, αντίστοιχα, που αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς τομείς της πρωτεΐνης (Συμπληρωματικό Σχήμα 3-5). Λαμβάνοντας υπόψη αυτές τις πληροφορίες, και τα λογισμικά Gubbins και RDP4 πραγματοποιούν ανάλυση, ελέγχοντας την πολλαπλή ευθυγράμμιση πυρήνα των μέγιστων 500 bp στο παράθυρο, επιβεβαιώσαμε ότι το γονίδιο PE/PPE δεν θα επηρεάσει το σήμα ανασυνδυασμού που επηρεάζει το narX και το pks12.
Παρόλο που τα σήματα ανασυνδυασμού που ανιχνεύονται σε αυτό το σύνολο δεδομένων μπορούν να θεωρηθούν υπολειμματικά, είναι αλήθεια ότι ο ανασυνδυασμός στο M. bovis δεν μπορεί να αποκλειστεί, επομένως θα πρέπει να συνεχίσει να αποτελεί αντικείμενο περαιτέρω ανάλυσης, στην οποία ολόκληρα γονιδιώματα από διαφορετικά επιδημιολογικά σενάρια αλληλουχούνται σε Σημαντικά.
Η σύγκριση των φυλογενετικών δέντρων ML που ελήφθησαν πριν και μετά τη διόρθωση ανασυνδυασμού (Σχήμα 2Α, Β) δεν οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στην υποτιθέμενη φυλογενετική σχέση και τα στελέχη M. bovis ομαδοποιήθηκαν στην ίδια ομάδα.
Μετά τη χαρτογράφηση 42 νέων αναγνώσεων αλληλουχίας M. bovis με το γονιδίωμα αναφοράς του M. bovis AF2122/97, ελήφθη μια ευθυγράμμιση SNP που περιείχε 1816 πολυμορφικές θέσεις. Τα περισσότερα SNP (87,1%) βρίσκονται στην κωδικοποιητική περιοχή και τα επηρεαζόμενα γονίδια χαρακτηρίζονται σύμφωνα με τις λειτουργικές κατηγορίες που φαίνονται στο Bovilist (Σχήμα 6Α, Β). Λαμβάνοντας υπόψη τον συνολικό αριθμό γονιδίων σε κάθε λειτουργική κατηγορία, τα γονίδια στην κατηγορία «μεταβολισμός λιπιδίων» εμφάνισαν περισσότερα SNP, ακολουθούμενα από «κυτταρικό τοίχωμα και κυτταρικές διεργασίες» και «ενδιάμεσο μεταβολισμό και αναπνοή», αποκαλύπτοντας ότι βρίσκονται σε εξέλιξη M. bovis.
Ιεραρχική ανάλυση του συνόλου δεδομένων M. bovis από την Πορτογαλία (n = 42). Ο συνολικός αριθμός καταχωρημένων SNPs και επηρεασμένων γονιδίων για κάθε λειτουργική κατηγορία (A). Ο συνολικός αριθμός συνώνυμων και μη συνώνυμων αλλαγών που καταγράφηκαν ανά λειτουργική κατηγορία (B).
Σε παγκόσμια κλίμακα, ο μέσος λόγος dN/dS είναι καλύτερος από 1,5, γεγονός που υποδηλώνει ότι η παγκόσμια εξελικτική πίεση είναι να απαλλαγούμε από την προγονική κατάσταση και αντιπροσωπεύει ένα θετικό (διαφοροποιημένο ή κατευθυνόμενο) ή/και χαλαρό σενάριο επιλογής καθαρισμού. Στις κατηγορίες «μολυσματικότητα, αποτοξίνωση, προσαρμογή», «αλληλουχίες εισαγωγής και φάγοι» και «ρυθμιστικές πρωτεΐνες», περισσότερα από τα δύο τρίτα των SNPs δεν είναι συνώνυμα (Σχήμα 6Β).
Σε όλες τις κατηγορίες, υπάρχουν γονίδια με πολλαπλά SNPs, με αποτέλεσμα ένα μέσο ποσοστό μετάλλαξης (δηλαδή, το μέσο SNP ανά γονίδιο) μεγαλύτερο από 1 (Σχήμα 6Α). Τα Pks12 (Mb2074c) με 15 SNPs και fas (Mb2553c) με 8 SNPs έχουν υψηλότερες τιμές μετάλλαξης. Και τα δύο αυτά γονίδια εμπλέκονται στον μεταβολισμό των λιπαρών οξέων. Το γονίδιο pks κωδικοποιεί τη συνθάση πολυκετιδίων (PKS), η οποία είναι ένα πολυλειτουργικό ένζυμο που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση λιπιδίων του κυτταρικού τοιχώματος των μυκοβακτηρίων74,75. Αυτό το γονίδιο κωδικοποιεί ένα πολυλειτουργικό πολυπεπτίδιο που εμπλέκεται στη σύνθεση μυκοκετιδίων74,76. Το γονίδιο fas εμπλέκεται στη σύνθεση του μυκολικού οξέος. Και τα δύο αυτά γονίδια παίζουν σημαντικό ρόλο στη βιοσύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος σε επαφή με τον ξενιστή.
Προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω η εξέλιξη του Mycobacterium bovis, αναλύθηκαν δύο σύνολα συγκεκριμένων γονιδίων. Προηγούμενα δημοσιευμένες εργασίες που χρησιμοποιούν σύνθεση αλληλουχίας και φυλογενετικές μεθόδους αναγνώρισαν γονίδια που αποκτήθηκαν από προγόνους MTBC μέσω HGT πριν από τη διαφοροποίηση37,38. Αυτά τα γονίδια παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 2. Αναλύθηκε η κατανομή SNP συνολικά 77 γονιδίων που μπορεί να σχετίζονται με την HGT και εντοπίστηκαν 26 πολυμορφικές θέσεις, οι οποίες στις περισσότερες περιπτώσεις (78%) οδήγησαν σε μη συνώνυμες (NS) αλλαγές (Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Προηγούμενη εργασία στο γονιδίωμα MTBC έδειξε ότι η υποτιθέμενη περιοχή HGT παρουσιάζει υψηλότερο λόγο NS SNP σε σύγκριση με το υπόλοιπο γονιδίωμα. Εάν κάποιος σκεφτεί ότι αυτές οι περιοχές ανασυνδυασμού αποκτήθηκαν από προγόνους MTBC και, ως εκ τούτου, υπερεκπροσωπούν αρχαίους πολυμορφισμούς, τότε το ποσοστό των συνώνυμων αλλαγών αναμένεται να είναι υψηλότερο, επειδή οι υποκαταστάσεις NS αναμένεται να εξαλειφθούν με αρνητική επιλογή λόγω αλλαγών αμινοξέων που μπορεί να αλλάξουν τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Επομένως, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι λειτουργικές συνέπειες μπορεί να προκύψουν από την αντικατάσταση γονιδίων τύπου HGT, γεγονός που αντανακλά τη σημασία τους για την πολύτιμη προσαρμοστική γενετική ποικιλομορφία.
Παράλληλα με αυτήν την ανάλυση, τα γονίδια που κωδικοποιούν τα συστατικά του συστήματος 3R (επιδιόρθωση, αντιγραφή και ανασυνδυασμός DNA) εξετάστηκαν διεξοδικά σύμφωνα με τον κατάλογο που είχε δημοσιευτεί προηγουμένως από τους dos Vultos και συνεργάτες του (2008)39. Η ανταλλαγή πανομοιότυπων θραυσμάτων DNA δεν μπορεί να παρατηρηθεί άμεσα, αν και μπορεί να είναι μια συχνή διαδικασία όταν εμπλέκονται στενά συγγενικά βακτήρια, όπως στην περίπτωση αυτού του συνόλου δεδομένων. Επιπλέον, αυτή η διαδικασία μπορεί να είναι το κλειδί για τις μεθόδους επιδιόρθωσης DNA72, επομένως παίζει ρόλο στον ομόλογο ανασυνδυασμό. Εντοπίστηκαν συνολικά 26 πολυμορφικές θέσεις κατανεμημένες σε 54 γονίδια (Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Σε αυτό το σύνολο γονιδίων, οι αλλαγές NS αντιπροσώπευαν περίπου το 65% των συνεπειών, γεγονός που συνάδει με προηγούμενες αναφορές για στελέχη Mycobacterium tuberculosis.
Ώρα δημοσίευσης: 21 Οκτωβρίου 2021