Hvala vam što ste posjetili Nature. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite noviju verziju preglednika (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Istovremeno, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranice bez stilova i JavaScripta.
Sekvenciranje genoma revitaliziralo je područje istraživanja zaraznih bolesti, otkrivajući epidemiologiju bolesti, patogenezu, interakcije domaćina i patogena te evolucijski proces nametnut patogenima. Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) smatra Mycobacterium bovis jednim od svojih adaptivnih članova koji uzrokuju tuberkulozu (TB) kod kopnenih sisara i tipičan je model bakterijske evolucije. Kao i drugi članovi MTBC-a, pretpostavlja se da je Mycobacterium bovis strogo kloniran, sporo evoluirajući patogen i očito nema znakova rekombinacije ili horizontalnog prijenosa gena. U ovom radu primjenjujemo komparativnu genomiku na skup podataka cijele sekvence genoma (WGS) sastavljen od 70 goveda M. iz različitih rodovnica (Evropa i Afrika) kako bismo stekli uvid u genetsku raznolikost goveda M. Evolucijska moć. Koriste se tri različite metode za procjenu znakova reorganizacije. Globalno, mali broj događaja rekombinacije identificiran je i potvrđen dvijema nezavisnim metodama sa čvrstom podrškom. Ipak, u poređenju s mutacijama, rekombinacija ima slabiji učinak na raznolikost M. bovis (ukupni r/m = 0,037). Razlika r/m prosjeka dobijena u klonskom kompleksu Mycobacterium bovis u našem skupu podataka u skladu je s općim konceptom da se stepen rekombinacije može značajno razlikovati između loza pripisanih istoj taksonomskoj vrsti. Na osnovu ovog rada, rekombinacija kod Mycobacterium bovis se ne može isključiti, tako da bi trebala biti predmet daljnjih napora u budućim istraživanjima komparativne genomike, u kojima je WGS velikih skupova podataka iz različitih epidemioloških scenarija širom svijeta ključan. Zatim je provedena dodatna analiza na manjem skupu podataka Mycobacterium bovis (n = 42) iz prevalencije tuberkuloze kod više domaćina, a identificirano je više od 1.800 lokusa, od kojih je barem jedan soj pokazao polimorfizam jednog nukleotida (SNP). Većina (87,1%) se nalazi u kodirajućoj regiji, a globalni omjer nesinonimnih promjena (dN/dS) sinonimnih promjena prelazi 1,5, što ukazuje na to da je pozitivna selekcija važna evolucijska sila koja djeluje na M. bovis. Veći udio SNP-ova otkriven je u genima bogatim funkcionalnim kategorijama "metabolizma lipida", "ćelijskog zida i ćelijskih procesa" i "intermedijarnog metabolizma i disanja", što otkriva njihov potencijal u biologiji i evoluciji važnosti Mycobacterium bovis. Detaljniji pogled na gene kod predaka MTBC-a koji su skloni horizontalnom transferu gena i uključeni u 3R (popravak, replikacija i rekombinacija DNK) sistem otkriva globalnu prosječnu negativnu vrijednost Taijiminog D neutralnog testa, što ukazuje na prošlo selektivno skeniranje. Nedavno usko grlo nakon širenja populacije i dalje je glavni evolucijski pokretački faktor za obavezni patogen Mycobacterium bovis u borbi protiv domaćina.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) jedan je od najuspješnijih taksona bakterijskih patogena i tipičan slučaj bakterijske evolucije. Njegovi članovi pokazuju iznenađujuće visok nukleotidni identitet na genomskom nivou (> 99%)1,2. Različiti ekotipovi MTBC-a mogu uzrokovati tuberkulozu (TB), koja je zarazna granulomatozna bolest, kod širokog spektra vrsta domaćina, od mikrosisara do ljudi3,4,5. Trenutno, kompleks uključuje ljude [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] i patogene prilagođene životinjama (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" i "dassie")5,6. M. canettii (također poznat kao "Nodobacter glabrata") Prosječna identičnost nukleotida sa prethodno spomenutim mikobakterijama je 98%, a rad komparativne genomike pokazao je da su se M. canettii i ostatak MTBC-a nedavno odvojili od zajedničkog pretka.7 Uzimajući u obzir ovaj koncept, neki autori nazivaju M. canettii članom MTBC-a 8.
MTBC se sistematski opisuje kao strogi klonski kompleks, a njegova populacijska struktura je jasno određena smanjenom raznolikošću, uskim grlima, selektivnim skeniranjem i genetičkim driftom9,10. Pod pretpostavkom da se kompleksna stroga klonska evolucija, poput nedostajućih polimorfizama, ne može obnoviti rekombinacijom. Na osnovu ove pretpostavke, uzastopni događaji genomske delecije diferencijalne regije (RD) i TbD1 (Mtb specifična regija delecije 1) predloženi su kao molekularni markeri evolucije MTBC2,5,11. Rad na komparativnoj genomici i sekvenciranju cijelog genoma (WGS) podržava podjelu članova prilagođenih čovjeku u devet loza (Mycobacterium tuberculosis L1 do L4, L7 i L8; i Mycobacterium africanum L5, L6 i L9), loze L2 do L4 dijele regiju delecije TbD12,11,12,13. Osim toga, pretpostavlja se da članovi prilagođeni životinjama dijele zajedničkog pretka, što je definirano kladno specifičnim delecijama u RD7, RD8, RD9 i RD102, 5 i 14.
Horizontalni transfer gena (HGT) i događaji rekombinacije smatraju se rijetkim i javljaju se kod predaka MTBC-a, a ne zbog različite historije cijelog člana MTBC-a15,16,17. Dva rana izvještaja Hughesa i saradnika (2002) i Gutackera i saradnika (2006) sugerirala su da događaji rekombinacije mogu pomoći u oblikovanju polimorfizama koji označavaju specifične lokuse u sojevima M. tuberculosis18,19. Razlozi za očigledan nedostatak rekombinacije u MTBC-u su: (1) mehanički proces i gubitak sposobnosti HGT-a; (2) rijetkost HGT događaja; (3) ne postoji mogućnost događaja rekombinacije u niši MTBC-a14,17. Nedavno su neke studije sekvenciranja cijelog genoma (WGS) primijenjene na soj MTBC-a 20 i Mycobacterium bovis 21 pružile dokaze o rekombinaciji, prve koje su pokazale da sojevi MTBC-a često razmjenjuju male fragmente DNK, ali zbog ograničene varijacije u nukleotidnoj sekvenci, ovi događaji još uvijek nisu primijećeni.
Mycobacterium bovis je najčešće izolirani član MTBC-a iz stoke (uglavnom goveda), iako se može izolirati i iz divljih životinja slobodnog uzgoja i ograđenih divljih životinja4,22,23,24. M. bovis se razvio u pet glavnih klonskih kompleksa [evropski 1 (Eu1), evropski 2 (Eu2), evropski 3 (Eu3), afrički 1 (Af1) i afrički 2 (Af2)], prema profilu spolignotipizacije, specifičnim delecijama i polimorfizmima jednog nukleotida (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 u specifičnim genima. Ovi klonski kompleksi pokazuju raznoliku strukturu populacije Mycobacterium bovis i njenu povezanost s geografskim regijama. Osim toga, nedavni rad WGS-a koji su proveli Zimpel i saradnici (2020.) osmislio je filogeniju zasnovanu na SNP-u Mycobacterium bovis, s više od 1.900 genoma, što ukazuje na to da postoje najmanje četiri različite loze (nazvane Lb1 do Lb1 do Lb4), one nisu u potpunosti konzistentne s prethodno definiranim klonskim kompleksom, iako se može potvrditi i geografska specifičnost30. Ovi autori su proveli diferencijalnu analizu filogenije i molekularnog datiranja, ali nisu proučavali rekombinaciju30.
Prethodni radovi korištenjem različitih molekularnih tehnika, kao što su spoligotipizacija, MIRU-VNTR (mikobakterijska interspersirana repetitivna jedinica - varijabilni tandemski broj repeticija) i nedavna SNP tipizacija otkrili su određeni nivo genetičke raznolikosti među sojevima M. bovis 31,32,33, 34,35. Diferencijacija genetičke varijacije postala je važan alat u proučavanju epidemiologije bolesti, što je korisno za dublje razumijevanje patogeneze, virulencije i prijenosa bolesti. Pojava WGS metode pruža mogućnost otkrivanja evolucijskih pokretačkih faktora koje nameće genom Mycobacterium bovis u procesu adaptacije i perzistencije na različite domaćine i epidemiološke scenarije.
U ovom radu koristimo komparativnu genomsku analizu različitih skupova podataka Mycoplasma bovis (n=70), uključujući izolate iz različitih klonskih kompleksa, kako bismo stekli uvid u evolucijski proces Mycoplasma bovis, posebno kako bismo razriješili filogenetske odnose i događaje rekombinacije. Kao dodatak ovoj analizi, dalje je istražen podskup izolata M. bovis (n = 42) dobivenih iz dobro okarakteriziranog područja tuberkuloze s više domaćina u Portugalu 31,36 kako bi se zaključilo o neidentitetu. Ravnoteža između relativnog omjera smislenih (dN) i sinonimnih (dS) nukleotidnih zamjena, kao i evolucijski doprinos specifičnih genoma spomenutih u literaturi, njih 37,38 dobivaju preci MTBC-a putem HGT-a i kodiraju komponente gena 3R (popravak, replikacija i rekombinacija DNK) sistema 39. Gene dobivene putem HGT-a biramo jer mogu predstavljati drevne polimorfizme, pa se očekuje da mogu sadržavati veći udio sinonimnih promjena. Geni uključeni u 3R sistem su odabrani jer je prethodni rad na sojevima M. tuberculosis ukazao na opće negativne/purifikacijske selekcije koje djeluju na ove gene, a oni mogu igrati važnu ulogu u evoluciji 39. Drugi cilj ovog rada je zaključiti o postojanju događaja reorganizacije. Iz tog razloga, s obzirom na to da naš skup podataka iz Portugala sadrži samo genome evropskog klonskog kompleksa 2 i sojeve kojima nije dodijeljen klonski kompleks, odlučili smo uključiti javno dostupne podatke o genomu kako bismo konačno dobili reprezentativni prikaz svih klonskih kompleksa i poboljšali robusnost i širinu rezultata.
42 novosekvencirana genoma Mycoplasma bovis iz portugalske endemske scene tuberkuloze s više domaćina (detalji u nastavku), prethodno okarakterizirana iz epidemiološke perspektive36, čine središte ovog rada. S obzirom na to da skup podataka iz Portugala sadrži samo predstavnike evropskih 2 klonskih kompleksa i sojeva bez označenih kompleksa, dodani su javno dostupni podaci o sekvenciranju cijelog genoma kako bi se proširio skup podataka koji uključuje sve predstavnike klonskih kompleksa M. bovis. Stoga su u ovom radu korištena tri izvora podataka o sekvenciranju cijelog genoma: kompletna/nacrtna montaža genoma, do 10 skela pohranjenih u NCBI (Nacionalni centar za biotehnološke informacije) (n = 15 izolata); pohranjena u SRA (Illumina fastq datoteka arhive pročitanih sekvenci) predstavlja kompleksnu raznolikost klonova M. bovis (n = 12 izolata)30; i 42 novosekvencirana genoma iz Portugala. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) je isključen iz NCBI pretrage. M. bovis AF2122/97 se obično koristi kao referentni genom koji se uključuje u skup podataka. Zbog javne nedostupnosti cijelog genomskog niza predstavljenog klonirajućim kompleksom African 1 i malog broja genoma iz reprezentativnih sojeva Af2 i Eu1, u ovim slučajevima korišteni su originalni podaci sekvenciranja koje je dostavio SRA. Rad Zimpela i njegovih saradnika (2020) pomogao je u identifikaciji genoma iz spomenutog klonirajućeg kompleksa i pomogao u odabiru Mycobacterium bovis za uključivanje u skup podataka. Za Eu3 je opisan samo jedan tip genoma (Branger et al., 2020), tako da je genom koji uključujemo zaseban predstavnik Eu3 kompleksa.
Globalno, ovaj skup podataka uključuje 70 vrsta Mycobacterium bovis izoliranih iz 8 vrsta domaćina, rasprostranjenih u 12 zemalja od 1985. do 2016. godine. 36 vrsta je označeno kao Eu2, 7 vrsta je Eu1, 1 vrsta je Eu3, 3 vrste su Af1, 4 vrste su Af2, a 19 se ne može pripisati nijednom klonskom kompleksu (detalji u nastavku). Detaljne informacije (uključujući pristupni broj) o Mycobacterium bovis korištenoj u ovoj studiji prikazane su u Tabeli 1 i Dodatnoj tabeli 1.
42 novosekvencirana cijela genoma Mycobacterium bovis iz portugalskih žarišta tuberkuloze životinja, distribuirana više od 12 godina, čine centar ove studije, budući da se redovno prate potencijalni sistemi bolesti divljih životinja i stoke 31,36 (Dodatna slika 1). Prema naknadnim procedurama, ovi sojevi su izolovani od goveda (n = 14), jelena (n = 16) i divlje svinje (n = 12) od 2003. do 2015. godine: prikupljanje i rukovanje životinjama treba obavljati u skladu sa preporučenim protokolarnim smjernicama. Uzorci tkiva nalaze se u Priručniku za kopnene životinje OIE-a i inokulirani su na čvrstom i tekućem mediju Stonebrink i Löwenstein-Jensen piruvatu. Kulture se inkubiraju na 37 °C, a rast se provjerava jednom sedmično tokom najmanje 12 sedmica. Kolonije se čuvaju direktno u rastvoru glicerola na -80 °C. U selektivnom mediju za Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), originalni arhivirani uzorci su propušteni kroz jednu in vitro pasažu kako bi se dobila DNK WGS programa. Za to je smrznuti osnovni rastvor kulture obogaćen sa 5% natrijum piruvata i 10% ADS-a (50 g albumina, 20 g glukoze, 8,5 g natrijum hlorida u 1 L vode) na Middlebrook 7H9 mediju na 37°C Retrain. Nakon 4 sedmice rasta, medij je obnovljen i kultura je redovno praćena dok nije uočen rast. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, talog je resuspendovan u 500 µL fosfatno puferovanog fiziološkog rastvora (PBS), zagrijan na 99°C tokom 30 minuta, centrifugiran, a supernatant je pohranjen na -20°C do WGS programa. Svi postupci se provode u objektima biološke sigurnosti nivoa 3.
WGS biblioteka genoma sparenih krajeva pripremljena je korištenjem jedinstvenog indeksa svakog uzorka DNK, a za sekvenciranje se koristi Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 uzoraka) i HiSeq (2 × 150 pb) (dva izolata) tehnologija (Eurofins Genomics, Njemačka). Prema uputama proizvođača, koristite Illumina Genome Analyzer s dvostrukim priključkom za modul za sekvenciranje genomske DNK i koristite Nextera XT DNA Library Prep Kit od Illumine za konstrukciju biblioteke.
Uzimajući u obzir podatke prikupljene iz SRA (n = 12), identifikacija klonskog kompleksa može se koristiti kao metapodaci odgovarajuće publikacije 30, 41, 43. Kada se razmatra kompletan genom, osim za Mycobacterium bovis AF2122/97 i Mycobacterium bovis 3601, koji su prepoznati članovi klonskog kompleksa Eu1 i Eu3 25, 29, respektivno, isti je kao i kompletan genom Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI pristupni broj NC_000962.3). Poravnanje genoma se vrši korištenjem MAFFT-a (program višestrukog poravnanja aminokiselinske ili nukleotidne sekvence, verzija 7.458) i parametra -addfragments48. Zatim se traži odsustvo različitih klonskih kompleksa i/ili prisustvo SNP karakteristika.
Novosekvencirani Mycobacterium bovis (n = 42) i originalni očitanja sastavljenog nacrta genoma (n = 3) poravnavaju kompleks sa referentnim genomom Mycobacterium tuberculosis H37Rv kroz vSNP cjevovod i prisustvo delecije i/ili SNP karakteristika različitih klonova. Provedena je pretraga.
Prikupite informacije na osnovu nedostatka karakteristika i/ili prisustva/odsustva SNP-a i profila spoligotipizacije kako biste dodijelili genomske podatke odgovarajućem klonskom kompleksu. Za četiri nacrta sklopa, profil spoligotipizacije se ne može zaključiti, pa su uključeni u grupu "bez složenosti".
Bioinformatički tok rada koji prati ovaj rad počinje od de novo sastavljanja i mapiranja u referentnu strategiju, s ciljem istraživanja rekombinacijskih događaja i specifičnih polimorfizama genoma. Slika 1 prikazuje dijagram toka sljedećih koraka. Za analizu rekombinacije koriste se svi genomi kako bi se povećala robusnost zaključaka i srodnih indikatora.
Kako bismo smanjili greške u generiranju konsenzus sekvenci genoma, prvo smo dobili de novo sastavljanje, a zatim i višestruka poravnanja jezgra. Unicycler cjevovod je trenutno dostupan na https://github.com/rrwick/Unicycler49 i koristi se za izvođenje de novo sastavljanja 54 sekvencirana genoma (42 novo sekvencirana i 12 fastq datoteka oporavljenih iz SRA). Ukratko, prije sastavljanja od nule, analiza kvaliteta očitavanja je izvršena u FastQC verziji 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) i Trimmomatic verziji 0.36 (primjenjuju se opcije "rezanje adaptera i drugih sekvenci specifičnih za osvjetljenje iz očitavanja" i "Izreži baze s kraja očitavanja, ako je niže od praga kvaliteta od 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Zatim je za sastavljanje genoma korišten SPAdes optimiser49, a za optimizaciju nakon sastavljanja Pilon verzija 1.1851. Odabran je konzervativni način premošćivanja kako bi se izbjeglo nepravilno sastavljanje, a veličina k-mera je pretražena i odabrana između 20% i 95% dužine očitavanja. Slijedite SPAdes smjernice i uzmite u obzir veličinu očitavanja, izbrišite kontige manje od 300 bp i uspostavite graničnu vrijednost pokrivenosti dubine od 20 očitavanja od 52. U de novo strategiji sastavljanja, genomske regije kao što su visoko repetitivni paralozi prolin-glutamata (PE) i prolin-prolin glutamata (PPE) nisu uklonjene.
Kvalitet de novo sastavljanja genoma procjenjuje se putem QUAST cjevovoda (http://quast.sourceforge.net/quast.html), koji olakšava obnovu kontiga i mapiranje referentnog genoma M. bovis AF2122/97 (NCBI pristupni broj LT708304.1) (vidi Dodatnu tabelu 1 za parametre kvaliteta).
Uz pomoć vSNP cjevovoda (https://github.com/USDA-VS/vSNP), FASTQ datoteka novo sekvenciranog M. bovis iz Illumina sekvenciranja upoređuje se sa referentnim genomom M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Prema preporukama najbolje prakse iz Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, primjenjuju se standardni parametri filtera ili varijantni rezultati mase za ponovnu kalibraciju. Rezultati se filtriraju korištenjem najnižeg SAMtools rezultata mase od 150 i AC = 2. Također koristite Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) za provjeru očitanja kako biste isključili kontaminaciju. vSNP cjevovod koji se koristi za mapiranje strategija sekvenciranja u našem radu ispituje niz definiranih SNP-ova i ciljeva, a također isključuje scenarije miješane infekcije. Pokrivenost očitanog genoma je bolja od 99% (Dodatna tabela 1).
Da biste izbjegli greške u mapiranju i pogrešne SNP-ove, filtrirajte varijantu u sljedećim slučajevima: (1) podržana je s manje od 20 očitanja, (2) pronađena je s frekvencijom manjom od 0,9, (3) prisutna je u barem jednom soju, ali barem postoje praznine u drugom soju. Integrirani preglednik genomike (IGV) verzije 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 korišten je za vizualnu provjeru SNP-ova i pozicija s problemima mapiranja ili poravnanja. Budući da su geni prolin-glutamata (PE) i prolin-prolin glutamata (PPE) visoko duplicirani i dio su višegenske porodice, lako ih je pogrešno shvatiti sekvenciranjem i pogrešnim mapiranjem Illumina, pa su oni poželjniji. Tok rada mikobakterijske bioinformatike uklonio je članove tuberkuloznog kompleksa pri korištenju strategije mapiranja u sekvencu za potvrdu SNP-ova. Stoga smo iz analize filtrirali gene PE/PPE i indele.
Prema Bovilistu (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), svi SNP-ovi su podijeljeni u funkcionalne kategorije. SnpEff cjevovod (https://pcingola.github.io/SnpEff/) se koristi za zaključivanje o posljedicama SNP-ova (sinonimne ili nesinonimne promjene). Kreirana je nova baza podataka genoma Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Višestruko poravnanje osnovnog genoma izvršeno je korištenjem Parsnp v1.2, trenutno dostupnog na https://github.com/marbl/parsnp57, korištenjem 69 kompletnih genoma/nacrta sklopova (s opcijom -c), a M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) se koristi kao referenca. Izvršena su četiri višestruka poravnanja osnovnog genoma: samo članovi Eu2 klonirajućeg kompleksa (n = 37), uključujući sve članove evropskog klonirajućeg kompleksa (n = 44), uključujući tačku spajanja evropskog i afričkog klonirajućeg kompleksa (n = 51), i uključujući sve Mycobacterium bovis u ovoj studiji (n = 70).
Osnovno poravnanje generirano pomoću Parsnp-a koristi se za zaključivanje o filogenetskom stablu maksimalne vjerovatnoće (ML) korištenjem CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 koristeći RAxML i izvođenje 1000 vođenih replikacija.
Za paralelnu provjeru prisutnosti rekombinacijskih događaja koriste se tri različita algoritma i bioinformatička alata: SplitsTree4 softver, Gubbins (nepristrasno određivanje porijekla kroz rekombinaciju u nukleotidnim sekvencama) pipeline i RDP4 (program za detekciju rekombinacije, verzija beta 4.101) softver.
Metoda podijeljene dekompozicije implementirana u SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 korištena je za izračunavanje filogenetske mreže bez korijena, korištenjem Phi testa za statističku verifikaciju, a prag značajnosti je p = 0,05. Analiza višestrukog poravnanja jezgre Parsnp-a koristi se kao ulaz, a podijeljena dekompozicija je realizovana kao mrežni standard.
Gubbins cjevovod v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) radi sa zadanim parametrima kao još jedan način za procjenu utjecaja rekombinacije na Mycobacterium bovis. Algoritam implementiran u cjevovodu rekonstruira relevantnu lozu klonova. Kompletan sklop genoma/nacrta našeg skupa podataka i referentni genom (goveđi bovid AF2122/97, LT708304.1) su međusobno usklađeni; i skeniraju položaj SNP-a na svakoj grani stabla kako bi se detektovao SNP klaster koji predstavlja događaj rekombinacije. Nula grane Pretpostavimo da nema događaja rekombinacije, što znači da SNP-ovi koji se javljaju na grani trebaju biti ravnomjerno raspoređeni. Višestruko poravnanje jezgra iz Parsnp-a i najbolje ocijenjeno ML stablo iz RAxML-a koriste se kao ulazne datoteke.
Konačno, kako bi se potvrdio događaj reorganizacije koji je predložio Gubbinsov cjevovod, šest algoritama implementiranih u RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 i SiScan66) primijenjeno je na Parsnp-ovo višestruko poravnanje pod zadanim postavkama. Utvrdili smo da najmanje tri algoritma implementirana u RDP4 moraju dosljedno pokazivati važan signal za provjeru svakog događaja rekombinacije.
Uzimajući u obzir da i Gubbins i RDP softver traže signale rekombinacije provjerom višestrukih poravnanja jezgra u prozoru do 500 bp i potvrđujući da uključivanje PE/PPE gena tokom de novo sklapanja neće ometati pronađene signale rekombinacije, daljnja analiza se vrši provjerom homolinearnosti u blizini gena koji identificira događaj rekombinacije. Sinlinearna mapa korištenjem kompletnog genoma konstruirana je korištenjem MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) kako bi se isključile lokalne translokacije ili inverzije genoma. Osim toga, cijeli genom je korišten za izvođenje analize homolinearnosti na aminokiselinskoj sekvenci putem SyntTax web servera (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Detaljnija analiza skupa podataka genoma dobijenih iz portugalskog sistema za tuberkulozu s više domaćina ima za cilj provjeru polimorfizma gena spomenutih u literaturi. Ovi geni su 37, 38 i gen koji kodira 3R, a koje su preci MTBC-a dobili putem komponenti HGT (popravak, replikacija i rekombinacija DNK) sistema 39. Koristite ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) i DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) za izračunavanje genske raznolikosti i nukleotidne raznolikosti (π) i unosa parametara Tajima's D neutralnog testa.
Dobijeno je filogenetsko stablo maksimalne vjerovatnoće (ML) zasnovano na 69 izolata Mycoplasma bovis i referentnih genoma (Slika 2A). U poređenju sa stablima zasnovanim na jednom genu ili stablima zasnovanim na više lokusa, ova strategija omogućava generisanje snažnijih stabala koja ne obuhvataju varijabilnost cijelog genoma i stoga pokazuju nižu sposobnost razlikovanja između vrsta 68,69. Topološka struktura ML stabla je obično u skladu sa složenom klasifikacijom klonova. Genom Eu2 je grupisan u grani, a genom Af1 je također grupisan zajedno (Slika 2A). Rezultat je također u skladu sa poznatim evolucijskim odnosom Mycobacterium bovis, odnosno postoji velika razlika između člana Eu1 i grupe koja se sastoji od svih ostalih klonskih kompleksa i genoma, ali klonski kompleks 30 nije specificiran. Mala nekonzistentnost između klonalnog kompleksa i odnosa uočenog na filogenetskom stablu može se objasniti činjenicom da je klonalni kompleks opisan na osnovu specifičnih genomskih regija, dok je filogenetsko stablo zasnovano na višestrukim poravnanjima osnovnih genoma koji predstavljaju cijeli genom.
Filogenetsko stablo maksimalne vjerovatnoće (GTR) konstruirano je na osnovu poravnanja jezgra genoma Mycobacterium bovis prije (A) i nakon (B) uklanjanja mjesta rekombinacije. Boje grana predstavljaju kompleks klonova Mycobacterium bovis: Evropa 1 je ljubičasta, Evropa 2 je crvena, Evropa 3 je plava, Afrika 1 je narandžasta, a Afrika 2 je zelena. Stablo je ukorijenjeno i nacrtano u mjerilu, a dužina grane se mjeri kao zamjena za svako mjesto.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis opisan je kao klonalno evoluiran, a većina dokaza prikupljenih tokom godina podržava ideju da se tekući HGT i rekombinacijski događaji neće odvijati na detektabilnom nivou MTBC15,17,18.
Prethodni rad je pokazao da može postojati ograničena rekombinacija između sojeva MTBC20,21, dok drugi nisu uspjeli identificirati mjerljive događaje rekombinacije70,71. Ponovo razmotrite ovo pitanje s fokusom na Mycobacterium bovis, što se razlikuje od prethodnog rada koji je razmatrao samo Mycobacterium tuberculosis70,71; ili razmotrite MTBC kao cjelinu, gotovo bez M. bovis koji predstavlja 20; ili razmotrite samo restriktivne frakcije goveda. Skup podataka o mikobakterijama, u ovom radu, ima ukupno 70 sojeva, koji predstavljaju sve klonske komplekse, korištene za skrining rekombinacije. Skup podataka je skaliran prema četiri kumulativna nivoa: (1) Eu2 članovi, (2) svi evropski članovi klonskog kompleksa (tj. Evropa), (3) evropski i afrički klonski kompleks (Eu + Af) i (4) cijele kolekcije podataka (uključujući genome koji nisu uključeni ni u jedan klonski kompleks koji je već opisan).
Kako bi se dalje proučila ova hipoteza, provedena je mreža podijeljene dekompozicije kako bi se procijenilo odsustvo događaja rekombinacije između genoma, jer ova metoda može vizualizirati odnos predaka između jedinki i prikazati konfliktne filogenetske signale. Sva četiri skupa podataka u analizi potvrdila su postojanje petlji u mreži (tj. područja koja se ne konvergiraju u jedno stablo), ali Phi test nema statističku podršku (Eu2, p = 0,0956; Evropa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; cijeli skup podataka p = 0,2451), što pruža slabe dokaze za postojanje događaja reorganizacije (Slika 3A-D).
U Evropi 2 genoma (n = 37) (A), evropski genomi (n = 44) (B), evropski i afrički genomi (n = 51) (C) i cijeli skup podataka (n = 70) (D).
Nakon ove analize, uzimajući u obzir ciklična zapažanja u svim mrežama, primijenjen je algoritam rekonstrukcije implementiran u Gubbinsovom cjevovodu kako bi se rekonstruirala klonska loza i dopunila procjena učinka rekombinacije na genom M. bovis. Zaključiti kumulativni broj događaja rekombinacije, od kojih se većina dogodila u terminalnim granama (tj. u jednom genomu) (Tabela 2). Ovi indikatori pokazuju konzistentnost cijelog skupa podataka i ukazuju na to da je učestalost događaja rekombinacije 200 do 300 puta veća od učestalosti mutacija. Parametar rho/theta koji predstavlja relativne stope rekombinacije i tačkastih mutacija na grani čini se između 0,0037 i 0,0056 (Tabela 3). Nedavno je objavljeni rad o soju 38 M. bovis pokazao veću vrijednost rho/theta (rho/theta = 0,1) od one dobivene u ovom skupu podataka, ali je rad Patanéa i kolega koristio sastavljanje na temelju referenci za zaključivanje parametara rekombinacije. Proceduralni detalj, zbog postupka sastavljanja, povezan je s obiljem pretpostavljenih događaja rekombinacije u terminalnoj grani.
Zatim, parametar r/m predstavlja omjer raznolikosti rekombinacije i uvođenja mutacija, a njegova prosječna vrijednost je između 0,025 i 0,037, što ukazuje da, u poređenju s mutacijama, rekombinacija ima manji ukupni utjecaj na genetičku raznolikost M. bovis (Tabela 3). Za opsežno poređenje, slična metoda je korištena za procjenu parametra r/m za skup podataka MTBC sastavljen od 23 genoma, pokazujući prosječnu vrijednost od 0,48620, dok je za skup podataka Patanéa i kolega od 38 genoma M. bovis dokazana prosječna vrijednost od 0,98. U prvoj studiji, samo dva od 23 genoma uključena u rad M. bovis (M. bovis BCG i referentni soj), tako da dobijena vrijednost može biti pristrasna zbog prekomjerne ekspresije genoma M. tuberculosis. U drugom izvještaju, analizirane populacije Mycobacterium bovis su uglavnom prikupljene iz Sjedinjenih Američkih Država i od domaćih životinja. Nasuprot tome, u našem skupu podataka zastupljeno je više geografskih lokacija i vrsta domaćina, a korišteni su i genomi grupirani u različite klonske komplekse s različitim populacijskim genetskim karakteristikama, čime se postiže dublje i šire poznavanje populacije. Razlika prosječne vrijednosti r/m dobivena s našim skupom podataka u skladu je s konceptom da se stepen rekombinacije uveliko razlikuje između loza dodijeljenih istoj taksonomskoj vrsti, tako da ovi rezultati ukazuju na to da klonski kompleks M. bovis može pokazivati razlike u rekombinaciji. Utjecaj je također onakav kakav sugeriraju Didelot i Maiden72. Ipak, značajno proširenje ovog skupa podataka uključivanjem većeg broja genoma M. bovis omogućit će daljnje pojašnjenje ove tačke. I parametri r/m i rho/theta pokazuju varijabilnost između grana, a ovaj rezultat je u skladu s izvještajima o drugim bakterijskim vrstama72,73.
Konačno, kako bi se potvrdili događaji reorganizacije identificirani Gubbinsovim cjevovodom, u RDP4 softveru korišteno je šest različitih algoritama za nezavisno testiranje različitih višestrukih poređenja jezgra. Globalno, manje od polovine događaja identificiranih Gubbinsom potvrđeno je pomoću RDP4 (Tabele 4 i 5). Uzimajući u obzir cijeli skup podataka, potvrđena su tri događaja rekombinacije, dva koja uključuju interne čvorove, a drugi koji uključuje jedan genom u terminalnoj grani, za koji se klonski kompleksi nisu mogli dodijeliti (Tabele 4 i 5). Identifikacija događaja u terminalnim granama može ukazivati na to da je rekombinacija još uvijek u toku kod savremenih sojeva M. bovis ili da je rezultat pogrešno postavljen70. U ovoj hipotetičkoj regiji rekombinacije, približno 20% pozicija ima nedefinirane nukleotide (N), što utiče na signal rekombinacije (Dodatna slika 2). Osim toga, ova regija utiče na gen rrs, koji kodira 16S ribosomsku RNK za koju se očekuje da je visoko konzervirana, tako da ovaj pretpostavljeni signal rekombinacije može biti rezultat grešaka u sekvenciranju ili pogrešnog poravnanja. Zatim je izvršeno poravnanje cijelog genoma između Mb0003 i Mycobacterium bovis AF2122/97, te je potvrđeno postojanje nedefiniranih nukleotida i SNP-ova, tako da mogući problemi vezani za pogrešno poravnanje nisu bili posljedica bioloških informacija implementiranih u ovom radu, već su se pojavili nakon učenja programa.
Nisu pronađene praznine ili nedefinirani nukleotidi u rekombinacijskim regijama unutrašnjih čvorova (Slike 4 i 5). Što se tiče ovih događaja, jedan sadrži samo genom Eu2 i utiče na gen pks12, koji kodira moguću poliketid sintazu; dok je drugi registrovan u genomu Eu1 i utiče na gen narX koji kodira moguću nitrat reduktazu (Tabela 4). Općenito, analiza rekombinacije pokazuje da postoji ograničen broj fragmenata rekombinacije sa statističkom podrškom, a izvedeni indikatori ukazuju na to da rekombinacija ima mali uticaj na liniju M. bovis. Očekuje se da će signal rekombinacije biti nizak, ali je važno razlikovati pravi signal evolucije od pozadinske buke, što je izazovan zadatak. Kako bi se smanjio signal buke koji uvode problemi sastavljanja zasnovani na referencama i neusklađenosti 70, 71, svi ostali osim kompletnog genoma su sastavljeni od nule, a kvalitet sastavljanja je provjeren i osiguran QUAST analizom cjevovoda (Dodatna tabela 1). Pored toga, proveden je niz dodatnih analiza kako bi se osigurala robusnost i tačnost cjelokupnog istraživanja. Stoga je kvalitet sekvenciranja gena narX i pks12 procijenjen mapiranjem očitavanja u odnosu na Mycobacterium bovis AF2122/97. Preporučena pozicija SNP-a u rekombinacijskoj regiji potvrđena je primjenom kriterija navedenih u odjeljku o metodi (najmanje 20 očitavanja i učestalost promjena od 0,9). Polimorfizam gena narX u potpunosti je potvrđen u dva genoma (Mb1792361 i Mb7240415; 2,3%) i genomima genoma pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 i Mb12. Međutim, za genom Mb2043, šest od osam pozicija ne ispunjava kriterij dubine čitanja jer SNP podržava maksimalno 17 čitanja, što je ispod utvrđene granične vrijednosti od 20. Stoga se može potvrditi rekombinacija šest genoma (8,6%) na ovom mjestu genoma (Slike 4 i 5).
Detaljna vizualizacija poravnanja rekombinacijske regije skupa podataka Mycobacterium bovis utiče na gen narX koji kodira moguću nitrat reduktazu. Nisu pronađene praznine ili nedefinirani nukleotidi u rekombinacijskoj regiji unutrašnjih čvorova. Ovaj konkretan događaj je registrovan u genomu Eu1. Kvalitet sekvenciranja gena narX procijenjen je crtanjem očitavanja Mycobacterium bovis AF2122/97. Potvrdite preporučenu lokaciju SNP-a u području rekombinacije primjenom kriterija navedenih u odjeljku o metodi (najmanje 20 očitavanja i frekvencija promjena od 0,9). Polimorfizam gena narX je u potpunosti potvrđen u genomima Mb1792361 i Mb7240415 (2,3%).
Detaljna vizualizacija poravnanja rekombinacijske regije skupa podataka Mycoplasma bovis koji utiče na gen pks12. Nisu pronađene praznine ili nedefinirani nukleotidi u rekombinacijskoj regiji unutrašnjih čvorova. Što se tiče događaja koji utiče na gen pks12 koji kodira moguću poliketid sintazu, on sadrži samo genom Eu2. Kvalitet sekvenciranja pks12 procijenjen je mapiranjem očitavanja Mycobacterium bovis AF2122/97. Potvrdite preporučenu lokaciju SNP-a u području rekombinacije primjenom kriterija navedenih u odjeljku o metodi (najmanje 20 očitavanja i frekvencija promjena od 0,9). Polimorfizmi genoma Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 i Mb1960 su u potpunosti potvrđeni.
PE i PPE geni imaju repetitivne regije koje se lako pogrešno očitavaju sekvenciranjem i pogrešnim mapiranjem pomoću Illumina-e, tako da se obično brišu iz bioinformatičkog toka rada članova M. tuberculosis samo kada se koristi strategija mapiranja u sekvencu. Zaključivanje o događajima rekombinacije primijenjeno u ovom radu zasniva se na de novo sastavljanju bez filtriranja PE/PPE. Vjerujemo da su, implementacijom tri različite komplementarne metode i algoritma putem SplitsTree, Gubbins pipeline-a i RDP4 softvera, primijenjene strategije robusne za obradu i filtriranje reorganizovanih regija uzrokovanih signalima greške. Međutim, kako bi se isključila interferencija PE/PPE gena na Gubbins i RDP4 softverima za identifikaciju SNP klastera, a time i identifikacija rekombinacijskih regija za koje se predlaže da utiču na gene narX i pks12, ispitano je susjedstvo ovih gena (Dopunska slika 3–5). Kod M. bovis AF2122/97, gen narX je odvojen sa narK2 i Mb1764c, dok je pks12 okružen sa Mb2075c i Mb2073c (Dodatna slika 3-5). Mapa generisana korištenjem MAUVE sinlinijske mape kompletnog genoma pruža informacije o očuvanosti i preuređenju genske sekvence, prikazujući četiri kolinearna bloka i bez znakova translokacije ili inverzije genoma. Pored toga, analiza komplementacije sa aminokiselinskom sekvencom dokazala je homologiju u svim kompletnim genomima, a PE/PPE nije pronađen u susjednim regijama narX ili pks12. Za narX, jedan genom (Mb0030) ima niži rezultat sinonimije jer je gen narX identifikovan kao dva fragmenta (fragmenti 1891 i 1890). Za pks12, zbog sličnosti, Mb0030 i Mb003 pokazali su niže rezultate silinearnosti, dok je pks12 identificiran u dva, odnosno tri fragmenta, koji predstavljaju različite domene proteina (Dodatna slika 3-5). Uzimajući u obzir ove informacije, te činjenicu da Gubbins i RDP4 softver oba provode analizu, provjeravaju višestruko poravnanje jezgra od maksimalnih 500 bp u prozoru, te smo potvrdili da gen PE/PPE neće ometati signal rekombinacije koji utiče na narX i pks12.
Iako se signali rekombinacije otkriveni u ovom skupu podataka mogu smatrati rezidualnim, istina je da se rekombinacija kod M. bovis ne može isključiti, tako da bi trebala i dalje biti predmet daljnje analize, u kojoj se cijeli genomi iz različitih epidemioloških scenarija sekvenciraju do važnosti.
Poređenje ML filogenetskih stabala dobijenih prije i nakon korekcije rekombinacije (Slika 2A, B) nije dovelo do značajnih promjena u utvrđenom filogenetskom odnosu, a sojevi M. bovis su grupisani u istu grupu.
Nakon mapiranja 42 novosekvencirana očitanja M. bovis s referentnim genomom M. bovis AF2122/97, dobiveno je poravnanje SNP-ova koje sadrži 1816 polimorfnih pozicija. Većina SNP-ova (87,1%) nalazi se u kodirajućoj regiji, a pogođeni geni su okarakterizirani prema funkcionalnim kategorijama prikazanim u Bovilistu (Slika 6A, B). Uzimajući u obzir ukupan broj gena u svakoj funkcionalnoj kategoriji, geni u kategoriji "metabolizam lipida" pokazali su više SNP-ova, a slijede ih geni u kategoriji "ćelijski zid i ćelijski procesi" te "intermedijarni metabolizam i disanje", što otkriva da se nalaze u evoluciji M. bovis.
Hijerarhijska analiza skupa podataka M. bovis iz Portugala (n = 42). Ukupan broj registrovanih SNP-ova i pogođenih gena za svaku funkcionalnu kategoriju (A). Ukupan broj sinonimnih i nesinonimnih promjena registrovanih po funkcionalnoj kategoriji (B).
Na globalnom nivou, prosječni odnos dN/dS je bolji od 1,5, što ukazuje na to da je globalni evolucijski pritisak da se riješimo predačkog stanja i predstavlja pozitivan (diverzificirani ili usmjereni) i/ili opušteni scenario izbora prečišćavanja. U kategorijama "virulencija, detoksikacija, adaptacija", "insercijske sekvence i fagi" i "regulatorni proteini", više od dvije trećine SNP-ova nisu sinonimni (Slika 6B).
U svim kategorijama postoje geni s višestrukim SNP-ovima, što rezultira prosječnom stopom mutacija (tj. prosječnim SNP-om po genu) većom od 1 (Slika 6A). Pks12 (Mb2074c) s 15 SNP-ova i fas (Mb2553c) s 8 SNP-ova imaju veće vrijednosti mutacija. Oba ova gena uključena su u metabolizam masnih kiselina. Gen pks kodira poliketid sintazu (PKS), koja je multifunkcionalni enzim uključen u biosintezu lipida ćelijskog zida mikobakterija74,75. Ovaj gen kodira multifunkcionalni polipeptid koji je uključen u sintezu mikoketida74,76. Gen fas uključen je u sintezu mikolne kiseline. Oba ova gena igraju važnu ulogu u biosintezi ćelijskog zida u kontaktu s domaćinom.
Kako bi se dalje proučila evolucija bakterije Mycobacterium bovis, analizirana su dva seta specifičnih gena. Prethodno objavljeni radovi koji koriste metode sastava sekvenci i filogenetske metode identificirali su gene koje su preci MTBC-a stekli putem HGT-a prije diverzifikacije37,38. Ovi geni su navedeni u Dodatnoj tabeli 2. Analizirana je SNP distribucija ukupno 77 gena koji mogu biti povezani s HGT-om, a identificirano je 26 polimorfnih mjesta, što je u većini slučajeva (78%) rezultiralo nesinonimnim (NS) promjenama (Dodatna tabela 2). Prethodni rad na genomu MTBC-a pokazao je da pretpostavljena HGT regija pokazuje veći omjer NS SNP-a u usporedbi s ostatkom genoma. Ako se smatra da su ove rekombinacijske regije stekli preci MTBC-a i da stoga previše predstavljaju drevne polimorfizme, onda se očekuje da će udio sinonimnih promjena biti veći, jer se očekuje da će NS supstitucije biti eliminirane negativnom selekcijom zbog promjena aminokiselina koje mogu promijeniti funkciju proteina. Stoga, naši rezultati ukazuju na to da funkcionalne posljedice mogu proizaći iz zamjene gena sličnih HGT-u, što odražava njihov značaj za vrijednu adaptivnu genetičku raznolikost.
Paralelno s ovom analizom, geni koji kodiraju komponente 3R (popravak, replikacija i rekombinacija DNK) sistema detaljno su ispitani u skladu s listom koju su prethodno objavili dos Vultos i saradnici (2008)39. Razmjena identičnih fragmenata DNK ne može se direktno posmatrati, iako može biti čest proces kada su uključene blisko srodne bakterije, kao u slučaju ovog skupa podataka; osim toga, ovaj proces može biti ključ metoda popravke DNK72, tako da igraju ulogu u homolognoj rekombinaciji. Identificirano je ukupno 26 polimorfnih pozicija raspoređenih po 54 gena (Dodatna tabela 3). U ovom skupu gena, NS promjene činile su oko 65% posljedica, što je u skladu s prethodnim izvještajima o sojevima Mycobacterium tuberculosis.
Vrijeme objave: 21. oktobar 2021.