Salamat sa pagbisita sa Kalikasan. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta para sa CSS. Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng mas bagong bersyon ng browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Kasabay nito, upang matiyak ang patuloy na suporta, magpapakita kami ng mga site na walang mga istilo at JavaScript.
Binuhay ng pagkakasunud-sunod ng genome ang larangan ng pananaliksik sa nakakahawang sakit, pagbubunyag ng epidemiology ng sakit, pathogenesis, pakikipag-ugnayan ng host-pathogen, at ang proseso ng ebolusyon na ipinataw sa mga pathogen. Itinuturing ng Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) ang Mycobacterium bovis bilang isa sa mga animal adaptive na miyembro nito na nagdudulot ng tuberculosis (TB) sa mga terrestrial mammal, at isang tipikal na modelo ng bacterial evolution. Tulad ng ibang mga miyembro ng MTBC, ang Mycobacterium bovis ay ipinapalagay na isang mahigpit na naka-clone, dahan-dahang umuusbong na pathogen, at malinaw na walang palatandaan ng recombination o pahalang na paglipat ng gene. Sa gawaing ito, inilalapat namin ang comparative genomics sa isang buong genome sequence (WGS) dataset na binubuo ng 70 baka M. mula sa iba't ibang pedigrees (Europe at Africa) upang makakuha ng mga insight sa genetic diversity ng baka M. Evolutionary power. Tatlong magkakaibang pamamaraan ang ginagamit upang matantya ang mga palatandaan ng muling pag-aayos. Sa buong mundo, ang isang maliit na bilang ng mga kaganapan sa recombination ay natukoy at nakumpirma ng dalawang independiyenteng pamamaraan na may solidong suporta. Gayunpaman, kumpara sa mga mutasyon, ang recombination ay may mas mahinang epekto sa pagkakaiba-iba ng M. bovis (kabuuang r/m = 0.037). Ang pagkakaiba ng r/m average na nakuha sa clonal complex ng Mycobacterium bovis sa aming set ng data ay pare-pareho sa pangkalahatang konsepto na ang antas ng recombination ay maaaring mag-iba nang malaki sa pagitan ng mga lineage na nakatalaga sa parehong taxonomic species. Batay sa gawaing ito, hindi maitatanggi ang recombination sa Mycobacterium bovis, kaya dapat itong maging paksa ng mga karagdagang pagsisikap sa hinaharap na paghahambing na pananaliksik sa genomics, kung saan ang WGS ng malalaking set ng data mula sa iba't ibang mga epidemiological na sitwasyon sa buong mundo ay napakahalaga. Pagkatapos ay isinagawa ang karagdagang pagsusuri sa mas maliit na set ng data ng Mycobacterium bovis (n = 42) mula sa pagkalat ng multi-host TB, at higit sa 1,800 loci ang natukoy, kung saan hindi bababa sa isang strain ang nagpakita ng isang solong nucleotide polymorphism (SNP) . Karamihan sa (87.1%) ay matatagpuan sa rehiyon ng coding, at ang pandaigdigang ratio ng mga hindi magkasingkahulugan na pagbabago (dN/dS) ng mga magkasingkahulugan na pagbabago ay lumampas sa 1.5, na nagpapahiwatig na ang positibong pagpili ay isang mahalagang ebolusyonaryong puwersa na ginawa sa M. bovis. Ang isang mas mataas na proporsyon ng mga SNP ay nakita sa mga gene na mayaman sa mga functional na kategorya ng "lipid metabolism", "cell wall at cellular na proseso", at "intermediate metabolism at respiration", na nagpapakita ng kanilang potensyal sa biology at ebolusyon ng kahalagahan ng Mycobacterium bovis. Ang isang mas malapit na pagtingin sa mga gene sa mga ninuno ng MTBC na madaling kapitan ng pahalang na paglipat ng gene at kasama sa 3R (DNA repair, replication, at recombination) system ay nagpapakita ng global average na negatibong halaga ng Taijima's D neutral test, na nagpapahiwatig ng nakaraang selective scanning Ang kamakailang bottleneck pagkatapos ng paglawak ng populasyon ay ang pangunahing evolutionary driving factor para sa mandatoryong pathogen na Mycobacterium.
Ang Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) ay isa sa pinakamatagumpay na taxa ng bacterial pathogens at isang tipikal na kaso ng bacterial evolution. Ang mga miyembro nito ay nagpapakita ng nakakagulat na mataas na pagkakakilanlan ng nucleotide sa antas ng genomic (> 99%)1,2. Ang iba't ibang mga ecotype ng MTBC ay maaaring magdulot ng tuberculosis (TB), na isang nakakahawang sakit na granulomatous, sa isang malawak na hanay ng mga host species mula sa mga micro-mammal hanggang sa mga tao3,4,5. Sa kasalukuyan, ang complex ay kinabibilangan ng mga tao [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] at mga pathogen na inangkop ng hayop (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter , Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surikampanzee") at "6") M. canettii (kilala rin bilang "Nodobacter glabrata") Ang average na pagkakakilanlan ng nucleotide na may nabanggit na mycobacteria ay 98%, at ipinakita ng comparative genomics work na ang M. canettii at ang iba pang bahagi ng MTBC ay naghiwalay kamakailan mula sa karaniwang ninuno.7 Kung isasaalang-alang ang konseptong ito, tinawag ng ilang may-akda ang M. canettii8 Member.
Ang MTBC ay sistematikong inilarawan bilang isang mahigpit na clonal complex, at ang istraktura ng populasyon nito ay malinaw na pinamamahalaan ng pinababang pagkakaiba-iba, mga bottleneck, selective scanning, at genetic drift9,10. Ipagpalagay na ang kumplikadong mahigpit na clonal evolution, tulad ng mga nawawalang polymorphism ay hindi maibabalik sa pamamagitan ng recombination. Batay sa premise na ito, ang mga magkakasunod na kaganapan ng genomic na pagtanggal ng differential region (RD) at TbD1 (Mtb specific deletion 1 region) ay iminungkahi bilang mga molekular na marker ng MTBC evolution2,5,11. Sinusuportahan ng comparative genomics at whole genome sequencing (WGS) work ang paghahati ng mga miyembrong inangkop ng tao sa siyam na linya (Mycobacterium tuberculosis L1 hanggang L4, L7, at L8; at Mycobacterium africanum L5, L6, at L9), ang mga lineage na L2 hanggang L4 ay ibinahagi tanggalin ang TbD1 region2,11. Bilang karagdagan, iminungkahi ng mga miyembrong naka-adapt ng hayop na magbahagi ng isang karaniwang ninuno, na tinutukoy ng mga pagtanggal na partikular sa clade sa RD7, RD8, RD9 at RD102, 5, at 14.
Ang pahalang na paglipat ng gene (HGT) at recombination na mga kaganapan ay itinuturing na bihira at nangyayari sa mga ninuno ng MTBC, sa halip na ang iba't ibang kasaysayan ng buong miyembro ng MTBC15,16,17. Dalawang maagang ulat ni Hughes at collaborators (2002) at Gutacker and collaborators (2006) ang nagmungkahi na ang mga kaganapan sa recombination ay maaaring makatulong sa paghubog ng mga polymorphism na nagmamarka ng partikular na loci sa M. tuberculosis strains18,19. Ang mga dahilan para sa halatang kakulangan ng recombination sa MTBC ay: (1) ang mekanikal na proseso at pagkawala ng kakayahan ng HGT; (2) ang pambihira ng mga kaganapan sa HGT; (3) walang pagkakataon ng recombination event sa MTBC niche14,17. Kamakailan lamang, ang ilang buong-genome sequencing (WGS) na pag-aaral na inilapat sa MTBC strain 20 at Mycobacterium bovis 21 ay nagbigay ng katibayan ng recombination, ang unang nagpakita na ang MTBC strains ay madalas na nagpapalitan ng maliliit na fragment ng DNA, ngunit dahil sa limitadong pagkakaiba-iba ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide, ang mga kaganapang ito ay hindi pa rin napansin.
Ang Mycobacterium bovis ay ang pinakakaraniwang nare-recover na miyembro ng MTBC mula sa mga alagang hayop (pangunahin ang mga baka), bagama't maaari rin itong ihiwalay sa mga free-range at nabakuran na ligaw na hayop4,22,23,24. Ang M. bovis ay umunlad sa limang pangunahing clonal complexes [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) at Africa 2 (Af2)], ayon sa spoligotyping profile, partikular na mga pagtanggal At single nucleotide polymorphism (SNPs) 25, 27,26, tukoy na gene. Ang mga clonal complex na ito ay nagpapakita ng magkakaibang istruktura ng populasyon ng Mycobacterium bovis at ang kaugnayan nito sa mga heyograpikong rehiyon. Bilang karagdagan, ang kamakailang gawaing WGS na isinagawa ng Zimpel at mga collaborator (2020) ay nagdisenyo ng isang phylogeny batay sa SNP ng Mycobacterium bovis, na may higit sa 1,900 genome, na nagpapahiwatig na mayroong hindi bababa sa apat na magkakaibang mga linya (pinangalanang Lb1 hanggang Lb1 hanggang Lb4), kahit na hindi sila ganap na naaayon sa dating heograpikong kumplikado, bagama't ang mga ito ay hindi ganap na naaayon sa dating heograpikong kumplikado, bagama't ang mga ito ay hindi ganap na naaayon sa dating heograpikong kumplikado. Ang mga may-akda na ito ay nagsagawa ng differential analysis ng phylogeny at molecular dating, ngunit hindi nag-aral ng recombination30.
Ang nakaraang trabaho gamit ang iba't ibang molecular technique, tulad ng spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), at kamakailang SNP typing ay nagsiwalat ng isang tiyak na antas ng genetic diversity sa M. bovis strains 31,32,33, 34,35. Ang pagkakaiba-iba ng pagkakaiba-iba ng genetic ay naging isang mahalagang tool sa pag-aaral ng epidemiology ng sakit, na nakakatulong para sa malalim na pag-unawa sa pathogenesis, virulence at paghahatid ng sakit. Ang paglitaw ng paraan ng WGS ay nagbibigay ng posibilidad na ibunyag ang evolutionary driving factors na ipinataw ng Mycobacterium bovis genome sa proseso ng adaptation at pagtitiyaga sa iba't ibang host at epidemiological scenario.
Sa gawaing ito, gumagamit kami ng comparative genomic analysis sa iba't ibang Mycoplasma bovis datasets (n=70), kabilang ang mga isolates mula sa iba't ibang clonal complex, upang makakuha ng mga insight sa ebolusyonaryong proseso ng Mycoplasma bovis, lalo na upang malutas ang mga phylogenetic na relasyon At recombination na mga kaganapan. Bilang karagdagan sa pagsusuring ito, ang isang sub-data set ng M. bovis isolates (n = 42) na nakuha mula sa isang well-characterized multi-host tuberculosis area sa Portugal 31,36 ay higit pang ginalugad upang mahinuha ang hindi pagkakakilanlan Ang balanse sa pagitan ng relative ratio ng sense (dN) sa magkasingkahulugan (dS) na mga pagpapalit ng nucleotide, na binanggit sa mga partikular na kontribusyon sa ebolusyon ng literatura. 37,38 na nakuha ng mga ninuno ng MTBC sa pamamagitan ng HGT, at nag-encode ng 3R (pag-aayos ng DNA, pagtitiklop, at recombination) na mga bahagi ng gene ng system 39. Pumili ng mga gene na nakuha sa pamamagitan ng HGT dahil maaaring kumatawan ang mga ito sa mga sinaunang polymorphism, kaya inaasahan na maaaring maglaman ang mga ito ng mas mataas na proporsyon ng magkasingkahulugan na mga pagbabago. Ang mga gene na kasama sa 3R system ay pinili dahil ang naunang gawain sa M. tuberculosis strains ay nagpahiwatig ng pangkalahatang negatibo/paglilinis na mga seleksyon na gumagana sa mga gene na ito, at maaaring may mahalagang papel ang mga ito sa ebolusyon 39. Ang isa pang layunin ng gawaing ito ay ipahiwatig ang pagkakaroon ng mga kaganapan sa pagbabagong-tatag. Para sa kadahilanang ito, isinasaalang-alang na ang aming dataset mula sa Portugal ay naglalaman lamang ng mga genome ng European clone complex 2 at ang mga strain na hindi nakatalaga sa clone complex, nagpasya kaming isama ang pampublikong magagamit na data ng genome upang sa wakas ay makakuha ng isang kinatawan ng lahat ng mga clone complex, at Pagbutihin ang katatagan at lawak ng mga resulta.
42 bagong sequenced na Mycoplasma bovis genome mula sa Portuguese endemic multi-host tuberculosis scene (mga detalye sa ibaba), na dating nailalarawan mula sa epidemiological perspective36, ang sentro ng gawaing ito. Isinasaalang-alang na ang set ng data mula sa Portugal ay mayroon lamang mga kinatawan ng European 2 clone complex at strain na walang mga itinalagang complex, idinagdag sa publiko ang whole-genome sequencing data upang palawakin ang set ng data na kinabibilangan ng lahat ng kinatawan ng M. bovis clone complex. Samakatuwid, tatlong buong genome sequencing data source ang ginamit sa gawaing ito: complete/draft genome assembly, hanggang 10 scaffolds na nakaimbak sa NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 isolates); na naka-imbak sa SRA ( Ang Illumina fastq file ng sequence read archive) ay kumakatawan sa kumplikadong pagkakaiba-iba ng M. bovis clone (n = 12 isolates)30; at 42 bagong sequenced genome mula sa Portugal. Ang Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ay hindi kasama sa paghahanap sa NCBI. Ang M. bovis AF2122/97 ay karaniwang ginagamit bilang reference genome na isasama sa dataset. Dahil sa hindi magagamit ng publiko ng buong pagkakasunud-sunod ng genome na kinakatawan ng African 1 cloning complex, at ang maliit na bilang ng mga genome mula sa mga kinatawan na strain ng Af2 at Eu1, ang orihinal na data ng pagkakasunud-sunod na ibinigay ng SRA ay ginamit sa mga kasong ito. Ang gawain ni Zimpel at ng kanyang mga collaborator (2020) ay tumulong na makilala ang genome mula sa nabanggit na cloning complex at tumulong na piliin ang Mycobacterium bovis para isama sa set ng data. Para sa Eu3, isang uri lamang ng genome ang inilarawan (Branger et al., 2020), kaya ang genome na isinama namin ay isang hiwalay na kinatawan ng Eu3 complex.
Sa buong mundo, kasama sa set ng data na ito ang 70 baka M. bovis na nakahiwalay sa 8 host species, na ipinamahagi sa 12 bansa mula 1985 hanggang 2016. 36 na species ang itinalaga bilang Eu2, 7 species ang Eu1, 1 species ang Eu3, 3 species ang Af1, 4 na species ang Af2 at 19 ang hindi nauugnay sa anumang clonal complex (na may kaugnayan sa alinmang clonal complex). Ang detalyadong impormasyon (kabilang ang numero ng pag-access) ng Mycobacterium bovis na ginamit sa pag-aaral na ito ay ipinapakita sa Talahanayan 1 at Karagdagang Talahanayan 1.
42 na bagong sequenced na buong genome ng Mycobacterium bovis mula sa mga animal tuberculosis hotspot ng Portugal at ipinamahagi nang higit sa 12 taon ang sentro ng pag-aaral na ito, dahil ang mga potensyal na wildlife-livestock disease system ay regular na sinusubaybayan 31,36 (Karagdagang Fig. 1). Ayon sa kasunod na mga pamamaraan, ang mga strain na ito ay nahiwalay sa mga baka (n = 14), pulang usa (n = 16) at baboy-ramo (n = 12) mula 2003 hanggang 2015: kinokolekta at pinangangasiwaan ang mga hayop alinsunod sa inirerekomendang mga alituntunin ng protocol Ang mga sample ng tissue ay nasa OIE Terrestrial Animal Handbook at inoculated sa Stonebringen-J at solidong medium na Löwensteink. Ang mga kultura ay incubated sa 37 °C at ang paglaki ay sinusuri isang beses sa isang linggo para sa hindi bababa sa 12 linggo. Ang mga kolonya ay direktang iniimbak sa isang gliserol na solusyon sa -80ºC. Sa Mycobacterium selective medium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), ang mga orihinal na naka-archive na sample ay ipinasa sa isang solong in vitro passage in vitro upang makuha ang DNA ng WGS program. Para dito, ang frozen culture stock solution ay pinayaman ng 5% sodium pyruvate at 10% ADS (50 g albumin, 20 g glucose, 8.5 g sodium chloride sa 1 L na tubig) sa Middlebrook 7H9 sa 37°C Retrain. Pagkatapos ng 4 na linggo ng paglaki, ang daluyan ay na-renew at ang kultura ay regular na sinusubaybayan hanggang sa paglaki ay naobserbahan. Ang mga cell ay inani sa pamamagitan ng centrifugation, ang pellet ay muling sinuspinde sa 500 µL phosphate buffered saline (PBS), pinainit sa 99 ° C sa loob ng 30 minuto, centrifuged, at ang supernatant ay naka-imbak sa -20 °C hanggang WGS. Ang lahat ng mga pamamaraan ay isinasagawa sa antas 3 biosafety facility.
Ang WGS paired-end genome library ay inihanda gamit ang natatanging index ng bawat sample ng DNA, at gumagamit ng Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 sample) at HiSeq (2 × 150 pb) (dalawang isolates) na teknolohiya (Eurofins Genomics, Germany) para sa sequencing. Ayon sa mga tagubilin ng tagagawa, gamitin ang Illumina Genome Analyzer na may double-ended na module attachment para i-sequence ang genomic DNA, at gamitin ang Nextera XT DNA Library Prep Kit mula sa Illumina para buuin ang library.
Isinasaalang-alang ang data na nakuhang muli mula sa SRA (n = 12), ang pagkakakilanlan ng clone complex ay maaaring gamitin bilang metadata ng kaukulang publikasyon 30, 41, 43. Kung isasaalang-alang ang kumpletong genome, maliban sa Mycobacterium bovis AF2122/97 at Mycobacterium bovis 3601, na kinikilala ang mga miyembro ng cloud1nal complex ng 3601 at Eco. 29, ayon sa pagkakabanggit, ito ay kapareho ng kumpletong genome ng Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI accession number NC_000962.3). Ginagawa ang genome alignment gamit ang MAFFT (multiple alignment program ng amino acid o nucleotide sequence, version 7.458) at parameter -addfragments48. Pagkatapos, hanapin ang kawalan ng iba't ibang mga clonal complex at/o ang pagkakaroon ng mga feature ng SNP.
Ang bagong sequenced Mycobacterium bovis (n = 42) at ang orihinal na mga nabasa ng assembled genome draft (n = 3) ay nakahanay sa complex sa reference na genome Mycobacterium tuberculosis H37Rv sa pamamagitan ng vSNP pipeline at ang pagkakaroon ng pagtanggal at/o SNP na mga feature ng iba't ibang clone Isang paghahanap ang isinagawa.
Mangolekta ng impormasyon mula sa kakulangan ng mga tampok at/o ang pagkakaroon/kawalan ng SNP at mga profile ng spoligotyping upang magtalaga ng genomic data sa kaukulang clonal complex. Para sa apat na draft assemblies, hindi mahihinuha ang profile ng spoligotyping, kaya kasama ang mga ito sa pangkat na "walang kumplikado."
Ang bioinformatics workflow na sinusundan ng gawaing ito ay nagsisimula mula sa de novo assembly at pagma-map sa isang reference na diskarte, na may layuning tuklasin ang mga kaganapan sa recombination at mga partikular na genome polymorphism. Ang Figure 1 ay nagbibigay ng flowchart ng mga hakbang na sinundan. Para sa recombination analysis, ang lahat ng genome ay ginagamit upang mapataas ang tibay ng mga inferences at mga kaugnay na indicator.
Upang mabawasan ang mga pagkakamali sa pagbuo ng mga pagkakasunud-sunod ng genome consensus, nakuha muna namin ang de novo assembly, at pagkatapos ay nakuha ang maraming mga core na pagkakahanay. Ang Unicycler pipeline ay kasalukuyang available sa https://github.com/rrwick/Unicycler49 at ginagamit para magsagawa ng de novo assembly ng 54 sequenced genome (42 na bagong sequenced at 12 fastq file na na-recover mula sa SRA). Sa madaling salita, bago mag-assemble mula sa simula, isinagawa ang pagsusuri sa kalidad ng pagbasa sa bersyon 0.11.7 ng FastQC (https://github.com/s-andrews/FastQC), at bersyon ng Trimmomatic na 0.36 (pagpipilian na "pagputol ng mga Adapter at iba pang mga pagkakasunud-sunod na partikular sa pag-iilaw mula sa mga nabasa" at "Pag-cut ng mga base mula sa dulo ng threshold" kung mas mababa ang kalidad kaysa sa 2 threshold. (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Pagkatapos, ginamit ang SPAdes optimiser49 para sa genome assembly, at ginamit ang Pilon version 1.1851 para sa post-assembly optimization. Pinili ang isang konserbatibong bridging mode upang maiwasan ang maling pagpupulong, at ang laki ng k-mer ay hinanap at pinili sa pagitan ng 20% at 95% ng haba ng nabasa. Sundin ang mga alituntunin ng SPAdes at isaalang-alang ang laki ng nabasa, tanggalin ang mga contig na mas maliit sa 300 bp, at magtatag ng 20 read depth coverage cutoff na 52. Sa diskarte sa pagpupulong ng de novo, hindi inalis ang mga genomic na rehiyon tulad ng napaka-uulit na proline-glutamate (PE) at proline-proline glutamate (PPE) paralog.
Ang kalidad ng de novo assembly ay tinasa sa pamamagitan ng QUAST pipeline (//quast.sourceforge.net/quast.html), na pinapadali ang pag-renew ng contig at ang M. bovis AF2122/97 reference genome (NCBI accession number LT708304.1) Mapping (tingnan ang Karagdagang Talahanayan 1 para sa mga parameter ng kalidad).
Sa tulong ng vSNP pipeline (https://github.com/USDA-VS/vSNP), ang FASTQ file ng bagong sequenced M. bovis mula sa Illumina sequencing ay inihambing sa M. bovis AF2122/97 reference genome (LT708304.1)). Ayon sa mga rekomendasyon sa pinakamahusay na kasanayan ng Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, ilapat ang mga karaniwang parameter ng filter o variant na mga marka ng masa para sa muling pagkakalibrate. Ang mga resulta ay sinasala gamit ang pinakamababang marka ng masa ng SAMtools na 150 at AC = 2. Gamitin din ang Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) upang suriin ang mga pagbabasa upang maalis ang kontaminasyon. Ang vSNP pipeline na ginamit sa pagmamapa sa mga diskarte sa pagkakasunud-sunod sa aming trabaho ay sumusuri ng isang serye ng mga tinukoy na SNP at mga target, at hindi rin kasama ang magkahalong mga sitwasyon ng impeksyon. Ang nabasa na saklaw ng genome ay mas mahusay kaysa sa 99% (Karagdagang Talahanayan 1).
Upang maiwasan ang mga error sa pagmamapa at mga maling SNP, i-filter ang isang variant sa mga sumusunod na kaso: (1) ito ay sinusuportahan ng mas mababa sa 20 pagbabasa, (2) ito ay matatagpuan na may dalas na mas mababa sa 0.9, (3) ito ay nasa hindi bababa sa isang Strain, ngunit hindi bababa sa may mga gaps sa isa pang strain. Ang integrated genomics viewer (IGV) na bersyon 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 ay ginamit upang biswal na i-verify ang mga SNP at mga posisyon na may mga problema sa pagmamapa o pag-align. Dahil ang mga gene na proline-glutamate (PE) at proline-proline glutamate (PPE) ay lubos na nadoble at bahagi ng isang multi-gene na pamilya, madali silang hindi maintindihan ng pagkakasunud-sunod at mismapping ng Illumina, kaya mas gusto ang mga ito Ang mycobacterial bioinformatics workflow ay nag-alis ng mga miyembro ng tuberculosis complex kapag ginagamit ang diskarte sa pagkumpirma ng SNP sa pagkakasunud-sunod. Samakatuwid, na-filter namin ang mga PE/PPE genes at indels mula sa pagsusuri.
Ayon sa Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), ang lahat ng SNP ay nahahati sa mga functional na kategorya. Ang pipeline ng SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) ay ginagamit upang ipahiwatig ang mga kahihinatnan ng SNP (mga pagbabagong magkasingkahulugan o hindi magkasingkahulugan). Gumawa ng bagong database ng Mycobacterium bovis AF2122/97 genome (LT708304.1).
Ang core genome multiple alignment ay isinagawa gamit ang Parsnp v1.2, kasalukuyang available sa https://github.com/marbl/parsnp57, gamit ang 69 kumpletong genome/draft assemblies (na may opsyon -c) at M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) ay ginagamit bilang sanggunian. Apat na core multiple alignment ang isinagawa: ang mga miyembro lamang ng Eu2 cloning complex (n = 37), kasama ang lahat ng miyembro ng European cloning complex (n = 44), kabilang ang junction point ng European at African cloning complex (n = 51), at isama ang lahat ng Mycobacterium bovis sa pag-aaral na ito (n = 70).
Ang core alignment na nabuo ng Parsnp ay ginagamit upang mahinuha ang maximum likelihood (ML) phylogenetic tree gamit ang CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 gamit ang RAxML, at magsagawa ng 1000 guided replications.
Tatlong magkakaibang mga algorithm at bioinformatics tool ang ginagamit upang suriin ang pagkakaroon ng mga kaganapan sa recombination nang magkatulad: SplitsTree4 software, Gubbins (walang pinapanigan na linya sa pamamagitan ng recombination sa mga nucleotide sequence) pipeline, at RDP4 (recombination detection program, bersyon beta 4.101) software.
Ang split decomposition method na ipinatupad sa SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 ay ginagamit upang kalkulahin ang walang ugat na phylogenetic network, gamit ang Phi test para sa statistical verification, at ang significance threshold ay p = 0.05. Ang core multi-alignment analysis ng Parsnp ay ginagamit bilang input, at ang splitting decomposition bilang isang network standard ay naisasakatuparan.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 ay tumatakbo na may mga default na parameter bilang isa pang paraan upang suriin ang epekto ng recombination sa Mycobacterium bovis. Ang algorithm na ipinatupad sa pipeline ay muling nagtatayo ng nauugnay na clone lineage Ang kumpletong genome/draft assembly ng aming data set at ang reference genome/97 LT708304.1) ay magkapareho; at i-scan ang posisyon ng SNP sa bawat branch ng puno upang makita ang SNP cluster na kumakatawan sa recombination na kaganapan.
Sa wakas, upang kumpirmahin ang kaganapan ng pagbabagong-tatag na iminungkahi ng pipeline ng Gubbins, ang anim na algorithm na ipinatupad sa RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 at SiScan66) ay inilapat sa core multiple alignment ng Parsnp sa ilalim ng mga default na setting. Natukoy namin na hindi bababa sa tatlo sa mga algorithm na ipinapatupad sa RDP4 ay dapat na patuloy na magpakita ng isang mahalagang signal upang i-verify ang bawat kaganapan ng recombination.
Isinasaalang-alang na ang parehong Gubbins at RDP software ay naghahanap ng mga signal ng recombination sa pamamagitan ng pagsuri sa core multiple alignment sa isang window na hanggang 500 bp, at pagkumpirma na ang pagsasama ng PE/PPE genes sa panahon ng de novo assembly ay hindi makagambala sa mga recombination signal na natagpuan, ang karagdagang pagsusuri ay ginagawa sa pamamagitan ng homolinearity Suriin ang paligid ng recombination na kaganapan na nagpapakilala sa kaganapan ng recombination. Ang synlinear na mapa gamit ang kumpletong genome ay itinayo gamit ang MAUVE-multi-genome alignment (//darlinglab.org/mauve/mauve.html) upang ibukod ang mga lokal na genome translocation o inversions. Bilang karagdagan, ang buong genome ay ginamit upang magsagawa ng pagsusuri ng homolinearity sa pagkakasunud-sunod ng amino acid sa pamamagitan ng SyntTax web server (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Ang isang mas malalim na pagsusuri ng genome data set na nakuha mula sa Portuguese multi-host tuberculosis system ay upang suriin ang polymorphism ng mga gene na binanggit sa panitikan. Ang mga gene na ito ay 37,38 at ang gene encoding na 3R na nakuha ng mga ninuno ng MTBC sa pamamagitan ng HGT (DNA repair, replication and recombination) na mga bahagi ng system 39. Gumamit ng ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) at gumamit ng DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnucleotide divers) at nucleotivers gene. (π) at D neutral test parameter input ng Tajima.
Ang isang maximum na posibilidad (ML) phylogenetic tree batay sa 69 Mycoplasma bovis isolates at reference genome ay nakuha (Larawan 2A). Kung ikukumpara sa mga single-gene-based na puno o multi-locus-based na puno, ang diskarte na ito ay nagbibigay-daan para sa pagbuo ng mas malakas na mga puno na hindi nakukuha ang pagkakaiba-iba ng buong genome at samakatuwid ay nagpapakita ng mas mababang kakayahang magdiskrimina sa pagitan ng mga species 68,69. Ang topological na istraktura ng puno ng ML ay karaniwang pare-pareho sa kumplikadong pag-uuri ng mga clone. Ang genome ng Eu2 ay naka-cluster sa isang sangay, at ang genome ng Af1 ay pinagsama-sama din (Larawan 2A). Ang resulta ay naaayon din sa kilalang ebolusyonaryong relasyon ng Mycobacterium bovis, iyon ay, mayroong malaking pagkakaiba sa pagitan ng miyembro ng Eu1 at ng pangkat na binubuo ng lahat ng iba pang mga clonal complex at genome, ngunit ang clonal complex 30 ay hindi tinukoy. Ang maliit na hindi pagkakapare-pareho sa pagitan ng clonal complex at ang relasyon na naobserbahan sa phylogenetic tree ay maaaring ipaliwanag sa pamamagitan ng katotohanan na ang clonal complex ay inilarawan batay sa mga tiyak na genomic na rehiyon, habang ang phylogenetic tree ay batay sa maraming alignment ng mga core genome na kumakatawan sa buong genome.
Ang maximum na posibilidad na phylogenetic tree (GTR) ay itinayo batay sa core genome alignment ng Mycobacterium bovis genome bago (A) at pagkatapos (B) na alisin ang recombination site. Ang mga kulay ng sanga ay kumakatawan sa Mycobacterium bovis clone complex: Europe 1 ay purple, Europe 2 ay pula, Europe 3 ay blue, Africa 1 ay orange, at Africa 2 ay green. Ang puno ay nakaugat at iginuhit sa sukat, at ang haba ng sanga ay sinusukat bilang kapalit para sa bawat site.
Ang Mycobacterium tuberculosis complex ay inilarawan bilang clonally evolved, at karamihan sa mga ebidensyang naipon sa paglipas ng mga taon ay sumusuporta sa ideya na ang patuloy na HGT at recombination na mga kaganapan ay hindi magaganap sa nakikitang antas ng MTBC15,17,18.
Ang nakaraang gawain ay nagpakita na maaaring may limitadong recombination sa pagitan ng MTBC strains20,21, habang ang iba ay nabigo na makilala ang masusukat na mga kaganapan sa recombination70,71. Muling talakayin ang isyung ito na may pagtuon sa Mycobacterium bovis, na iba sa nakaraang gawain na isinasaalang-alang lamang ang Mycobacterium tuberculosis 70,71; o isaalang-alang ang MTBC sa kabuuan, na halos walang M. bovis na kumakatawan sa 20; o isaalang-alang lamang ang mga paghihigpit na fraction ng baka. Ang mycobacteria dataset, sa gawaing ito, mayroong kabuuang 70 mga strain, na kumakatawan sa lahat ng mga clonal complex, na ginamit upang i-screen para sa recombination. Ang set ng data ay na-scale ayon sa apat na pinagsama-samang antas: (1) mga miyembro ng Eu2, (2) lahat ng European clone complex na miyembro (ibig sabihin, Europe), (3) European at African clone complex (Eu + Af) at (4) ang buong Koleksyon ng data (kabilang ang mga genome na hindi kasama sa anumang cloning complex na inilarawan na).
Upang higit pang pag-aralan ang hypothesis na ito, ang isang split-decomposition network ay isinagawa upang masuri ang kawalan ng mga kaganapan sa recombination sa pagitan ng mga genome, dahil ang pamamaraang ito ay maaaring mailarawan ang ancestral na relasyon sa pagitan ng mga indibidwal at magpakita ng magkasalungat na phylogenetic signal. Kinumpirma ng lahat ng apat na set ng data sa pagsusuri ang pagkakaroon ng mga loop sa network (iyon ay, mga lugar na hindi nagtatagpo sa iisang puno), ngunit ang Phi test ay walang suporta sa istatistika (Eu2, p = 0.0956; Europe, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; ang buong set ng data na p = 0.2451 ay nagbibigay ng hindi magandang ebidensiya para sa pagkakaroon ng ebidensiya para sa pag-iral. 3A-D).
Sa Europe 2 genome (n = 37) (A), European genome (n = 44) (B), European at African genome (n = 51) (C) at ang buong set ng data (n = 70) (D).
Pagkatapos ng pagsusuri na ito, at isinasaalang-alang ang mga cyclic na obserbasyon sa lahat ng mga network, ang reconstruction algorithm na ipinatupad sa pipeline ng Gubbins ay inilapat upang muling buuin ang clonal lineage at upang madagdagan ang pagtatantya ng epekto ng recombination sa M. bovis genome. Ipahiwatig ang pinagsama-samang bilang ng mga kaganapan sa recombination, karamihan sa mga ito ay naganap sa mga sanga ng terminal (iyon ay, sa isang genome) (Talahanayan 2). Ang mga tagapagpahiwatig na ito ay nagpapakita ng pagkakapare-pareho ng buong set ng data at nagpapahiwatig na ang dalas ng mga kaganapan sa recombination ay 200 hanggang 300 beses kaysa sa mga mutasyon. Kapag ang parameter ng rho/theta na kumakatawan sa mga kamag-anak na rate ng recombination at point mutations sa sangay ay lumilitaw na nasa pagitan ng 0.0037 at 0.0056 (Talahanayan 3). Kamakailan lamang, ang nai-publish na gawain ng 38 M. bovis strain ay nagpakita ng mas mataas na halaga ng rho/theta (rho/theta = 0.1) kaysa sa nakuha sa dataset na ito, ngunit ang gawain ni Patané at mga kasamahan ay gumamit ng reference-based na pagpupulong upang maghinuha ng mga parameter ng recombination , Isang detalye ng pamamaraan, dahil sa pamamaraan ng pagpupulong, ay nauugnay sa recombination ng mga sangay ng mga kaganapan sa putative.
Susunod, ang r/m parameter ay kumakatawan sa diversity ratio ng recombination at mutation introduction, at ang average na halaga nito ay nasa pagitan ng 0.025 at 0.037, na nagpapahiwatig na kumpara sa mutations, ang recombination ay may mas mababang pangkalahatang epekto sa genetic diversity ng M. bovis (Talahanayan 3)). Para sa malawak na paghahambing, ginamit ang isang katulad na pamamaraan upang tantyahin ang r/m parameter para sa MTBC dataset na binubuo ng 23 genome, na nagpapakita ng average na halaga na 0.48620, habang para sa Patané at mga kasamahan na 38 M. bovis dataset, pinatunayan nito ang average na halaga Ay 0.98. Sa unang pag-aaral, dalawa lamang sa 23 genome ang kasama sa gawain ng M. bovis (M. bovis BCG at ang reference strain), kaya maaaring maging bias ang nakuhang halaga dahil sa sobrang pagpapahayag ng M. tuberculosis genome . Sa pangalawang ulat, ang nasuri na populasyon ng Mycobacterium bovis ay pangunahing nakuhang muli mula sa Estados Unidos at mga host ng hayop. Sa kaibahan, sa aming set ng data, mas maraming heyograpikong lokasyon at host species ang kinakatawan, at ang mga genome na pinagsama-sama sa iba't ibang mga clonal complex na may iba't ibang mga genetic na katangian ng populasyon ay ginagamit din, kaya nakakamit ang isang mas malalim at mas malawak na kaalaman sa Populasyon. Ang pagkakaiba ng average na halaga ng r/m na nakuha sa aming set ng data ay pare-pareho sa konsepto na ang antas ng recombination ay lubhang nag-iiba sa pagitan ng mga lineage na nakatalaga sa parehong taxonomic species, kaya ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang M. bovis clone complex ay maaaring magpakita ng mga pagkakaiba sa recombination Ang epekto ay tulad din ng iminungkahi ni Didelot & Maiden72. Gayunpaman, ang makabuluhang pagpapalawak ng set ng data na ito sa pamamagitan ng pagsasama ng mas malaking bilang ng M. bovis genome ay magbibigay-daan para sa karagdagang paglilinaw ng puntong ito. Parehong ang r / m at rho / theta na mga parameter ay nagpapakita ng pagkakaiba-iba sa pagitan ng mga sanga, at ang resulta na ito ay pare-pareho sa mga ulat sa iba pang mga bacterial species72,73.
Sa wakas, upang kumpirmahin ang mga kaganapan sa muling pagsasaayos na kinilala ng pipeline ng Gubbins, anim na magkakaibang algorithm ang ginamit sa software ng RDP4 upang independiyenteng subukan ang iba't ibang mga pangunahing multi-paghahambing. Sa buong mundo, wala pang kalahati ng mga kaganapang kinilala ni Gubbins ang kinumpirma ng RDP4 (Tables 4 at 5). Isinasaalang-alang ang buong set ng data, tatlong mga kaganapan sa recombination ang nakumpirma, dalawa na kinasasangkutan ng mga panloob na node at ang isa pa ay kinasasangkutan ng isang solong genome sa isang sangay ng terminal, kung saan ang mga clonal complex ay hindi maitalaga (Talahanayan 4 at 5). Ang pagkakakilanlan ng mga kaganapan sa mga sanga ng terminal ay maaaring magpahiwatig na ang recombination ay nagpapatuloy pa rin sa kontemporaryong M. bovis strains o ang resulta ay nailagay sa ibang lugar70. Sa rehiyon ng hypothetical na recombination na ito, humigit-kumulang 20% ng mga posisyon ay may hindi natukoy na mga nucleotides (N), kaya nakakaapekto sa signal ng recombination (Karagdagang Larawan 2). Bilang karagdagan, ang rehiyon na ito ay nakakaapekto sa rrs gene, na naka-encode sa 16S ribosomal RNA na inaasahang lubos na mapangalagaan, kaya ang putative recombination signal na ito ay maaaring resulta ng mga error sa pagkakasunud-sunod o misalignment. Pagkatapos ay ang buong genome alignment sa pagitan ng Mb0003 at Mycobacterium bovis AF2122/97 ay ginanap, at ang pagkakaroon ng hindi natukoy na mga nucleotide at SNP ay nakumpirma, kaya ang mga posibleng problema na nauugnay sa maling pagkakahanay ay hindi dahil sa biological na impormasyon na ipinatupad sa gawaing ito Lumitaw pagkatapos malaman ang programa.
Walang mga gaps o hindi natukoy na mga nucleotide ang natagpuan sa mga rehiyon ng recombination ng mga panloob na node (Mga Figure 4 at 5). Tungkol sa mga kaganapang ito, ang isa ay naglalaman lamang ng Eu2 genome at nakakaapekto sa pks12 gene, na nag-encode ng posibleng polyketide synthase; habang ang isa ay nakarehistro sa Eu1 genome at nakakaapekto sa narX gene na nag-encode ng posibleng nitrate reductase (Talahanayan 4). Sa pangkalahatan, ipinapakita ng pagsusuri ng recombination na may limitadong bilang ng mga fragment ng recombination na may suporta sa istatistika, at ang mga inferred indicator ay nagpapahiwatig na ang recombination ay may mababang epekto sa M. bovis lineage. Inaasahang mababa ang signal ng recombination, ngunit mahalagang makilala ang tunay na signal ng ebolusyon mula sa ingay sa background, na isang mapaghamong gawain. Upang mabawasan ang signal ng ingay na ipinakilala ng reference-based na pagpupulong at mismatch na mga problema 70, 71, ang lahat ng iba pa maliban sa kumpletong genome ay natipon mula sa simula, at ang kalidad ng pagpupulong ay nasuri at natiyak ng QUAST pipeline analysis (Karagdagang Talahanayan 1). Bilang karagdagan, ang isang serye ng mga karagdagang pagsusuri ay isinagawa upang magbigay ng katatagan at katumpakan ng pangkalahatang survey. Samakatuwid, ang kalidad ng pagkakasunud-sunod ng narX at pks12 na mga gene ay nasuri sa pamamagitan ng read mapping laban sa Mycobacterium bovis AF2122/97. Ang inirekumendang posisyon ng SNP sa rehiyon ng recombination ay nakumpirma sa pamamagitan ng paglalapat ng mga pamantayang binanggit sa seksyon ng pamamaraan (hindi bababa sa 20 pagbabasa at 0.9 na dalas ng pagbabago). Ang polymorphism ng narX gene ay ganap na nakumpirma sa dalawang genome (Mb1792361 at Mb7240415; 2.3%) at ang mga genome ng pks12 genome: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb17046, Mb17046, Mb. Gayunpaman, para sa genome Mb2043, anim sa walong posisyon ang hindi nakakatugon sa criterion ng lalim ng pagbasa dahil ang SNP ay sinusuportahan ng maximum na 17 reads, na mas mababa sa itinatag na halaga ng cutoff na 20. Samakatuwid, ang recombination ng anim na genome (8.6%) sa genome site na ito ay maaaring makumpirma (Figures 4 at 5).
Ang detalyadong visualization ng recombination region alignment ng Mycobacterium bovis dataset ay nakakaapekto sa narX gene na nag-encode ng posibleng nitrate reductase. Walang mga gaps o hindi natukoy na mga nucleotide ang natagpuan sa recombination na rehiyon ng mga panloob na node. Ang partikular na kaganapang ito ay nakarehistro sa Eu1 genome. Ang kalidad ng pagkakasunud-sunod ng narX gene ay nasuri sa pamamagitan ng pag-plot ng mga pagbasa ng Mycobacterium bovis AF2122/97. Kumpirmahin ang inirerekomendang lokasyon ng SNP sa recombination area sa pamamagitan ng paglalapat ng pamantayang binanggit sa seksyon ng pamamaraan (hindi bababa sa 20 pagbabasa at 0.9 na dalas ng pagbabago). Ang polymorphism ng narX gene ay ganap na nakumpirma sa mga genome ng Mb1792361 at Mb7240415 (2.3%).
Detalyadong visualization ng recombination region alignment ng Mycoplasma bovis dataset na nakakaapekto sa pks12 gene. Walang mga gaps o hindi natukoy na mga nucleotide ang natagpuan sa recombination na rehiyon ng mga panloob na node. Tungkol sa kaganapang nakakaapekto sa pks12 gene na pag-encode ng posibleng polyketide synthase, naglalaman lamang ito ng Eu2 genome. Ang kalidad ng pagkakasunud-sunod ng pks12 ay nasuri sa pamamagitan ng read mapping ng Mycobacterium bovis AF2122/97. Kumpirmahin ang inirerekomendang lokasyon ng SNP sa recombination area sa pamamagitan ng paglalapat ng pamantayang binanggit sa seksyon ng pamamaraan (hindi bababa sa 20 pagbabasa at 0.9 na dalas ng pagbabago). Ang mga polymorphism ng mga genome na Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, at Mb1960 ay ganap na nakumpirma.
Ang mga gene ng PE at PPE ay may mga paulit-ulit na rehiyon na madaling maling nabasa ng pagkakasunud-sunod at maling pagmamapa ng Illumina, kaya kadalasang tinatanggal ang mga ito mula sa bioinformatics na daloy ng trabaho ng mga miyembro ng M. tuberculosis kapag ginagamit lamang ang diskarte sa pagmamapa-sa-sequence. Ang hinuha ng recombination event na inilapat sa gawaing ito ay batay sa de novo assembly nang hindi sinasala ang PE/PPE. Naniniwala kami na sa pamamagitan ng pagpapatupad ng tatlong magkakaibang mga pantulong na pamamaraan at algorithm sa pamamagitan ng SplitsTree, Gubbins pipeline at RDP4 software, ang mga diskarte na inilapat ay matatag sa pagproseso at pag-filter ng mga muling inayos na rehiyon na dulot ng mga signal ng error. Gayunpaman, upang maibukod ang pagkagambala ng PE / PPE gene sa Gubbins at RDP4 software upang makilala ang mga kumpol ng SNP, at samakatuwid ang pagkilala sa mga rehiyon ng recombination na iminungkahi na makaapekto sa narX at pks12 na mga gene, ang kapitbahayan ng mga gen na ito ay sinuri (Karagdagang Fig. 3–5). Sa M. bovis AF2122/97, ang narX gene ay pinaghihiwalay ng narK2 at Mb1764c, habang ang pks12 ay napapalibutan ng Mb2075c e Mb2073c (Karagdagang Larawan 3-5). Ang mapa na nabuo gamit ang MAUVE synline na mapa ng kumpletong genome ay nagbibigay ng impormasyon tungkol sa gene sequence conservation at rearrangement, na nagpapakita ng apat na collinear blocks, at walang mga senyales ng genome translocation o inversion. Bilang karagdagan, ang pagsusuri ng komplementasyon sa pagkakasunud-sunod ng amino acid ay pinatunayan ang homology sa lahat ng kumpletong genome, at walang PE / PPE ang natagpuan sa mga katabing rehiyon ng narX o pks12. Para sa narX, ang isang genome (Mb0030) ay may mas mababang marka ng kasingkahulugan dahil ang narX gene ay nakilala bilang dalawang fragment (mga fragment 1891 at 1890). Para sa pks12, dahil sa pagkakapareho, ang Mb0030 at Mb003 ay nagpakita ng mas mababang mga marka ng synlinearity, habang ang pks12 ay nakilala sa dalawa at tatlong mga fragment, ayon sa pagkakabanggit, na kumakatawan sa iba't ibang mga domain ng protina (Karagdagang Larawan 3-5). Isinasaalang-alang ang impormasyong ito, at ang Gubbins at RDP4 software ay parehong nagsasagawa ng pagsusuri, suriin ang core multiple alignment ng maximum na 500 bp sa window, kinumpirma namin na ang PE/PPE gene ay hindi makagambala sa recombination signal na nakakaapekto sa narX at pks12.
Bagama't ang mga signal ng recombination na nakita sa set ng data na ito ay maaaring ituring na nalalabi, totoo na ang recombination sa M. bovis ay hindi maaaring ipagbukod, kaya dapat itong patuloy na maging paksa ng karagdagang pagsusuri, kung saan ang buong genome mula sa iba't ibang mga epidemiological na senaryo ay nakasunod sa Mahalaga.
Ang paghahambing ng ML phylogenetic tree na nakuha bago at pagkatapos ng recombination correction (Larawan 2A, B) ay hindi humantong sa mga makabuluhang pagbabago sa inferred phylogenetic na relasyon, at ang M. bovis strains ay naka-cluster sa parehong grupo.
Matapos ma-map ang 42 bagong sequenced M. bovis reads na may reference genome ng M. bovis AF2122/97, nakuha ang isang SNP alignment na naglalaman ng 1816 polymorphic positions. Karamihan sa mga SNP (87.1%) ay matatagpuan sa rehiyon ng coding, at ang mga apektadong gen ay nailalarawan ayon sa mga functional na kategorya na ipinakita sa Bovilist (Larawan 6A, B). Isinasaalang-alang ang kabuuang bilang ng mga gene sa bawat functional na kategorya, ang mga gene sa kategoryang "lipid metabolism" ay nagpakita ng mas maraming SNP, na sinusundan ng "cell wall at cell process" at "intermediate metabolism at respiration", na nagpapakita na sila ay nasa M. bovis evolution.
Hierarchical analysis ng M. bovis dataset mula sa Portugal (n = 42). Ang kabuuang bilang ng mga nakarehistrong SNP at apektadong mga gene para sa bawat functional na kategorya (A). Ang kabuuang bilang ng mga pagbabagong magkasingkahulugan at hindi magkasingkahulugan na nakarehistro ayon sa kategorya ng function (B).
Sa pandaigdigang sukat, ang average na dN/dS ratio ay mas mahusay kaysa sa 1.5, na nagpapahiwatig na ang pandaigdigang evolutionary pressure ay upang alisin ang ancestral state at kumakatawan sa isang positibong (diversified o directed) at/o relaxed purification choice scenario. Sa mga kategorya ng "virulence, detoxification, adaptation", "insertion sequence and phages", at "regulatory proteins", higit sa dalawang-katlo ng mga SNP ay hindi magkasingkahulugan (Larawan 6B).
Sa lahat ng mga kategorya, mayroong mga gene na may maraming mga SNP, na nagreresulta sa isang average na rate ng mutation (iyon ay, ang average na SNP bawat gene) na higit sa 1 (Larawan 6A). Ang Pks12 (Mb2074c) na may 15 SNP at fas (Mb2553c) na may 8 SNP ay may mas mataas na halaga ng mutation. Pareho sa mga gene na ito ay kasangkot sa metabolismo ng fatty acid. Ang pks gene ay nag-encode ng polyketide synthase (PKS), na isang multifunctional enzyme na kasangkot sa mycobacterial cell wall lipid biosynthesis74,75. Ang gene na ito ay nag-encode ng isang multifunctional polypeptide na kasangkot sa synthesis ng mycoketides74,76. Ang fas gene ay kasangkot sa synthesis ng mycolic acid. Ang parehong mga gene na ito ay may mahalagang papel sa biosynthesis ng cell wall na nakikipag-ugnayan sa host.
Upang higit pang pag-aralan ang ebolusyon ng Mycobacterium bovis, dalawang set ng mga partikular na gene ang nasuri. Naunang nai-publish na mga gawa gamit ang pagkakasunud-sunod na komposisyon at mga pamamaraan ng phylogenetic na kinilala ang mga gene na nakuha ng mga ninuno ng MTBC sa pamamagitan ng HGT bago ang pagkakaiba-iba37, 38. Ang mga gen na ito ay nakalista sa Karagdagang Talahanayan 2. Ang pamamahagi ng SNP ng kabuuang 77 mga gene na maaaring nauugnay sa HGT ay nasuri, at 26 na polymorphic na mga site ang natukoy, na sa karamihan ng mga kaso (78%) ay nagresulta sa mga pagbabagong hindi magkasingkahulugan (NS) (Karagdagang Talahanayan 2). Ang nakaraang gawain sa genome ng MTBC ay nagpakita na ang putative HGT na rehiyon ay nagpapakita ng isang mas mataas na ratio ng NS SNP kumpara sa natitirang bahagi ng genome. Kung iniisip ng isang tao na ang mga rehiyon ng recombination na ito ay nakuha ng mga ninuno ng MTBC, at samakatuwid, labis nilang kinakatawan ang mga sinaunang polymorphism, kung gayon ang proporsyon ng magkasingkahulugan na mga pagbabago ay inaasahan na mas mataas, dahil ang mga pagpapalit ng NS ay inaasahan na maalis sa pamamagitan ng negatibong pagpili dahil sa mga pagbabago sa amino acid Maaaring baguhin ang pag-andar ng protina. Samakatuwid, ipinapahiwatig ng aming mga resulta na ang mga functional na kahihinatnan ay maaaring magmula sa pagpapalit ng mga gen na tulad ng HGT, na sumasalamin sa kanilang kahalagahan para sa mahalagang adaptive genetic diversity.
Kaayon ng pagsusuring ito, ang mga gene na naka-encode sa mga bahagi ng 3R (DNA repair, replication, and recombination) na sistema ay lubusang napagmasdan alinsunod sa listahang naunang inilathala ng dos Vultos and collaborators (2008)39. Ang pagpapalitan ng magkaparehong mga fragment ng DNA ay hindi maaaring direktang maobserbahan, bagama't maaaring ito ay isang madalas na proseso kapag ang malapit na nauugnay na bakterya ay kasangkot, tulad ng sa kaso ng set ng data na ito; bilang karagdagan, ang prosesong ito ay maaaring maging susi sa mga pamamaraan ng pag-aayos ng DNA72, kaya't Magkaroon ng papel sa homologous recombination. Isang kabuuan ng 26 na polymorphic na posisyon na ipinamahagi ng 54 na mga gene ay nakilala (Karagdagang Talahanayan 3). Sa hanay ng mga gene na ito, ang mga pagbabago sa NS ay umabot ng humigit-kumulang 65% ng mga kahihinatnan, na naaayon sa mga nakaraang ulat sa mga strain ng Mycobacterium tuberculosis.
Oras ng post: Okt-21-2021