Хвала вам што сте посетили сајт Nature. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите новију верзију прегледача (или да искључите режим компатибилности у Internet Explorer-у). Истовремено, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајтове без стилова и JavaScript-а.
Секвенцирање генома је оживело област истраживања заразних болести, откривајући епидемиологију болести, патогенезу, интеракције домаћина и патогена и еволутивни процес наметнут патогенима. Комплекс Mycobacterium tuberculosis (MTBC) сматра Mycobacterium bovis једним од својих животињских адаптивних чланова који изазивају туберкулозу (ТБ) код копнених сисара и представља типичан модел бактеријске еволуције. Као и други чланови MTBC, претпоставља се да је Mycobacterium bovis строго клонирани, споро еволуирајући патоген и очигледно нема знакова рекомбинације или хоризонталног преноса гена. У овом раду примењујемо упоредну геномику на скуп података целе секвенце генома (WGS) састављен од 70 говеда M. из различитих родовника (Европа и Африка) како бисмо стекли увид у генетску разноликост говеда M. Еволуциона моћ. Три различите методе се користе за процену знакова реорганизације. Глобално, мали број рекомбинационих догађаја је идентификован и потврђен двема независним методама са чврстом подршком. Ипак, у поређењу са мутацијама, рекомбинација има слабији ефекат на разноликост M. bovis (укупни r/m = 0,037). Разлика r/m просека добијена у клоналном комплексу Mycobacterium bovis у нашем скупу података је у складу са општим концептом да степен рекомбинације може значајно да варира између линија приписаних истој таксономској врсти. На основу овог рада, рекомбинација код Mycobacterium bovis се не може искључити, тако да би требало да буде предмет даљих напора у будућим истраживањима компаративне геномике, у којима је WGS великих скупова података из различитих епидемиолошких сценарија широм света кључан. Затим је извршена додатна анализа на мањем скупу података Mycobacterium bovis (n = 42) из преваленције туберкулозе код више домаћина, и идентификовано је више од 1.800 локуса, од којих је најмање један сој показао полиморфизам једног нуклеотида (SNP). Већина (87,1%) се налази у кодирајућем региону, а глобални однос несинонимних промена (dN/dS) синонимних промена превазилази 1,5, што указује да је позитивна селекција важна еволутивна сила која делује на M. bovis. Већи удео SNP-ова је откривен у генима богатим функционалним категоријама „метаболизам липида“, „ћелијски зид и ћелијски процеси“ и „интермедијарни метаболизам и дисање“, што открива њихов потенцијал у биологији и еволуцији важности Mycobacterium bovis. Пажљивији поглед на гене код предака MTBC-а који су склони хоризонталном трансферу гена и укључени у 3R (поправка, репликација и рекомбинација ДНК) систем открива глобалну просечну негативну вредност Таиџиминог D неутралног теста, што указује на прошло селективно скенирање. Недавно уско грло након ширења популације је и даље главни еволутивни покретачки фактор за обавезни патоген Mycobacterium bovis у борби против домаћина.
Комплекс Mycobacterium tuberculosis (MTBC) један је од најуспешнијих таксона бактеријских патогена и типичан случај бактеријске еволуције. Његови чланови показују изненађујуће висок нуклеотидни идентитет на геномском нивоу (> 99%)1,2. Различити екотипови MTBC могу изазвати туберкулозу (ТБ), која је инфективна грануломатозна болест, код широког спектра врста домаћина, од микро-сисара до људи3,4,5. Тренутно, комплекс обухвата људе [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] и патогене прилагођене животињама (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, „Bacillus chimpanzee“ и „dassie“) 5,6. M. canettii (такође познат као „Nodobacter glabrata“) Просечан идентитет нуклеотида са горепоменутим микобактеријама је 98%, а упоредни геномски рад је показао да су се M. canettii и остатак MTBC недавно одвојили од заједничког претка.7 Узимајући у обзир овај концепт, неки аутори називају M. canettii чланом MTBC 8.
МТБЦ се систематски описује као стриктни клонски комплекс, а његова популациона структура је јасно одређена смањеном разноликошћу, уским грлима, селективним скенирањем и генетским дрифтом9,10. Под претпоставком да се сложена стриктна клонска еволуција, као што су недостајући полиморфизми, не може обновити рекомбинацијом. На основу ове премисе, узастопни догађаји геномске делеције диференцијалног региона (РД) и TbD1 (регион специфичан за делецију 1 Мтб) предложени су као молекуларни маркери еволуције МТБЦ2,5,11. Рад на упоредној геномици и секвенцирању целог генома (WGS) подржава поделу чланова адаптираних на човека у девет линија (Mycobacterium tuberculosis L1 до L4, L7 и L8; и Mycobacterium africanum L5, L6 и L9), лозе L2 до L4 деле регион делеције TbD12,11,12,13. Поред тога, претпоставља се да чланови прилагођени животињама деле заједничког претка, што је дефинисано делецијама специфичним за кладу у RD7, RD8, RD9 и RD102, 5 и 14.
Хоризонтални трансфер гена (ХГТ) и догађаји рекомбинације сматрају се ретким и јављају се код предака МТБЦ, а не због различите историје целог члана МТБЦ15,16,17. Два рана извештаја Хјуза и сарадника (2002) и Гутакера и сарадника (2006) сугерисала су да догађаји рекомбинације могу помоћи у обликовању полиморфизама који обележавају специфичне локусе код сојева M. tuberculosis18,19. Разлози за очигледан недостатак рекомбинације код МТБЦ су: (1) механички процес и губитак способности ХГТ; (2) реткост ХГТ догађаја; (3) нема шансе за догађаје рекомбинације у МТБЦ ниши14,17. Недавно су неке студије секвенцирања целог генома (WGS) примењене на сој МТБЦ 20 и Mycobacterium bovis 21 пружиле доказе о рекомбинацији, прве које су показале да сојеви МТБЦ често размењују мале фрагменте ДНК, али због ограничене варијације нуклеотидних секвенци, ови догађаји још увек нису примећени.
Mycobacterium bovis је најчешће изолован члан MTBC из стоке (углавном говеда), мада се може изоловати и из дивљих животиња слободног узгоја и ограђених дивљих животиња4,22,23,24. M. bovis је еволуирао у пет главних клонских комплекса [европски 1 (Eu1), европски 2 (Eu2), европски 3 (Eu3), афрички 1 (Af1) и афрички 2 (Af2)], према профилу сполиготипизације, специфичним делецијама и полиморфизмима једног нуклеотида (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 у специфичним генима. Ови клонски комплекси показују разнолику структуру популације Mycobacterium bovis и њену повезаност са географским регионима. Поред тога, недавни рад на WGS-у који су спровели Зимпел и сарадници (2020) дизајнирао је филогенију засновану на SNP-у Mycobacterium bovis, са више од 1.900 генома, што указује да постоје најмање четири различите лозе (именоване Lb1 до Lb1 до Lb4), оне нису у потпуности конзистентне са претходно дефинисаним клонским комплексом, иако се географска специфичност такође може потврдити30. Ови аутори су извршили диференцијалну анализу филогеније и молекуларно датирање, али нису проучавали рекомбинацију30.
Претходни радови који користе различите молекуларне технике, као што су сполиготипизација, MIRU-VNTR (микобактеријска испреплетена понављајућа јединица-варијабилни тандемски број понављања) и недавно SNP типизовање открили су одређени ниво генетске разноликости међу сојевима M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Диференцијација генетске варијације постала је важан алат у проучавању епидемиологије болести, што је корисно за дубинско разумевање патогенезе, вируленције и преношења болести. Појава WGS методе пружа могућност откривања еволутивних покретачких фактора које намеће геном Mycobacterium bovis у процесу адаптације и перзистенције на различите домаћине и епидемиолошке сценарије.
У овом раду, користимо упоредну геномску анализу на различитим скуповима података Mycoplasma bovis (n=70), укључујући изолате из различитих клонских комплекса, како бисмо стекли увид у еволутивни процес Mycoplasma bovis, посебно да бисмо разрешили филогенетске односе и догађаје рекомбинације. Као додатак овој анализи, под-скуп података изолата M. bovis (n = 42) добијених из добро окарактерисаног подручја туберкулозе са више домаћина у Португалу 31,36 је даље истражен како би се закључило о неидентитету. Равнотежа између релативног односа смисаоних (dN) и синонимних (dS) нуклеотидних супституција, као и еволутивни допринос специфичних генома поменутих у литератури, они су 37,38 добијени од MTBC предака путем HGT-а и кодирају компоненте гена 3R (поправка, репликација и рекомбинација ДНК) система 39. Изаберите гене добијене путем HGT-а јер могу представљати древне полиморфизме, па се очекује да могу садржати већи удео синонимних промена. Гени укључени у 3R систем су одабрани зато што је претходни рад на сојевима M. tuberculosis указао на опште негативне/пречишћавајуће селекције које делују на ове гене, и они могу играти важну улогу у еволуцији 39. Још један циљ овог рада је да се закључи о постојању догађаја реорганизације. Из тог разлога, с обзиром на то да наш скуп података из Португала садржи само геноме европског клонског комплекса 2 и сојеве којима није додељен клонски комплекс, одлучили смо да укључимо јавно доступне податке о геному како бисмо коначно добили репрезентативни приказ свих клонских комплекса и побољшали робусност и ширину резултата.
42 новосеквенцирана генома Mycoplasma bovis са португалске ендемске сцене туберкулозе са више домаћина (детаљи у наставку), претходно окарактерисана из епидемиолошке перспективе36, чине центар овог рада. С обзиром на то да скуп података из Португала садржи само представнике европских клонских комплекса 2 и сојеве без означених комплекса, додати су јавно доступни подаци о секвенцирању целог генома како би се проширио скуп података који укључује све представнике клонских комплекса M. bovis. Стога су у овом раду коришћена три извора података о секвенцирању целог генома: комплетна/нацртна монтажа генома, до 10 скела сачуваних у NCBI (Национални центар за биотехнолошке информације) (n = 15 изолата); сачувана у SRA (датотека Illumina fastq архиве за читање секвенци) која представља комплексну разноликост клонова M. bovis (n = 12 изолата)30; и 42 новосеквенцирана генома из Португала. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) је искључен из NCBI претраге. M. bovis AF2122/97 се обично користи као референтни геном који се укључује у скуп података. Због јавне недоступности целе секвенце генома представљене клонирајућим комплексом African 1 и малог броја генома из репрезентативних сојева Af2 и Eu1, у овим случајевима су коришћени оригинални подаци о секвенцирању које је обезбедио SRA. Рад Зимпела и његових сарадника (2020) помогао је у идентификацији генома из горе поменутог клонирајућег комплекса и помогао је у одабиру Mycobacterium bovis за укључивање у скуп података. За Eu3 је описан само један тип генома (Branger et al., 2020), тако да је геном који укључујемо посебан представник Eu3 комплекса.
Глобално, овај скуп података обухвата 70 врста Mycobacterium bovis изолованих из 8 врста домаћина, распрострањених у 12 земаља од 1985. до 2016. године. 36 врста је означено као Eu2, 7 врста је Eu1, 1 врста је Eu3, 3 врсте су Af1, 4 врсте су Af2 и 19 се не могу приписати ниједном клонском комплексу (детаљи у наставку). Детаљне информације (укључујући приступни број) Mycobacterium bovis коришћене у овој студији приказане су у Табели 1 и Додатној табели 1.
42 новосеквенцирана цела генома Mycobacterium bovis из жаришта животињске туберкулозе у Португалу, дистрибуирана више од 12 година, су у центру ове студије, јер се потенцијални системи болести дивљих животиња и стоке редовно прате 31,36 (Допунска слика 1). Према накнадним процедурама, ови сојеви су изоловани од говеда (n = 14), јелена (n = 16) и дивљих свиња (n = 12) од 2003. до 2015. године: сакупљати и руковати животињама у складу са препорученим смерницама протокола. Узорци ткива се налазе у Приручнику за копнене животиње ОИЕ и инокулирани су на чврстој и течној подлози од пирувата Стоунбринка и Левенштајн-Јенсена. Културе се инкубирају на 37 °C, а раст се проверава једном недељно током најмање 12 недеља. Колоније се чувају директно у раствору глицерола на -80 °C. У селективном медијуму за Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), оригинални архивирани узорци су пропуштени кроз једну in vitro пасажу in vitro да би се добила ДНК WGS програма. За ово је замрзнути раствор културе обогаћен са 5% натријум пирувата и 10% ADS (50 г албумина, 20 г глукозе, 8,5 г натријум хлорида у 1 л воде) на Middlebrook 7H9 медијуму на 37°C Retrain. Након 4 недеље раста, медијум је обновљен и култура је редовно праћена док није примећен раст. Ћелије су сакупљене центрифугирањем, пелет је ресуспендован у 500 µL фосфатно пуферованог физиолошког раствора (PBS), загрејан на 99°C током 30 минута, центрифугиран, а супернатант је чуван на -20°C до WGS програма. Све процедуре се спроводе у објектима биолошке безбедности нивоа 3.
WGS библиотека генома упарених крајева је припремљена коришћењем јединственог индекса сваког узорка ДНК, а за секвенцирање користи Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 узорака) и HiSeq (2 × 150 pb) (два изолата) технологију (Eurofins Genomics, Немачка). Према упутствима произвођача, користите Illumina Genome Analyzer са модулом са два краја за секвенцирање геномске ДНК и користите Nextera XT DNA Library Prep Kit од Illumina за конструисање библиотеке.
Узимајући у обзир податке добијене из SRA (n = 12), идентификација клонског комплекса може се користити као метаподаци одговарајуће публикације 30, 41, 43. Када се разматра комплетан геном, изузев Mycobacterium bovis AF2122/97 и Mycobacterium bovis 3601, који су препознати чланови клонског комплекса Eu1 и Eu3 25, 29, респективно, исти је као и комплетан геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI приступни број NC_000962.3). Поравнање генома се врши коришћењем MAFFT-а (програм за вишеструко поравнање аминокиселинских или нуклеотидних секвенци, верзија 7.458) и параметра -addfragments48. Затим, потражите одсуство различитих клонских комплекса и/или присуство SNP карактеристика.
Новосеквенцирани Mycobacterium bovis (n = 42) и оригинална очитавања састављеног нацрта генома (n = 3) поравнавају комплекс са референтним геномом Mycobacterium tuberculosis H37Rv кроз vSNP цевовод и присуство делеције и/или SNP карактеристика различитих клонова. Спроведена је претрага.
Прикупите информације на основу недостатка карактеристика и/или присуства/одсуства SNP и профила сполиготипизације да бисте доделили геномске податке одговарајућем клонском комплексу. За четири нацрта склопова, профил сполиготипизације се не може закључити, па су укључени у групу „без сложености“.
Биоинформатички ток рада који прати овај рад почиње од de novo склапања и мапирања у референтну стратегију, са циљем истраживања рекомбинационих догађаја и специфичних полиморфизама генома. Слика 1 приказује дијаграм тока праћених корака. За анализу рекомбинације, сви геноми се користе како би се повећала робусност закључака и повезаних индикатора.
Да бисмо смањили грешке у генерисању консензусних секвенци генома, прво смо добили de novo асемблирање, а затим смо добили вишеструка поравнања језгра. Unicycler цевовод је тренутно доступан на https://github.com/rrwick/Unicycler49 и користи се за извођење de novo асемблирања 54 секвенцирана генома (42 ново секвенцирана и 12 fastq датотека опорављених из SRA). Укратко, пре асемблирања од нуле, анализа квалитета читања је извршена у FastQC верзији 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) и Trimmomatic верзији 0.36 (примењене су опције „сечење адаптера и других секвенци специфичних за осветљење из очитавања“ и „Исеци базе са краја читања, ако је ниже од прага квалитета од 20“) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Затим је за асемблирање генома коришћен SPAdes optimiser49, а за оптимизацију након асемблирања коришћена је Pilon верзија 1.1851. Конзервативни режим премошћавања је изабран како би се избегло неправилно склапање, а величина k-мера је претражена и одабрана између 20% и 95% дужине очитавања. Пратите SPAdes смернице и узмите у обзир величину очитавања, обришите контиге мање од 300 bp и успоставите граничну вредност покривености дубине очитавања од 20 од 52. У de novo стратегији склапања, геномски региони као што су високо репетитивни паралози пролин-глутамата (PE) и пролин-пролин глутамата (PPE) нису уклоњени.
Квалитет de novo склопа процењује се путем QUAST цевовода (http://quast.sourceforge.net/quast.html), који олакшава обнову контига и мапирање референтног генома M. bovis AF2122/97 (NCBI приступни број LT708304.1) (видети Додатну табелу 1 за параметре квалитета).
Уз помоћ vSNP цевовода (https://github.com/USDA-VS/vSNP), FASTQ датотека новосеквенцираног M. bovis из Illumina секвенцирања упоређује се са референтним геномом M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Према препорукама најбоље праксе из Genome Analysis Toolkit-а (GATK) 53, 54, 55, примењују се стандардни параметри филтера или варијантни масени резултати за рекалибрацију. Резултати се филтрирају коришћењем најнижег SAMtools масеног резултата од 150 и AC = 2. Такође користите Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) за проверу очитавања како бисте искључили контаминацију. vSNP цевовод који се користи за мапирање стратегија секвенцирања у нашем раду испитује низ дефинисаних SNP-ова и циљева, а такође искључује сценарије мешовите инфекције. Покривеност очитаног генома је боља од 99% (Додатна табела 1).
Да бисте избегли грешке у мапирању и погрешне SNP-ове, филтрирајте варијанту у следећим случајевима: (1) подржава је мање од 20 очитавања, (2) налази се са фреквенцијом мањом од 0,9, (3) налази се у најмање једном соју, али барем постоје празнине у другом соју. Интегрисани прегледач геномике (IGV) верзије 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 коришћен је за визуелну верификацију SNP-ова и позиција са проблемима мапирања или поравнања. Пошто су гени пролин-глутамата (PE) и пролин-пролин глутамата (PPE) високо дуплирани и део су породице више гена, лако их је погрешно разумети секвенцирањем и погрешним мапирањем помоћу Illumina, па су пожељнији. Микобактеријски биоинформатички ток рада уклонио је чланове туберкулозног комплекса када се користи стратегија мапирања у секвенцу ради потврде SNP-ова. Стога смо филтрирали PE/PPE гене и инделе из анализе.
Према подацима сајта Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), сви SNP-ови су подељени у функционалне категорије. SnpEff цевовод (https://pcingola.github.io/SnpEff/) се користи за закључивање последица SNP-ова (синонимне или несинонимне промене). Направљена је нова база података генома Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Вишеструко поравнање основног генома извршено је коришћењем Parsnp v1.2, тренутно доступног на https://github.com/marbl/parsnp57, користећи 69 комплетних генома/нацрта склопова (са опцијом -c) и M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) је коришћен као референца. Извршена су четири вишеструка поравнања основног генома: само чланови Eu2 клонирајућег комплекса (n = 37), укључујући све чланове европског клонирајућег комплекса (n = 44), укључујући тачку спајања европског и афричког клонирајућег комплекса (n = 51), и укључујући све Mycobacterium bovis у овој студији (n = 70).
Основно поравнање које генерише Parsnp користи се за закључивање филогенетског стабла максималне вероватноће (ML) коришћењем CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 користећи RAxML и извршава 1000 вођених репликација.
За паралелну проверу присуства рекомбинационих догађаја користе се три различита алгоритма и биоинформатички алати: софтвер SplitsTree4, Gubbins (непристрасно одређивање линије кроз рекомбинацију у нуклеотидним секвенцама) цевовод и RDP4 (програм за детекцију рекомбинације, верзија бета 4.101) софтвер.
Метода раздвојене декомпозиције имплементирана у SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 коришћена је за израчунавање филогенетске мреже без корена, користећи Phi тест за статистичку верификацију, а праг значајности је p = 0,05. Анализа вишеструког поравнања језгра Parsnp-а користи се као улаз, а раздвојена декомпозиција је реализована као стандард мреже.
Губинсов цевовод v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) ради са подразумеваним параметрима као још један начин за процену утицаја рекомбинације на Mycobacterium bovis. Алгоритам имплементиран у цевоводу реконструише релевантну клонску лозу. Комплетан склоп генома/нацрта нашег скупа података и референтни геном (говеђи бовид AF2122/97, LT708304.1) су међусобно; и скенира положај SNP-а на свакој грани стабла да би се детектовао SNP кластер који представља догађај рекомбинације. Нула гране Претпоставимо да нема догађаја рекомбинације, што значи да SNP-ови који се јављају на грани треба да буду равномерно распоређени. Основно вишеструко поравнање из Parsnp-а и најбоље оцењено ML стабло из RAxML користе се као улазне датотеке.
Коначно, како би се потврдио догађај реорганизације који је предложио Губинсов цевовод, шест алгоритама имплементираних у RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 и SiScan66) примењено је на вишеструко поравнање језгра Parsnp под подразумеваним подешавањима. Утврдили смо да најмање три алгоритма имплементирана у RDP4 морају доследно показивати важан сигнал за верификацију сваког догађаја рекомбинације.
Узимајући у обзир да и Gubbins и RDP софтвер траже сигнале рекомбинације провером вишеструких поравнања језгра у прозору до 500 bp и потврђујући да укључивање PE/PPE гена током de novo склапања неће ометати пронађене сигнале рекомбинације, даља анализа се врши провером хомолинеарности - провером близине гена који идентификује догађај рекомбинације. Синлинеарна мапа коришћењем комплетног генома је конструисана коришћењем MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) да би се искључиле локалне транслокације или инверзије генома. Поред тога, цео геном је коришћен за извођење анализе хомолинеарности аминокиселинске секвенце преко SyntTax веб сервера (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Детаљнија анализа скупа података генома добијених из португалског система за туберкулозу са више домаћина јесте провера полиморфизма гена поменутих у литератури. Ови гени су 37, 38 и ген који кодира 3R, које су преци МТБЦ добили путем компоненти система ХГТ (поправка, репликација и рекомбинација ДНК) 39. Користите ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) и DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) да бисте израчунали генску разноликост и нуклеотидну разноликост (π) и унос параметара Таџиминог D неутралног теста.
Добијено је филогенетско стабло максималне вероватноће (ML) засновано на 69 изолата Mycoplasma bovis и референтних генома (Слика 2А). У поређењу са стаблима заснованим на једном гену или стаблима заснованим на више локуса, ова стратегија омогућава генерисање моћнијих стабала која не обухватају варијабилност целог генома и стога показују мању способност разликовања између врста 68,69. Тополошка структура ML стабла је обично у складу са сложеном класификацијом клонова. Геном Eu2 је груписан у грани, а геном Af1 је такође груписан заједно (Слика 2А). Резултат је такође у складу са познатим еволутивним односом Mycobacterium bovis, односно постоји велика разлика између члана Eu1 и групе која се састоји од свих осталих клонских комплекса и генома, али клонски комплекс 30 није наведен. Мала недоследност између клонског комплекса и односа примећеног на филогенетском стаблу може се објаснити чињеницом да је клонски комплекс описан на основу специфичних геномских региона, док је филогенетско стабло засновано на вишеструким поравнањима језграстих генома који представљају цео геном.
Филогенетско стабло максималне вероватноће (GTR) је конструисано на основу поравнања језгра генома Mycobacterium bovis пре (А) и после (Б) уклањања места рекомбинације. Боје грана представљају комплекс клонова Mycobacterium bovis: Европа 1 је љубичаста, Европа 2 је црвена, Европа 3 је плава, Африка 1 је наранџаста, а Африка 2 је зелена. Стабло је укорењено и нацртано у размери, а дужина гране је мерена као замена за свако место.
Комплекс Mycobacterium tuberculosis је описан као клонално еволуирао, и већина доказа акумулираних током година подржава идеју да се текући HGT и рекомбинациони догађаји неће десити на детектабилном нивоу MTBC15,17,18.
Претходни рад је показао да може постојати ограничена рекомбинација између сојева МТБЦ20,21, док други нису успели да идентификују мерљиве догађаје рекомбинације70,71. Поново размотрите ово питање са фокусом на Mycobacterium bovis, што се разликује од претходног рада који је разматрао само Mycobacterium tuberculosis70,71; или размотрите МТБЦ као целину, са скоро потпуно без M. bovis који представља 20; или размотрите само рестриктивне фракције говеда. Скуп података о микобактеријама, у овом раду, садржи укупно 70 сојева, који представљају све клонске комплексе, који се користе за скрининг рекомбинације. Скуп података је скалиран према четири кумулативна нивоа: (1) чланови Eu2, (2) сви чланови европског клонског комплекса (тј. Европа), (3) европски и афрички клонски комплекс (Eu + Af) и (4) целокупне колекције података (укључујући геноме који нису укључени ни у један већ описани клонски комплекс).
Да би се даље проучила ова хипотеза, спроведена је мрежа са сплит-декомпозицијом како би се проценило одсуство рекомбинационих догађаја између генома, јер ова метода може визуализовати предачке односе између јединки и приказати супротстављене филогенетске сигнале. Сва четири скупа података у анализи потврдила су постојање петљи у мрежи (то јест, области које се не конвергирају у једно стабло), али Phi тест нема статистичку подршку (Eu2, p = 0,0956; Европа, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; цео скуп података p = 0,2451), што пружа слабе доказе за постојање догађаја реорганизације (слика 3A-D).
У Европи 2 генома (n = 37) (А), европски геноми (n = 44) (Б), европски и афрички геноми (n = 51) (Ц) и цео скуп података (n = 70) (Д).
Након ове анализе, и узимајући у обзир циклична посматрања у свим мрежама, алгоритам реконструкције имплементиран у Губинсовом цевоводу је примењен да би се реконструисала клонска линија и допунила процена ефекта рекомбинације на геном M. bovis. Закључите кумулативни број рекомбинационих догађаја, од којих се већина догодила у терминалним гранама (то јест, у једном геному) (Табела 2). Ови индикатори показују конзистентност целог скупа података и указују на то да је учесталост рекомбинационих догађаја 200 до 300 пута већа од учесталости мутација. Када се параметар rho/theta који представља релативне стопе рекомбинације и тачкастих мутација на грани појави између 0,0037 и 0,0056 (Табела 3). Недавно је објављени рад соја 38 M. bovis показао већу вредност rho/theta (rho/theta = 0,1) од оне добијене у овом скупу података, али је рад Патанеа и колега користио склапање засновано на референцама за закључивање параметара рекомбинације. Процедурални детаљ, због поступка склапања, повезан је са обиљем претпостављених догађаја рекомбинације у терминалној грани.
Затим, параметар r/m представља однос разноликости рекомбинације и увођења мутација, а његова просечна вредност је између 0,025 и 0,037, што указује да, у поређењу са мутацијама, рекомбинација има мањи укупни утицај на генетску разноликост M. bovis (Табела 3). За опсежно поређење, слична метода је коришћена за процену параметра r/m за скуп података MTBC састављен од 23 генома, показујући просечну вредност од 0,48620, док је за скуп података од 38 M. bovis Патанеа и колега доказано да је просечна вредност 0,98. У првој студији, само два од 23 генома укључена у рад M. bovis (M. bovis BCG и референтни сој), тако да добијена вредност може бити пристрасна због прекомерне експресије генома M. tuberculosis. У другом извештају, анализиране популације Mycobacterium bovis су углавном добијене из Сједињених Држава и од домаћих стока. Насупрот томе, у нашем скупу података представљено је више географских локација и врста домаћина, а коришћени су и геноми груписани у различите клонске комплексе са различитим популационо-генетским карактеристикама, чиме се постиже дубље и шире знање о популацији. Просечна вредност разлике r/m добијена нашим скупом података је у складу са концептом да степен рекомбинације значајно варира између линија додељених истој таксономској врсти, тако да ови резултати указују да клонски комплекс M. bovis може показивати разлике у рекомбинацији. Утицај је такође онакав какав сугеришу Диделот и Мејден72. Ипак, значајно проширење овог скупа података укључивањем већег броја генома M. bovis омогућиће даље разјашњење ове тачке. И параметри r/m и rho/theta показују варијабилност између грана, а овај резултат је у складу са извештајима о другим бактеријским врстама72,73.
Коначно, како би се потврдили догађаји реорганизације идентификовани помоћу Габинсовог цевовода, у софтверу RDP4 коришћено је шест различитих алгоритама за независно тестирање различитих основних вишеструких поређења. Глобално, мање од половине догађаја које је Габинс идентификовао потврђено је помоћу RDP4 (Табеле 4 и 5). Узимајући у обзир цео скуп података, потврђена су три догађаја рекомбинације, два која укључују унутрашње чворове, а други који укључује један геном у терминалној грани, за који клонски комплекси нису могли бити додељени (Табеле 4 и 5). Идентификација догађаја у терминалним гранама може указивати на то да је рекомбинација још увек у току код савремених сојева M. bovis или да је резултат погрешно постављен70. У овом хипотетичком региону рекомбинације, приближно 20% позиција има недефинисане нуклеотиде (N), што утиче на сигнал рекомбинације (Додатна слика 2). Поред тога, овај регион утиче на ген rrs, који кодира 16S рибозомалну РНК за коју се очекује да је високо конзервисана, тако да овај претпостављени сигнал рекомбинације може бити резултат грешака у секвенцирању или погрешног поравнања. Затим је извршено целокупно поравнање генома између Mb0003 и Mycobacterium bovis AF2122/97, и потврђено је постојање недефинисаних нуклеотида и SNP-ова, тако да могући проблеми везани за погрешно поравнање нису били последица биолошких информација имплементираних у овом раду. Појавили су се након учења програма.
Нису пронађене празнине или недефинисани нуклеотиди у рекомбинационим регионима унутрашњих чворова (слике 4 и 5). Што се тиче ових догађаја, један садржи само геном Eu2 и утиче на ген pks12, који кодира могућу поликетидну синтазу; док је други регистрован у геному Eu1 и утиче на ген narX који кодира могућу нитрат редуктазу (табела 4). Генерално, анализа рекомбинације показује да постоји ограничен број фрагмената рекомбинације са статистичком подршком, а закључени индикатори указују на то да рекомбинација има мали утицај на лозу M. bovis. Очекује се да ће сигнал рекомбинације бити низак, али је важно разликовати прави еволуциони сигнал од позадинске буке, што је изазован задатак. Да би се смањио сигнал буке који уносе проблеми склапања засновани на референцама и неусклађености 70, 71, сви остали осим комплетног генома су склопљени од нуле, а квалитет склапања је проверен и осигуран QUAST анализом цевовода (додатна табела 1). Поред тога, спроведена је серија додатних анализа како би се обезбедила робусност и тачност целокупног истраживања. Стога је квалитет секвенцирања гена narX и pks12 процењен мапирањем очитавања у односу на Mycobacterium bovis AF2122/97. Препоручена позиција SNP-а у региону рекомбинације потврђена је применом критеријума поменутих у одељку о методи (најмање 20 очитавања и фреквенција промена од 0,9). Полиморфизам гена narX је потпуно потврђен у два генома (Mb1792361 и Mb7240415; 2,3%) и геномима генома pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 и Mb12. Међутим, за геном Mb2043, шест од осам позиција не испуњава критеријум дубине читања јер је SNP подржан са највише 17 очитавања, што је испод утврђене граничне вредности од 20. Стога се може потврдити рекомбинација шест генома (8,6%) на овом месту генома (слике 4 и 5).
Детаљна визуелизација поравнања рекомбинационог региона скупа података Mycobacterium bovis утиче на narX ген који кодира могућу нитрат редуктазу. Нису пронађене празнине или недефинисани нуклеотиди у рекомбинационом региону унутрашњих чворова. Овај посебан догађај је регистрован у Eu1 геному. Квалитет секвенцирања narX гена је процењен цртањем очитавања Mycobacterium bovis AF2122/97. Потврдите препоручену локацију SNP-а у рекомбинационом подручју применом критеријума поменутих у одељку о методи (најмање 20 очитавања и фреквенција промена од 0,9). Полиморфизам narX гена је у потпуности потврђен у геномима Mb1792361 и Mb7240415 (2,3%).
Детаљна визуелизација поравнања рекомбинационог региона скупа података Mycoplasma bovis који утиче на ген pks12. Нису пронађене празнине или недефинисани нуклеотиди у рекомбинационом региону унутрашњих чворова. Што се тиче догађаја који утиче на ген pks12 који кодира могућу поликетид синтазу, он садржи само Eu2 геном. Квалитет секвенцирања pks12 је процењен мапирањем очитавања Mycobacterium bovis AF2122/97. Потврдите препоручену локацију SNP-а у рекомбинационом подручју применом критеријума наведених у одељку о методи (најмање 20 очитавања и фреквенција промена од 0,9). Полиморфизми генома Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 и Mb1960 су у потпуности потврђени.
Гени PE и PPE имају понављајуће регионе који се лако погрешно очитавају секвенцирањем и мапирањем помоћу Illumina-е, тако да се обично бришу из биоинформатичког тока рада чланова M. tuberculosis само када се користи стратегија мапирања у секвенцу. Закључивање о рекомбинационим догађајима примењено у овом раду заснива се на de novo склапању без филтрирања PE/PPE. Верујемо да су, имплементацијом три различите комплементарне методе и алгоритми путем SplitsTree-а, Gubbins pipeline-а и RDP4 софтвера, примењене стратегије робусне за обраду и филтрирање реорганизованих региона изазваних сигналима грешака. Међутим, да би се искључила интерференција гена PE/PPE на Gubbins и RDP4 софтвере за идентификацију SNP кластера, а самим тим и идентификација рекомбинационих региона за које се претпоставља да утичу на гене narX и pks12, испитано је суседство ових гена (Допунска слика 3–5). Код M. bovis AF2122/97, ген narX је раздвојен са narK2 и Mb1764c, док је pks12 окружен са Mb2075c и Mb2073c (Додатна слика 3-5). Мапа генерисана коришћењем MAUVE синлинеарне мапе комплетног генома пружа информације о конзервацији и преуређењу генске секвенце, приказујући четири колинеарна блока и без знакова транслокације или инверзије генома. Поред тога, анализа комплементације са аминокиселинском секвенцом доказала је хомологију у свим комплетним геномима, а није пронађен PE/PPE у суседним регионима narX или pks12. За narX, један геном (Mb0030) има нижи резултат синонимије јер је ген narX идентификован као два фрагмента (фрагменти 1891 и 1890). За pks12, због сличности, Mb0030 и Mb003 су показали ниже резултате синлинеарности, док је pks12 идентификован у два и три фрагмента, респективно, који представљају различите домене протеина (Додатна слика 3-5). Узимајући у обзир ове информације, и то што су софтвери Gubbins и RDP4 оба извршили анализу, проверили вишеструко поравнање језгра од максималних 500 bp у прозору, потврдили смо да ген PE/PPE неће ометати сигнал рекомбинације који утиче на narX и pks12.
Иако се сигнали рекомбинације откривени у овом скупу података могу сматрати резидуалним, тачно је да се рекомбинација код M. bovis не може искључити, тако да би требало да настави да буде предмет даље анализе, у којој се цели геноми из различитих епидемиолошких сценарија секвенцирају на важно.
Поређење филогенетских стабала МЛ добијених пре и после корекције рекомбинације (слика 2А, Б) није довело до значајних промена у закљученој филогенетској вези, а сојеви M. bovis су груписани у истој групи.
Након мапирања 42 новосеквенцирана читања M. bovis са референтним геномом M. bovis AF2122/97, добијено је поравнање SNP-ова које садржи 1816 полиморфних позиција. Већина SNP-ова (87,1%) налази се у кодирајућем региону, а погођени гени су окарактерисани према функционалним категоријама приказаним у Bovilist-у (слика 6А, Б). Узимајући у обзир укупан број гена у свакој функционалној категорији, гени у категорији „метаболизам липида“ показали су више SNP-ова, затим следе гени „ћелијски зид и ћелијски процеси“ и „интермедијарни метаболизам и дисање“, што открива да се налазе у еволуцији M. bovis.
Хијерархијска анализа скупа података M. bovis из Португала (n = 42). Укупан број регистрованих SNP-ова и погођених гена за сваку функционалну категорију (А). Укупан број синонимних и несинонимних промена регистрованих по функционалној категорији (Б).
На глобалном нивоу, просечан однос dN/dS је бољи од 1,5, што указује да је глобални еволутивни притисак да се решимо предачког стања и представља позитиван (диверзификован или усмерен) и/или опуштен сценарио избора пречишћавања. У категоријама „вируленција, детоксикација, адаптација“, „инсерционе секвенце и фаги“ и „регулаторни протеини“, више од две трећине SNP-ова нису синоними (слика 6Б).
У свим категоријама постоје гени са вишеструким SNP-овима, што резултира просечном стопом мутација (то јест, просечним SNP-ом по гену) већом од 1 (Слика 6А). Pks12 (Mb2074c) са 15 SNP-ова и fas (Mb2553c) са 8 SNP-ова имају веће вредности мутација. Оба ова гена су укључена у метаболизам масних киселина. Ген pks кодира поликетид синтазу (PKS), која је мултифункционални ензим укључен у биосинтезу липида ћелијског зида микобактерија74,75. Овај ген кодира мултифункционални полипептид који је укључен у синтезу микокетида74,76. Ген fas је укључен у синтезу миколне киселине. Оба ова гена играју важну улогу у биосинтези ћелијског зида у контакту са домаћином.
Ради даљег проучавања еволуције Mycobacterium bovis, анализирана су два сета специфичних гена. Претходно објављени радови који користе методе састава секвенци и филогенетске методе идентификовали су гене које су преци МТБЦ стекли путем ХГТ пре диверзификације37,38. Ови гени су наведени у Додатној табели 2. Анализирана је SNP дистрибуција укупно 77 гена који могу бити повезани са ХГТ, и идентификовано је 26 полиморфних места, што је у већини случајева (78%) резултирало несинонимним (НС) променама (Додатна табела 2). Претходни рад на геному МТБЦ показао је да претпостављени ХГТ регион показује већи однос НС СНП у поређењу са остатком генома. Ако се сматра да су ове рекомбинационе регионе стекли преци МТБЦ, и стога, они прекомерно представљају древне полиморфизме, онда се очекује да ће удео синонимних промена бити већи, јер се очекује да ће НС супституције бити елиминисане негативном селекцијом због промена аминокиселина које могу променити функцију протеина. Стога, наши резултати указују да функционалне последице могу произаћи из замене гена сличних HGT-у, што одражава њихов значај за вредну адаптивну генетску разноликост.
Паралелно са овом анализом, гени који кодирају компоненте 3R (поправка, репликација и рекомбинација ДНК) система су темељно испитани у складу са листом коју су претходно објавили дос Вултос и сарадници (2008)39. Размена идентичних фрагмената ДНК не може се директно посматрати, иако може бити чест процес када су укључене блиско сродне бактерије, као у случају овог скупа података; поред тога, овај процес може бити кључ за методе поправке ДНК72, тако да играју улогу у хомологној рекомбинацији. Укупно је идентификовано 26 полиморфних позиција распоређених по 54 гена (Додатна табела 3). У овом скупу гена, NS промене су чиниле око 65% последица, што је у складу са претходним извештајима о сојевима Mycobacterium tuberculosis.
Време објаве: 21. октобар 2021.