Kiitos käynnistäsi Nature-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme uudemman selainversion käyttöä (tai Internet Explorerin yhteensopivuustilan poistamista käytöstä). Samalla tuen jatkuvuuden varmistamiseksi näytämme sivustot ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Genomin sekvensointi on elvyttänyt tartuntatautitutkimuksen alaa paljastaen tautien epidemiologian, patogeneesin, isännän ja patogeenin vuorovaikutukset sekä patogeeneihin kohdistuvan evoluutioprosessin. Mycobacterium tuberculosis -kompleksi (MTBC) pitää Mycobacterium bovis -bakteeria yhtenä eläinten adaptiivisista jäsenistään, joka aiheuttaa tuberkuloosia (TB) maanisäkkäillä, ja se on tyypillinen bakteerien evoluution malli. Kuten muidenkin MTBC:n jäsenten, Mycobacterium bovis -bakteerin oletetaan olevan tiukasti kloonattu, hitaasti kehittyvä patogeeni, eikä rekombinaatiosta tai horisontaalisesta geeninsiirrosta ole ilmeisesti merkkejä. Tässä työssä sovellamme vertailevaa genomitiedettä koko genomin sekvensointiaineistoon (WGS), joka koostuu 70 naudan M.-yksilöstä eri sukupuista (Eurooppa ja Afrikka), saadaksemme tietoa nautojen M.-bakteerien geneettisestä monimuotoisuudesta. Evoluutiovoima. Kolmea eri menetelmää käytetään uudelleenjärjestelyn merkkien arvioimiseen. Maailmanlaajuisesti pieni määrä rekombinaatiotapahtumia on tunnistettu ja vahvistettu kahdella riippumattomalla menetelmällä, joilla on vankka tuki. Mutaatioihin verrattuna rekombinaatiolla on kuitenkin heikompi vaikutus M. bovis -bakteerin monimuotoisuuteen (kokonais-r/m = 0,037). Mycobacterium bovis -bakteerin klonaalikompleksissa omassa aineistossamme havaittu r/m-keskiarvon ero on yhdenmukainen yleisen käsityksen kanssa, jonka mukaan rekombinaation aste voi vaihdella suuresti samaan taksonomiseen lajiin liitettyjen linjojen välillä. Tämän työn perusteella rekombinaatiota Mycobacterium bovisissa ei voida sulkea pois, joten sitä tulisi tutkia jatkossa vertailevassa genomitutkimuksessa, jossa eri epidemiologisista skenaarioista eri puolilta maailmaa peräisin olevien suurten aineistojen WGS on ratkaisevan tärkeää. Tämän jälkeen suoritettiin lisäanalyysi pienemmälle Mycobacterium bovis -aineistolle (n = 42) moni-isäntätuberkuloosin esiintyvyydestä, ja tunnistettiin yli 1 800 lokusta, joista ainakin yhdellä kannalla oli yhden nukleotidin polymorfismi (SNP). Suurin osa (87,1 %) sijaitsee koodaavalla alueella, ja synonyymien muutosten ei-synonyymien muutosten globaali suhde (dN/dS) ylittää 1,5, mikä osoittaa, että positiivinen valinta on tärkeä M. bovis -bakteeriin kohdistuva evolutiivinen voima. Suurempi osuus SNP:itä havaittiin geeneissä, jotka olivat täynnä toiminnallisia luokkia kuten "lipidiaineenvaihdunta", "soluseinä ja soluprosessit" sekä "väliaineenvaihdunta ja hengitys", mikä paljastaa niiden potentiaalin Mycobacterium bovisin biologiassa ja evoluutiossa. Lähempi tarkastelu MTBC-esi-isien geenejä, jotka ovat alttiita horisontaaliselle geeninsiirrolle ja sisältyvät 3R-järjestelmään (DNA:n korjaus, replikaatio ja rekombinaatio), paljastaa Taijiman D-neutraalitestin globaalin keskimääräisen negatiivisen arvon, mikä viittaa aiempaan selektiiviseen skannaukseen. Viimeaikainen pullonkaula populaation laajentumisen jälkeen on edelleen tärkein evolutiivinen ajava tekijä pakollisen patogeenin Mycobacterium bovisin taistelussa isäntää vastaan.
Mycobacterium tuberculosis -kompleksi (MTBC) on yksi menestyneimmistä bakteeripatogeenien taksoneista ja tyypillinen esimerkki bakteerien evoluutiosta. Sen jäsenillä on yllättävän korkea nukleotidi-identiteetti genomitasolla (> 99 %)1,2. Eri MTBC-ekotyypit voivat aiheuttaa tuberkuloosia (TB), joka on tarttuva granulomatoottinen sairaus, monilla isäntälajeilla mikronisäkkäistä ihmisiin3,4,5. Tällä hetkellä kompleksiin kuuluvat ihmiset [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] ja eläimiin sopeutuneet patogeenit (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" ja "dassie")5,6. M. canettii (tunnetaan myös nimellä "Nodobacter glabrata") Keskimääräinen nukleotidi-identiteetti edellä mainittujen mykobakteerien kanssa on 98 %, ja vertaileva genomitutkimus on osoittanut, että M. canettii ja muu MTBC:n osa ovat viime aikoina eronneet yhteisestä esi-isästään.7 Tämän käsitteen perusteella jotkut kirjoittajat kutsuvat M. canettiita MTBC:n jäseneksi 8.
MTBC:tä kuvataan systemaattisesti tiukkana klonaalisena kompleksina, ja sen populaatiorakennetta selvästi säätelevät vähentynyt monimuotoisuus, pullonkaulat, selektiivinen skannaus ja geneettinen ajautuminen9,10. Olettaen, että monimutkaista tiukkaa klonaalista evoluutiota, kuten puuttuvia polymorfismeja, ei voida palauttaa rekombinaatiolla. Tämän lähtökohdan perusteella differentiaalisen alueen (RD) genomisen deleetion ja TbD1:n (Mtb-spesifinen deleetio 1 -alue) peräkkäisiä tapahtumia on ehdotettu MTBC:n evoluution molekyylimarkkereiksi2,5,11. Vertaileva genomitutkimus ja koko genomin sekvensointi (WGS) tukevat ihmiseen sopeutuneiden jäsenten jakautumista yhdeksään sukulinjaan (Mycobacterium tuberculosis L1-L4, L7 ja L8; ja Mycobacterium africanum L5, L6 ja L9), sukulinjoilla L2-L4 on yhteinen deleetio TbD1-alue2,11,12,13. Lisäksi eläimiin sopeutuneilla jäsenillä ehdotetaan olevan yhteinen esi-isä, joka määritellään kladispesifisillä deleetioilla RD7:ssä, RD8:ssa, RD9:ssä ja RD1:ssä02, 5 ja 14.
Horisontaalisia geeninsiirtoja (HGT) ja rekombinaatiotapahtumia pidetään harvinaisina ja niitä esiintyy MTBC:n esi-isissä, eikä koko MTBC:n jäsenen erilaisessa historiassa15,16,17. Kaksi varhaista raporttia Hughesilta ja yhteistyökumppaneilta (2002) sekä Gutackerilta ja yhteistyökumppaneilta (2006) ehdottivat, että rekombinaatiotapahtumat voivat auttaa muokkaamaan polymorfismeja, jotka merkitsevät tiettyjä lokuksia M. tuberculosis -kannoissa18,19. Syyt rekombinaation ilmeiseen puutteeseen MTBC:ssä ovat: (1) HGT:n mekaaninen prosessi ja kyvyn menetys; (2) HGT-tapahtumien harvinaisuus; (3) rekombinaatiotapahtumien mahdollisuus MTBC:n lokerossa14,17. Viime aikoina jotkut MTBC-kantaan 20 ja Mycobacterium bovis 21 sovelletut koko genomin sekvensointitutkimukset (WGS) ovat antaneet näyttöä rekombinaatiosta, ensimmäiset, jotka osoittavat, että MTBC-kannat vaihtavat usein pieniä DNA-fragmentteja, mutta rajoitetun nukleotidisekvenssivariaation vuoksi näitä tapahtumia ei ole vieläkään havaittu.
Mycobacterium bovis on yleisimmin karjasta (pääasiassa naudoista) löydetty MTBC-jäsen, vaikka se voidaan eristää myös vapaiden laidunten ja aidattujen villieläinten eläimistä4,22,23,24. M. bovis kehittyi viiteen pääklonaaliseen kompleksiin [eurooppalainen 1 (Eu1), eurooppalainen 2 (Eu2), eurooppalainen 3 (Eu3), afrikkalainen 1 (Af1) ja afrikkalainen 2 (Af2)] spoligotyypitysprofiilin, spesifisten deleetioiden ja yksittäisten nukleotidipolymorfismien (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 mukaan tietyissä geeneissä. Nämä klonaaliset kompleksit osoittavat Mycobacterium bovis -populaation monimuotoisen rakenteen ja sen yhteyden maantieteellisiin alueisiin. Lisäksi Zimpelin ja yhteistyökumppaneiden (2020) äskettäin tekemässä WGS-työssä suunniteltiin Mycobacterium bovisin SNP:hen perustuva fylogenia, jossa on yli 1 900 genomia. Tämä osoittaa, että on olemassa ainakin neljä eri sukulinjaa (nimeltään Lb1 - Lb1 - Lb4). Ne eivät kuitenkaan ole täysin yhdenmukaisia aiemmin määritellyn klonaalisen kompleksin kanssa, vaikka maantieteellinen spesifisyys voidaan myös vahvistaa30. Nämä kirjoittajat suorittivat fylogenian ja molekyyliajoituksen differentiaalianalyysin, mutta eivät tutkineet rekombinaatiota30.
Aiempi työ, jossa on käytetty erilaisia molekyylitekniikoita, kuten spoligotyypitystä, MIRU-VNTR:ää (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) ja viimeaikaista SNP-tyypitystä, paljasti tietyn tason geneettistä monimuotoisuutta M. bovis -kantojen välillä 31,32,33, 34,35. Geneettisen vaihtelun erilaistumisesta on tullut tärkeä työkalu tautiepidemiologian tutkimuksessa, mikä on hyödyllistä patogeneesin, virulenssin ja tautien leviämisen syvällisemmässä ymmärtämisessä. WGS-menetelmän esiinmarssi tarjoaa mahdollisuuden paljastaa Mycobacterium bovis -genomin evolutiiviset ajuritekijät sopeutumisprosessissa ja pysyvyydessä eri isännissä ja epidemiologisissa skenaarioissa.
Tässä työssä käytämme vertailevaa genomianalyysia erilaisista Mycoplasma bovis -aineistoista (n = 70), mukaan lukien eri klonaalisista komplekseista peräisin olevat isolaatit, saadaksemme tietoa Mycoplasma bovisin evoluutioprosessista, erityisesti fylogeneettisten suhteiden ja rekombinaatiotapahtumien ratkaisemiseksi. Tämän analyysin täydennyksenä tutkittiin edelleen Portugalin hyvin karakterisoidulta moni-isäntätuberkuloosialueelta31,36 saatujen M. bovis -isolaattien (n = 42) osaaineistoa ei-identiteettisten muutosten päättelemiseksi. Sense- (dN) ja synonyymisten (dS) nukleotidisubstituutioiden suhteellisen suhteen tasapaino sekä kirjallisuudessa mainittujen tiettyjen genomien evolutiivinen panos ovat 37,38 MTBC-esi-isien saamia HGT:n kautta, ja ne koodaavat 3R (DNA:n korjaus, replikaatio ja rekombinaatio) -järjestelmän geenikomponentteja 39. Valitse HGT:n kautta saatuja geenejä, koska ne voivat edustaa ikivanhoja polymorfismeja, joten on odotettavissa, että ne saattavat sisältää suuremman osuuden synonyymeja muutoksia. 3R-järjestelmään sisällytetyt geenit valittiin, koska aiempi M. tuberculosis -kannoilla tehty työ osoitti yleisiä negatiivisia/puhdistavia valintoja, jotka toimivat näillä geeneillä, ja niillä voi olla tärkeä rooli evoluutiossa39. Tämän työn toisena tavoitteena on päätellä reorganisaatiotapahtumien olemassaolo. Tästä syystä, ottaen huomioon, että Portugalista peräisin oleva aineistomme sisältää vain eurooppalaisen kloonikompleksi 2:n genomit ja kannat, joille kloonikompleksi ei ole määritetty, päätimme sisällyttää julkisesti saatavilla olevaa genomitietoa saadaksemme lopulta edustavan kuvan kaikista kloonikomplekseista ja parantaaksemme tulosten luotettavuutta ja laajuutta.
Tämän työn keskiössä ovat 42 uutta sekvensoitua Mycoplasma bovis -genomia Portugalin endeemisestä moni-isäntätuberkuloosiskenestä (yksityiskohdat alla), jotka on aiemmin karakterisoitu epidemiologisesta näkökulmasta36. Koska Portugalista peräisin oleva aineisto sisältää vain eurooppalaisten 2 kloonin kompleksien edustajia ja kantoja ilman nimettyjä komplekseja, on lisätty julkisesti saatavilla olevaa koko genomin sekvensointidataa laajentamaan aineistoa, joka sisältää kaikki M. bovis -kloonikompleksien edustajat. Siksi tässä työssä käytettiin kolmea koko genomin sekvensointidatan lähdettä: täydellinen/luonnosgenomin kokoonpano, jopa 10 NCBI:ssä (National Center for Biotechnology Information) tallennettua telakkaa (n = 15 isolaattia); SRA:ssa (sekvenssien lukuarkiston Illumina fastq -tiedosto) tallennettu telakka, joka edustaa M. bovis -kloonien monimutkaista monimuotoisuutta (n = 12 isolaattia)30; ja 42 uutta sekvensoitua genomia Portugalista. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) jätettiin pois NCBI-hausta. M. bovis AF2122/97:ää käytetään yleensä referenssigenomina, jotka sisällytetään tietojoukkoon. Koska afrikkalaisen 1-kloonauskompleksin edustama koko genomisekvenssi ei ole julkisesti saatavilla ja Af2- ja Eu1-kantojen edustavista kannoista on vain vähän genomeja, näissä tapauksissa käytettiin SRA:n toimittamaa alkuperäistä sekvensointidataa. Zimpelin ja hänen yhteistyökumppaneidensa (2020) työ auttoi tunnistamaan genomin edellä mainitusta kloonauskompleksista ja auttoi valitsemaan Mycobacterium bovisin sisällytettäväksi tietojoukkoon. Eu3:lle on kuvattu vain yksi genomityyppi (Branger et al., 2020), joten sisällyttämämme genomi on erillinen Eu3-kompleksin edustaja.
Maailmanlaajuisesti tämä aineisto sisältää 70 naudan M. bovis -bakteeria, jotka on eristetty kahdeksasta isäntälajista 12 maassa vuosina 1985–2016. Lajeista 36 on nimetty Eu2-lajeiksi, 7 lajia Eu1-lajeiksi, 1 laji Eu3-lajeiksi, 3 lajia Af1-lajeiksi, 4 lajia Af2-lajeiksi ja 19 ei kuulu mihinkään klonaaliseen kompleksiin (tiedot alla). Tässä tutkimuksessa käytetyt Mycobacterium bovis -bakteerin yksityiskohtaiset tiedot (mukaan lukien talletusnumero) on esitetty taulukossa 1 ja lisätaulukossa 1.
Tämän tutkimuksen keskipisteenä on 42 uutta sekvensoitua Mycobacterium bovis -bakteerin kokonaisgenomia Portugalin eläinten tuberkuloosialueilta, jotka ovat olleet levinneet alueille yli 12 vuoden ajan, sillä potentiaalisia villieläinten ja karjaeläinten tautijärjestelmiä on seurattu säännöllisesti31,36 (lisäkuva 1). Myöhempien menetelmien mukaisesti nämä kannat eristettiin naudoista (n = 14), saksanhirvistä (n = 16) ja villisioista (n = 12) vuosina 2003–2015: eläimet on kerättävä ja käsiteltävä suositeltujen protokollaohjeiden mukaisesti. Kudosnäytteet ovat OIE:n maaeläinten käsikirjassa ja ne on inokuloitu Stonebrinkin ja Löwenstein-Jensenin pyruvaatti-kiinteälle ja nestemäiselle kasvatusalustalle. Viljelmiä inkuboidaan 37 °C:ssa ja kasvua tarkistetaan kerran viikossa vähintään 12 viikon ajan. Yhdyskuntia säilytetään suoraan glyseroliliuoksessa -80 °C:ssa. Mycobacterium-selektiivisessä elatusaineessa (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) alkuperäiset arkistoidut näytteet ajettiin yhden in vitro -viljelyn läpi WGS-ohjelman DNA:n saamiseksi. Tätä varten pakastettu viljelyliuos rikastettiin 5 % natriumpyruvaatilla ja 10 % ADS:llä (50 g albumiinia, 20 g glukoosia, 8,5 g natriumkloridia 1 litrassa vettä) Middlebrook 7H9 -elatusaineessa 37 °C:n lämpötilassa (Retrain). Neljän viikon kasvun jälkeen elatusaine uusittiin ja viljelmää seurattiin säännöllisesti, kunnes kasvua havaittiin. Solut kerättiin sentrifugoimalla, pelletti suspendoitiin uudelleen 500 µl:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), kuumennettiin 99 °C:ssa 30 minuuttia, sentrifugoitiin ja supernatantti säilytettiin -20 °C:ssa WGS-ohjelmaan asti. Kaikki toimenpiteet suoritetaan tason 3 bioturvallisuustiloissa.
WGS-paritetun genomikirjaston valmistelussa käytetään kunkin DNA-näytteen yksilöllistä indeksiä, ja sekvensointiin käytetään Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 näytettä) ja HiSeq (2 × 150 pb) (kaksi isolaattia) -tekniikkaa (Eurofins Genomics, Saksa). Valmistajan ohjeiden mukaisesti genomisen DNA:n sekvensointiin käytetään Illumina Genome Analyzer -laitetta, jossa on kaksipäinen moduulikiinnitys, ja kirjaston rakentamiseen käytetään Illuminan Nextera XT DNA Library Prep Kit -pakkausta.
Ottaen huomioon SRA:sta talteen otetut tiedot (n = 12), kloonikompleksin tunnistusta voidaan käyttää vastaavan julkaisun 30, 41, 43 metatietona. Kun tarkastellaan koko genomia, lukuun ottamatta Mycobacterium bovis AF2122/97:ää ja Mycobacterium bovis 3601:tä, jotka ovat tunnistettuja Eu1- ja Eu3-klonaalisten kompleksien 25, 29 jäseniä, se on sama kuin Mycobacterium tuberculosis H37Rv:n (NCBI:n talletusnumero NC_000962.3) täydellinen genomi. Genomin linjaus suoritetaan käyttämällä MAFFT:tä (aminohappo- tai nukleotidisekvenssien monilinjainen linjausohjelma, versio 7.458) ja parametria -addfragments48. Sitten etsitään eri klonaalisten kompleksien puuttumista ja/tai SNP-ominaisuuksien esiintymistä.
Uudelleen sekvensoitu Mycobacterium bovis (n = 42) ja kootun genomiluonnoksen alkuperäiset lukemat (n = 3) rinnastavat kompleksin referenssigenomiin Mycobacterium tuberculosis H37Rv vSNP-prosessin ja eri kloonien deleetio- ja/tai SNP-ominaisuuksien esiintymisen kautta. Suoritettiin haku.
Kerää tietoa ominaisuuksien puutteesta ja/tai SNP:n esiintymisestä/puuttumisesta sekä spoligotyypitysprofiileista genomitietojen liittämiseksi vastaavaan klonaalikompleksiin. Neljän luonnoskokoonpanon spoligotyypitysprofiilia ei voida päätellä, joten ne sisältyvät "ei monimutkaisuutta" -ryhmään.
Tässä työssä noudatettava bioinformatiikan työnkulku alkaa de novo -kokoamisesta ja kartoituksesta referenssistrategiaan asti, tavoitteenaan tutkia rekombinaatiotapahtumia ja spesifisiä genomipolymorfismeja. Kuva 1 esittää vuokaavion seuratuista vaiheista. Rekombinaatioanalyysissä kaikkia genomeja käytetään päätelmien ja niihin liittyvien indikaattoreiden luotettavuuden lisäämiseksi.
Genomin konsensussekvenssien generointivirheiden vähentämiseksi teimme ensin de novo -kokoonpanon ja sitten useita ydinlinjauksia. Unicycler-prosessi on tällä hetkellä saatavilla osoitteessa https://github.com/rrwick/Unicycler49, ja sitä käytetään 54 sekvensoidun genomin (42 uutta sekvensoitua ja 12 SRA:sta palautettua fastq-tiedostoa) de novo -kokoonpanoon. Lyhyesti sanottuna ennen kokoamista tyhjästä lukulaadun analyysi suoritettiin FastQC-versiossa 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) ja Trimmomatic-versiossa 0.36 (käytössä ovat vaihtoehdot "sovittimien ja muiden valaistuskohtaisten sekvenssien leikkaaminen lukemista" ja "emästen leikkaaminen lukemisen lopusta, jos laatu on alle 20 kynnysarvon") (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Sitten genomin kokoamiseen käytettiin SPAdes-optimizeria49 ja kokoamisen jälkeiseen optimointiin Pilon-versiota 1.1851. Virheellisen kokoamisen välttämiseksi valittiin konservatiivinen silloitusmenetelmä, ja k-mer-kokoa etsittiin ja valittiin 20–95 %:n lukupituudesta. Noudata SPAdes-ohjeita ja ota huomioon lukukoko, poista alle 300 bp:n kokoiset kontigit ja aseta 20 lukusyvyyden kattavuusrajaksi 52. De novo -kokoamisstrategiassa genomisia alueita, kuten erittäin toistuvia proliini-glutamaatti (PE) ja proliini-proliiniglutamaatti (PPE) -paralogeja, ei poistettu.
De novo -kokoonpanon laatua arvioidaan QUAST-putkilinjan (//quast.sourceforge.net/quast.html) kautta, joka helpottaa kontigin ja M. bovis AF2122/97 -referenssigenomin (NCBI-tunnus LT708304.1) uusimista (katso laatuparametrit lisätaulukosta 1).
Illumina-sekvensoinnista saatua äskettäin sekvensoitua M. bovis -geenin FASTQ-tiedostoa verrataan vSNP-prosessiin (https://github.com/USDA-VS/vSNP) M. bovis AF2122/97 -referenssigenomiin (LT708304.1). Genome Analysis Toolkitin (GATK) 53, 54, 55 parhaiden käytäntöjen suositusten mukaisesti käytetään uudelleenkalibrointiin standardisuodatusparametreja tai varianttien massapisteitä. Tulokset suodatetaan käyttämällä alhaisinta SAMtools-massapisteytystä 150 ja AC = 2. Käytä myös Krakenia (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) lukemien tarkistamiseen kontaminaation poissulkemiseksi. Työssämme sekvensointistrategioihin kartoittamiseen käytetty vSNP-prosessi tutkii useita määriteltyjä SNP:itä ja kohteita ja sulkee pois myös sekainfektioskenaariot. Luetun genomin kattavuus on parempi kuin 99 % (lisätaulukko 1).
Välttääksesi kartoitusvirheet ja väärät SNP:t, suodata variantti pois seuraavissa tapauksissa: (1) sitä tukee alle 20 lukemaa, (2) se löytyy alle 0,9:n frekvenssillä, (3) se esiintyy ainakin yhdessä kannassa, mutta ainakin toisessa kannassa on aukkoja. Integrated Genomics Viewer (IGV) -ohjelman versiota 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 käytettiin SNP:iden ja niiden sijaintien visuaaliseen tarkistamiseen, joissa oli kartoitus- tai kohdistusongelmia. Koska proliini-glutamaatti- (PE) ja proliini-proliiniglutamaatti- (PPE) geenit ovat erittäin kahdentuneita ja kuuluvat monigeeniseen perheeseen, Illumina-sekvensointi ja virheellinen kartoitus voivat helposti ymmärtää ne väärin, joten niitä suositaan. Mykobakteerien bioinformatiikan työnkulku poisti tuberkuloosikompleksin jäsenet, kun SNP:iden vahvistamiseksi käytettiin kartoitusstrategiaa sekvensointiin. Siksi suodatettiin PE/PPE-geenit ja indelit pois analyysistä.
Bovilistin (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) mukaan kaikki SNP:t jaetaan toiminnallisiin luokkiin. SnpEff-prosessia (https://pcingola.github.io/SnpEff/) käytetään SNP-seurausten (synonyymisten tai ei-synonyymisten muutosten) päättelemiseen. Mycobacterium bovis AF2122/97 -genomista luotiin uusi tietokanta (LT708304.1).
Ydingenomin moninkertaisrinnastus suoritettiin käyttämällä Parsnp v1.2 -ohjelmaa, joka on tällä hetkellä saatavilla osoitteesta https://github.com/marbl/parsnp57, käyttäen 69 täydellistä genomi-/luonnoskokoonpanoa (optiolla -c) ja referenssinä M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Suoritettiin neljä ydingenomin moninkertaisrinnastus: vain Eu2-kloonauskompleksin jäsenet (n = 37), mukaan lukien kaikki eurooppalaisen kloonauskompleksin jäsenet (n = 44), mukaan lukien eurooppalaisen ja afrikkalaisen kloonauskompleksin liitoskohta (n = 51), ja kaikki Mycobacterium bovis -bakteerit (n = 70) tässä tutkimuksessa.
Parsnp:n tuottamaa ydinlinjausta käytetään suurimman uskottavuuden (ML) fylogeneettisen puun päättelemiseen CIPRES Science Gateway v3.3:lla (http://www.phylo.org/)58 käyttäen RAxML:ää ja 1000 ohjattua replikaatiota.
Rekombinaatiotapahtumien esiintymisen tarkistamiseen käytetään rinnakkain kolmea eri algoritmia ja bioinformatiikan työkalua: SplitsTree4-ohjelmistoa, Gubbins-prosessia (harhaton sukulaisuus rekombinaation kautta nukleotidisekvensseissä) ja RDP4-ohjelmistoa (rekombinaation havaitsemisohjelma, versio beta 4.101).
Juurettoman fylogeneettisen verkoston laskemiseen käytetään SplitsTree4 v4.15.1:ssä (http://www.splitstree.org/)59 toteutettua jakohajotelmamenetelmää, tilastolliseen varmennukseen käytetään Phi-testiä, ja merkitsevyyskynnys on p = 0,05. Syötteenä käytetään Parsnp:n ydinmonilinjausanalyysiä, ja jakohajotelma toteutetaan verkostostandardina.
Gubbins-prosessi v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) toimii oletusparametreilla toisena tapana arvioida rekombinaation vaikutusta Mycobacterium bovikseen. Prosessiprosessissa käytetty algoritmi rekonstruoi asiaankuuluvan kloonilinjan. Datajoukkomme täydellinen genomi/luonnoskokoonpano ja referenssigenomi (naudan laastarin AF2122/97, LT708304.1) tarkistetaan keskenään ja skannataan SNP:n sijainti puun jokaisella haaralla havaitakseen rekombinaatiotapahtumaa edustavan SNP-klusterin. Haaran nollakohta Oletetaan, että rekombinaatiotapahtumaa ei ole, mikä tarkoittaa, että haarassa esiintyvien SNP:iden tulisi jakautua tasaisesti. Syöttötiedostoina käytetään Parsnp:n ydinmonikohdistusta ja RAxML:n parhaiten pisteytettyä ML-puuta.
Lopuksi, Gubbins-liukuhihnan ehdottaman uudelleenjärjestelytapahtuman vahvistamiseksi, RDP467:ssä toteutettuja kuutta algoritmia (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 ja SiScan66) sovelletaan Parsnp:n ydinmonikohdistukseen oletusasetuksilla. Määritimme, että ainakin kolmen RDP4:ssä toteutetuista algoritmeista on johdonmukaisesti osoitettava tärkeä signaali jokaisen rekombinaatiotapahtuman varmistamiseksi.
Koska sekä Gubbins että RDP-ohjelmistot etsivät rekombinaatiosignaaleja tarkistamalla ydinten moninkertaiset rinnastukset jopa 500 bp:n ikkunassa ja varmistamalla, että PE/PPE-geenien sisällyttäminen de novo -kokoonpanon aikana ei häiritse löydettyjä rekombinaatiosignaaleja, lisäanalyysi tehdään homolineaarisuuden avulla tarkistamalla rekombinaatiotapahtuman tunnistavan geenin läheisyys. Koko genomia käyttävä synlineaarinen kartta konstruoitiin käyttämällä MAUVE-multi-genome-linjausta (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) paikallisten genomin translokaatioiden tai inversioiden poissulkemiseksi. Lisäksi koko genomia käytettiin aminohapposekvenssin homolineaarisuusanalyysiin SyntTax-verkkopalvelimen kautta (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Portugalilaisesta moni-isäntätuberkuloosijärjestelmästä saadun genomiaineiston perusteellisempi analyysi on kirjallisuudessa mainittujen geenien polymorfismin tarkistaminen. Nämä geenit ovat 37, 38 ja MTBC-esi-isien HGT (DNA:n korjaus, replikaatio ja rekombinaatio) -järjestelmän komponenttien kautta saatu 3R:ää koodaava geeni 39. Geenidiversiteetin ja nukleotididiversiteetin (π) laskemiseen ja Tajiman D-neutraalitestin parametrien syötteeseen käytetään ClustalX v2.1:tä (http://www.clustal.org/clustal2/) ja DnaSP v6.12.03:a (http://www.ub.edu/dnasp/).
Saatiin 69 Mycoplasma bovis -isolaatin ja referenssigenomin perusteella maksimaalisen uskottavuuden (ML) fylogeneettinen puu (kuva 2A). Verrattuna yhden geenin tai usean lokuksen perustuviin puihin, tämä strategia mahdollistaa tehokkaampien puiden luomisen, jotka eivät tallenna koko genomin vaihtelua ja joilla on siksi heikompi kyky erottaa lajeja toisistaan 68,69. ML-puun topologinen rakenne on yleensä yhdenmukainen kloonien monimutkaisen luokittelun kanssa. Eu2:n genomi on ryhmittynyt haaraksi, ja myös Af1:n genomi on ryhmittynyt yhteen (kuva 2A). Tulos on myös yhdenmukainen Mycobacterium bovisin tunnetun evolutiivisen suhteen kanssa, eli Eu1-jäsenen ja kaikkien muiden klonaalisten kompleksien ja genomien ryhmän välillä on suuri ero, mutta klonaalista kompleksia 30 ei ole määritelty. Kloonaalisen kompleksin ja fylogeneettisessä puussa havaitun suhteen välinen pieni epäjohdonmukaisuus voidaan selittää sillä, että kloonaalinen kompleksi kuvataan tiettyjen genomialueiden perusteella, kun taas fylogeneettinen puu perustuu koko genomia edustavien ydingenomien useisiin rinnastuksiin.
Maksimaalisen uskottavuuden fylogeneettinen puu (GTR) konstruoidaan Mycobacterium bovis -genomin ydingenomin linjauksen perusteella ennen rekombinaatiokohdan poistoa (A) ja sen jälkeen (B). Oksan värit edustavat Mycobacterium bovis -kloonikompleksia: Eurooppa 1 on violetti, Eurooppa 2 on punainen, Eurooppa 3 on sininen, Afrikka 1 on oranssi ja Afrikka 2 on vihreä. Puu on juurtunut ja piirretty mittakaavaan, ja oksan pituus mitataan kunkin kohdan korvaamiseksi.
Mycobacterium tuberculosis -kompleksia kuvataan klonaalisesti kehittyneeksi, ja suurin osa vuosien varrella kertyneestä todistusaineistosta tukee ajatusta, että meneillään olevia HGT- ja rekombinaatiotapahtumia ei tapahdu havaittavalla MTBC-tasolla15,17,18.
Aiempi työ on osoittanut, että MTBC-kantojen välillä voi olla rajoitettua rekombinaatiota20,21, kun taas toisissa ei ole onnistuttu tunnistamaan mitattavia rekombinaatiotapahtumia70,71. Keskustele tästä asiasta uudelleen keskittyen Mycobacterium bovikseen, mikä eroaa aiemmasta työstä, jossa käsiteltiin vain Mycobacterium tuberculosista 70,71; tai tarkastele MTBC:tä kokonaisuutena, jossa M. bovis ei juurikaan edusta 20; tai tarkastele vain rajoittavia nautakarjan osuuksia. Tässä työssä käytetyssä mykobakteeriaineistossa on yhteensä 70 kantaa, jotka edustavat kaikkia klonaalisia komplekseja, joita käytetään rekombinaation seulontaan. Aineisto on skaalattu neljän kumulatiivisen tason mukaan: (1) Eu2-jäsenet, (2) kaikki eurooppalaiset kloonikompleksien jäsenet (eli Eurooppa), (3) eurooppalainen ja afrikkalainen kloonikompleksi (Eu + Af) ja (4) koko datakokoelma (mukaan lukien genomit, jotka eivät sisälly mihinkään jo kuvattuihin kloonauskomplekseihin).
Tämän hypoteesin jatkotutkimiseksi suoritettiin split-decomposition-verkko genomien välisten rekombinaatiotapahtumien puuttumisen arvioimiseksi, koska tämä menetelmä voi visualisoida yksilöiden välisen esi-isien välisen sukulaisuussuhteen ja näyttää ristiriitaisia fylogeneettisiä signaaleja. Kaikki neljä analyysin aineistoa vahvistivat silmukoiden olemassaolon verkostossa (eli alueet, jotka eivät suppene yhdeksi puuksi), mutta Phi-testillä ei ole tilastollista tukea (Eu2, p = 0,0956; Eurooppa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; koko aineisto p = 0,2451), mikä antaa heikon näytön reorganizaatiotapahtumien olemassaolosta (kuva 3A-D).
Euroopassa kaksi genomia (n = 37) (A), eurooppalaiset genomit (n = 44) (B), eurooppalaiset ja afrikkalaiset genomit (n = 51) (C) ja koko aineisto (n = 70) (D).
Tämän analyysin jälkeen ja ottaen huomioon sykliset havainnot kaikissa verkostoissa, Gubbinsin prosessissa toteutettua rekonstruktioalgoritmia sovellettiin klonaalisen linjan rekonstruointiin ja rekombinaation vaikutuksen M. bovis -genomiin arvioinnin täydentämiseen. Pääteltiin rekombinaatiotapahtumien kumulatiivinen lukumäärä, joista suurin osa tapahtui terminaalisissa haaroissa (eli yhdessä genomissa) (taulukko 2). Nämä indikaattorit osoittavat koko datajoukon johdonmukaisuuden ja osoittavat, että rekombinaatiotapahtumien taajuus on 200–300 kertaa mutaatioiden taajuus. Kun haaran rekombinaation ja pistemutaatioiden suhteellisia nopeuksia edustava rho/theta-parametri näyttää olevan välillä 0,0037–0,0056 (taulukko 3). Äskettäin julkaistussa 38 M. bovis -kannan työssä osoitettiin korkeampi rho/theta-arvo (rho/theta = 0,1) kuin tässä aineistossa saatu, mutta Patanén ja kollegoiden työssä käytettiin referenssipohjaista kokoonpanoa rekombinaatioparametrien päättelemiseen. Kokoonpanomenetelmästä johtuva proseduraalinen yksityiskohta on yhdistetty oletettujen rekombinaatiotapahtumien runsauteen terminaalihaarassa.
Seuraavaksi r/m-parametri edustaa rekombinaation ja mutaation syntymisen monimuotoisuussuhdetta, ja sen keskiarvo on 0,025–0,037, mikä osoittaa, että rekombinaatiolla on mutaatioihin verrattuna pienempi kokonaisvaikutus M. bovisin geneettiseen monimuotoisuuteen (taulukko 3). Laajan vertailun vuoksi käytettiin samanlaista menetelmää r/m-parametrin arvioimiseen 23 genomista koostuvassa MTBC-aineistossa, jonka keskiarvo oli 0,48620, kun taas Patanén ja kollegoiden 38 genomin M. bovis -aineistossa keskiarvoksi saatiin 0,98. Ensimmäisessä tutkimuksessa vain kaksi 23 genomista sisällytettiin M. bovisin työhön (M. bovis BCG ja referenssikanta), joten saatu arvo voi olla vääristynyt M. tuberculosis -genomin yliekspression vuoksi. Toisessa raportissa analysoidut Mycobacterium bovis -populaatiot saatiin pääasiassa Yhdysvalloista ja karjaeläimistä. Sitä vastoin meidän aineistossamme on edustettuna useampia maantieteellisiä sijainteja ja isäntälajeja, ja käytetään myös genomeja, jotka on ryhmitelty eri klonaalisiksi komplekseiksi, joilla on erilaiset populaatiogeneettiset ominaisuudet, jolloin saavutetaan syvempi ja laajempi populaatiotieto. Aineistomme avulla saatu r/m-keskiarvon ero on yhdenmukainen sen käsitteen kanssa, että rekombinaatioaste vaihtelee suuresti samaan taksonomiseen lajiin liitettyjen linjojen välillä, joten nämä tulokset osoittavat, että M. bovis -kloonikompleksissa saattaa esiintyä rekombinaatioeroja. Vaikutus on myös Didelotin ja Maidenin72 ehdottama. Aineistoa laajennettaessa merkittävästi lisää M. bovis -genomeja voidaan kuitenkin selventää tätä asiaa. Sekä r/m- että rho/theta-parametrit osoittavat vaihtelua haarojen välillä, ja tämä tulos on yhdenmukainen muiden bakteerilajien72,73 raporttien kanssa.
Lopuksi, Gubbinsin prosessissa tunnistamien uudelleenorganisoitumistapahtumien vahvistamiseksi RDP4-ohjelmistossa käytettiin kuutta eri algoritmia eri ydinvertailujen itsenäiseen testaamiseen. Maailmanlaajuisesti alle puolet Gubbinsin tunnistamista tapahtumista vahvistettiin RDP4:llä (taulukot 4 ja 5). Koko datajoukosta vahvistettiin kolme rekombinaatiotapahtumaa, joista kaksi koski sisäisiä solmuja ja yksi yksittäistä genomia terminaalihaarassa, jolle ei voitu määrittää klonaalisia komplekseja (taulukot 4 ja 5). Tapahtumien tunnistaminen terminaalihaaroissa voi viitata siihen, että rekombinaatio on edelleen käynnissä nykyisissä M. bovis -kannoissa tai tulos on väärässä paikassa70. Tässä hypoteettisessa rekombinaatioalueella noin 20 %:lla kohdista on määrittelemättömiä nukleotideja (N), mikä vaikuttaa rekombinaatiosignaaliin (lisäkuva 2). Lisäksi tämä alue vaikuttaa rrs-geeniin, joka koodaa 16S ribosomaalista RNA:ta, jonka odotetaan olevan erittäin konservoitunut, joten tämä oletettu rekombinaatiosignaali voi olla seurausta sekvensointivirheistä tai virheellisestä kohdistuksesta. Sitten suoritettiin koko genomin rinnastus Mb0003:n ja Mycobacterium bovis AF2122/97:n välillä, ja määrittämättömien nukleotidien ja SNP:ien olemassaolo varmistettiin, joten mahdolliset väärään rinnastukseen liittyvät ongelmat eivät johtuneet tässä työssä toteutetusta biologisesta tiedosta, vaan ne ilmenivät ohjelman oppimisen jälkeen.
Sisäisten solmujen rekombinaatioalueilta ei löytynyt aukkoja tai määrittelemättömiä nukleotideja (kuvat 4 ja 5). Näistä tapahtumista toinen sisältää vain Eu2-genomin ja vaikuttaa pks12-geeniin, joka koodaa mahdollista polyketidisyntaasia; toinen taas on rekisteröity Eu1-genomiin ja vaikuttaa narX-geeniin, joka koodaa mahdollista nitraattireduktaasia (taulukko 4). Yleisesti ottaen rekombinaatioanalyysi osoittaa, että tilastollisesti tuettuja rekombinaatiofragmentteja on rajallinen määrä, ja päätellyt indikaattorit osoittavat, että rekombinaatiolla on vähäinen vaikutus M. bovis -linjaan. Rekombinaatiosignaalin odotetaan olevan heikko, mutta on tärkeää erottaa todellinen evoluutiosignaali taustakohinasta, mikä on haastava tehtävä. Referenssipohjaisten kokoonpano- ja yhteensopimattomuusongelmien 70, 71 aiheuttaman kohinan vähentämiseksi kaikki muut paitsi koko genomi koottiin alusta alkaen, ja kokoonpanon laatu tarkistettiin ja varmistettiin QUAST-putkianalyysillä (lisätaulukko 1). Lisäksi suoritettiin sarja täydentäviä analyysejä kokonaistutkimuksen luotettavuuden ja tarkkuuden varmistamiseksi. Siksi narX- ja pks12-geenien sekvensoinnin laatua arvioitiin lukukartoituksella Mycobacterium bovis AF2122/97:ää vastaan. Suositeltu SNP-sijainti rekombinaatioalueella varmistettiin soveltamalla menetelmäosiossa mainittuja kriteerejä (vähintään 20 lukemaa ja 0,9 muutostaajuus). narX-geenin polymorfismi varmistettiin täysin kahdessa genomissa (Mb1792361 ja Mb7240415; 2,3 %) sekä pks12-genomin genomeissa: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 ja Mb12-geenit. Genomin Mb2043 osalta kuusi kahdeksasta kohdasta ei kuitenkaan täytä lukusyvyyden kriteeriä, koska SNP:tä tukee enintään 17 lukua, mikä on alle vakiintuneen raja-arvon 20. Siksi kuuden genomin (8,6 %) rekombinaatio tässä genomikohdassa voidaan vahvistaa (kuvat 4 ja 5).
Mycobacterium bovis -aineiston rekombinaatioalueiden linjauksen yksityiskohtainen visualisointi vaikuttaa narX-geeniin, joka koodaa mahdollista nitraattireduktaasia. Sisäisten solmujen rekombinaatioalueelta ei löytynyt aukkoja tai määrittelemättömiä nukleotideja. Tämä tietty tapahtuma on rekisteröity Eu1-genomiin. NarX-geenin sekvensoinnin laatua arvioitiin piirtämällä Mycobacterium bovis AF2122/97:n lukemat. Vahvista suositeltu SNP:n sijainti rekombinaatioalueella soveltamalla menetelmäosiossa mainittuja kriteerejä (vähintään 20 lukemaa ja 0,9 muutostaajuus). NarX-geenin polymorfismi varmistettiin täysin Mb1792361:n ja Mb7240415:n genomeissa (2,3 %).
Mycoplasma bovis -aineiston pks12-geeniin vaikuttavan rekombinaatioalueen linjauksen yksityiskohtainen visualisointi. Sisäisten solmujen rekombinaatioalueelta ei löytynyt aukkoja tai määrittelemättömiä nukleotideja. Mahdollista polyketidisyntaasia koodaavaan pks12-geeniin vaikuttavan tapahtuman osalta se sisältää vain Eu2-genomin. pks12:n sekvensoinnin laatu arvioitiin Mycobacterium bovis AF2122/97:n lukukartoituksella. Vahvista suositeltu SNP:n sijainti rekombinaatioalueella soveltamalla menetelmäosiossa mainittuja kriteerejä (vähintään 20 lukemaa ja 0,9 muutostaajuus). Genomien Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 ja Mb1960 polymorfismit on täysin vahvistettu.
PE- ja PPE-geeneissä on toistuvia alueita, jotka Illumina-sekvensointi ja -kartoitus voivat helposti tulkita väärin, joten ne yleensä poistetaan M. tuberculosis -jäsenten bioinformatiikan työnkulusta vain käytettäessä sekvenssikartoitusstrategiaa. Tässä työssä sovellettu rekombinaatiotapahtumien päättely perustuu de novo -kokoonpanoon ilman PE/PPE-suodatusta. Uskomme, että toteuttamalla kolme erilaista toisiaan täydentävää menetelmää ja algoritmia SplitsTree-, Gubbins-liukuhihna- ja RDP4-ohjelmistojen avulla, käytetyt strategiat ovat kestäviä virhesignaalien aiheuttamien uudelleenjärjestäytyneiden alueiden käsittelyssä ja suodattamisessa. Jotta kuitenkin voitaisiin sulkea pois PE/PPE-geenin vaikutus Gubbins- ja RDP4-ohjelmistoihin SNP-klusterien tunnistamisessa ja siten narX- ja pks12-geeneihin vaikuttavien rekombinaatioalueiden tunnistamisessa, tutkittiin näiden geenien naapurustoa (lisäkuva 3–5). M. bovis AF2122/97:ssä narX-geenin erottavat narK2 ja Mb1764c, kun taas pks12:ta ympäröivät Mb2075c ja Mb2073c (lisäkuva 3-5). Koko genomin MAUVE-synline-karttaa käyttäen luotu kartta antaa tietoa geenisekvenssin säilymisestä ja uudelleenjärjestymisestä, ja siinä näkyy neljä kolineaarista lohkoa eikä merkkejä genomin translokaatiosta tai inversiosta. Lisäksi aminohapposekvenssillä tehty komplementaatioanalyysi osoitti homologian kaikissa täydellisissä genomeissa, eikä narX:n tai pks12:n vierekkäisillä alueilla havaittu PE/PPE-yhdisteitä. NarX:n osalta yhdellä genomilla (Mb0030) on alhaisempi synonymiapisteytys, koska narX-geeni tunnistettiin kahtena fragmenttina (fragmentit 1891 ja 1890). pks12:n tapauksessa samankaltaisuuksien vuoksi Mb0030:lla ja Mb003:lla oli alhaisemmat synlineaarisuuspisteet, kun taas pks12 tunnistettiin vastaavasti kahdessa ja kolmessa fragmentissa, jotka edustavat proteiinin eri domeeneja (lisäkuva 3-5). Ottaen huomioon nämä tiedot ja Gubbins- ja RDP4-ohjelmistojen suorittaman analyysin, joka tarkistaa ikkunan maksimissaan 500 bp:n ydinten moninkertaisen kohdistuksen, vahvistimme, että PE/PPE-geeni ei häiritse narX:ään ja pks12:een vaikuttavaa rekombinaatiosignaalia.
Vaikka tässä aineistossa havaittuja rekombinaatiosignaaleja voidaan pitää jäännössignaaleina, on totta, että rekombinaatiota M. bovisissa ei voida sulkea pois, joten sitä tulisi edelleen analysoida lisää, ja eri epidemiologisista skenaarioista peräisin olevia kokonaisia genomeja sekvensoidaan tärkeiksi.
Rekombinaatiokorjausta edeltäneiden ja sen jälkeisten ML-fylogeneettisten puiden vertailu (kuva 2A, B) ei johtanut merkittäviin muutoksiin päätellyssä fylogeneettisessä suhteessa, ja M. bovis -kannat ryhmittyivät samaan ryhmään.
Kun 42 uutta sekvensoitua M. bovis -lukua oli kartoitettu M. bovis AF2122/97:n referenssigenomiin, saatiin SNP-rinnastus, joka sisälsi 1816 polymorfista kohtaa. Useimmat SNP:t (87,1 %) sijaitsevat koodaavalla alueella, ja kyseessä olevat geenit on karakterisoitu Bovilist-taulukossa esitettyjen funktionaalisten luokkien mukaisesti (kuva 6A, B). Kunkin funktionaalisen luokan geenien kokonaismäärä huomioon ottaen "lipidiaineenvaihdunta"-kategorian geeneissä oli enemmän SNP:itä, seuraavaksi eniten SNP:itä esiintyi "soluseinä ja soluprosessit" ja "väliaineenvaihdunta ja hengitys", mikä paljastaa niiden olevan mukana M. bovis -evoluutiossa.
Portugalilaisen M. bovis -aineiston hierarkkinen analyysi (n = 42). Rekisteröityjen SNP:ien ja muuttuneiden geenien kokonaismäärä kullekin toiminnalliselle luokalle (A). Rekisteröityjen synonyymien ja ei-synonyymien muutosten kokonaismäärä toiminnallisella luokalla (B).
Globaalilla tasolla keskimääräinen dN/dS-suhde on parempi kuin 1,5, mikä osoittaa, että globaali evolutiivinen paine on päästä eroon esi-isien tilasta ja edustaa positiivista (monimuotoista tai suunnattua) ja/tai rennompaa puhdistusvalintaskenaariota. Kategorioissa "virulenssi, detoksifikaatio, sopeutuminen", "insertiosekvenssit ja faagit" sekä "säätelyproteiinit" yli kaksi kolmasosaa SNP:istä on ei-synonyymejä (kuva 6B).
Kaikissa kategorioissa on geenejä, joissa on useita SNP:itä, jolloin keskimääräinen mutaatioaste (eli keskimääräinen SNP geeniä kohden) on suurempi kuin 1 (kuva 6A). Pks12:lla (Mb2074c), jossa on 15 SNP:tä, ja fas:lla (Mb2553c), jossa on 8 SNP:tä, on korkeammat mutaatioarvot. Molemmat näistä geeneistä osallistuvat rasvahappojen aineenvaihduntaan. pks-geeni koodaa polyketidisyntaasia (PKS), joka on monitoiminen entsyymi, joka osallistuu mykobakteerien soluseinän lipidien biosynteesiin74,75. Tämä geeni koodaa monitoimista polypeptidiä, joka osallistuu mykoketidien synteesiin74,76. Fas-geeni osallistuu mykolihapon synteesiin. Molemmilla geeneillä on tärkeä rooli isäntäsolun kanssa kosketuksissa olevan soluseinän biosynteesissä.
Mycobacterium bovisin evoluution jatkotutkimiseksi analysoitiin kaksi joukkoa spesifisiä geenejä. Aiemmin julkaistuissa sekvenssikoostumusta ja fylogeneettisiä menetelmiä käyttäneissä tutkimuksissa tunnistettiin geenejä, jotka MTBC-esi-isät olivat hankkineet HGT:n kautta ennen monimuotoistumista37,38. Nämä geenit on lueteltu lisätaulukossa 2. Analysoitiin yhteensä 77 HGT:hen mahdollisesti liittyvän geenin SNP-jakauma ja tunnistettiin 26 polymorfista kohtaa, jotka useimmissa tapauksissa (78 %) johtivat ei-synonyymiin (NS) muutoksiin (lisätaulukko 2). Aiempi MTBC-genomia koskeva työ osoitti, että oletetulla HGT-alueella on korkeampi NS SNP -suhde verrattuna muuhun genomiin. Jos ajatellaan, että MTBC-esi-isät ovat hankkineet nämä rekombinaatioalueet ja että ne siksi edustavat ylimäärin muinaisia polymorfismeja, synonyymien muutosten osuuden odotetaan olevan suurempi, koska NS-substituutioiden odotetaan poistuvan negatiivisella valinnalla aminohappojen muutosten vuoksi, jotka voivat muuttaa proteiinin toimintaa. Siksi tuloksemme osoittavat, että toiminnalliset seuraukset voivat johtua HGT:n kaltaisten geenien korvautumisesta, mikä heijastaa niiden merkitystä arvokkaalle adaptiiviselle geneettiselle monimuotoisuudelle.
Tämän analyysin rinnalla tutkittiin perusteellisesti 3R-järjestelmän (DNA:n korjaus, replikaatio ja rekombinaatio) komponentteja koodaavia geenejä dos Vultosin ja yhteistyökumppaneiden (2008)39 aiemmin julkaiseman luettelon mukaisesti. Identtisten DNA-fragmenttien vaihtoa ei voida havaita suoraan, vaikka se voi olla yleinen prosessi, kun kyseessä ovat läheisesti sukua olevat bakteerit, kuten tämän aineiston tapauksessa. Lisäksi tämä prosessi voi olla avain DNA:n korjausmenetelmiin72, joten sillä voi olla rooli homologisessa rekombinaatiossa. Yhteensä 26 polymorfista asemaa tunnistettiin 54 geenissä (lisätaulukko 3). Tässä geenijoukossa NS-muutokset selittivät noin 65 % seurauksista, mikä on yhdenmukaista aiempien Mycobacterium tuberculosis -kantoja koskevien raporttien kanssa.
Julkaisun aika: 21.10.2021