Matur nuwun kanggo ngunjungi Alam. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan winates kanggo CSS. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake versi browser sing luwih anyar (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer). Ing wektu sing padha, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Urutan genom wis nyegerake bidang riset penyakit infèksius, ngungkapake epidemiologi penyakit, patogenesis, interaksi inang-patogen, lan proses evolusi sing ditrapake kanggo patogen. Komplek Mycobacterium tuberculosis (MTBC) nganggep Mycobacterium bovis minangka salah sawijining anggota adaptif kewan sing nyebabake tuberkulosis (TB) ing mamalia darat, lan minangka model evolusi bakteri sing khas. Kaya anggota MTBC liyane, Mycobacterium bovis dianggep minangka kloning sing ketat, patogen sing berkembang alon-alon, lan ora ana tandha-tandha rekombinasi utawa transfer gen horisontal. Ing karya iki, kita aplikasi genomic komparatif kanggo kabèh dataset urutan genom (WGS) dumadi saka 70 sapi M. saka macem-macem pedigrees (Eropa lan Afrika) kanggo gain pemahaman ing bhinéka genetis sapi M. daya evolusi. Telung cara sing beda digunakake kanggo ngira-ngira tandha-tandha reorganisasi. Sacara global, sawetara acara rekombinasi wis diidentifikasi lan dikonfirmasi kanthi rong cara mandiri kanthi dhukungan sing kuat. Nanging, dibandhingake karo mutasi, rekombinasi duweni efek sing luwih lemah ing keragaman M. bovis (sakabèhé r / m = 0,037). Bentenipun r / m rata-rata sing dipikolehi ing kompleks klonal Mycobacterium bovis ing set data kita konsisten karo konsep umum yen tingkat rekombinasi bisa beda-beda banget antarane garis keturunan sing ditugasake kanggo spesies taksonomi sing padha. Adhedhasar karya iki, rekombinasi ing Mycobacterium bovis ora bisa ditolak, mula kudu dadi subyek upaya luwih lanjut ing riset genomik komparatif ing mangsa ngarep, ing ngendi WGS saka set data gedhe saka skenario epidemiologis sing beda-beda ing saindenging jagad penting banget. Analisis tambahan banjur ditindakake ing set data Mycobacterium bovis sing luwih cilik (n = 42) saka prevalensi TB multi-host, lan luwih saka 1,800 lokus diidentifikasi, sing paling ora siji galur nuduhake polimorfisme nukleotida tunggal (SNP). Paling (87,1%) dumunung ing wilayah coding, lan rasio global saka owah-owahan non-sinonim (dN / dS) saka owah-owahan sinonim ngluwihi 1,5, nuduhake yen pilihan positif minangka pasukan evolusi penting sing ditindakake ing M. bovis. Proporsi SNP sing luwih dhuwur dideteksi ing gen sing sugih ing kategori fungsional "metabolisme lipid", "tembok sel lan proses seluler", lan "metabolisme lan respirasi penengah", ngungkapake potensial ing biologi lan evolusi pentinge Mycobacterium bovis. Nliti gen ing leluhur MTBC sing rawan transfer gen horisontal lan kalebu ing sistem 3R (repair DNA, replikasi, lan rekombinasi) nuduhake nilai negatif rata-rata global saka tes netral D Taijima, sing nuduhake pemindaian selektif kepungkur.
Komplek Mycobacterium tuberculosis (MTBC) minangka salah sawijining takson sing paling sukses saka patogen bakteri lan kasus evolusi bakteri sing khas. Anggotane nuduhake identitas nukleotida sing dhuwur banget ing tingkat genomik (> 99%)1,2. Ekotipe MTBC sing beda-beda bisa nyebabake tuberkulosis (TB), yaiku penyakit granulomatosa infèksius, ing macem-macem spesies inang saka mamalia mikro nganti manungsa3,4,5. Saiki, kompleks kasebut kalebu manungsa [M. Tuberkulosis (Mtb), Mycobacterium africanum] lan patogen sing diadaptasi kewan (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter , Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surikampanzee") lan "6" M. canettii (uga dikenal minangka "Nodobacter glabrata") Rata-rata identitas nukleotida karo mycobacteria kasebut ing ndhuwur iku 98%, lan karya genomik komparatif wis nuduhake yen M. canettii lan liyane saka MTBC bubar diverged saka leluhur umum.7 Ngelingi konsep iki, sawetara penulis nyebut M. canettii8 Anggota.
MTBC digambarake kanthi sistematis minangka kompleks klonal sing ketat, lan struktur populasi kasebut kanthi jelas diatur kanthi nyuda keragaman, kemacetan, pemindaian selektif, lan drift genetik9,10. Kanthi nganggep evolusi klonal sing kompleks, kayata polimorfisme sing ilang, ora bisa dipulihake kanthi rekombinasi. Adhedhasar premis iki, acara pambusakan genomik saka wilayah diferensial (RD) lan TbD1 (wilayah penghapusan spesifik Mtb 1) wis diusulake minangka penanda molekuler evolusi MTBC2,5,11. Genom komparatif lan urutan genom wutuh (WGS) karya ndhukung divisi anggota manungsa-dicocogake menyang sangang garis keturunan (Mycobacterium tuberculosis L1 kanggo L4, L7, lan L8; lan Mycobacterium africanum L5, L6, lan L9), garis keturunan L2 kanggo L4 nuduhake mbusak TbD1 region2,11. Kajaba iku, anggota sing diadaptasi kewan diusulake kanggo nuduhake leluhur sing padha, sing ditemtokake dening penghapusan khusus clade ing RD7, RD8, RD9 lan RD102, 5, lan 14.
Transfer gen horisontal (HGT) lan acara rekombinasi dianggep langka lan kedadeyan ing leluhur MTBC, tinimbang sejarah sing beda saka kabeh anggota MTBC15,16,17. Loro laporan awal dening Hughes lan kolaborator (2002) lan Gutacker lan kolaborator (2006) nyaranake yen acara rekombinasi bisa mbantu mbentuk polimorfisme sing menehi tandha lokus spesifik ing galur M. tuberkulosis18,19. Alasan kanggo kekurangan rekombinasi sing jelas ing MTBC yaiku: (1) proses mekanik lan mundhut kemampuan HGT; (2) langka acara HGT; (3) ora ana kemungkinan acara rekombinasi ing niche MTBC14,17. Bubar, sawetara kabèh-genome sequencing (WGS) pasinaon Applied kanggo MTBC galur 20 lan Mycobacterium bovis 21 wis kasedhiya bukti rekombinasi, pisanan nuduhake yen galur MTBC asring ngganti pecahan DNA cilik, nanging amarga variasi urutan nukleotida winates, acara iki Isih ana ora ngeweruhi.
Mycobacterium bovis minangka anggota MTBC sing paling umum ditemokake saka ternak (utamane sapi), sanajan uga bisa diisolasi saka kewan liar sing bebas lan dipager4,22,23,24. M. bovis ngalami évolusi dadi limang komplek klonal utama [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), Afrika 1 (Af1) lan Afrika 2 (Af2)], miturut profil spoligotyping, penghapusan spesifik Lan polimorfisme nukleotida tunggal (SNPs) 25, 26, 25, 25, 26 spesifik, Komplek klonal iki nuduhake struktur maneka warna populasi Mycobacterium bovis lan hubungane karo wilayah geografis. Kajaba iku, karya WGS anyar sing ditindakake dening Zimpel lan kolaborator (2020) ngrancang filogeni adhedhasar SNP saka Mycobacterium bovis, kanthi luwih saka 1,900 génom, sing nuduhake paling ora ana papat garis keturunan sing beda (jenenge Lb1 nganti Lb1 nganti Lb4), nanging ora bisa ditemtokake sacara spesifik karo kompleksitas geografis sing wis ditemtokake sadurunge. Penulis iki nindakake analisis diferensial filogeni lan kencan molekuler, nanging ora nyinaoni rekombinasi30.
Karya sadurunge nggunakake teknik molekuler sing beda, kayata spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem number repeat), lan pengetikan SNP anyar nuduhake tingkat keragaman genetik tartamtu ing antarane galur M. bovis 31,32,33, 34,35. Diferensiasi variasi genetis wis dadi alat penting ing studi epidemiologi penyakit, sing mbiyantu kanggo mangerteni sing luwih jero babagan patogenesis, virulensi lan panularan penyakit. Munculé metode WGS nyedhiyakake kamungkinan kanggo mbukak faktor nyopir evolusi sing dileksanakake dening genom Mycobacterium bovis ing proses adaptasi lan ketekunan kanggo macem-macem host lan skenario epidemiologis.
Ing karya iki, kita nggunakake analisis genomik komparatif ing macem-macem kumpulan data Mycoplasma bovis (n = 70), kalebu isolat saka kompleks klonal sing beda, kanggo ngerteni proses evolusi Mycoplasma bovis, utamane kanggo ngatasi hubungan filogenetik Lan acara rekombinasi. Minangka tambahan kanggo analisis iki, sub-data set M. bovis isolates (n = 42) sing dipikolehi saka wilayah tuberkulosis multi-host kanthi apik ing Portugal 31,36 luwih ditliti kanggo nyimpulake non-identitas. 37,38 dijupuk dening leluhur MTBC liwat HGT, lan encode 3R (repair DNA, replikasi, lan rekombinasi) komponen gen sistem 39. Pilih gen sing dipikolehi liwat HGT amarga padha bisa makili polymorphisms kuna, supaya samesthine sing padha bisa ngemot proporsi luwih saka owah-owahan sinonim. Gen sing kalebu ing sistem 3R dipilih amarga karya sadurunge ing galur M. tuberkulosis nuduhake pilihan negatif / pemurnian umum sing bisa digunakake ing gen kasebut, lan bisa uga nduweni peran penting ing evolusi 39. Tujuan liyane saka karya iki yaiku kanggo nyimpulake anane acara reorganisasi. Kanggo alasan iki, ngelingi yen dataset saka Portugal mung ngemot génom kompleks klon Eropa 2 lan galur sing durung nemtokake kompleks klon, kita mutusake kanggo nyakup data génom sing kasedhiya kanggo umum kanggo pungkasane entuk wakil saka kabeh kompleks klon, lan Ngapikake kekiatan lan jembar asil.
42 genom Mycoplasma bovis sing mentas diurutake saka adegan tuberkulosis multi-host endemik Portugis (rincian ing ngisor), sing sadurunge ditondoi saka perspektif epidemiologi36, minangka pusat karya iki. Ngelingi manawa set data saka Portugal mung duwe wakil saka kompleks lan galur klon Eropa 2 tanpa kompleks sing ditemtokake, data urutan genom sing kasedhiya kanggo umum ditambahake kanggo nggedhekake set data sing kalebu kabeh wakil saka kompleks klon M. bovis. Mulane, telung sumber data urutan genom kabeh digunakake ing karya iki: perakitan genom lengkap / rancangan, nganti 10 scaffolds disimpen ing NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 isolat); disimpen ing SRA (Illumina fastq file saka urutan maca arsip) nggantosi bhinéka Komplek M. bovis klon (n = 12 isolat)30; lan 42 génom anyar sing diurutake saka Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ora kalebu saka telusuran NCBI. M. bovis AF2122/97 biasane digunakake minangka génom referensi kanggo kalebu ing dataset. Amarga ora kasedhiya umum kabeh urutan genom sing diwakili dening kompleks kloning Afrika 1, lan jumlah genom cilik saka galur wakil Af2 lan Eu1, data urutan asli sing diwenehake dening SRA digunakake ing kasus kasebut. Karya Zimpel lan kolaboratore (2020) mbantu ngenali génom saka kompleks kloning kasebut lan mbantu milih Mycobacterium bovis kanggo dilebokake ing set data. Kanggo Eu3, mung siji jinis genom sing diterangake (Branger et al., 2020), saengga genom sing kalebu minangka wakil kapisah saka kompleks Eu3.
Sacara global, kumpulan data iki kalebu 70 sapi M. bovis sing diisolasi saka 8 spesies inang, sing disebar ing 12 negara wiwit taun 1985 nganti 2016. 36 spesies ditetepake minangka Eu2, 7 spesies yaiku Eu1, 1 spesies yaiku Eu3, 3 spesies yaiku Af1, 4 spesies yaiku Af2 lan 19 ora ana ing ngisor iki. Informasi rinci (kalebu nomer aksesi) saka Mycobacterium bovis sing digunakake ing panliten iki ditampilake ing Tabel 1 lan Tabel Tambahan 1.
42 genom Mycobacterium bovis sing mentas diurutake saka hotspot tuberkulosis kewan Portugal lan disebarake luwih saka 12 taun minangka pusat panliten iki, amarga sistem penyakit satwa-ternak potensial wis dipantau kanthi rutin 31,36 (Tambahan Gambar 1). Miturut prosedur sakteruse, galur iki diisolasi saka sapi (n = 14), kidang abang (n = 16) lan celeng (n = 12) saka 2003 nganti 2015: ngumpulake lan nangani kewan miturut pedoman protokol sing disaranake. Budaya kasebut diinkubasi ing suhu 37 ° C lan wutah dipriksa seminggu paling ora 12 minggu. Koloni disimpen langsung ing larutan gliserol kanthi suhu -80ºC. Ing medium selektif Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), conto arsip asli dilewati liwat siji in vitro wacana in vitro kanggo njupuk DNA saka program WGS. Kanggo iki, solusi stok kultur beku wis diperkaya karo 5% natrium piruvat lan 10% ADS (50 g albumin, 20 g glukosa, 8,5 g natrium klorida ing 1 L banyu) ing Middlebrook 7H9 ing 37 ° C Retrain. Sawise 4 minggu tuwuh, media kasebut dianyari maneh lan budaya dipantau kanthi rutin nganti tuwuh. Sel-sel dipanen kanthi sentrifugasi, pelet disuspensi maneh ing 500 µL phosphate buffered saline (PBS), digawe panas ing 99 °C suwene 30 menit, disentrifugasi, lan supernatan disimpen ing -20 °C nganti WGS. Kabeh prosedur ditindakake ing fasilitas biosafety level 3.
Pustaka genom pasangan WGS disiapake kanthi nggunakake indeks unik saben sampel DNA, lan nggunakake teknologi Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 conto) lan HiSeq (2 × 150 pb) (loro isolat) (Eurofins Genomics, Jerman) kanggo urutan. Miturut pandhuan pabrikan, gunakake Illumina Genome Analyzer kanthi lampiran modul kaping pindho kanggo ngurutake DNA genomik, lan nggunakake Nextera XT DNA Library Prep Kit saka Illumina kanggo mbangun perpustakaan.
Ngelingi data sing dibalekake saka SRA (n = 12), identifikasi kompleks klon bisa digunakake minangka metadata saka publikasi sing cocog 30, 41, 43. Nalika ngelingi genom lengkap, kajaba Mycobacterium bovis AF2122/97 lan Mycobacterium bovis 3601, sing dikenal minangka anggota ECO3 lan 3601, sing diakoni kanthi lengkap. 29, masing-masing, padha karo genom lengkap Mycobacterium tuberculosis H37Rv (nomer aksesi NCBI NC_000962.3). Alignment genom dileksanakake nggunakake MAFFT (multiple alignment program asam amino utawa urutan nukleotida, versi 7.458) lan parameter -addfragments48. Banjur, goleki ora ana kompleks klonal sing beda lan / utawa ana fitur SNP.
Mycobacterium bovis sing mentas diurutake (n = 42) lan wacan asli saka konsep genom sing dirakit (n = 3) nyelarasake kompleks kasebut karo genom referensi Mycobacterium tuberculosis H37Rv liwat pipa vSNP lan anané pambusakan lan / utawa fitur SNP saka klon sing beda-beda.
Nglumpukake informasi saka lack saka fitur lan / utawa ngarsane / ana SNP lan profil spoligotyping kanggo nemtokake data genomik kanggo Komplek klonal cocog. Kanggo papat rancangan majelis, profil spoligotyping ora bisa disimpulake, mula kalebu ing grup "ora kerumitan".
Alur kerja bioinformatika sing diterusake karo karya iki diwiwiti saka perakitan lan pemetaan de novo menyang strategi referensi, kanthi tujuan kanggo njelajah acara rekombinasi lan polimorfisme genom tartamtu. Gambar 1 nyedhiyakake diagram alur saka langkah-langkah sing ditindakake. Kanggo analisis rekombinasi, kabeh génom digunakake kanggo nambah kakuwatan inferensi lan indikator sing gegandhengan.
Kanggo nyuda kesalahan ing generasi urutan konsensus genom, kita entuk perakitan de novo dhisik, banjur entuk sawetara alignment inti. Pipa Unicycler saiki kasedhiya ing https://github.com/rrwick/Unicycler49 lan digunakake kanggo nindakake perakitan de novo saka 54 genom sing diurutake (42 sing anyar diurutake lan 12 file fastq sing dipulihake saka SRA). Cekakipun, sadurunge ngrakit saka ngeruk, analisis kualitas waca wis dileksanakake ing FastQC versi 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), lan Trimmomatic versi 0.36 (opsi "motong Adaptor lan urutan cahya-tartamtu liyane saka maca" lan "Cut basa saka mburi batesan 2" kualitas Applied luwih murah tinimbang 0. (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Banjur, SPAdes optimiser49 digunakake kanggo perakitan genom, lan Pilon versi 1.1851 digunakake kanggo optimasi post-assembly. A mode bridging konservatif dipilih kanggo supaya Déwan salah, lan ukuran k-mer ditelusuri lan milih antarane 20% lan 95% saka dawa diwaca. Tindakake pedoman SPAdes lan nimbang ukuran sing diwaca, mbusak contigs sing luwih cilik tinimbang 300 bp, lan nggawe potongan jangkoan ambane maca 20 saka 52. Ing strategi perakitan de novo, wilayah genomik kayata proline-glutamat (PE) lan proline-proline glutamat (PPE) paralogs ora dicopot.
Kualitas perakitan de novo ditaksir liwat pipa QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), sing nggampangake nganyari maneh contig lan genome referensi M. bovis AF2122/97 (nomer aksesi NCBI LT708304.1) pemetaan (pirsani Tabel Tambahan 1 kanggo paramèter kualitas).
Kanthi bantuan saka pipa vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), file FASTQ saka M. bovis mentas diurutake saka urutan Illumina dibandhingake karo genome referensi M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Miturut rekomendasi praktik paling apik saka Toolkit Analisis Genom (GATK) 53, 54, 55, aplikasi paramèter filter standar utawa skor massa varian kanggo kalibrasi ulang. Asil disaring nggunakake skor massa SAMtools paling 150 lan AC = 2. Uga nggunakake Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) kanggo mriksa wacan kanggo ngilangi kontaminasi. Pipa vSNP sing digunakake kanggo peta strategi urutan ing karya kita mriksa seri SNP lan target sing ditetepake, lan uga ora kalebu skenario infeksi campuran. Jangkoan genom sing diwaca luwih apik tinimbang 99% (Tabel Tambahan 1).
Kanggo ngindhari kasalahan pemetaan lan SNPs salah, Filter metu varian ing kasus ing ngisor iki: (1) didhukung dening kurang saka 20 maca, (2) ditemokaké karo frekuensi kurang saka 0,9, (3) iku ing paling siji Galur, nanging ing paling ana kesenjangan ing galur liyane. Integrated genomics viewer (IGV) versi 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 digunakake kanggo verifikasi visual SNP lan posisi kanthi masalah pemetaan utawa keselarasan. Wiwit gen proline-glutamat (PE) lan proline-proline glutamat (PPE) diduplikasi banget lan minangka bagéan saka kulawarga multi-gen, mula gampang disalahpahami dening urutan Illumina lan mismapping, mula luwih disenengi Alur kerja bioinformatika mycobacterial mbusak anggota saka kompleks tuberkulosis nalika nggunakake strategi pemetaan kanggo urutan SNP. Mulane, kita nyaring gen PE/PPE lan indel saka analisis.
Miturut Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), kabeh SNP dipérang dadi kategori fungsional. Pipa SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) digunakake kanggo nyimpulake akibat SNP (pangowahan sinonim utawa ora sinonim). Nggawe database anyar Mycobacterium bovis AF2122/97 genome (LT708304.1).
Genom inti kaping alignment iki dileksanakake nggunakake Parsnp v1.2, saiki kasedhiya ing https://github.com/marbl/parsnp57, nggunakake 69 genome lengkap / rakitan rancangan (karo pilihan -c) lan M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) digunakake minangka referensi. Sekawan alignment inti ditindakake: mung anggota kompleks kloning Eu2 (n = 37), kalebu kabeh anggota kompleks kloning Eropa (n = 44), kalebu titik persimpangan kompleks kloning Eropa lan Afrika (n = 51), lan kalebu kabeh Mycobacterium bovis ing panliten iki (n = 70).
Alignment inti sing digawe dening Parsnp digunakake kanggo nyimpulake wit filogenetik kemungkinan maksimum (ML) nggunakake CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 nggunakake RAxML, lan nindakake 1000 replikasi sing dipandu.
Telung algoritma lan alat bioinformatika sing beda digunakake kanggo mriksa anané acara rekombinasi kanthi paralel: piranti lunak SplitsTree4, Gubbins (garis keturunan ora bias liwat rekombinasi ing urutan nukleotida) pipa, lan piranti lunak RDP4 (program deteksi rekombinasi, versi beta 4.101).
Cara dekomposisi pamisah sing ditindakake ing SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 digunakake kanggo ngetung jaringan filogenetik tanpa oyot, nggunakake tes Phi kanggo verifikasi statistik, lan ambang pinunjul yaiku p = 0,05. Analisis multi-alignment inti saka Parsnp digunakake minangka input, lan dekomposisi pamisahan minangka standar jaringan diwujudake.
Pipa Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 mlaku kanthi paramèter standar minangka cara liya kanggo ngevaluasi dampak rekombinasi ing Mycobacterium bovis. LT708304.1) sing bebarengan; lan mindai posisi SNP ing saben cabang wit kanggo ndeteksi cluster SNP makili acara rekombinasi Nul saka cabang Asumsi sing ora ana acara rekombinasi, kang tegese SNPs sing dumadi ing cabang kudu disebarake merata saka sawetara file alignment saka RAML paling apik.
Pungkasan, kanggo konfirmasi acara reorganisasi sing disaranake dening saluran pipa Gubbins, enem algoritma sing diimplementasikake ing RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 lan SiScan66) ditrapake kanggo keselarasan pirang-pirang inti Parsnp ing setelan gawan. Kita nemtokake manawa paling ora telung algoritma sing ditindakake ing RDP4 kudu terus-terusan nuduhake sinyal penting kanggo verifikasi saben acara rekombinasi.
Ngelingi manawa piranti lunak Gubbins lan RDP nggoleki sinyal rekombinasi kanthi mriksa sawetara alignment inti ing jendela nganti 500 bp, lan konfirmasi manawa kalebu gen PE / PPE sajrone perakitan de novo ora bakal ngganggu sinyal rekombinasi sing ditemokake, analisis luwih lanjut ditindakake kanthi homolinearitas Priksa sacedhake gen sing ngenali gen kasebut. Peta synlinear nggunakake genom lengkap dibangun nggunakake MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) kanggo ngilangi translokasi genom lokal utawa inversi. Kajaba iku, kabeh genom digunakake kanggo nindakake analisis homolinearity ing urutan asam amino liwat server web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Analisis sing luwih jero babagan set data genom sing dipikolehi saka sistem tuberkulosis multi-host Portugis yaiku mriksa polimorfisme gen sing kasebut ing literatur. Gen iki ana 37,38 lan gen enkoding 3R sing dipikolehi dening leluhur MTBC liwat komponen sistem HGT (DNA repair, replication and recombination). (π) lan input parameter uji netral D Tajima.
Wit filogenetik kemungkinan maksimum (ML) adhedhasar 69 isolat Mycoplasma bovis lan genom referensi dipikolehi (Gambar 2A). Dibandhingake karo wit-witan adhedhasar gen tunggal utawa wit basis multi-lokus, strategi iki ngidini kanggo generasi wit-witan sing luwih kuat sing ora bisa nangkep variabilitas kabeh genom lan mulane nuduhake kemampuan sing luwih murah kanggo mbedakake antarane spesies 68,69. Struktur topologi wit ML biasane konsisten karo klasifikasi klon sing kompleks. Genom Eu2 diklompokaké ing cabang, lan génom Af1 uga diklompokaké bebarengan (Gambar 2A). Asil kasebut uga konsisten karo hubungan evolusi Mycobacterium bovis sing dikenal, yaiku, ana bedane gedhe antarane anggota Eu1 lan klompok sing dumadi saka kabeh kompleks lan génom klonal liyane, nanging kompleks klonal 30 ora ditemtokake. Inkonsistensi cilik antarane kompleks klonal lan hubungan sing diamati ing wit filogenetik bisa diterangake kanthi kasunyatan manawa kompleks klonal diterangake adhedhasar wilayah genom tartamtu, dene wit filogenetik adhedhasar pirang-pirang alignment genom inti sing makili kabeh genom.
Wit filogenetik kemungkinan maksimum (GTR) dibangun adhedhasar keselarasan genom inti saka genom Mycobacterium bovis sadurunge (A) lan sawise (B) mbusak situs rekombinasi. Werna cabang kasebut nggambarake kompleks klon Mycobacterium bovis: Eropa 1 yaiku ungu, Eropa 2 abang, Eropa 3 biru, Afrika 1 oranye, lan Afrika 2 ijo. Wit kasebut bosok lan digambar kanthi ukuran, lan dawa cabang diukur minangka panggantos kanggo saben situs.
Komplek Mycobacterium tuberculosis diterangake minangka klon berkembang, lan akeh bukti sing dikumpulake sajrone pirang-pirang taun ndhukung gagasan yen HGT lan acara rekombinasi ora bakal kedadeyan ing tingkat MTBC15,17,18 sing bisa dideteksi.
Karya sadurunge wis ditampilake sing ana uga winates rekombinasi antarane MTBC galur20,21, nalika liyane wis gagal kanggo ngenali acara rekombinasi bisa diukur70,71. Rembugan maneh masalah iki kanthi fokus ing Mycobacterium bovis, sing beda karo karya sadurunge sing mung dianggep Mycobacterium tuberculosis 70,71; utawa nimbang MTBC minangka kabèh, karo meh ora M. bovis makili 20; utawa mung nimbang pecahan sapi mbatesi. Dataset mycobacteria, ing karya iki, ana total 70 galur, sing makili kabeh kompleks klonal, digunakake kanggo layar kanggo rekombinasi. Set data skala miturut papat tingkat kumulatif: (1) anggota Eu2, (2) kabeh anggota kompleks klon Eropa (yaiku Eropa), (3) kompleks klon Eropa lan Afrika (Eu + Af) lan (4) kabeh Koleksi data (kalebu genom sing ora kalebu ing kompleks kloning sing wis diterangake).
Kanggo luwih nyinaoni hipotesis iki, jaringan pamisah-dekomposisi ditindakake kanggo netepake ora ana acara rekombinasi antarane genom, amarga cara iki bisa nggambarake hubungan leluhur antarane individu lan nampilake sinyal filogenetik sing bertentangan. Kabeh papat set data ing analisis kasebut dikonfirmasi anané puteran ing jaringan (yaiku, wilayah sing ora nggabung dadi siji wit), nanging tes Phi ora duwe dhukungan statistik (Eu2, p = 0.0956; Eropa, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; kabeh set data p = 0.2451, sing nyedhiyakake bukti orane tumrap kahanan sing ora apik), 3A-D).
Ing Eropah 2 génom (n = 37) (A), génom Eropah (n = 44) (B), génom Eropah lan Afrika (n = 51) (C) lan kabeh set data (n = 70) (D).
Sawise analisis iki, lan njupuk pengamatan siklus ing kabeh jaringan, algoritma rekonstruksi sing diimplementasikake ing pipa Gubbins ditrapake kanggo mbangun maneh garis keturunan klonal lan kanggo nambah perkiraan efek rekombinasi ing genome M. bovis. Nyimpulake jumlah kumulatif acara rekombinasi, sing paling akeh kedadeyan ing cabang terminal (yaiku, ing genom siji) (Tabel 2). Indikator kasebut nuduhake konsistensi kabeh set data lan nuduhake yen frekuensi acara rekombinasi yaiku 200 nganti 300 kaping mutasi. Sawise parameter rho / theta makili tarif relatif saka rekombinasi lan mutasi titik ing cabang katon antarane 0,0037 lan 0,0056 (Tabel 3). Bubar, karya diterbitake saka 38 M. bovis galur nduduhake nilai rho / theta sing luwih dhuwur (rho / theta = 0,1) tinimbang sing dipikolehi ing dataset iki, nanging karya Patané lan kolega digunakake perakitan basis referensi kanggo infer paramèter rekombinasi , A rinci prosedural, amarga prosedur perakitan, wis digandhengake karo turah mbrawah cabang saka acara putative.
Sabanjure, parameter r / m nggambarake rasio keragaman rekombinasi lan introduksi mutasi, lan nilai rata-rata antarane 0,025 lan 0,037, nuduhake yen dibandhingake karo mutasi, rekombinasi nduweni pengaruh sakabèhé sing luwih murah ing keragaman genetik M. bovis (Tabel 3)). Kanggo mbandhingake ekstensif, cara sing padha digunakake kanggo ngira parameter r / m kanggo dataset MTBC sing kasusun saka 23 génom, nuduhake nilai rata-rata 0,48620, nalika kanggo Patané lan kolega 38 M. bovis dataset, mbuktekaken nilai rata-rata 0,98. Ing panaliten pisanan, mung loro saka 23 génom sing kalebu ing karya M. bovis (M. bovis BCG lan galur referensi), saéngga nilai sing dipikolehi bisa bias amarga overexpression saka genome M. tuberkulosis. Ing laporan kapindho, populasi Mycobacterium bovis sing dianalisis utamane ditemokake saka Amerika Serikat lan host ternak. Ing kontras, ing set data kita, luwih akeh lokasi geografis lan spesies inang sing diwakili, lan génom sing diklompokaké dadi kompleks klonal sing beda-beda kanthi karakteristik genetik populasi sing beda uga digunakake, saéngga bisa nggayuh kawruh Populasi sing luwih jero lan luwih jembar. Bentenipun r / m Nilai rata-rata dijupuk karo set data kita konsisten karo konsep sing jurusan rekombinasi beda-beda gumantung banget antarane garis keturunan diutus kanggo spesies taksonomi padha, supaya asil iki nuduhake yen M. bovis klon Komplek bisa nuduhake beda rekombinasi Dampak uga disaranake dening Didelot & Maiden72. Nanging, kanthi signifikan ngembangaken set data iki kanthi nyakup luwih akeh genom M. bovis bakal ngidini klarifikasi luwih lengkap babagan titik iki. Paramèter r/m lan rho/theta nuduhake variasi ing antarane cabang, lan asil iki konsisten karo laporan spesies bakteri liyane72,73.
Pungkasan, kanggo ngonfirmasi acara reorganisasi sing diidentifikasi dening pipa Gubbins, enem algoritma beda digunakake ing piranti lunak RDP4 kanggo nguji multi-perbandingan inti kanthi mandiri. Sacara global, kurang saka setengah acara sing diidentifikasi dening Gubbins dikonfirmasi dening RDP4 (Tabel 4 lan 5). Ngelingi kabeh set data, telung acara rekombinasi dikonfirmasi, loro nglibatake kelenjar internal lan liyane nglibatake genom siji ing cabang terminal, sing ora bisa diwenehi komplek klonal (Tabel 4 lan 5). Identifikasi acara ing cabang terminal bisa nunjukake yen rekombinasi isih ditindakake ing galur M. bovis kontemporer utawa asile misplaced70. Ing wilayah rekombinasi hipotetis iki, kira-kira 20% saka posisi duwe nukleotida sing ora ditemtokake (N), saéngga mengaruhi sinyal rekombinasi (Gambar Tambahan 2). Kajaba iku, wilayah iki mengaruhi gen rrs, enkoding RNA ribosom 16S sing samesthine bakal banget lestari, supaya sinyal rekombinasi putative iki bisa dadi asil saka kesalahan urutan utawa misalignment. Banjur kabeh alignment genom antarane Mb0003 lan Mycobacterium bovis AF2122 / 97 ditindakake, lan anane nukleotida lan SNP sing ora ditemtokake dikonfirmasi, saéngga masalah sing bisa digandhengake karo keselarasan sing salah ora amarga informasi biologi sing ditindakake ing karya iki Muncul sawise sinau program kasebut.
Ora ana celah utawa nukleotida sing ora ditemtokake ing wilayah rekombinasi saka kelenjar internal (Gambar 4 lan 5). Babagan acara kasebut, siji mung ngemot genom Eu2 lan mengaruhi gen pks12, sing ngode sintase polyketide; dene liyane kadhaptar ing génom Eu1 lan mengaruhi gen narX sing ngode reduktase nitrat bisa (Tabel 4). Umumé, analisis rekombinasi nuduhake yen ana sawetara fragmen rekombinasi sing winates kanthi dhukungan statistik, lan indikator sing disimpulake nuduhake yen rekombinasi nduweni pengaruh sing kurang ing garis keturunan M. bovis. Sinyal rekombinasi samesthine bakal kurang, nanging penting kanggo mbedakake sinyal evolusi sing bener saka gangguan latar mburi, sing dadi tugas sing tantangan. Kanggo ngurangi sinyal gangguan sing disedhiyakake dening perakitan basis referensi lan masalah mismatch 70, 71, kabeh liyane kajaba genom lengkap dirakit saka awal, lan kualitas perakitan dicenthang lan dipastikan dening analisis pipa QUAST (Tabel Tambahan 1). Kajaba iku, seri analisis tambahan ditindakake kanggo nyedhiyakake kekuwatan lan akurasi survey sakabèhé. Mulane, kualitas urutan gen narX lan pks12 dievaluasi kanthi maca pemetaan marang Mycobacterium bovis AF2122/97. Posisi SNP sing disaranake ing wilayah rekombinasi dikonfirmasi kanthi ngetrapake kritéria sing kasebut ing bagean metode (paling ora 20 maca lan frekuensi owah-owahan 0,9). Polimorfisme gen narX wis dikonfirmasi kanthi lengkap ing rong genom kasebut (Mb1792361 lan Mb7240415; 2,3%) lan genom gen pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb17046, Mb. Nanging, kanggo génom Mb2043, enem saka wolung posisi ora ketemu kritéria ambane maca amarga SNP didhukung dening maksimum 17 maca, kang ngisor nilai cutoff ditetepake 20. Mulane, rekombinasi enem génom (8.6%) ing situs genom iki bisa dikonfirmasi (Gambar 4 lan 5).
Visualisasi rinci babagan keselarasan wilayah rekombinasi saka dataset Mycobacterium bovis mengaruhi gen narX sing ngode reduktase nitrat sing mungkin. Ora ana celah utawa nukleotida sing ora ditemtokake ing wilayah rekombinasi kelenjar internal. Acara tartamtu iki kadhaptar ing génom Eu1. Kualitas urutan gen narX dievaluasi kanthi ngrancang maca Mycobacterium bovis AF2122/97. Konfirmasi lokasi SNP sing disaranake ing area rekombinasi kanthi ngetrapake kritéria kasebut ing bagean metode (paling ora 20 maca lan 0,9 frekuensi owah-owahan). Polimorfisme gen narX wis dikonfirmasi kanthi lengkap ing genom Mb1792361 lan Mb7240415 (2,3%).
Visualisasi rinci babagan keselarasan wilayah rekombinasi saka dataset Mycoplasma bovis sing mengaruhi gen pks12. Ora ana celah utawa nukleotida sing ora ditemtokake ing wilayah rekombinasi kelenjar internal. Babagan acara sing mengaruhi gen pks12 sing bisa enkoding polyketide synthase, mung ngemot genom Eu2. Kualitas urutan pks12 dievaluasi kanthi maca pemetaan Mycobacterium bovis AF2122/97. Konfirmasi lokasi SNP sing disaranake ing area rekombinasi kanthi ngetrapake kritéria kasebut ing bagean metode (paling ora 20 maca lan 0,9 frekuensi owah-owahan). Polimorfisme genom Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, lan Mb1960 wis dikonfirmasi kanthi lengkap.
gen PE lan PPE duwe wilayah bola-bali sing gampang misread dening Illumina sequencing lan mismapping, supaya padha biasane dibusak saka bioinformatics workflow anggota M. tuberkulosis mung nalika nggunakake strategi pemetaan-kanggo-urutan. Inferensi acara rekombinasi sing ditrapake ing karya iki adhedhasar perakitan de novo tanpa nyaring PE/PPE. Kita pitados bilih kanthi ngleksanakake telung cara pelengkap lan algoritma liwat SplitsTree, Pipa Gubbins lan piranti lunak RDP4, Sastranegara Applied kuwat kanggo Processing lan nyaring wilayah reorganized disebabake kesalahan sinyal. Nanging, kanggo ngilangi gangguan gen PE / PPE ing piranti lunak Gubbins lan RDP4 kanggo ngenali klompok SNP, lan mulane identifikasi wilayah rekombinasi sing diusulake kanggo mengaruhi gen narX lan pks12, lingkungan gen kasebut ditliti (Tambahan Gambar 3-5). Ing M. bovis AF2122/97, gen narX dipisahake dening narK2 lan Mb1764c, nalika pks12 diubengi dening Mb2075c e Mb2073c (Tambahan Gambar 3-5). Peta sing digawe nggunakake peta synline MAUVE saka genom lengkap menehi informasi babagan konservasi lan rearrangement urutan gen, nuduhake papat pamblokiran collinear, lan ora ana pratandha saka translokasi genom utawa inversi. Kajaba iku, analisis komplementasi kanthi urutan asam amino mbuktekake homologi ing kabeh genom lengkap, lan ora ana PE / PPE sing ditemokake ing wilayah jejer narX utawa pks12. Kanggo narX, siji génom (Mb0030) nduweni skor sinonim sing luwih murah amarga gen narX diidentifikasi minangka rong fragmen (fragmen 1891 lan 1890). Kanggo pks12, amarga padha, Mb0030 lan Mb003 nampilake skor synlinearity sing luwih murah, dene pks12 diidentifikasi ing rong lan telung fragmen, masing-masing, sing makili domain protein sing beda (Tambahan Gambar 3-5). Njupuk menyang akun informasi iki, lan software Gubbins lan RDP4 loro nindakake analisis, mriksa inti kaping alignment maksimum 500 bp ing jendhela, kita dikonfirmasi sing PE / gene PPE ora bakal ngganggu sinyal rekombinasi sing mengaruhi narX lan pks12.
Senadyan sinyal rekombinasi sing dideteksi ing set data iki bisa uga dianggep residual, bener yen rekombinasi ing M. bovis ora bisa diilangi, mula kudu terus dadi subyek analisis luwih lanjut, ing ngendi kabeh genom saka skenario epidemiologis sing beda-beda diurutake menyang Penting.
Mbandhingake wit filogenetik ML sing dipikolehi sadurunge lan sawise koreksi rekombinasi (Gambar 2A, B) ora nyebabake owah-owahan sing signifikan ing hubungan filogenetik sing disimpulake, lan galur M. bovis diklompokake ing klompok sing padha.
Sawise pemetaan 42 M. bovis anyar urutan maca karo génom referensi M. bovis AF2122/97, alignment SNP ngemot 1816 posisi polymorphic dijupuk. Paling SNPs (87,1%) dumunung ing wilayah coding, lan gen sing kena pengaruh ditondoi miturut kategori fungsional sing ditampilake ing Bovilist (Gambar 6A, B). Nganggep jumlah total gen ing saben kategori fungsional, gen ing kategori "metabolisme lipid" nuduhake luwih akeh SNPs, ngiring dening "tembok sel lan pangolahan sel" lan "metabolisme lan respirasi penengah", ngungkapake yen ana ing evolusi M. bovis.
Analisis hirarki saka dataset M. bovis saka Portugal (n = 42). Jumlah total SNP sing kadhaptar lan gen sing kena pengaruh kanggo saben kategori fungsional (A). Jumlah total owah-owahan sinonim lan non-sinonim sing didaftar miturut kategori fungsi (B).
Ing skala global, rasio dN / dS rata-rata luwih apik tinimbang 1,5, sing nuduhake yen tekanan evolusi global kanggo nyingkirake negara leluhur lan nggambarake skenario pilihan pemurnian sing positif (diversifikasi utawa diarahake) lan / utawa santai. Ing kategori "virulensi, detoksifikasi, adaptasi", "urutan penyisipan lan fag", lan "protein pangaturan", luwih saka rong pertiga saka SNP ora sinonim (Gambar 6B).
Ing kabeh kategori, ana gen kanthi pirang-pirang SNP, sing nyebabake tingkat mutasi rata-rata (yaiku rata-rata SNP saben gen) luwih saka 1 (Gambar 6A). Pks12 (Mb2074c) kanthi 15 SNP lan fas (Mb2553c) kanthi 8 SNP nduweni nilai mutasi sing luwih dhuwur. Kaloro gen kasebut melu metabolisme asam lemak. Gen pks ngode polyketide synthase (PKS), yaiku enzim multifungsi sing melu biosintesis lipid dinding sel mikobakteri74,75. Gen iki nyandi polipeptida multifungsi sing melu sintesis mycoketide74,76. Gen fas melu sintesis asam mikolat. Kaloro gen kasebut nduweni peran penting ing biosintesis tembok sel sing kontak karo inang.
Kanggo luwih nyinaoni evolusi Mycobacterium bovis, rong set gen spesifik dianalisis. Karya sing diterbitake sadurunge nggunakake komposisi urutan lan metode filogenetik sing diidentifikasi gen sing dipikolehi dening leluhur MTBC liwat HGT sadurunge diversifikasi37,38. Gen kasebut kadhaptar ing Tabel Tambahan 2. Distribusi SNP saka total 77 gen sing bisa uga ana hubungane karo HGT dianalisis, lan situs polimorfik 26 diidentifikasi, sing paling akeh (78%) nyebabake owah-owahan non-sinonim (NS) (Tabel Tambahan 2). Karya sadurunge ing genom MTBC nuduhake yen wilayah HGT putative nuduhake rasio NS SNP sing luwih dhuwur dibandhingake karo genom liyane. Yen ana sing ngira yen wilayah rekombinasi kasebut dipikolehi dening leluhur MTBC, lan mulane, dheweke nggambarake polimorfisme kuno, mula proporsi owah-owahan sinonim bakal luwih dhuwur, amarga substitusi NS samesthine bakal diilangi kanthi pilihan negatif amarga owah-owahan asam amino Bisa ngganti fungsi protein. Mulane, asil kita nuduhake yen konsekuensi fungsional bisa uga asale saka panggantos gen kaya HGT, sing nuduhake pentinge kanggo keragaman genetik adaptif sing terkenal.
Sejajar karo analisis iki, gen sing ngode komponen sistem 3R (DNA repair, replication, and recombination) ditliti kanthi tliti miturut dhaptar sing sadurunge diterbitake dening dos Vultos and collaborators (2008)39. Ijol-ijolan fragmen DNA sing identik ora bisa langsung diamati, sanajan bisa dadi proses sing kerep nalika ana bakteri sing ana hubungane, kayata ing set data iki; Kajaba iku, proses iki bisa dadi kunci kanggo metode repair DNA72, supaya muter peran ing rekombinasi homolog. Gunggunge 26 posisi polimorfik sing disebarake dening 54 gen diidentifikasi (Tabel Tambahan 3). Ing set gen iki, owah-owahan NS kira-kira 65% saka akibat, sing konsisten karo laporan sadurunge babagan galur Mycobacterium tuberculosis.
Wektu kirim: Oct-21-2021