Дякуємо за відвідування Nature. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати новішу версію браузера (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Водночас, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайти без стилів та JavaScript.
Секвенування геному відродило галузь досліджень інфекційних захворювань, розкриваючи епідеміологію захворювань, патогенез, взаємодію між господарем і патогеном, а також еволюційний процес, нав'язаний патогенам. Комплекс Mycobacterium tuberculosis (MTBC) розглядає Mycobacterium bovis як одного зі своїх адаптивних членів, що викликають туберкульоз (ТБ) у наземних ссавців, і є типовою моделлю бактеріальної еволюції. Як і інші члени MTBC, Mycobacterium bovis вважається суворо клонованим, повільно еволюціонуючим патогеном, і очевидно, що немає жодних ознак рекомбінації або горизонтального переносу генів. У цій роботі ми застосовуємо порівняльну геноміку до набору даних послідовності цілого геному (WGS), що складається з 70 голів великої рогатої худоби M. з різних родоводів (Європа та Африка), щоб отримати уявлення про генетичне різноманіття голої рогатої худоби M. Еволюційна сила. Для оцінки ознак реорганізації використовуються три різні методи. У світовому масштабі невелика кількість подій рекомбінації була ідентифікована та підтверджена двома незалежними методами з вагомими доказами. Тим не менш, порівняно з мутаціями, рекомбінація має слабший вплив на різноманітність M. bovis (загальне r/m = 0,037). Різниця середніх значень r/m, отримана в клональному комплексі Mycobacterium bovis у нашому наборі даних, узгоджується із загальною концепцією, що ступінь рекомбінації може значно відрізнятися між лініями, віднесеними до одного таксономічного виду. Виходячи з цієї роботи, рекомбінацію в Mycobacterium bovis не можна виключати, тому вона має бути предметом подальших зусиль у майбутніх дослідженнях порівняльної геноміки, в яких вирішальне значення має WGS великих наборів даних з різних епідеміологічних сценаріїв по всьому світу. Потім було проведено додатковий аналіз меншого набору даних Mycobacterium bovis (n = 42) за поширеністю туберкульозу серед багатьох господарів, і було виявлено понад 1800 локусів, з яких принаймні один штам показав однонуклеотидний поліморфізм (SNP). Більшість (87,1%) розташовані в кодуючій області, а глобальне співвідношення несинонімічних змін (dN/dS) синонімічних змін перевищує 1,5, що вказує на те, що позитивний відбір є важливою еволюційною силою, що діє на M. bovis. Більша частка SNP була виявлена в генах, багатих на функціональні категорії "ліпідний метаболізм", "клітинна стінка та клітинні процеси" та "проміжний метаболізм та дихання", що свідчить про їхній потенціал у біології та еволюції Mycobacterium bovis. Більш детальний розгляд генів у предків MTBC, схильних до горизонтального переносу генів та включених до системи 3R (репарація, реплікація та рекомбінація ДНК), показує середнє глобальне негативне значення D-нейтрального тесту Тайдзіми, що вказує на минуле селективне сканування. Нещодавнє вузьке місце після розширення популяції все ще є основним еволюційним рушійним фактором для обов'язкового патогену Mycobacterium bovis у боротьбі з хазяїном.
Комплекс Mycobacterium tuberculosis (MTBC) є одним з найуспішніших таксонів бактеріальних патогенів та типовим випадком бактеріальної еволюції. Його члени демонструють напрочуд високу нуклеотидну ідентичність на геномному рівні (> 99%)1,2. Різні екотипи MTBC можуть спричиняти туберкульоз (ТБ), який є інфекційним гранулематозним захворюванням, у широкого кола видів господарів, від мікроссавців до людини3,4,5. Наразі комплекс включає людей [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] та адаптовані до тварин патогени (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" та "dassie")5,6. M. canettii (також відомий як «Nodobacter glabrata»). Середня ідентичність нуклеотидів із вищезгаданими мікобактеріями становить 98%, а порівняльні геномні дослідження показали, що M. canettii та решта MTBC нещодавно відійшли від спільного предка.7 Враховуючи цю концепцію, деякі автори називають M. canettii членом MTBC 8.
МТБК систематично описується як суворий клональний комплекс, а його популяційна структура чітко регулюється зниженою різноманітністю, вузькими місцями, селективним скануванням та генетичним дрейфом9,10. Припускаючи, що складна сувора клональна еволюція, така як відсутні поліморфізми, не може бути відновлена шляхом рекомбінації. Виходячи з цієї передумови, послідовні події геномної делеції диференціальної області (RD) та TbD1 (регіон Mtb-специфічної делеції 1) були запропоновані як молекулярні маркери еволюції МТБК2,5,11. Роботи з порівняльної геноміки та секвенування всього геному (WGS) підтверджують поділ адаптованих до людини членів на дев'ять ліній (Mycobacterium tuberculosis L1-L4, L7 та L8; та Mycobacterium africanum L5, L6 та L9), лінії L2-L4 мають спільну делецію області TbD12,11,12,13. Крім того, передбачається, що адаптовані до тварин представники мають спільного предка, що визначається специфічними для клад делеціями в RD7, RD8, RD9 та RD102, 5 та 14.
Горизонтальний перенос генів (ГПГ) та події рекомбінації вважаються рідкісними та трапляються у предків МТБК, а не у всій ніші МТБК15,16,17. Дві ранні публікації Хьюза та його колег (2002) і Гутакера та його колег (2006) показали, що події рекомбінації можуть допомогти сформувати поліморфізми, які позначають специфічні локуси у штамах M. tuberculosis18,19. Причини очевидної відсутності рекомбінації в МТБК такі: (1) механічний процес та втрата здатності до ГПГ; (2) рідкість подій ГПГ; (3) відсутність ймовірності подій рекомбінації в ніші МТБК14,17. Нещодавно деякі дослідження секвенування всього геному (ПГГ), застосовані до штаму МТБК 20 та Mycobacterium bovis 21, надали докази рекомбінації, вперше показавши, що штами МТБК часто обмінюються невеликими фрагментами ДНК, але через обмежену варіацію нуклеотидної послідовності ці події досі не помічені.
Mycobacterium bovis є найчастіше виявленим членом MTBC у худоби (головним чином великої рогатої худоби), хоча його також можна виділити у диких тварин вільного вигулу та огороджених диких тварин4,22,23,24. M. bovis еволюціонував у п'ять основних клональних комплексів [європейський 1 (Eu1), європейський 2 (Eu2), європейський 3 (Eu3), африканський 1 (Af1) та африканський 2 (Af2)], згідно з профілем споліготипування, специфічними делеціями та однонуклеотидними поліморфізмами (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 у певних генах. Ці клональні комплекси демонструють різноманітну структуру популяції Mycobacterium bovis та її зв'язок з географічними регіонами. Крім того, нещодавня робота WGS, проведена Цімпелем та його колегами (2020), розробила філогенію на основі SNP Mycobacterium bovis з більш ніж 1900 геномами, що вказує на існування щонайменше чотирьох різних ліній (названих від Lb1 до Lb1 до Lb4), вони не повністю узгоджуються з раніше визначеним клональним комплексом, хоча географічну специфічність також можна підтвердити30. Ці автори провели диференціальний аналіз філогенії та молекулярне датування, але не вивчали рекомбінацію30.
Попередні дослідження з використанням різних молекулярних методів, таких як споліготипування, MIRU-VNTR (мікобактеріальне вставне повторення одиниць - змінна тандемна кількість повторів) та нещодавнє SNP-типування виявили певний рівень генетичної різноманітності серед штамів M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Диференціація генетичної варіації стала важливим інструментом у вивченні епідеміології захворювань, що допомагає для поглибленого розуміння патогенезу, вірулентності та передачі захворювань. Поява методу WGS надає можливість виявити еволюційні рушійні фактори, що накладаються геномом Mycobacterium bovis у процесі адаптації та персистенції до різних господарів та епідеміологічних сценаріїв.
У цій роботі ми використовуємо порівняльний геномний аналіз різних наборів даних Mycoplasma bovis (n=70), включаючи ізоляти з різних клональних комплексів, щоб отримати уявлення про еволюційний процес Mycoplasma bovis, особливо для визначення філогенетичних зв'язків та подій рекомбінації. Як доповнення до цього аналізу, було додатково досліджено піднабір ізолятів M. bovis (n = 42), отриманих з добре охарактеризованого району туберкульозу з кількома господарями в Португалії31,36, щоб зробити висновок про неідентичність. Баланс між відносним співвідношенням сенсових (dN) та синонімічних (dS) нуклеотидних замін, а також еволюційний внесок конкретних геномів, згаданих у літературі,37,38 отримані предками MTBC через HGT та кодують компоненти генів системи 3R (репарація, реплікація та рекомбінація ДНК)39. Вибираємо гени, отримані через HGT, оскільки вони можуть представляти давні поліморфізми, тому очікується, що вони можуть містити вищу частку синонімічних змін. Гени, включені до системи 3R, були обрані, оскільки попередні дослідження штамів M. tuberculosis вказували на загальні негативні/очисні відбори, які працюють на ці гени, і вони можуть відігравати важливу роль в еволюції 39. Ще однією метою цієї роботи є висновок про існування подій реорганізації. З цієї причини, враховуючи, що наш набір даних з Португалії містить лише геноми європейського клонового комплексу 2 та штамів, яким не призначено клоновий комплекс, ми вирішили включити загальнодоступні дані геному, щоб нарешті отримати репрезентативну інформацію про всі клонові комплекси та покращити надійність та широту результатів.
42 нещодавно секвеновані геноми Mycoplasma bovis з португальської ендемічної багатогосподарської туберкульозної сцени (деталі нижче), раніше охарактеризовані з епідеміологічної точки зору36, є центром цієї роботи. Враховуючи, що набір даних з Португалії містить лише представників європейських клонових комплексів 2 та штамів без позначених комплексів, було додано загальнодоступні дані секвенування всього геному для розширення набору даних, який включає всіх представників клонових комплексів M. bovis. Тому в цій роботі було використано три джерела даних секвенування всього геному: повна/чернетка збірки геному, до 10 скаффолдів, що зберігаються в NCBI (Національний центр біотехнологічної інформації) (n = 15 ізолятів); що зберігаються в SRA (файл Illumina fastq архіву зчитування послідовностей), що представляє комплексне різноманіття клонів M. bovis (n = 12 ізолятів)30; та 42 нещодавно секвеновані геноми з Португалії. Mycobacterium bovis BCG (бацила Кальметта-Герена) було виключено з пошуку NCBI. M. bovis AF2122/97 зазвичай використовується як референсний геном для включення до набору даних. Через публічну недоступність усієї послідовності геному, представленої клонуючим комплексом African 1, та невелику кількість геномів від репрезентативних штамів Af2 та Eu1, у цих випадках використовувалися оригінальні дані секвенування, надані SRA. Робота Цімпеля та його колег (2020) допомогла ідентифікувати геном із вищезгаданого клонуючого комплексу та допомогла вибрати Mycobacterium bovis для включення до набору даних. Для Eu3 описано лише один тип геному (Branger et al., 2020), тому геном, який ми включаємо, є окремим представником комплексу Eu3.
У світовому масштабі цей набір даних включає 70 видів великої рогатої худоби M. bovis, виділених з 8 видів господарів, поширених у 12 країнах з 1985 по 2016 рік. 36 видів позначені як Eu2, 7 видів - Eu1, 1 вид - Eu3, 3 види - Af1, 4 види - Af2, а 19 не належать до жодного клонального комплексу (деталі нижче). Детальна інформація (включаючи номер доступу) про Mycobacterium bovis, використана в цьому дослідженні, наведена в таблиці 1 та додатковій таблиці 1.
42 нещодавно секвеновані цілі геноми Mycobacterium bovis з гарячих точок туберкульозу тварин у Португалії, поширені протягом понад 12 років, є центром цього дослідження, оскільки потенційні системи захворювань диких тварин та худоби регулярно контролювалися 31,36 (Додатковий рис. 1). Згідно з наступними процедурами, ці штами були виділені від великої рогатої худоби (n = 14), благородного оленя (n = 16) та дикого кабана (n = 12) з 2003 по 2015 рік: збирати та обробляти тварин відповідно до рекомендованих протоколів. Зразки тканин містяться в Довіднику з наземних тварин МЕБ та інокулюються на тверде та рідке середовище з піруватом Стоунбрінка та Левенштейна-Йенсена. Культури інкубують при 37 °C, а ріст перевіряють раз на тиждень протягом щонайменше 12 тижнів. Колонії зберігають безпосередньо в розчині гліцерину при -80 °C. У селективному середовищі Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) оригінальні архівні зразки пропускали через один пасаж in vitro для отримання ДНК програми WGS. Для цього заморожений розчин культури збагачували 5% піруватом натрію та 10% ADS (50 г альбуміну, 20 г глюкози, 8,5 г хлориду натрію в 1 л води) на середовищі Middlebrook 7H9 при температурі 37°C Retrain. Після 4 тижнів вирощування середовище оновлювали, і культуру регулярно контролювали, доки не спостерігали ріст. Клітини збирали центрифугуванням, осад ресуспендували у 500 мкл фосфатно-сольового буферного розчину (PBS), нагрівали при 99°C протягом 30 хвилин, центрифугували, а супернатант зберігали при температурі -20°C до WGS. Всі процедури проводилися в приміщеннях біобезпеки 3 рівня.
Бібліотека геному WGS з парними кінцями готується з використанням унікального індексу кожного зразка ДНК та використовує технології Illumina MiSeq (2 × 250 п.н.) (40 зразків) та HiSeq (2 × 150 п.н.) (два ізоляти) (Eurofins Genomics, Німеччина) для секвенування. Відповідно до інструкцій виробника, використовуйте аналізатор геному Illumina з двостороннім модулем для секвенування геномної ДНК та набір Nextera XT DNA Library Prep Kit від Illumina для створення бібліотеки.
Беручи до уваги дані, отримані з SRA (n = 12), ідентифікацію клонового комплексу можна використовувати як метадані відповідної публікації 30, 41, 43. Якщо розглядати повний геном, за винятком Mycobacterium bovis AF2122/97 та Mycobacterium bovis 3601, які є визнаними членами клонального комплексу Eu1 та Eu3 25, 29 відповідно, це те саме, що й повний геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv (номер доступу NCBI NC_000962.3). Вирівнювання геному виконується за допомогою MAFFT (програма множинного вирівнювання амінокислотної або нуклеотидної послідовності, версія 7.458) та параметра -addfragments48. Потім виконується пошук відсутності різних клональних комплексів та/або наявності SNP-ознак.
Нещодавно секвеновані Mycobacterium bovis (n = 42) та оригінальні зчитування зібраного чернетки геному (n = 3) узгоджують комплекс з референтним геномом Mycobacterium tuberculosis H37Rv через конвеєр vSNP та наявність делеційних та/або SNP-ознак різних клонів. Було проведено пошук.
Зібрати інформацію про відсутність ознак та/або наявність/відсутність SNP та профілів споліготипування, щоб призначити геномні дані відповідному клональному комплексу. Для чотирьох чернеток збірок профіль споліготипування неможливо визначити, тому вони включені до групи «без складності».
Біоінформатичний робочий процес, який застосовується в цій роботі, починається зі складання de novo та зіставлення з еталонною стратегією з метою дослідження подій рекомбінації та специфічних поліморфізмів геному. На рисунку 1 наведено блок-схему наступних кроків. Для рекомбінаційного аналізу використовуються всі геноми для підвищення надійності висновків та пов'язаних з ними показників.
Щоб зменшити кількість помилок у генерації консенсусних послідовностей геному, ми спочатку отримали de novo збірку, а потім отримали множинні вирівнювання ядра. Конвеєр Unicycler наразі доступний за адресою https://github.com/rrwick/Unicycler49 і використовується для виконання de novo збірки 54 секвенованих геномів (42 щойно секвенованих та 12 файлів fastq, відновлених з SRA). Коротше кажучи, перед складанням з нуля, аналіз якості зчитування було виконано у FastQC версії 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) та Trimmomatic версії 0.36 (застосовуються опції "вирізати адаптери та інші специфічні для освітлення послідовності з зчитувань" та "Вирізати бази з кінця зчитування, якщо нижче порогової якості 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic)50. Потім для збірки геному було використано SPAdes optimiser49, а для оптимізації після збірки - Pilon версії 1.1851. Було обрано консервативний режим мостового збірки, щоб уникнути неправильного складання, а розмір k-меру було пошукано та обрано між 20% та 95% довжини зчитування. Дотримуйтесь рекомендацій SPAdes та враховуйте розмір зчитування, видаляйте контиги менші за 300 пар основ та встановлюйте граничне значення глибини покриття 20 зчитувань, рівне 52. У стратегії складання de novo геномні області, такі як високоповторні паралоги пролін-глутамату (PE) та пролін-пролінглутамату (PPE), не видалялися.
Якість de novo збірки оцінюється за допомогою конвеєра QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), який сприяє оновленню контигу та картування референсного геному M. bovis AF2122/97 (номер доступу NCBI LT708304.1) (див. параметри якості в Додатковій таблиці 1).
За допомогою конвеєра vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP) файл FASTQ щойно секвенованого M. bovis, отриманого за допомогою секвенування Illumina, порівнюється з референсним геномом M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Відповідно до рекомендацій щодо найкращої практики Інструментарію аналізу геному (GATK) 53, 54, 55, застосовуються стандартні параметри фільтрації або варіантні масові оцінки для повторного калібрування. Результати фільтруються з використанням найнижчої масової оцінки SAMtools, що становить 150, та AC = 2. Також використовується Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) для перевірки показань, щоб виключити забруднення. Конвеєр vSNP, який використовується для зіставлення зі стратегіями секвенування в нашій роботі, досліджує серію визначених SNP та мішеней, а також виключає сценарії змішаного зараження. Покриття геному зчитуванням краще за 99% (Додаткова таблиця 1).
Щоб уникнути помилок зіставлення та неправильних SNP, відфільтруйте варіант у таких випадках: (1) він підтримується менш ніж 20 показниками, (2) він зустрічається з частотою менше 0,9, (3) він є принаймні в одному штамі, але принаймні є прогалини в іншому штамі. Для візуальної перевірки SNP та позицій з проблемами зіставлення або вирівнювання використовувався інтегрований переглядач геноміки (IGV) версії 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56. Оскільки гени пролін-глутамату (PE) та пролін-пролінглутамату (PPE) сильно дублюються та є частиною багатогенної родини, їх легко неправильно зрозуміти при секвенуванні та неправильному зіставленні Illumina, тому їм надається перевага. Робочий процес мікобактеріальної біоінформатики видалив члени туберкульозного комплексу під час використання стратегії зіставлення з послідовністю для підтвердження SNP. Тому ми відфільтрували гени PE/PPE та інделі з аналізу.
Згідно з Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), усі SNP поділяються на функціональні категорії. Конвеєр SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) використовується для визначення наслідків SNP (синонімічні або несинонімічні зміни). Створено нову базу даних геному Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Множинне вирівнювання основного геному було виконано за допомогою Parsnp версії 1.2, який зараз доступний за адресою https://github.com/marbl/parsnp57, з використанням 69 повних збірок геномів/чернеток (з опцією -c), а M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) використовується як еталон. Було виконано чотири множинні вирівнювання основного геному: лише члени клонуючого комплексу Eu2 (n = 37), включаючи всіх членів європейського клонуючого комплексу (n = 44), включаючи точку стику європейського та африканського клонуючих комплексів (n = 51), та включаючи всі Mycobacterium bovis у цьому дослідженні (n = 70).
Основне вирівнювання, згенероване Parsnp, використовується для виведення філогенетичного дерева максимальної правдоподібності (ML) за допомогою CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 з використанням RAxML та виконання 1000 керованих реплікацій.
Для паралельної перевірки наявності подій рекомбінації використовуються три різні алгоритми та біоінформатичні інструменти: програмне забезпечення SplitsTree4, конвеєр Gubbins (неупереджене визначення походження через рекомбінацію в нуклеотидних послідовностях) та програмне забезпечення RDP4 (програма виявлення рекомбінації, версія бета 4.101).
Метод розщеплення та декомпозиції, реалізований у SplitsTree4 версії 4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59, використовується для розрахунку безкореневої філогенетичної мережі з використанням тесту Phi для статистичної перевірки, а поріг значущості становить p = 0,05. Як вхідні дані використовується аналіз багаторівневого вирівнювання основного гена Parsnp, і розщеплення та декомпозиція реалізуються як стандарт мережі.
Конвеєр Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) працює з параметрами за замовчуванням як ще один спосіб оцінки впливу рекомбінації на Mycobacterium bovis. Алгоритм, реалізований у конвеєрі, реконструює відповідну лінію клонів. Повна збірка геному/чернетки нашого набору даних та референсний геном (велика рогата худоба AF2122/97, LT708304.1) взаємно узгоджені; та сканують положення SNP на кожній гілці дерева, щоб виявити кластер SNP, що представляє подію рекомбінації. Нуль гілки. Припустимо, що події рекомбінації немає, що означає, що SNP, які зустрічаються на гілці, повинні бути рівномірно розподілені. Як вхідні файли використовуються основне множинне вирівнювання з Parsnp та найкраще оцінене дерево ML з RAxML.
Зрештою, для підтвердження події реорганізації, запропонованої конвеєром Gubbins, шість алгоритмів, реалізованих у RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 та SiScan66), застосовуються до основного множинного вирівнювання Parsnp за налаштуваннями за замовчуванням. Ми визначили, що принаймні три алгоритми, реалізовані в RDP4, повинні послідовно демонструвати важливий сигнал для перевірки кожної події рекомбінації.
Враховуючи, що як програмне забезпечення Gubbins, так і RDP шукають сигнали рекомбінації, перевіряючи основні множинні вирівнювання у вікні до 500 пар основ та підтверджуючи, що включення генів PE/PPE під час de novo складання не заважатиме знайденим сигналам рекомбінації, подальший аналіз проводиться шляхом перевірки гомолінеарності поблизу гена, що ідентифікує подію рекомбінації. Синлінійна карта з використанням повного геному була побудована за допомогою вирівнювання MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) для виключення локальних транслокацій або інверсій геному. Крім того, весь геном був використаний для проведення аналізу гомолінеарності амінокислотної послідовності через веб-сервер SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Більш глибокий аналіз набору даних геному, отриманих з португальської системи багатохозного туберкульозу, полягає в перевірці поліморфізму генів, згаданих у літературі. Це гени 37, 38 та ген, що кодує 3R, отримані предками MTBC через компоненти системи HGT (репарація, реплікація та рекомбінація ДНК) 39. Використовуйте ClustalX версії 2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) та DnaSP версії 6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) для розрахунку різноманітності генів та нуклеотидної різноманітності (π) та вхідного параметра D-нейтрального тесту Тадзіми.
Було отримано філогенетичне дерево максимальної правдоподібності (ML) на основі 69 ізолятів Mycoplasma bovis та референсних геномів (Рисунок 2A). Порівняно з деревами на основі одного гена або деревами на основі кількох локусів, ця стратегія дозволяє генерувати потужніші дерева, які не охоплюють мінливість усього геному і тому демонструють нижчу здатність розрізняти види 68,69. Топологічна структура дерева ML зазвичай узгоджується зі складною класифікацією клонів. Геном Eu2 кластеризований у гілці, а геном Af1 також кластеризований разом (Рисунок 2A). Результат також узгоджується з відомим еволюційним зв'язком Mycobacterium bovis, тобто існує велика різниця між членом Eu1 та групою, що складається з усіх інших клональних комплексів та геномів, але клональний комплекс 30 не уточнюється. Невелику невідповідність між клональним комплексом та взаємозв'язком, що спостерігається на філогенетичному дереві, можна пояснити тим, що клональний комплекс описується на основі певних геномних областей, тоді як філогенетичне дерево базується на множинних вирівнюваннях основних геномів, що представляють весь геном.
Філогенетичне дерево максимальної правдоподібності (ФДМП) побудовано на основі вирівнювання ядра геному Mycobacterium bovis до (A) та після (B) видалення сайту рекомбінації. Кольори гілок представляють комплекс клонів Mycobacterium bovis: Європа 1 – фіолетова, Європа 2 – червона, Європа 3 – синя, Африка 1 – помаранчева, а Африка 2 – зелена. Дерево має кореневі корені та намальовано в масштабі, а довжина гілки вимірюється як заміна для кожного сайту.
Комплекс Mycobacterium tuberculosis описується як клонально еволюціонований, і більшість накопичених протягом багатьох років доказів підтверджують ідею про те, що поточні події HGT та рекомбінації не відбуватимуться на рівні виявлення MTBC15,17,18.
Попередні роботи показали, що між штамами MTBC може бути обмежена рекомбінація20,21, тоді як інші не змогли виявити вимірювані події рекомбінації70,71. Повторно обговоріть це питання з акцентом на Mycobacterium bovis, що відрізняється від попередньої роботи, яка розглядала лише Mycobacterium tuberculosis70,71; або розглядайте MTBC в цілому, майже без M. bovis, що представляє 20; або розглядайте лише обмежувальні фракції великої рогатої худоби. Набір даних мікобактерій у цій роботі містить загалом 70 штамів, що представляють усі клональні комплекси, що використовуються для скринінгу рекомбінації. Набір даних масштабовано відповідно до чотирьох кумулятивних рівнів: (1) члени Eu2, (2) усі члени європейського клонового комплексу (тобто Європа), (3) європейський та африканський клоновий комплекс (Eu + Af) та (4) усі колекції даних (включаючи геноми, які не включені до жодних вже описаних клонуючих комплексів).
Для подальшого вивчення цієї гіпотези було проведено мережу з розщепленням та декомпозицією, щоб оцінити відсутність подій рекомбінації між геномами, оскільки цей метод може візуалізувати предкові зв'язки між особинами та відображати суперечливі філогенетичні сигнали. Усі чотири набори даних в аналізі підтвердили існування петель у мережі (тобто областей, які не сходяться в одне дерево), але тест Phi не має статистичного підтвердження (Eu2, p = 0,0956; Європа, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; весь набір даних p = 0,2451), що надає слабкі докази існування подій реорганізації (Рисунок 3A-D).
У Європі 2 геноми (n = 37) (A), європейські геноми (n = 44) (B), європейські та африканські геноми (n = 51) (C) та весь набір даних (n = 70) (D).
Після цього аналізу та з урахуванням циклічних спостережень у всіх мережах, алгоритм реконструкції, реалізований у конвеєрі Губбінса, був застосований для реконструкції клональної лінії та доповнення оцінки впливу рекомбінації на геном M. bovis. Визначте кумулятивну кількість подій рекомбінації, більшість з яких відбулися в термінальних гілках (тобто в одному геномі) (Таблиця 2). Ці показники демонструють узгодженість усього набору даних і вказують на те, що частота подій рекомбінації в 200-300 разів перевищує частоту мутацій. Як тільки параметр rho/theta, що представляє відносні швидкості рекомбінації та точкових мутацій на гілці, здається, знаходиться в діапазоні від 0,0037 до 0,0056 (Таблиця 3). Нещодавно опублікована робота штаму 38 M. bovis продемонструвала вище значення rho/theta (rho/theta = 0,1), ніж отримане в цьому наборі даних, але в роботі Патане та його колег використовувалося складання на основі посилань для визначення параметрів рекомбінації. Процедурна деталь, зумовлена процедурою складання, була пов'язана з великою кількістю передбачуваних подій рекомбінації в термінальній гілці.
Далі, параметр r/m представляє коефіцієнт різноманітності рекомбінації та введення мутацій, а його середнє значення становить від 0,025 до 0,037, що вказує на те, що порівняно з мутаціями, рекомбінація має менший загальний вплив на генетичне різноманіття M. bovis (Таблиця 3). Для детального порівняння аналогічний метод був використаний для оцінки параметра r/m для набору даних MTBC, що складається з 23 геномів, показавши середнє значення 0,48620, тоді як для набору даних Patané та його колег з 38 геномів M. bovis середнє значення дорівнює 0,98. У першому дослідженні були використані лише два з 23 геномів M. bovis (M. bovis BCG та референсний штам), тому отримане значення може бути спотвореним через надмірну експресію геному M. tuberculosis. У другому звіті аналізовані популяції Mycobacterium bovis були переважно отримані зі Сполучених Штатів та від худоби-господарів. На противагу цьому, в нашому наборі даних представлено більше географічних місць та видів господарів, а також використовуються геноми, згруповані в різні клональні комплекси з різними генетичними характеристиками популяції, що дозволяє досягти глибшого та ширшого знання про популяцію. Середнє значення різниці r/m, отримане з нашим набором даних, узгоджується з концепцією, що ступінь рекомбінації значно варіюється між лініями, віднесеними до одного таксономічного виду, тому ці результати вказують на те, що клоновий комплекс M. bovis може демонструвати відмінності в рекомбінації. Вплив також відповідає припущенню Didelot & Maiden72. Тим не менш, значне розширення цього набору даних шляхом включення більшої кількості геномів M. bovis дозволить додатково прояснити цей момент. Як параметри r/m, так і rho/theta показують мінливість між гілками, і цей результат узгоджується зі звітами про інші види бактерій72,73.
Зрештою, для підтвердження подій реорганізації, виявлених конвеєром Gubbins, у програмному забезпеченні RDP4 було використано шість різних алгоритмів для незалежного тестування різних основних мультипорівнянь. У світовому масштабі менше половини подій, виявлених Gubbins, були підтверджені RDP4 (таблиці 4 та 5). Враховуючи весь набір даних, було підтверджено три події рекомбінації: дві з внутрішніми вузлами, а інша - з одним геномом у термінальній гілці, для якої не вдалося визначити клональні комплекси (таблиці 4 та 5). Ідентифікація подій у термінальних гілках може свідчити про те, що рекомбінація все ще триває в сучасних штамах M. bovis або результат неправильно розміщений70. У цій гіпотетичній області рекомбінації приблизно 20% позицій мають невизначені нуклеотиди (N), що впливає на сигнал рекомбінації (додатковий рисунок 2). Крім того, ця область впливає на ген rrs, що кодує 16S рибосомну РНК, яка, як очікується, є висококонсервативною, тому цей передбачуваний сигнал рекомбінації може бути результатом помилок секвенування або неправильного вирівнювання. Потім було проведено повне вирівнювання геному між Mb0003 та Mycobacterium bovis AF2122/97, і було підтверджено існування невизначених нуклеотидів та SNP, тому можливі проблеми, пов'язані з неправильним вирівнюванням, не були пов'язані з біологічною інформацією, реалізованою в цій роботі. Вони з'явилися після вивчення програми.
У рекомбінаційних областях внутрішніх вузлів не було виявлено жодних прогалин або невизначених нуклеотидів (рисунки 4 та 5). Щодо цих подій, одна містить лише геном Eu2 та впливає на ген pks12, який кодує можливу полікетидсинтазу; тоді як інша зареєстрована в геномі Eu1 та впливає на ген narX, який кодує можливу нітратредуктазу (таблиця 4). Загалом, аналіз рекомбінації показує, що існує обмежена кількість фрагментів рекомбінації зі статистичною підтримкою, а отримані показники вказують на те, що рекомбінація має низький вплив на лінію M. bovis. Очікується, що сигнал рекомбінації буде низьким, але важливо відрізнити справжній сигнал еволюції від фонового шуму, що є складним завданням. Щоб зменшити шумовий сигнал, що вноситься проблемами збірки на основі посилань та невідповідності 70, 71, усі інші, крім повного геному, були зібрані з нуля, а якість збірки була перевірена та забезпечена за допомогою конвеєрного аналізу QUAST (додаткова таблиця 1). Крім того, було проведено серію додаткових аналізів для забезпечення надійності та точності загального дослідження. Таким чином, якість секвенування генів narX та pks12 була оцінена шляхом картування зчитувань проти Mycobacterium bovis AF2122/97. Рекомендоване положення SNP в області рекомбінації було підтверджено, застосовуючи критерії, зазначені в розділі про метод (принаймні 20 зчитувань та частота змін 0,9). Поліморфізм гена narX був повністю підтверджений у двох геномах (Mb1792361 та Mb7240415; 2,3%) та геномах геному pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 та Mb12. Однак, для геному Mb2043 шість із восьми позицій не відповідають критерію глибини зчитування, оскільки SNP підтримується максимум 17 зчитуваннями, що нижче встановленого порогового значення 20. Таким чином, рекомбінацію шести геномів (8,6%) у цій ділянці геному можна підтвердити (рис. 4 та 5).
Детальна візуалізація вирівнювання області рекомбінації набору даних Mycobacterium bovis впливає на ген narX, який кодує можливу нітратредуктазу. У області рекомбінації внутрішніх вузлів не виявлено прогалин або невизначених нуклеотидів. Ця конкретна подія зареєстрована в геномі Eu1. Якість секвенування гена narX оцінювали шляхом побудови графіків зчитувань Mycobacterium bovis AF2122/97. Підтвердіть рекомендоване розташування SNP в області рекомбінації, застосовуючи критерії, зазначені в розділі про метод (принаймні 20 зчитувань та частота змін 0,9). Поліморфізм гена narX був повністю підтверджений у геномах Mb1792361 та Mb7240415 (2,3%).
Детальна візуалізація вирівнювання області рекомбінації набору даних Mycoplasma bovis, що впливає на ген pks12. В області рекомбінації внутрішніх вузлів не виявлено прогалин або невизначених нуклеотидів. Щодо події, що впливає на ген pks12, що кодує можливу полікетидсинтазу, він містить лише геном Eu2. Якість секвенування pks12 оцінювали за допомогою картування зчитування Mycobacterium bovis AF2122/97. Підтвердіть рекомендоване розташування SNP в області рекомбінації, застосовуючи критерії, зазначені в розділі про метод (принаймні 20 зчитувань та частота змін 0,9). Поліморфізми геномів Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 та Mb1960 були повністю підтверджені.
Гени PE та PPE мають повторювані області, які легко неправильно зчитуються секвенуванням та неправильним картуванням Illumina, тому вони зазвичай видаляються з біоінформатичного робочого процесу членів M. tuberculosis лише при використанні стратегії картування в послідовність. Висновок про події рекомбінації, застосований у цій роботі, базується на de novo складанні без фільтрації PE/PPE. Ми вважаємо, що завдяки реалізації трьох різних додаткових методів та алгоритмів за допомогою програмного забезпечення SplitsTree, Gubbins pipeline та RDP4, застосовані стратегії є стійкими до обробки та фільтрації реорганізованих областей, спричинених сигналами помилок. Однак, щоб виключити втручання гена PE/PPE в програмне забезпечення Gubbins та RDP4 для ідентифікації кластерів SNP, а отже, ідентифікації областей рекомбінації, які, як передбачається, впливають на гени narX та pks12, було досліджено сусідство цих генів (Додаткові рис. 3–5). У M. bovis AF2122/97 ген narX розділений narK2 та Mb1764c, тоді як pks12 оточений Mb2075c та Mb2073c (Додатковий Рисунок 3-5). Карта, створена за допомогою синлінійної карти MAUVE повного геному, надає інформацію про збереження та перебудову послідовності генів, показуючи чотири колінеарні блоки та відсутність ознак транслокації чи інверсії геному. Крім того, аналіз комплементації з амінокислотною послідовністю довів гомологію у всіх повних геномах, і в сусідніх областях narX або pks12 не було виявлено PE/PPE. Для narX один геном (Mb0030) має нижчий бал синонімії, оскільки ген narX був ідентифікований як два фрагменти (фрагменти 1891 та 1890). Для pks12, через подібність, Mb0030 та Mb003 продемонстрували нижчі показники синлінеарності, тоді як pks12 був ідентифікований у двох та трьох фрагментах відповідно, що представляють різні домени білка (Додатковий Рисунок 3-5). Беручи до уваги цю інформацію, а також те, що програмне забезпечення Gubbins та RDP4 виконали аналіз, перевіривши множинне вирівнювання ядра максимальних 500 bp у вікні, ми підтвердили, що ген PE/PPE не заважатиме сигналу рекомбінації, який впливає на narX та pks12.
Хоча сигнали рекомбінації, виявлені в цьому наборі даних, можна вважати залишковими, це правда, що рекомбінацію у M. bovis не можна виключати, тому вона повинна продовжувати бути предметом подальшого аналізу, в якому цілі геноми з різних епідеміологічних сценаріїв секвенуються до важливості.
Порівняння філогенетичних дерев ML, отриманих до та після корекції рекомбінації (рис. 2A, B), не призвело до суттєвих змін у визначеному філогенетичному зв'язку, і штами M. bovis були згруповані в одній групі.
Після зіставлення 42 нещодавно секвенованих фрагментів M. bovis з референсним геномом M. bovis AF2122/97 було отримано вирівнювання SNP, що містить 1816 поліморфних позицій. Більшість SNP (87,1%) розташовані в кодуючій області, а уражені гени характеризуються відповідно до функціональних категорій, показаних у Bovilist (Рисунок 6A, B). Беручи до уваги загальну кількість генів у кожній функціональній категорії, гени в категорії «метаболізм ліпідів» показали більше SNP, далі йдуть гени «клітинна стінка та клітинні процеси» та «проміжний метаболізм та дихання», що свідчить про їхню присутність в еволюції M. bovis.
Ієрархічний аналіз набору даних M. bovis з Португалії (n = 42). Загальна кількість зареєстрованих SNP та уражених генів для кожної функціональної категорії (A). Загальна кількість синонімічних та несинонімічних змін, зареєстрованих за функціональною категорією (B).
У глобальному масштабі середнє співвідношення dN/dS краще за 1,5, що вказує на глобальний еволюційний тиск, спрямований на позбавлення від предкового стану, і представляє позитивний (диверсифікований або спрямований) та/або послаблений сценарій вибору очищення. У категоріях «вірулентність, детоксикація, адаптація», «інсерційні послідовності та фаги» та «регуляторні білки» понад дві третини SNP є несинонімічними (Рисунок 6B).
У всіх категоріях є гени з кількома SNP, що призводить до середньої частоти мутацій (тобто середньої кількості SNP на ген) більше 1 (Рисунок 6A). Pks12 (Mb2074c) з 15 SNP та fas (Mb2553c) з 8 SNP мають вищі значення мутацій. Обидва ці гени беруть участь у метаболізмі жирних кислот. Ген pks кодує полікетидсинтазу (PKS), яка є багатофункціональним ферментом, що бере участь у біосинтезі ліпідів клітинної стінки мікобактерій74,75. Цей ген кодує багатофункціональний поліпептид, який бере участь у синтезі мікокетидів74,76. Ген fas бере участь у синтезі міколової кислоти. Обидва ці гени відіграють важливу роль у біосинтезі клітинної стінки, що контактує з хазяїном.
Для подальшого вивчення еволюції Mycobacterium bovis було проаналізовано два набори специфічних генів. У раніше опублікованих роботах з використанням методів складання послідовностей та філогенезу було виявлено гени, які були отримані предками MTBC через HGT до диверсифікації37,38. Ці гени перелічені в Додатковій таблиці 2. Було проаналізовано розподіл SNP загалом 77 генів, які можуть бути пов'язані з HGT, і було виявлено 26 поліморфних сайтів, які в більшості випадків (78%) призвели до несинонімічних (NS) змін (Додаткова таблиця 2). Попередня робота над геномом MTBC показала, що передбачувана область HGT демонструє вище співвідношення NS SNP порівняно з рештою геному. Якщо вважати, що ці рекомбінаційні області були отримані предками MTBC, і тому вони надмірно представляють давні поліморфізми, то очікується, що частка синонімічних змін буде вищою, оскільки очікується, що NS-заміни будуть усунені негативним відбором через зміни амінокислот, які можуть змінити функцію білка. Таким чином, наші результати показують, що функціональні наслідки можуть виникати внаслідок заміни генів, подібних до HGT, що відображає їхню важливість для цінного адаптивного генетичного різноманіття.
Паралельно з цим аналізом, гени, що кодують компоненти системи 3R (репарація, реплікація та рекомбінація ДНК), були ретельно досліджені відповідно до списку, раніше опублікованого дос Вультосом та його колегами (2008)39. Обмін ідентичними фрагментами ДНК неможливо безпосередньо спостерігати, хоча це може бути частим процесом, коли задіяні близькоспоріднені бактерії, як у випадку цього набору даних; крім того, цей процес може бути ключем до методів репарації ДНК72, тому вони відіграють роль у гомологічній рекомбінації. Загалом було ідентифіковано 26 поліморфних позицій, розподілених за 54 генами (Додаткова таблиця 3). У цьому наборі генів зміни NS становили близько 65% наслідків, що узгоджується з попередніми повідомленнями про штами Mycobacterium tuberculosis.
Час публікації: 21 жовтня 2021 р.