O ṣeun fun abẹwo si Iseda. Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin to lopin fun CSS. Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹya tuntun ti ẹrọ aṣawakiri (tabi pa ipo ibaramu ni Internet Explorer). Ni akoko kanna, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣafihan awọn aaye laisi awọn aza ati JavaScript.
Iṣeduro genome ti sọji aaye ti iwadii arun ajakalẹ-arun, ṣiṣafihan ajakale-arun, pathogenesis, awọn ibaraenisepo-ogun-ogun, ati ilana itiranya ti a fi lelẹ lori awọn pathogens. Awọn eka ikọ-ara Mycobacterium (MTBC) n ṣakiyesi Mycobacterium bovis bi ọkan ninu awọn ọmọ ẹgbẹ adaṣe ti ẹranko ti o fa iko (TB) ni awọn osin ori ilẹ, ati pe o jẹ apẹrẹ aṣoju ti itankalẹ kokoro-arun. Gẹgẹbi awọn ọmọ ẹgbẹ MTBC miiran, Mycobacterium bovis ni a ro pe o jẹ cloned ti o muna, ti o dagbasoke laiyara, ati pe ko si ami ti atunko tabi gbigbe jiini petele. Ninu iṣẹ yii, a lo awọn genomics comparative to a odidi genome lesese (WGS) dataset ti o kq ti 70 ẹran M. lati orisirisi pedigrees (Europe ati Africa) lati jèrè imọ sinu awọn jiini oniruuru ti ẹran M. Evolutionary agbara. Awọn ọna oriṣiriṣi mẹta ni a lo lati ṣe iṣiro awọn ami ti atunto. Ni kariaye, nọmba kekere ti awọn iṣẹlẹ isọdọtun ti jẹ idanimọ ati timo nipasẹ awọn ọna ominira meji pẹlu atilẹyin to lagbara. Bibẹẹkọ, ni akawe pẹlu awọn iyipada, isọdọtun ni ipa alailagbara lori oniruuru M. bovis (apapọ r/m = 0.037). Iyatọ r/m ti a gba ni ile-iṣẹ clonal ti Mycobacterium bovis ninu eto data wa ni ibamu pẹlu imọran gbogbogbo pe iwọn ti atunda le yatọ pupọ laarin awọn ila ti a yàn si iru-ori kanna. Da lori iṣẹ yii, atunṣe ni Mycobacterium bovis ko le ṣe akoso, nitorinaa o yẹ ki o jẹ koko-ọrọ ti awọn igbiyanju siwaju sii ni iwadii jinomiki afiwera iwaju, ninu eyiti WGS ti awọn ipilẹ data nla lati oriṣiriṣi awọn oju iṣẹlẹ ajakale-arun ni ayika agbaye jẹ pataki. Atunyẹwo afikun lẹhinna ni a ṣe lori ipilẹ data Mycobacterium bovis ti o kere ju (n = 42) lati inu itankalẹ TB ti ọpọlọpọ-ogun, ati pe diẹ sii ju 1,800 loci ti a mọ, eyiti o kere ju igara kan fihan polymorphism nucleotide kan ṣoṣo (SNP). Pupọ julọ (87.1%) wa ni agbegbe ifaminsi, ati ipin agbaye ti awọn iyipada ti kii ṣe ibaramu (dN/dS) ti awọn iyipada isọdọkan kọja 1.5, ti o nfihan pe yiyan rere jẹ agbara itiranya pataki ti o ṣiṣẹ lori M. bovis. Iwọn ti o ga julọ ti awọn SNP ni a rii ni awọn jiini ọlọrọ ni awọn ẹka iṣẹ ti “iṣelọpọ ọra”, “ogiri sẹẹli ati awọn ilana cellular”, ati “iṣelọpọ agbedemeji ati isunmi”, ti n ṣafihan agbara wọn ninu isedale ati itankalẹ ti pataki Mycobacterium bovis. A jo wo ni awọn Jiini ninu awọn baba MTBC ti o wa ni prone to petele pupọ gbigbe ati ki o to wa ninu awọn 3R (DNA titunṣe, atunse, ati recombination) eto han ni agbaye apapọ odi iye ti Taijima's D eedu igbeyewo, eyi ti o tọkasi ti o ti kọja yiyan Antivirus The laipe bottleneck lẹhin olugbe imugboroosi jẹ tun ni akọkọ ti itiranya ifosiwewe fun awọn ogun bovis pathogen lati ja ogun Mycobacterin.
Mycobacterium iko eka (MTBC) jẹ ọkan ninu awọn julọ aseyori taxa ti kokoro arun pathogens ati kan aṣoju nla ti itankalẹ kokoro arun. Awọn ọmọ ẹgbẹ rẹ ṣe afihan idanimọ nucleotide giga iyalẹnu ni ipele jiini (> 99%)1,2. Awọn oriṣiriṣi ecotypes MTBC le fa ikọ-ọgbẹ (TB), eyiti o jẹ arun granulomatous ti o ni àkóràn, ni ọpọlọpọ awọn eya ogun lati awọn micro-mammals si eniyan3,4,5. Lọwọlọwọ, eka naa pẹlu eniyan [M. iko (Mtb), Mycobacterium africanum] ati eranko-adapted pathogens (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" ati, 6). M. canettii (ti a tun mọ ni "Nodobacter glabrata") Apapọ idanimọ nucleotide pẹlu mycobacteria ti a ti sọ tẹlẹ jẹ 98%, ati pe iṣẹ-ipin-ara-ara ti o ṣe afiwe ti fihan pe M. canettii ati iyokù MTBC ti yapa laipe lati ọdọ baba ti o wọpọ.7 Ni imọran imọran yii, diẹ ninu awọn onkọwe pe M.
A ṣe apejuwe MTBC ni ọna ṣiṣe bi eka clonal ti o muna, ati pe eto olugbe rẹ jẹ iṣakoso ni kedere nipasẹ iyatọ ti o dinku, awọn igo, wiwa yiyan, ati jiini drift9,10. A ro pe itankalẹ clonal ti o muna ti o muna, gẹgẹbi awọn polymorphisms ti o padanu ko le ṣe atunṣe nipasẹ atunko. Da lori ayika ile yii, awọn iṣẹlẹ itẹlera ti piparẹ genomic ti agbegbe iyatọ (RD) ati TbD1 (agbegbe Mtb pato piparẹ 1 agbegbe) ti ni imọran bi awọn ami ami molikula ti MTBC evolution2,5,11. Awọn genomics Comparative ati gbogbo iṣẹ-ṣiṣe genome (WGS) ṣe atilẹyin pipin awọn ọmọ ẹgbẹ ti o ni iyipada si awọn ila mẹsan (Mycobacterium tuberculosis L1 si L4, L7, ati L8; ati Mycobacterium africanum L5, L6, ati L9), awọn ila L2 si L4 pin paarẹ TbD1 agbegbe2,131.12 Ni afikun, awọn ọmọ ẹgbẹ ti o baamu ẹranko ni a daba lati pin baba nla kan, eyiti o jẹ asọye nipasẹ awọn piparẹ-pataki ni RD7, RD8, RD9 ati RD102, 5, ati 14.
Petele jiini gbigbe (HGT) ati atunda iṣẹlẹ ti wa ni kà toje ati ki o waye ninu awọn baba ti MTBC, dipo ju awọn ti o yatọ itan ti gbogbo MTBC member15,16,17. Awọn ijabọ ibẹrẹ meji nipasẹ Hughes ati awọn alabaṣiṣẹpọ (2002) ati Gutacker and collaborators (2006) daba pe awọn iṣẹlẹ isọdọtun le ṣe iranlọwọ lati ṣe apẹrẹ awọn polymorphisms ti o samisi loci kan pato ni awọn igara iko-ara M.18,19. Awọn idi fun aini isọdọtun ti o han gbangba ni MTBC ni: (1) ilana ẹrọ ati isonu ti agbara ti HGT; (2) awọn Rarity ti HGT iṣẹlẹ; (3) ko si aye ti awọn iṣẹlẹ isọdọtun ni MTBC niche14,17. Laipe, diẹ ninu awọn iwadi ti o wa ni kikun-genome sequencing (WGS) ti a lo si MTBC strain 20 ati Mycobacterium bovis 21 ti pese ẹri ti atunṣe, akọkọ lati fihan pe awọn iṣoro MTBC nigbagbogbo paarọ awọn ajẹku DNA kekere, ṣugbọn nitori iyatọ ti nucleotide ti o ni idiwọn, awọn iṣẹlẹ wọnyi Ṣi ko ṣe akiyesi.
Mycobacterium bovis jẹ ọmọ ẹgbẹ MTBC ti o wọpọ julọ ti o gba pada lati ẹran-ọsin (paapaa ẹran), botilẹjẹpe o tun le ya sọtọ si ibiti o wa laaye ati awọn ẹranko igbẹ olodi4,22,23,24. M. bovis wa sinu awọn ile-iṣẹ clonal pataki marun [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) ati Africa 2 (Af2)], ni ibamu si profaili spoligotyping, awọn piparẹ pato Ati awọn polymorphisms nucleotide kanṣoṣo (SNPs) 25,27,26 in 8. Awọn eka clonal wọnyi ṣe afihan ọna oniruuru ti olugbe Mycobacterium bovis ati ajọṣepọ rẹ pẹlu awọn agbegbe agbegbe. Ni afikun, iṣẹ WGS aipẹ ti o ṣe nipasẹ Zimpel ati awọn alabaṣiṣẹpọ (2020) ṣe apẹrẹ phylogeny ti o da lori SNP ti Mycobacterium bovis, pẹlu diẹ sii ju awọn genomes 1,900, ti o nfihan pe o kere ju awọn ila mẹrin mẹrin (ti a npè ni Lb1 si Lb1 si Lb4), wọn ko ni ibamu patapata pẹlu eka-iṣọkan tẹlẹ, bi o tilẹ jẹ pe gemu ti a ti sọ tẹlẹ. Awọn onkọwe wọnyi ṣe itupalẹ iyatọ ti phylogeny ati ibaṣepọ molikula, ṣugbọn ko ṣe iwadi atunko30.
Iṣẹ iṣaaju ti o nlo awọn ọna ẹrọ molikula oriṣiriṣi, gẹgẹbi spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), ati titẹ SNP to ṣẹṣẹ ṣe afihan ipele kan ti oniruuru jiini laarin M. bovis strains 31,32,33, 34,35. Iyatọ ti iyatọ ti jiini ti di ohun elo pataki ninu iwadi ti awọn ajakale-arun ti aisan, eyiti o ṣe iranlọwọ fun oye ti o jinlẹ ti pathogenesis, virulence ati gbigbe arun. Ifarahan ti ọna WGS n pese aye lati ṣafihan awọn ifosiwewe awakọ itiranya ti a fi lelẹ nipasẹ genome Mycobacterium bovis ninu ilana ti aṣamubadọgba ati itẹramọṣẹ si awọn ogun oriṣiriṣi ati awọn oju iṣẹlẹ ajakale-arun.
Ninu iṣẹ yii, a lo itupalẹ genomic afiwera lori ọpọlọpọ awọn datasets Mycoplasma bovis (n=70), pẹlu awọn ipinya lati oriṣiriṣi awọn eka clonal, lati ni oye si ilana itiranya ti Mycoplasma bovis, ni pataki lati yanju awọn ibatan phylogenetic Ati awọn iṣẹlẹ isọdọtun. Bi awọn kan afikun si yi onínọmbà, a iha-data ṣeto ti M. bovis isolates (n = 42) gba lati kan daradara-characterized olona-ogun iko agbegbe ni Portugal 31,36 ti a siwaju waidi lati infer ti kii-idanimo Iwontunws.funfun laarin awọn ojulumo ipin ti ori (dN) to bakannaa (dS) nucleotide substitutions, bi daradara bi awọn gevolutions ti wa ni awọn aropo ti o wa ninu awọn iwe-titun. 37,38 ti a gba nipasẹ awọn baba MTBC nipasẹ HGT, ati koodu 3R (atunṣe DNA, atunṣe, ati atunda) awọn ẹya ara ẹrọ jiini 39. Yan awọn Jiini ti a gba nipasẹ HGT nitori wọn le ṣe aṣoju awọn polymorphisms atijọ, nitorinaa o nireti pe wọn le ni ipin ti o ga julọ ti awọn iyipada bakanna. Awọn Jiini ti o wa ninu eto 3R ni a yan nitori iṣẹ iṣaaju lori awọn igara iko-ara M. ṣe afihan awọn aṣayan odi gbogbogbo / iwẹnumọ ti o ṣiṣẹ lori awọn Jiini wọnyi, ati pe wọn le ṣe ipa pataki ninu itankalẹ 39. Idi miiran ti iṣẹ yii ni lati ṣe akiyesi aye ti awọn iṣẹlẹ isọdọtun. Fun idi eyi, ni imọran pe dataset wa lati Ilu Pọtugali nikan ni awọn genomes ti eka ẹda oniye ti Ilu Yuroopu 2 ati awọn igara ti ko ti sọtọ eka ẹda oniye, a pinnu lati ṣafikun data jiini ti o wa ni gbangba lati nikẹhin gba aṣoju ti gbogbo awọn eka ẹda oniye, ati Mu agbara ati iwọn awọn abajade pọ si.
42 titun lesese Mycoplasma bovis genomes lati Portuguese endemic olona-ogun si nmu iko (alaye ni isalẹ), tẹlẹ characterized lati ẹya ajakale irisi36, ni aarin ti ise yi. Ti o ba ṣe akiyesi pe data ti a ṣeto lati Ilu Pọtugali nikan ni awọn aṣoju ti awọn ile-iṣẹ oniye oniye 2 European ati awọn igara laisi awọn ile-iṣẹ ti a yan, ti o wa ni gbangba gbogbo data ti o tẹle-genome ti wa ni afikun lati faagun eto data ti o pẹlu gbogbo awọn aṣoju ti awọn eka oniye M. bovis. Nitori naa, awọn orisun data ti o wa ni kikun-genome mẹta ni a lo ninu iṣẹ yii: pipe / apẹrẹ genome apejọ, to awọn 10 scaffolds ti a fipamọ sinu NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 isolates); ti o ti fipamọ ni SRA (The Illumina fastq faili ti awọn ọkọọkan ka pamosi) duro awọn eka oniruuru ti M. bovis ere ibeji (n = 12 sọtọ) 30; ati 42 rinle lesese genomes lati Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ni a yọkuro lati inu wiwa NCBI. M. bovis AF2122/97 ni a maa n lo gẹgẹbi jiini itọkasi lati wa ninu iwe data. Nitori aisi gbogbo eniyan ti gbogbo ilana genome ti o jẹ aṣoju nipasẹ ile-iṣẹ cloning 1 ti Afirika, ati nọmba kekere ti awọn genomes lati awọn igara asoju ti Af2 ati Eu1, data itọsẹ atilẹba ti o pese nipasẹ SRA ni a lo ninu awọn ọran wọnyi. Iṣẹ ti Zimpel ati awọn alabaṣiṣẹpọ rẹ (2020) ṣe iranlọwọ lati ṣe idanimọ jiini-jiini lati eka ti cloning ti a mẹnuba rẹ ati ṣe iranlọwọ yan Mycobacterium bovis fun ifisi ninu ṣeto data. Fun Eu3, iru genome kan ṣoṣo ni a ṣapejuwe (Branger et al., 2020), nitorinaa genome ti a pẹlu jẹ aṣoju lọtọ ti eka Eu3.
Ni agbaye, eto data yii pẹlu 70 ẹran M. bovis ti o ya sọtọ lati awọn eya ogun 8, ti a pin ni awọn orilẹ-ede 12 lati ọdun 1985 si 2016. Awọn eya 36 jẹ apẹrẹ bi Eu2, awọn eya 7 jẹ Eu1, awọn eya 1 jẹ Eu3, awọn eya 3 jẹ Af1, awọn eya 4 jẹ Af2 ati 19 kii ṣe idiju si eyikeyi idiju. Alaye alaye (pẹlu nọmba wiwọle) ti Mycobacterium bovis ti a lo ninu iwadi yii jẹ afihan ni Tabili 1 ati Tabili 1 Afikun.
42 titun lesese gbogbo genomes ti Mycobacterium bovis lati Portugal ká eranko iko hotspot ati ki o pin fun diẹ ẹ sii ju 12 years ni o wa aarin ti yi iwadi, bi o pọju eda abemi egan-ẹran-ọsin eto ti a ti deede abojuto 31,36 (Ifikun eeya. 1). Gẹgẹbi awọn ilana ti o tẹle, awọn igara wọnyi ya sọtọ lati malu (n = 14), agbọnrin pupa (n = 16) ati boar egan (n = 12) lati 2003 si 2015: gba ati mu awọn ẹranko ni ibamu pẹlu awọn ilana ilana ti a ṣe iṣeduro Awọn ayẹwo tissu wa ninu OIE Terrestrial Animal Handbook ati pe o wa ni inoculated lori OIE Terrestrial Animal Handbook ati pe o wa ni inoculated Stein-Jeente ati Löculated. omi alabọde. Awọn aṣa ti wa ni idawọle ni 37 °C ati pe a ṣe ayẹwo idagba lẹẹkan ni ọsẹ fun o kere ju ọsẹ 12. Awọn ileto ti wa ni ipamọ taara ni ojutu glycerol ni -80ºC. Ninu agbedemeji yiyan Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), awọn ayẹwo atilẹba ti a pamosi ni a kọja nipasẹ ọna aye in vitro kan ninu fitiro lati gba DNA ti eto WGS. Fun eyi, ojutu ọja iṣura ti aṣa tio tutunini jẹ idarato pẹlu 5% sodium pyruvate ati 10% ADS (50 g albumin, 20 g glucose, 8.5 g sodium kiloraidi ninu omi 1 L) lori Middlebrook 7H9 ni 37°C Retrain. Lẹhin awọn ọsẹ mẹrin ti idagbasoke, alabọde ti tunse ati aṣa naa ni abojuto nigbagbogbo titi ti a fi rii idagbasoke. Awọn sẹẹli naa ni ikore nipasẹ centrifugation, pellet ti tun daduro ni 500 µL fosifeti buffered saline (PBS), kikan ni 99 °C fun awọn iṣẹju 30, centrifuged, ati pe a ti fipamọ supernatant ni -20 °C titi WGS. Gbogbo awọn ilana ni a ṣe ni awọn ohun elo biosafety ipele 3.
Ile-ikawe jiini-igbẹkẹle-ipari WGS ti pese sile ni lilo atọka alailẹgbẹ ti ayẹwo DNA kọọkan, o si lo Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (awọn ayẹwo 40) ati HiSeq (2 × 150 pb) (awọn iyasọtọ meji) imọ-ẹrọ (Eurofins Genomics, Jẹmánì) fun tito lẹsẹsẹ. Ni ibamu si awọn ilana olupese, lo Illumina Genome Analyzer pẹlu ilọpo-opin module asomọ lati ọkọọkan DNA jiini, ki o si lo Nextera XT DNA Library Prep Apo lati Illumina lati òrùka awọn ìkàwé.
Ti o ba ṣe akiyesi data ti o gba pada lati SRA (n = 12), idanimọ ti eka ẹda oniye le ṣee lo bi metadata ti ikede ti o baamu 30, 41, 43. Nigbati o ba ṣe akiyesi genome pipe, ayafi fun Mycobacterium bovis AF2122/97 ati Mycobacteriu bovis 3601, eyiti a mọye 1 ati awọn ọmọ ẹgbẹ E25, clou22 ati E25. lẹsẹsẹ, o jẹ kanna bi jiini pipe ti Mycobacterium tuberculosis H37Rv (nọmba wiwọle NCBI NC_000962.3). Titete genome ni a ṣe ni lilo MAFFT (eto titete ọpọ ti amino acid tabi ọkọọkan nucleotide, ẹya 7.458) ati paramita -addfragments48. Lẹhinna, wa isansa ti awọn eka clonal oriṣiriṣi ati/tabi wiwa awọn ẹya SNP.
Mycobacterium bovis tuntun ti a tẹle (n = 42) ati atilẹba kika ti apẹrẹ jiini ti a pejọ (n = 3) ṣe afiwe eka naa pẹlu jiini itọkasi Mycobacterium iko H37Rv nipasẹ opo gigun ti epo vSNP ati wiwa ti piparẹ ati/tabi awọn ẹya SNP ti awọn ere ibeji oriṣiriṣi A ṣe iwadii kan.
Gba alaye lati aini awọn ẹya ati / tabi wiwa / aini ti SNP ati awọn profaili spoligotyping lati fi data genomic si eka clonal ti o baamu. Fun awọn apejọ apẹrẹ mẹrin, profaili spoligotyping ko le ṣe akiyesi, nitorinaa wọn wa ninu ẹgbẹ “ko si idiju”.
Ṣiṣan iṣẹ ṣiṣe bioinformatics ti o tẹle pẹlu iṣẹ yii bẹrẹ lati apejọ de novo ati aworan agbaye si ilana itọkasi kan, pẹlu ibi-afẹde ti ṣawari awọn iṣẹlẹ isọdọtun ati awọn polymorphisms genome kan pato. Olusin 1 n pese apẹrẹ ṣiṣan ti awọn igbesẹ ti o tẹle. Fun itupalẹ isọdọtun, gbogbo awọn genomes ni a lo lati mu agbara ti awọn itọkasi ati awọn itọkasi ti o jọmọ pọ si.
Lati le dinku awọn aṣiṣe ni iran ti awọn ilana ifọkanbalẹ genome, a kọkọ gba apejọ de novo, ati lẹhinna gba awọn alignments pupọ akọkọ. Pipeline Unicycler wa lọwọlọwọ ni https://github.com/rrwick/Unicycler49 ati pe a lo lati ṣe apejọ de novo ti awọn genomes ti o tẹle 54 (42 ti a ṣe lẹsẹsẹ ati awọn faili fastq 12 ti o gba pada lati SRA). Ni kukuru, ṣaaju kikojọ lati ibere, a ṣe itupalẹ didara kika ni ẹya FastQC 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), ati ẹya Trimmomatic 0.36 (aṣayan “awọn ohun elo gige gige ati awọn ilana ina-kan pato lati awọn kika” ati “Gege awọn ipilẹ lati opin didara ti 2 ti a lo,” ti o ba jẹ pe o wa ni isalẹ ti kika 2, (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Lẹhinna, SPAdes optimiser49 ni a lo fun apejọ genome, ati ẹya Pilon 1.1851 ti a lo fun iṣapeye apejọ lẹhin igbimọ. A yan ipo asopọ Konsafetifu lati yago fun apejọ ti ko tọ, ati pe iwọn k-mer ti wa ati yan laarin 20% ati 95% ti ipari kika. Tẹle awọn itọnisọna SPAdes ati ki o ṣe akiyesi iwọn kika, pa awọn contigs ti o kere ju 300 bp, ki o si fi idi 20 kan kalẹ ijinle gige gige ti 52. Ninu ilana apejọ de novo, awọn agbegbe genomic gẹgẹbi proline-glutamate ti o ni atunṣe pupọ (PE) ati proline-proline glutamate (PPE) paralogs ko yọ kuro.
Didara apejọ de novo ni a ṣe ayẹwo nipasẹ opo gigun ti epo QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), eyiti o jẹ ki isọdọtun ti contig ati M. bovis AF2122/97 itọkasi genome (Nọmba wiwọle NCBI LT708304.1) Iyaworan (wo Afikun tabili 1 fun awọn ipilẹ didara).
Pẹlu iranlọwọ ti opo gigun ti epo vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), faili FASTQ ti ọna tuntun M. bovis lati ipasẹ Illumina jẹ akawe pẹlu genome itọkasi M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Gẹgẹbi awọn iṣeduro adaṣe ti o dara julọ ti Ohun elo Ohun elo Analysis Genome (GATK) 53, 54, 55 lo awọn paramita àlẹmọ boṣewa tabi awọn nọmba ibi-iyatọ fun isọdọtun. Awọn esi ti wa ni filtered nipa lilo awọn ni asuwon ti SAMtools ibi- Dimegilio ti 150 ati AC = 2. Tun lo Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) lati ṣayẹwo awọn kika lati ṣe akoso jade. Opo opo gigun ti epo vSNP ti a lo lati ṣe maapu si awọn ilana ilana-tẹle ninu iṣẹ wa ṣe idanwo lẹsẹsẹ awọn SNPs ti a ti ṣalaye ati awọn ibi-afẹde, ati pe o tun yọkuro awọn oju iṣẹlẹ ikolu ti o dapọ. Idede jiini kika jẹ dara ju 99% (Tabili Afikun 1).
Lati yago fun awọn aṣiṣe iyaworan ati awọn SNP ti ko tọ, ṣe àlẹmọ iyatọ ninu awọn iṣẹlẹ wọnyi: (1) o ni atilẹyin nipasẹ kere ju awọn kika 20, (2) o wa pẹlu igbohunsafẹfẹ ti o kere ju 0.9, (3) o wa ni o kere ju Igara kan, ṣugbọn o kere ju awọn ela wa ninu igara miiran. Ẹya 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/) 56 oluwo awọn genomics ti irẹpọ (IGV) ni a lo lati rii daju awọn SNPs oju ati awọn ipo pẹlu awọn iṣoro aworan agbaye tabi titete. Niwọn igba ti awọn jiini proline-glutamate (PE) ati proline-proline glutamate (PPE) jẹ pidánpidán pupọ ati pe o jẹ apakan ti idile pupọ-pupọ, wọn ni irọrun ni oye nipasẹ ipasẹ Illumina ati aiṣedeede, nitorinaa wọn fẹran iṣan-iṣẹ bioinformatics mycobacterial ti yọkuro awọn ọmọ ẹgbẹ ti iko-ara ti o jẹri eka nigba lilo ilana ti aworan agbaye si awọn ilana SNP. Nitorinaa, a ṣe iyọda awọn jiini PE/PPE ati awọn indels lati inu itupalẹ.
Gẹgẹbi Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), gbogbo awọn SNP ti pin si awọn ẹka iṣẹ. Opo opo gigun ti epo SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) ni a lo lati ṣe afihan awọn abajade SNP (awọn ayipada alaiṣe tabi ailorukọsilẹ). Ṣẹda data tuntun ti Mycobacterium bovis AF2122/97 genome (LT708304.1).
Awọn mojuto genome ọpọ alignment ti a ṣe nipa lilo Parsnp v1.2, Lọwọlọwọ wa ni https://github.com/marbl/parsnp57, lilo 69 pipe genomes/draft assemblies (pẹlu aṣayan -c) ati M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) ti lo bi itọkasi. Mẹrin mojuto ọpọ alignments ti a ṣe: nikan awọn ọmọ ẹgbẹ ti Eu2 eka cloning (n = 37), pẹlu gbogbo awọn ọmọ ẹgbẹ ti European cloning eka (n = 44), pẹlu awọn ipade ojuami ti awọn European ati ki o African cloning eka (n = 51), ati ki o pẹlu gbogbo Mycobacterium bovis ninu iwadi yi (n = 70).
Titete mojuto ti a ṣe nipasẹ Parsnp ni a lo lati jẹ ki o ṣeeṣe julọ (ML) igi phylogenetic nipa lilo CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/) 58 ni lilo RaxML, ati ṣe awọn atunṣe itọsọna 1000.
Awọn algoridimu oriṣiriṣi mẹta ati awọn irinṣẹ bioinformatics ni a lo lati ṣayẹwo fun wiwa awọn iṣẹlẹ isọdọtun ni afiwe: sọfitiwia SplitsTree4, Gubbins (ilana aibikita nipasẹ isọdọtun ni awọn ilana nucleotide) opo gigun ti epo, ati RDP4 (eto wiwa atunṣe, ẹya beta 4.101) sọfitiwia.
Ọna jijẹ pipin ti a ṣe imuse ni SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/) 59 ni a lo lati ṣe iṣiro netiwọki phylogenetic ti ko ni gbongbo, ni lilo idanwo Phi fun ijẹrisi iṣiro, ati aaye pataki jẹ p = 0.05. Itupalẹ isọdi-ọpọlọpọ mojuto ti Parsnp ni a lo bi titẹ sii, ati jijẹ pipin bi boṣewa nẹtiwọki kan ti ni imuse.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 nṣiṣẹ pẹlu awọn paramita aiyipada bi ọna miiran lati ṣe iṣiro ipa ti atunda lori Mycobacterium bovis. Algorithm ti a ṣe ni opo gigun ti epo n ṣe atunṣe ila ti ẹda oniye ti o niiṣe pipe genome/draft meeting of our data set and the reference genome (bovine bovid92) LT708304.1).
Lakotan, lati le jẹrisi iṣẹlẹ isọdọtun ti a daba nipasẹ opo gigun ti epo Gubbins, awọn algoridimu mẹfa ti a ṣe ni RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 ati SiScan66) ni a lo si isọdọtun pupọ ti Parsnp labẹ awọn eto aiyipada. A pinnu pe o kere ju mẹta ti awọn algoridimu ti a ṣe imuse ni RDP4 gbọdọ ṣe afihan ifihan agbara pataki nigbagbogbo lati jẹrisi iṣẹlẹ isọdọkan kọọkan.
Ṣiyesi pe Gubbins ati sọfitiwia RDP mejeeji n wa awọn ifihan agbara isọdọtun nipa ṣiṣe ayẹwo awọn isọdi pupọ ni window kan ti o to 500 bp, ati ifẹsẹmulẹ pe ifisi ti awọn jiini PE/PPE lakoko apejọ de novo kii yoo dabaru pẹlu awọn ami isọdọtun ti a rii, itupalẹ siwaju ni a ṣe nipasẹ homolinearity Ṣayẹwo agbegbe ti jiini ti n ṣe idanimọ iṣẹlẹ naa.com Maapu synlinear nipa lilo genome pipe ni a ṣe pẹlu lilo MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) lati yọkuro awọn iyipada genome agbegbe tabi awọn iyipada. Ni afikun, gbogbo genome ni a lo lati ṣe itupalẹ homolinearity lori ọkọọkan amino acid nipasẹ olupin wẹẹbu SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Ayẹwo ti o jinlẹ diẹ sii ti ṣeto data genome ti o gba lati inu eto iko-ọpọ-ogun Portuguese ni lati ṣayẹwo polymorphism ti awọn Jiini ti a mẹnuba ninu awọn iwe-iwe. Awọn Jiini wọnyi jẹ 37,38 ati jiini fifi koodu 3R ti o gba nipasẹ awọn baba MTBC nipasẹ HGT (atunṣe DNA, atunṣe ati atunṣe) awọn paati eto 39. Lo ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) ati lo DnaSP v6.12.03 (http://wwwsp.ubity) (π) ati igbewọle paramita idanwo didoju Tajima's D.
Igi phylogenetic ti o pọju (ML) ti o da lori 69 Mycoplasma bovis ya sọtọ ati awọn genomes itọkasi ni a gba (Figure 2A). Ti a bawe pẹlu awọn igi orisun-ẹyọkan tabi awọn igi orisun-pupọ, ilana yii ngbanilaaye fun iran ti awọn igi ti o ni agbara diẹ sii ti ko gba iyipada ti gbogbo genome ati nitorina ṣe afihan agbara kekere lati ṣe iyatọ laarin eya 68,69. Ilana topological ti igi ML nigbagbogbo ni ibamu pẹlu isọdi idiju ti awọn ere ibeji. Ẹya ara-ara ti Eu2 ti wa ni iṣupọ ni ẹka kan, ati pe genome ti Af1 tun ṣe akopọ papọ (Aworan 2A). Abajade tun jẹ ibamu pẹlu ibatan itankalẹ ti a mọ ti Mycobacterium bovis, iyẹn ni, iyatọ nla wa laarin ọmọ ẹgbẹ Eu1 ati ẹgbẹ ti o ni gbogbo awọn eka clonal miiran ati awọn genomes, ṣugbọn eka clonal 30 ko ni pato. Aiṣedeede kekere laarin eka clonal ati ibatan ti a ṣe akiyesi lori igi phylogenetic ni a le ṣe alaye nipasẹ otitọ pe a ṣe apejuwe eka clonal ti o da lori awọn agbegbe genomic kan pato, lakoko ti igi phylogenetic da lori ọpọlọpọ awọn alignments ti awọn genomes mojuto ti o nsoju gbogbo genome.
Igi phylogenetic ti o pọ julọ (GTR) ti wa ni itumọ ti o da lori titete genome mojuto ti mycobacterium bovis genome ṣaaju (A) ati lẹhin (B) yiyọ kuro ti aaye isọdọkan. Awọn awọ ẹka jẹ aṣoju fun eka Mycobacterium bovis clone: Yuroopu 1 jẹ eleyi ti, Yuroopu 2 pupa, Yuroopu 3 jẹ buluu, Afirika 1 jẹ osan, ati Afirika 2 jẹ alawọ ewe. Igi naa ti fidimule ati ki o fa si iwọn, ati pe ipari ẹka naa jẹ iwọn bi rirọpo fun aaye kọọkan.
Apejuwe ikọlu ikọ-ara Mycobacterium bi ti wa ni idagbasoke ti clonally, ati ọpọlọpọ awọn ẹri ti a kojọpọ ni awọn ọdun ṣe atilẹyin imọran pe HGT ti nlọ lọwọ ati awọn iṣẹlẹ isọdọtun kii yoo waye ni ipele wiwa ti MTBC15,17,18.
Awọn iṣẹ iṣaaju ti fihan pe isọdọtun lopin le wa laarin awọn igara MTBC20,21, lakoko ti awọn miiran ti kuna lati ṣe idanimọ awọn iṣẹlẹ isọdọtun iwọnwọn70,71. Tun-fi ọrọ yii sọrọ pẹlu idojukọ lori Mycobacterium bovis, eyiti o yatọ si iṣẹ iṣaaju ti o ṣe akiyesi iko-ara Mycobacterium nikan 70,71; tabi ro MTBC bi kan gbogbo, pẹlu fere ko si M. bovis o nsoju 20; tabi kiki awọn ida-malu ti o ni ihamọ nikan. Awọn dataset mycobacteria, ninu iṣẹ yii, apapọ awọn igara 70 wa, ti o nsoju gbogbo awọn eka clonal, ti a lo lati ṣe iboju fun isọdọtun. Eto data naa jẹ iwọn ni ibamu si awọn ipele ikojọpọ mẹrin: (1) Awọn ọmọ ẹgbẹ Eu2, (2) gbogbo awọn ọmọ ẹgbẹ ti ẹda oniye ti Ilu Yuroopu (ie Yuroopu), (3) eka ẹda oniye ti Ilu Yuroopu ati Afirika (Eu + Af) ati (4) gbogbo awọn ikojọpọ data (pẹlu awọn genomes ti ko si ninu eyikeyi awọn eka cloning tẹlẹ ti ṣapejuwe).
Lati ṣe iwadi siwaju si ile-itumọ yii, nẹtiwọọki pipin-pipin ni a ṣe lati ṣe ayẹwo isansa ti awọn iṣẹlẹ isọdọtun laarin awọn genomes, nitori ọna yii le foju inu wo ibatan ibatan baba laarin awọn eniyan kọọkan ati ṣafihan awọn ifihan agbara phylogenetic. Gbogbo awọn ipilẹ data mẹrin ti o wa ninu itupalẹ jẹrisi aye ti awọn losiwajulosehin ninu nẹtiwọọki (iyẹn ni, awọn agbegbe ti ko ṣajọpọ sinu igi kan), ṣugbọn idanwo Phi ko ni atilẹyin iṣiro (Eu2, p = 0.0956; Yuroopu, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; gbogbo data ṣeto p = 0.245), eyiti o pese ẹri ti ko dara ti eto ara eniyan 3A-D).
Ni Europe 2 genomes (n = 37) (A), European genomes (n = 44) (B), European ati African genomes (n = 51) (C) ati gbogbo data ṣeto (n = 70) (D).
Lẹhin itupalẹ yii, ati ni akiyesi awọn akiyesi cyclic ni gbogbo awọn nẹtiwọọki, algorithm atunkọ ti a ṣe imuse ni opo gigun ti Gubbins ni a lo lati ṣe atunto iran ti clonal ati lati ṣe afikun idiyele ti ipa ti atunda lori genome M. bovis. Fi nọmba akopọ ti awọn iṣẹlẹ isọdọtun, pupọ julọ eyiti o waye ni awọn ẹka ebute (iyẹn ni, ni genome kan) (Table 2). Awọn itọkasi wọnyi ṣe afihan aitasera ti gbogbo ṣeto data ati tọka pe igbohunsafẹfẹ ti awọn iṣẹlẹ isọdọtun jẹ awọn akoko 200 si 300 ti awọn iyipada. Ni kete ti paramita rho/theta ti o nsoju awọn oṣuwọn ibatan ti isọdọtun ati awọn iyipada aaye lori ẹka naa han lati wa laarin 0.0037 ati 0.0056 (Table 3). Laipe, iṣẹ ti a tẹjade ti igara 38 M. bovis ṣe afihan iye rho / theta ti o ga julọ (rho / theta = 0.1) ju eyiti o gba ninu iwe data yii, ṣugbọn iṣẹ ti Patané ati awọn ẹlẹgbẹ lo apejọ ti o da lori itọkasi lati ṣe infer awọn paramita atunlo , Apejuwe ilana, nitori ilana apejọ, ti ni nkan ṣe pẹlu awọn iṣẹlẹ isọdọtun ti opo.
Nigbamii ti, paramita r / m duro fun ipin oniruuru ti atunṣe ati ifihan iyipada, ati pe iye apapọ rẹ wa laarin 0.025 ati 0.037, ti o nfihan pe ni akawe pẹlu awọn iyipada, atunṣe ni ipa ti o kere julọ lori iyatọ ti ẹda ti M. bovis (Table 3)). Fun lafiwe ti o gbooro, ọna ti o jọra ni a lo lati ṣe iṣiro paramita r/m fun dataset MTBC ti o ni awọn genomes 23, ti o nfihan iye aropin ti 0.48620, lakoko ti datasetPatané ati awọn ẹlẹgbẹ '38 M. bovis dataset, ṣe afihan iye apapọ Jẹ 0.98. Ninu iwadi akọkọ, nikan meji ninu awọn genomes 23 ti o wa ninu iṣẹ ti M. bovis (M. bovis BCG ati igara itọkasi), nitorina iye ti o gba le jẹ aiṣedeede nitori iṣeduro pupọ ti M. tuberculosis genome. Ninu ijabọ keji, awọn olugbe Mycobacterium bovis ti a ṣe atupale ni a gba pada ni pataki lati Amẹrika ati awọn agbalejo ẹran. Ni ifiwera, ninu ṣeto data wa, awọn ipo agbegbe diẹ sii ati awọn ẹya agbalejo jẹ aṣoju, ati pe awọn genomes ti a ṣe akojọpọ si oriṣiriṣi awọn eka clonal pẹlu oriṣiriṣi awọn abuda jiini olugbe ni a tun lo, nitorinaa ṣaṣeyọri jinlẹ ati imọ Olugbe gbooro. Iyatọ r / m iye apapọ ti a gba pẹlu eto data wa ni ibamu pẹlu imọran pe iwọn ti atunṣe yatọ gidigidi laarin awọn ila ti a yàn si iru-ori taxonomic kanna, nitorina awọn abajade wọnyi fihan pe M. bovis clone complex le ṣe afihan awọn iyatọ atunṣe Ipa naa tun jẹ bi imọran nipasẹ Didelot & Maiden72. Síbẹ̀síbẹ̀, ìmúgbòòrò ìtòlẹ́sẹẹsẹ ìsọfúnni yí ní pàtàkì nípa fífi nọ́mbà tí ó pọ̀ síi ti M. bovis genomes yóò yọ̀ọ̀da fún ṣíṣàlàyé síwájú síi ti kókó yìí. Mejeeji r/m ati rho/theta paramita ṣe afihan iyatọ laarin awọn ẹka, ati pe abajade yii jẹ ibamu pẹlu awọn ijabọ lori awọn eya kokoro-arun miiran72,73.
Lakotan, lati le jẹrisi awọn iṣẹlẹ atunto ti a damọ nipasẹ opo gigun ti epo Gubbins, awọn algorithm oriṣiriṣi mẹfa ni a lo ninu sọfitiwia RDP4 lati ṣe idanwo ni ominira oriṣiriṣi awọn afiwera-pupọ mojuto. Ni kariaye, o kere ju idaji awọn iṣẹlẹ ti a damọ nipasẹ Gubbins ni a fi idi rẹ mulẹ nipasẹ RDP4 (Awọn tabili 4 ati 5). Ti o ba ṣe akiyesi gbogbo eto data, awọn iṣẹlẹ isọdọtun mẹta ni a timo, meji ti o kan awọn apa inu ati ekeji ti o kan genome kan ni ẹka ebute kan, eyiti a ko le yan awọn eka clonal (Awọn tabili 4 ati 5). Idanimọ ti awọn iṣẹlẹ ni awọn ẹka ebute le fihan pe isọdọtun tun wa ni ilọsiwaju ni awọn igara M. bovis ti ode oni tabi abajade ti ko tọ70. Ni agbegbe isọdọtun arosọ yii, isunmọ 20% ti awọn ipo ni awọn nucleotides ti ko ṣe alaye (N), nitorinaa ni ipa lori ifihan agbara atunpo (Eya Afihan 2). Ni afikun, agbegbe yii ni ipa lori jiini rrs, fifi koodu 16S ribosomal RNA ti a nireti lati wa ni ipamọ gaan, nitorinaa ifihan agbara atunkopọ putative yii le jẹ abajade ti awọn aṣiṣe atẹle tabi aiṣedeede. Lẹhinna gbogbo titete genome laarin Mb0003 ati Mycobacterium bovis AF2122/97 ni a ṣe, ati pe aye ti awọn nucleotides ti ko ni alaye ati awọn SNP ti fi idi rẹ mulẹ, nitorinaa awọn iṣoro ti o ṣeeṣe ti o jọmọ titete ti ko tọ kii ṣe nitori alaye ti ẹkọ ti ara ti a ṣe imuse ninu iṣẹ yii Ti o han lẹhin kikọ eto naa.
Ko si awọn ela tabi awọn nucleotides aisọye ti a rii ni awọn agbegbe isọdọtun ti awọn apa inu (Awọn eeya 4 ati 5). Nipa awọn iṣẹlẹ wọnyi, ọkan ni genome Eu2 nikan ati pe o ni ipa lori jiini pks12, eyiti o ṣe koodu ti o ṣeeṣe polyketide synthase; nigba ti ekeji ti wa ni aami ninu Eu1 genome ati ki o ni ipa lori narX pupọ ti o ṣe koodu kan ti ṣee ṣe nitrate reductase (Table 4). Ni gbogbogbo, iṣeduro atunṣe fihan pe nọmba ti o ni opin ti awọn ajẹkù atunṣe wa pẹlu atilẹyin iṣiro, ati awọn itọkasi ti a ṣe afihan ṣe afihan pe atunṣe ni ipa kekere lori ila-ara M. bovis. Ifihan agbara isọdọtun ni a nireti lati jẹ kekere, ṣugbọn o ṣe pataki lati ṣe iyatọ ifihan agbara itankalẹ otitọ lati ariwo ẹhin, eyiti o jẹ iṣẹ-ṣiṣe nija. Lati le dinku ifihan agbara ariwo ti a ṣe nipasẹ apejọ orisun-itọkasi ati awọn iṣoro aiṣedeede 70, 71, gbogbo awọn iyokù ayafi jiini pipe ni a pejọ lati ibere, ati pe a ti ṣayẹwo didara apejọ ati rii daju nipasẹ itupalẹ opo gigun ti QUAST (Tabili afikun 1). Ni afikun, lẹsẹsẹ awọn itupalẹ afikun ni a ṣe lati pese agbara ati deede ti iwadii gbogbogbo. Nitorinaa, didara itọsẹ ti narX ati awọn jiini pks12 ni a ṣe ayẹwo nipasẹ ṣiṣe aworan kika lodi si Mycobacterium bovis AF2122/97. Ipo SNP ti a ṣe iṣeduro ni agbegbe isọdọtun ni a fi idi mulẹ nipa lilo awọn iyasọtọ ti a mẹnuba ni apakan ọna (o kere ju awọn kika 20 ati 0.9 iyipada igbohunsafẹfẹ). Polymorphism ti jiini narX ni a ti fi idi mulẹ ni kikun ninu awọn genomes meji (Mb1792361 ati Mb7240415; 2.3%) ati awọn genomes ti genome pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb17256. Sibẹsibẹ, fun genome Mb2043, mẹfa ninu awọn ipo mẹjọ ko ni ibamu si imọran ijinle kika nitori pe SNP ni atilẹyin nipasẹ iwọn 17 ti o pọju, eyiti o wa ni isalẹ iye gige ti a ti ṣeto ti 20. Nitorina, atunṣe ti awọn genomes mẹfa (8.6%) ni aaye genome yii le jẹ idaniloju (Awọn nọmba 4 ati 5).
Iwoye alaye ti titete agbegbe atunkopọ ti dataset Mycobacterium bovis ni ipa lori jiini narX ti o ṣe koodu koodu iyọkuro ti o ṣeeṣe. Ko si awọn ela tabi awọn nucleotides aisọye ni a rii ni agbegbe isọdọkan ti awọn apa inu. Iṣẹlẹ pataki yii ti forukọsilẹ ni genome Eu1. Didara tito lẹsẹsẹ ti jiini narX ni a ṣe ayẹwo nipasẹ sisọ awọn kika ti Mycobacterium bovis AF2122/97. Jẹrisi ipo SNP ti a ṣe iṣeduro ni agbegbe isọdọtun nipa lilo awọn iyasọtọ ti a mẹnuba ni apakan ọna (o kere ju awọn kika 20 ati 0.9 iyipada igbohunsafẹfẹ). Polymorphism ti jiini narX ti ni idaniloju ni kikun ninu awọn genomes ti Mb1792361 ati Mb7240415 (2.3%).
Iwoye ni kikun ti titete agbegbe atunkopọ ti dataset Mycoplasma bovis ti o kan jiini pks12. Ko si awọn ela tabi awọn nucleotides aisọye ni a rii ni agbegbe isọdọkan ti awọn apa inu. Nipa iṣẹlẹ ti o kan jiini pks12 ti n ṣe koodu ti o ṣeeṣe polyketide synthase, o ni jiini Eu2 nikan. Didara ilana atẹle ti pks12 jẹ iṣiro nipasẹ aworan kika ti Mycobacterium bovis AF2122/97. Jẹrisi ipo SNP ti a ṣe iṣeduro ni agbegbe isọdọtun nipa lilo awọn iyasọtọ ti a mẹnuba ni apakan ọna (o kere ju awọn kika 20 ati 0.9 iyipada igbohunsafẹfẹ). Awọn polymorphisms ti genomes Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, ati Mb1960 ti ni idaniloju ni kikun.
Awọn Jiini PE ati PPE ni awọn agbegbe atunwi ti o rọrun lati ka nipasẹ ilana Illumina ati aiṣedeede, nitorinaa wọn nigbagbogbo paarẹ lati iṣan-iṣẹ bioinformatics ti awọn ọmọ ẹgbẹ iko M. nikan nigbati o nlo ilana ilana-aworan-si-tẹle. Itọkasi ti awọn iṣẹlẹ isọdọtun ti a lo ninu iṣẹ yii da lori apejọ de novo laisi sisẹ PE/PPE. A gbagbọ pe nipa imuse awọn ọna ibaramu oriṣiriṣi mẹta ati awọn algoridimu nipasẹ SplitsTree, opo gigun ti epo Gubbins ati sọfitiwia RDP4, awọn ọgbọn ti a lo ni agbara lati sisẹ ati sisẹ awọn agbegbe ti a tunto ti o fa nipasẹ awọn ami aṣiṣe. Sibẹsibẹ, lati le yọkuro kikọlu ti jiini PE / PPE lori Gubbins ati sọfitiwia RDP4 lati ṣe idanimọ awọn iṣupọ SNP, ati nitorinaa idanimọ ti awọn agbegbe isọdọtun ti o pinnu lati ni ipa lori awọn Jiini narX ati pks12, agbegbe ti awọn Jiini wọnyi ni a ṣe ayẹwo (Eya Afikun. 3-5). Ni M. bovis AF2122/97, jiini narX ti yapa nipasẹ narK2 ati Mb1764c, lakoko ti pks12 wa ni ayika Mb2075c e Mb2073c (Afikun Aworan 3-5). Maapu ti a ṣe ipilẹṣẹ nipa lilo maapu synline MAUVE ti jiini pipe n pese alaye nipa itọju ọna lẹsẹsẹ pupọ ati atunto, ti n ṣafihan awọn bulọọki collinear mẹrin, ati pe ko si awọn ami ti iyipada genome tabi iyipada. Ni afikun, itupalẹ imudara pẹlu ọkọọkan amino acid ṣe afihan homology ni gbogbo awọn genomes pipe, ko si si PE/PPE ti a rii ni awọn agbegbe ti o wa nitosi ti narX tabi pks12. Fun narX, genome kan (Mb0030) ni Dimegilio bakannaa kekere nitori jiini narX jẹ idamọ bi awọn ajẹkù meji (awọn ajẹkù 1891 ati 1890). Fun pks12, nitori awọn ibajọra, Mb0030 ati Mb003 ṣe afihan awọn ikun synlinearity kekere, lakoko ti a ṣe idanimọ pks12 ni awọn ajẹkù meji ati mẹta, ni atele, ti o nsoju awọn agbegbe oriṣiriṣi ti amuaradagba (Afikun Aworan 3-5). Ti o ba ṣe akiyesi alaye yii, ati Gubbins ati RDP4 sọfitiwia ṣe itupalẹ mejeeji, ṣayẹwo titete ọpọ mojuto ti 500 BP ti o pọju ninu window, a jẹrisi pe pupọ PE/PPE kii yoo dabaru pẹlu ifihan atunda ti o ni ipa lori narX ati pks12.
Botilẹjẹpe awọn ifihan agbara isọdọtun ti a rii ni eto data yii le jẹ pe o ku, o jẹ otitọ pe atunda ni M. bovis ko le ṣe ilana, nitorinaa o yẹ ki o tẹsiwaju lati jẹ koko-ọrọ ti itupalẹ siwaju, ninu eyiti gbogbo awọn genomes lati oriṣiriṣi awọn oju iṣẹlẹ ajakale-arun ti wa ni lẹsẹsẹ si Pataki.
Ifiwera awọn igi phylogenetic ML ti o gba ṣaaju ati lẹhin atunṣe atunṣe (Figure 2A, B) ko yorisi awọn ayipada pataki ninu ibatan phylogenetic inferred, ati awọn igara M. bovis ti wa ni akojọpọ ni ẹgbẹ kanna.
Lẹhin ti aworan agbaye 42 tuntun ti a tẹle M. bovis ka pẹlu jiini itọkasi ti M. bovis AF2122/97, titete SNP kan ti o ni awọn ipo polymorphic 1816 ti gba. Pupọ julọ awọn SNPs (87.1%) wa ni agbegbe ifaminsi, ati awọn jiini ti o kan ni a ṣe afihan ni ibamu si awọn ẹka iṣẹ ti o han ni Bovilist (Figure 6A, B). Ti o ṣe akiyesi nọmba lapapọ ti awọn Jiini ni ẹka iṣẹ-ṣiṣe kọọkan, awọn Jiini ti o wa ninu ẹka "iṣelọpọ-ara-ara" fihan diẹ sii awọn SNPs, ti o tẹle "ogiri sẹẹli ati awọn ilana sẹẹli" ati "iṣelọpọ agbedemeji ati isunmi", ti o fi han pe wọn wa ninu itankalẹ M. bovis.
Iṣalaye iṣalaye ti dataset M. bovis lati Ilu Pọtugali (n = 42). Nọmba apapọ ti awọn SNP ti o forukọsilẹ ati awọn Jiini ti o kan fun ẹka iṣẹ kọọkan (A). Nọmba apapọ ti awọn iyipada bakanna ati ti kii ṣe ibaramu ti a forukọsilẹ nipasẹ ẹka iṣẹ (B).
Ni iwọn agbaye kan, apapọ dN/dS ratio dara ju 1.5, eyiti o tọka si pe titẹ itankalẹ agbaye ni lati yọkuro kuro ni ipo baba ati ṣe aṣoju rere (diversial tabi itọsọna) ati/tabi oju iṣẹlẹ isọdọtun isinmi. Ni awọn ẹka ti "virulence, detoxification, adaptation", "fi sii awọn ilana ati awọn phages", ati "awọn ọlọjẹ ilana", diẹ sii ju meji-meta ti awọn SNP ti kii ṣe alaimọ (Nọmba 6B).
Ni gbogbo awọn ẹka, awọn Jiini wa pẹlu ọpọlọpọ awọn SNPs, ti o mu ki iwọn iyipada apapọ (eyini ni, apapọ SNP fun pupọ) tobi ju 1 (Figure 6A). Pks12 (Mb2074c) pẹlu 15 SNPs ati fas (Mb2553c) pẹlu 8 SNP ni awọn iye iyipada ti o ga julọ. Mejeji ti awọn Jiini wọnyi ni ipa ninu iṣelọpọ ti acid fatty. Jiini pks n ṣe koodu si polyketide synthase (PKS), eyiti o jẹ enzymu multifunctional ti o ni ipa ninu biosynthesis ogiri cell mycobacterial ogiri74,75. Jiini yii ṣe koodu polypeptide multifunctional ti o ni ipa ninu iṣelọpọ ti mycoketides74,76. Jiini fas ni ipa ninu iṣelọpọ ti mycolic acid. Mejeji ti awọn Jiini wọnyi ṣe ipa pataki ninu biosynthesis ti ogiri sẹẹli ni olubasọrọ pẹlu agbalejo naa.
Lati le ṣe iwadi siwaju sii nipa itankalẹ ti Mycobacterium bovis, awọn ipilẹ meji ti awọn jiini pato ni a ṣe atupale. Awọn iṣẹ ti a tẹjade ni iṣaaju nipa lilo akopọ lẹsẹsẹ ati awọn ọna phylogenetic ti ṣe idanimọ awọn jiini ti o gba nipasẹ awọn baba MTBC nipasẹ HGT ṣaaju isọdi37,38. Awọn Jiini wọnyi ti wa ni akojọ si ni Afikun Table 2. Pipin SNP lapapọ ti awọn jiini 77 ti o le ni ibatan si HGT ni a ṣe atupale, ati pe awọn aaye polymorphic 26 ni a mọ, eyiti ni ọpọlọpọ awọn ọran (78%) yorisi awọn iyipada ti kii ṣe ibaramu (NS) (Tabili Iyọkuro 2). Iṣẹ iṣaaju lori jiometirika MTBC ṣe afihan pe agbegbe HGT putative ṣe afihan ipin NS SNP ti o ga julọ ni akawe si iyoku ti jiini. Ti ẹnikan ba ro pe awọn agbegbe isọdọtun wọnyi ni o gba nipasẹ awọn baba MTBC, ati nitorinaa, wọn ṣe afihan awọn polymorphisms atijọ, lẹhinna ipin ti awọn ayipada isọdọkan ni a nireti lati ga julọ, nitori awọn aropo NS ni a nireti lati yọkuro nipasẹ yiyan odi nitori awọn iyipada amino acid Le yi iṣẹ amuaradagba pada. Nitorinaa, awọn abajade wa tọka pe awọn abajade iṣẹ ṣiṣe le jẹ lati rirọpo ti awọn Jiini ti o dabi HGT, eyiti o ṣe afihan pataki wọn fun oniruuru jiini adaṣe adaṣe.
Ni afiwe pẹlu itupalẹ yii, awọn Jiini ti n ṣe koodu awọn paati ti eto 3R (atunṣe DNA, ẹda, ati atundapọ) ni a ṣe ayẹwo daradara ni ibamu pẹlu atokọ ti a gbejade tẹlẹ nipasẹ dos Vultos ati awọn alabaṣiṣẹpọ (2008) 39. Paṣipaarọ awọn ajẹkù DNA ti o jọra ko le ṣe akiyesi taara, botilẹjẹpe o le jẹ ilana loorekoore nigbati awọn kokoro arun ti o ni ibatan ni pẹkipẹki, gẹgẹbi ninu ọran ti ṣeto data yii; ni afikun, ilana yii le jẹ bọtini si awọn ọna atunṣe DNA72, nitorina Mu ipa kan ninu isọdọkan isokan. Lapapọ awọn ipo polymorphic 26 ti a pin nipasẹ awọn jiini 54 ni a damọ (Tbili Afikun 3). Ninu akojọpọ awọn Jiini, awọn iyipada NS ṣe iṣiro nipa 65% ti awọn abajade, eyiti o ni ibamu pẹlu awọn ijabọ iṣaaju lori awọn igara iko-ara Mycobacterium.
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹwa-21-2021