Diolch am ymweld â Nature. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth gyfyngedig ar gyfer CSS. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio fersiwn newydd o'r porwr (neu'n diffodd y modd cydnawsedd yn Internet Explorer). Ar yr un pryd, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn arddangos safleoedd heb arddulliau a JavaScript.
Mae dilyniannu genom wedi adfywio maes ymchwil clefydau heintus, gan ddatgelu epidemioleg clefydau, pathogenesis, rhyngweithiadau gwesteiwr-pathogen, a'r broses esblygiadol a orfodir ar bathogenau. Mae'r cyfadeilad Mycobacterium tuberculosis (MTBC) yn ystyried Mycobacterium bovis yn un o'i aelodau addasol anifeiliaid sy'n achosi twbercwlosis (TB) mewn mamaliaid daearol, ac mae'n fodel nodweddiadol o esblygiad bacteriol. Fel aelodau MTBC eraill, tybir bod Mycobacterium bovis yn bathogen wedi'i glonio'n llym, sy'n esblygu'n araf, ac yn amlwg nid oes unrhyw arwydd o ailgyfuno na throsglwyddo genynnau llorweddol. Yn y gwaith hwn, rydym yn cymhwyso genomeg gymharol i set ddata dilyniant genom cyfan (WGS) sy'n cynnwys 70 o wartheg M. o wahanol linachau (Ewrop ac Affrica) i gael cipolwg ar amrywiaeth genetig gwartheg M. Pŵer esblygiadol. Defnyddir tri dull gwahanol i amcangyfrif arwyddion ad-drefnu. Yn fyd-eang, mae nifer fach o ddigwyddiadau ailgyfuno wedi'u nodi a'u cadarnhau gan ddau ddull annibynnol gyda chefnogaeth gadarn. Serch hynny, o'i gymharu â mwtaniadau, mae gan ailgyfuno effaith wannach ar amrywiaeth M. bovis (r/m cyffredinol = 0.037). Mae'r gwahaniaeth cyfartaledd r/m a gafwyd yng nghyfadeilad clonal Mycobacterium bovis yn ein set ddata yn gyson â'r cysyniad cyffredinol y gall graddfa'r ailgyfuno amrywio'n fawr rhwng y llinachau a neilltuwyd i'r un rhywogaeth dacsonomig. Yn seiliedig ar y gwaith hwn, ni ellir diystyru ailgyfuno yn Mycobacterium bovis, felly dylai fod yn destun ymdrechion pellach mewn ymchwil genomig gymharol yn y dyfodol, lle mae WGS o setiau data mawr o wahanol senarios epidemiolegol ledled y byd yn hanfodol. Yna perfformiwyd dadansoddiad ychwanegol ar y set ddata Mycobacterium bovis lai (n = 42) o gyffredinolrwydd TB aml-letywr, a nodwyd mwy na 1,800 o loci, ac roedd o leiaf un straen yn dangos polymorffedd niwcleotid sengl (SNP). Mae'r rhan fwyaf (87.1%) wedi'u lleoli yn y rhanbarth codio, ac mae'r gymhareb fyd-eang o newidiadau anghyson (dN/dS) o newidiadau cyfystyr yn fwy na 1.5, sy'n dangos bod detholiad cadarnhaol yn rym esblygiadol pwysig a roddir ar M. bovis. Canfuwyd cyfran uwch o SNPs mewn genynnau sy'n gyfoethog mewn categorïau swyddogaethol o "metaboledd lipid", "wal celloedd a phrosesau cellog", a "metaboledd canolradd ac anadlu", gan ddatgelu eu potensial ym mhwysigrwydd bioleg ac esblygiad Mycobacterium bovis. Mae golwg agosach ar y genynnau yn hynafiaid MTBC sy'n dueddol o drosglwyddo genynnau llorweddol ac sydd wedi'u cynnwys yn y system 3R (atgyweirio DNA, dyblygu ac ailgyfuno) yn datgelu gwerth negyddol cyfartalog byd-eang prawf niwtral D Taijima, sy'n dangos sganio dethol yn y gorffennol. Y tagfa ddiweddar ar ôl ehangu'r boblogaeth yw'r prif ffactor gyrru esblygiadol o hyd i'r pathogen gorfodol Mycobacterium bovis ymladd y gwesteiwr.
Mae cyfadeilad Mycobacterium twbercwlosis (MTBC) yn un o'r tacsonau mwyaf llwyddiannus o bathogenau bacteriol ac yn achos nodweddiadol o esblygiad bacteriol. Mae ei aelodau'n dangos hunaniaeth niwcleotid o uchel yn syndod ar y lefel genomig (> 99%)1,2. Gall gwahanol ecoteipiau MTBC achosi twbercwlosis (TB), sy'n glefyd granulomatous heintus, mewn ystod eang o rywogaethau gwesteiwr o ficro-famaliaid i fodau dynol3,4,5. Ar hyn o bryd, mae'r cyfadeilad yn cynnwys bodau dynol [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] a phathogenau sydd wedi'u haddasu i anifeiliaid (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" a "dassie")5,6. M. canettii (a elwir hefyd yn "Nodobacter glabrata") Mae'r hunaniaeth niwcleotid gyfartalog gyda'r mycobacteria uchod yn 98%, ac mae gwaith genomig cymharol wedi dangos bod M. canettii a gweddill MTBC wedi gwahanu'n ddiweddar oddi wrth yr hynafiad cyffredin.7 O ystyried y cysyniad hwn, mae rhai awduron yn galw M. canettii yn Aelod o MTBC 8.
Disgrifir MTBC yn systematig fel cymhleth clonal llym, ac mae ei strwythur poblogaeth yn cael ei lywodraethu'n glir gan amrywiaeth lai, tagfeydd, sganio dethol, a drifft genetig9,10. Gan dybio na ellir adfer esblygiad clonal llym cymhleth, fel polymorffismau coll trwy ailgyfuno. Yn seiliedig ar y rhagdybiaeth hon, cynigiwyd digwyddiadau olynol dileu genomig y rhanbarth gwahaniaethol (RD) a TbD1 (rhanbarth dileu penodol Mtb 1) fel marcwyr moleciwlaidd o esblygiad MTBC2,5,11. Mae gwaith genomig cymharol a dilyniannu genom cyfan (WGS) yn cefnogi rhannu aelodau sydd wedi'u haddasu i fodau dynol yn naw llinach (Mycobacterium tuberculosis L1 i L4, L7, ac L8; a Mycobacterium africanum L5, L6, ac L9), rhannodd llinachau L2 i L4 ranbarth dileu TbD12,11,12,13. Yn ogystal, cynigir bod aelodau sydd wedi addasu i anifeiliaid yn rhannu hynafiad cyffredin, a ddiffinnir gan ddileuadau penodol i'r clade yn RD7, RD8, RD9 ac RD102, 5, a 14.
Ystyrir bod digwyddiadau trosglwyddo genynnau llorweddol (HGT) ac ailgyfuno yn brin ac yn digwydd yn hynafiaid MTBC, yn hytrach na hanes gwahanol aelod cyfan MTBC15,16,17. Awgrymodd dau adroddiad cynnar gan Hughes a chydweithwyr (2002) a Gutacker a chydweithwyr (2006) y gallai digwyddiadau ailgyfuno helpu i lunio polymorffismau sy'n nodi loci penodol mewn straenau M. tuberculosis18,19. Y rhesymau dros y diffyg amlwg o ailgyfuno yn MTBC yw: (1) y broses fecanyddol a cholli gallu HGT; (2) prinder digwyddiadau HGT; (3) nid oes unrhyw siawns o ddigwyddiadau ailgyfuno yn y gilfach MTBC14,17. Yn ddiweddar, mae rhai astudiaethau dilyniannu genom cyfan (WGS) a gymhwyswyd i straen MTBC 20 a Mycobacterium bovis 21 wedi darparu tystiolaeth o ailgyfuno, y cyntaf i ddangos bod straenau MTBC yn aml yn cyfnewid darnau DNA bach, ond oherwydd amrywiad dilyniant niwcleotid cyfyngedig, nid yw'r digwyddiadau hyn yn dal i gael eu sylwi.
Mycobacterium bovis yw'r aelod MTBC a adferir amlaf o dda byw (gwartheg yn bennaf), er y gellir ei ynysu hefyd o anifeiliaid gwyllt maes a rhai wedi'u ffensio4,22,23,24. Esblygodd M. bovis i bum cymhlyg clonal mawr [Ewropeaidd 1 (Eu1), Ewropeaidd 2 (Eu2), Ewropeaidd 3 (Eu3), Affricanaidd 1 (Af1) ac Affrica 2 (Af2)], yn ôl y proffil spoligoteipio, dileuadau penodol A pholymorffismau niwcleotid sengl (SNPs) 25, 26, 27, 28, 29 mewn genynnau penodol. Mae'r cymhlygion clonal hyn yn dangos strwythur amrywiol poblogaeth Mycobacterium bovis a'i chysylltiad â rhanbarthau daearyddol. Yn ogystal, dyluniodd y gwaith WGS diweddar a gynhaliwyd gan Zimpel a chydweithwyr (2020) ffylogeni yn seiliedig ar SNP Mycobacterium bovis, gyda mwy na 1,900 o genomau, sy'n dangos bod o leiaf bedwar llinach wahanol (o'r enw Lb1 i Lb1 i Lb4), nid ydynt yn gwbl gyson â'r cymhleth clonal a ddiffiniwyd yn flaenorol, er y gellir cadarnhau manylder daearyddol hefyd30. Cynhaliodd yr awduron hyn ddadansoddiad gwahaniaethol o ffylogeni a dyddio moleciwlaidd, ond ni wnaethant astudio ailgyfuno30.
Datgelodd gwaith blaenorol gan ddefnyddio gwahanol dechnegau moleciwlaidd, megis spoligoteipio, MIRU-VNTR (nifer ailadrodd tandem newidyn uned ailadrodd rhyngblethedig mycobacterial), a theipio SNP diweddar lefel benodol o amrywiaeth genetig ymhlith straenau M. bovis 31,32,33, 34,35. Mae gwahaniaethu amrywiad genetig wedi dod yn offeryn pwysig wrth astudio epidemioleg clefydau, sy'n ddefnyddiol ar gyfer dealltwriaeth fanwl o bathogenesis, firwleiddiad a throsglwyddo clefydau. Mae ymddangosiad y dull WGS yn rhoi'r posibilrwydd i ddatgelu'r ffactorau gyrru esblygiadol a orfodir gan genom Mycobacterium bovis yn y broses o addasu a pharhau i wahanol westeiwyr a senarios epidemiolegol.
Yn y gwaith hwn, rydym yn defnyddio dadansoddiad genomig cymharol ar wahanol setiau data Mycoplasma bovis (n=70), gan gynnwys ynysyddion o wahanol gymhlethdodau clonal, i gael cipolwg ar broses esblygiadol Mycoplasma bovis, yn enwedig i ddatrys perthnasoedd ffylogenetig a digwyddiadau ailgyfuno. Fel atodiad i'r dadansoddiad hwn, archwiliwyd ymhellach is-set ddata o ynysyddion M. bovis (n = 42) a gafwyd o ardal twbercwlosis aml-letywr a nodweddwyd yn dda ym Mhortiwgal 31,36 i gasglu diffyg hunaniaeth. Y cydbwysedd rhwng y gymhareb gymharol o amnewidiadau niwcleotid synnwyr (dN) i gyfystyr (dS), yn ogystal â chyfraniad esblygiadol genomau penodol a grybwyllir yn y llenyddiaeth, maent yn 37,38 a gafwyd gan hynafiaid MTBC trwy HGT, ac yn amgodio cydrannau genynnau system 3R (atgyweirio, dyblygu ac ailgyfuno DNA) 39. Dewiswch enynnau a gafwyd trwy HGT oherwydd gallant gynrychioli polymorffismau hynafol, felly disgwylir y gallant gynnwys cyfran uwch o newidiadau cyfystyr. Dewiswyd y genynnau a oedd wedi'u cynnwys yn y system 3R oherwydd bod gwaith blaenorol ar straenau M. tuberculosis wedi dangos detholiadau negyddol/puro cyffredinol sy'n gweithio ar y genynnau hyn, a gallant chwarae rhan bwysig yn esblygiad 39. Nod arall i'r gwaith hwn yw casglu bodolaeth digwyddiadau ad-drefnu. Am y rheswm hwn, o ystyried mai dim ond genom cymhlyg clôn Ewropeaidd 2 a'r straenau nad ydynt wedi aseinio'r cymhlyg clôn sydd yn ein set ddata o Bortiwgal, penderfynon ni gynnwys data genom sydd ar gael i'r cyhoedd i gael cynrychiolaeth o'r holl gymhlygion clôn o'r diwedd, a Gwella cadernid a lled y canlyniadau.
Mae 42 genom Mycoplasma bovis wedi'u dilyniannu'n ddiweddar o olygfa twbercwlosis aml-letywr endemig Portiwgal (manylion isod), a nodweddwyd yn flaenorol o safbwynt epidemiolegol36, yn ganolbwynt i'r gwaith hwn. O ystyried mai dim ond cynrychiolwyr o'r 2 gymhlyg clôn Ewropeaidd a straeniau heb gymhlygion dynodedig sydd gan y set ddata o Bortiwgal, ychwanegwyd data dilyniannu genom cyfan sydd ar gael yn gyhoeddus i ehangu'r set ddata sy'n cynnwys holl gynrychiolwyr y cymhlygion clôn M. bovis. Felly, defnyddiwyd tair ffynhonnell data dilyniannu genom cyfan yn y gwaith hwn: cydosod genom cyflawn/drafft, hyd at 10 sgaffald wedi'u storio yn NCBI (Canolfan Genedlaethol ar gyfer Gwybodaeth Biotechnoleg) (n = 15 ynysol); wedi'i storio yn SRA (ffail Illumina fastq o'r archif darllen dilyniant) yn cynrychioli amrywiaeth gymhleth clonau M. bovis (n = 12 ynysol)30; a 42 genom wedi'u dilyniannu'n ddiweddar o Bortiwgal. Cafodd Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ei eithrio o chwiliad NCBI. Defnyddir M. bovis AF2122/97 fel arfer fel genom cyfeirio i'w gynnwys yn y set ddata. Oherwydd nad yw dilyniant cyfan y genom a gynrychiolir gan y cymhlyg clonio Affricanaidd 1 ar gael i'r cyhoedd, a'r nifer fach o genomau o straenau cynrychioliadol o Af2 ac Eu1, defnyddiwyd y data dilyniannu gwreiddiol a ddarparwyd gan SRA yn yr achosion hyn. Helpodd gwaith Zimpel a'i gydweithwyr (2020) i adnabod y genom o'r cymhlyg clonio uchod a helpodd i ddewis Mycobacterium bovis i'w gynnwys yn y set ddata. Ar gyfer Eu3, dim ond un math o genom a ddisgrifir (Branger et al., 2020), felly mae'r genom rydyn ni'n ei gynnwys yn gynrychiolydd ar wahân o'r cymhlyg Eu3.
Yn fyd-eang, mae'r set ddata hon yn cynnwys 70 o wartheg M. bovis wedi'u hynysu o 8 rhywogaeth letyol, wedi'u dosbarthu mewn 12 gwlad o 1985 i 2016. Mae 36 rhywogaeth wedi'u dynodi fel Eu2, 7 rhywogaeth yw Eu1, 1 rhywogaeth yw Eu3, 3 rhywogaeth yw Af1, 4 rhywogaeth yw Af2 ac nid yw 19 yn briodol i unrhyw gymhleth clonal (manylion isod). Dangosir y wybodaeth fanwl (gan gynnwys y rhif derbyn) am Mycobacterium bovis a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn Nhabl 1 a Thabl Atodol 1.
Mae 42 genom cyfan newydd eu dilyniannu o Mycobacterium bovis o fannau problemus twbercwlosis anifeiliaid Portiwgal ac wedi'u dosbarthu ers dros 12 mlynedd yn ganolbwynt i'r astudiaeth hon, gan fod systemau clefydau bywyd gwyllt-da byw posibl wedi'u monitro'n rheolaidd 31,36 (Ffig. Atodol 1). Yn ôl gweithdrefnau dilynol, ynyswyd y straeniau hyn o wartheg (n = 14), ceirw coch (n = 16) a baedd gwyllt (n = 12) o 2003 i 2015: casglwch a thrinwch anifeiliaid yn unol â'r canllawiau protocol a argymhellir. Mae'r samplau meinwe yn Llawlyfr Anifeiliaid Daearol yr OIE ac maent wedi'u brechu ar gyfrwng solet a chyfrwng hylif pyruvate Stonebrink a Löwenstein-Jensen. Caiff y diwylliannau eu deori ar 37 °C a chaiff twf ei wirio unwaith yr wythnos am o leiaf 12 wythnos. Caiff y cytrefi eu storio'n uniongyrchol mewn toddiant glyserol ar -80ºC. Yn y cyfrwng dethol Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), pasiwyd y samplau gwreiddiol a archifwyd trwy un darn in vitro in vitro i gael DNA'r rhaglen WGS. Ar gyfer hyn, cyfoethogwyd yr hydoddiant stoc diwylliant wedi'i rewi â 5% sodiwm pyruvat a 10% ADS (50 g albwmin, 20 g glwcos, 8.5 g sodiwm clorid mewn 1 L o ddŵr) ar Middlebrook 7H9 ar 37°C Retrain. Ar ôl 4 wythnos o dwf, adnewyddwyd y cyfrwng a monitrwyd y diwylliant yn rheolaidd nes bod twf i'w weld. Casglwyd y celloedd trwy allgyrchu, ailataliwyd y belen mewn 500 µL o halwynog ffosffad wedi'i glustogi (PBS), ei gynhesu ar 99 °C am 30 munud, ei allgyrchu, a storiwyd yr uwchnofant ar -20 °C tan WGS. Cynhelir yr holl weithdrefnau mewn cyfleusterau bioddiogelwch lefel 3.
Mae llyfrgell genom pen-paru WGS yn cael ei pharatoi gan ddefnyddio mynegai unigryw pob sampl DNA, ac mae'n defnyddio technoleg Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 sampl) a HiSeq (2 × 150 pb) (dau ynysiad) (Eurofins Genomics, yr Almaen) ar gyfer dilyniannu. Yn ôl cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, defnyddiwch yr Illumina Genome Analyzer gydag atodiad modiwl pen-dwbl i ddilyniannu'r DNA genomig, a defnyddiwch y Nextera XT DNA Library Prep Kit gan Illumina i adeiladu'r llyfrgell.
Gan ystyried y data a adferwyd o'r SRA (n = 12), gellir defnyddio adnabod y cymhlyg clôn fel metadata'r cyhoeddiad cyfatebol 30, 41, 43. Wrth ystyried y genom cyflawn, ac eithrio Mycobacterium bovis AF2122/97 a Mycobacterium bovis 3601, sy'n aelodau cydnabyddedig o'r cymhlyg clonal Eu1 ac Eu3 25, 29, yn y drefn honno, mae'r un fath â genom cyflawn Mycobacterium tuberculosis H37Rv (rhif mynediad NCBI NC_000962.3). Perfformir aliniad genom gan ddefnyddio MAFFT (rhaglen aliniad lluosog o ddilyniant asid amino neu niwcleotid, fersiwn 7.458) a pharamedr -addfragments48. Yna, chwiliwch am absenoldeb cymhlygion clonal gwahanol a/neu bresenoldeb nodweddion SNP.
Mae'r Mycobacterium bovis sydd newydd ei ddilyniannu (n = 42) a'r darlleniadau gwreiddiol o'r drafft genom a gasglwyd (n = 3) yn alinio'r cymhlyg â'r genom cyfeirio Mycobacterium tuberculosis H37Rv trwy'r biblinell vSNP a phresenoldeb nodweddion dileu a/neu SNP gwahanol gloniau. Cynhaliwyd chwiliad.
Casglwch wybodaeth o ddiffyg nodweddion a/neu bresenoldeb/absenoldeb SNP a phroffiliau spoligoteipio i aseinio data genomig i'r cymhlyg clonal cyfatebol. Ar gyfer y pedwar cynulliad drafft, ni ellir casglu'r proffil spoligoteipio, felly maent wedi'u cynnwys yn y grŵp "dim cymhlethdod".
Mae'r llif gwaith biowybodeg a ddilynir gan y gwaith hwn yn dechrau o gydosod de novo a mapio i strategaeth gyfeirio, gyda'r nod o archwilio digwyddiadau ailgyfuno a pholymorffismau genom penodol. Mae Ffigur 1 yn darparu siart llif o'r camau a ddilynir. Ar gyfer dadansoddi ailgyfuno, defnyddir yr holl genomau i gynyddu cadernid casgliadau a dangosyddion cysylltiedig.
Er mwyn lleihau gwallau wrth gynhyrchu dilyniannau consensws genom, fe wnaethom ni gael cydosod de novo yn gyntaf, ac yna cael aliniadau lluosog craidd. Mae piblinell Unicycler ar gael ar hyn o bryd yn https://github.com/rrwick/Unicycler49 ac fe'i defnyddir i gynnal cydosod de novo o 54 o genomau wedi'u dilyniannu (42 wedi'u dilyniannu'n ddiweddar a 12 ffeil fastq wedi'u hadfer o SRA). Yn gryno, cyn cydosod o'r dechrau, perfformiwyd dadansoddiad ansawdd darllen yn FastQC fersiwn 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), a Trimmomatic fersiwn 0.36 (mae'r opsiwn "torri Addaswyr a dilyniannau penodol i oleuadau eraill o ddarlleniadau" a "Torri basau o ddiwedd y darlleniad, os yw'n is na'r ansawdd trothwy o 20" yn cael eu cymhwyso) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Yna, defnyddiwyd SPAdes optimizer49 ar gyfer cydosod genom, a defnyddiwyd Pilon fersiwn 1.1851 ar gyfer optimeiddio ôl-gydosod. Dewiswyd modd pontio ceidwadol i osgoi cydosod anghywir, a chwiliwyd am faint y k-mer a'i ddewis rhwng 20% a 95% o hyd y darlleniad. Dilynwch ganllawiau SPAdes ac ystyriwch faint y darlleniad, dileu contigs sy'n llai na 300 bp, a sefydlu terfyn gorchudd dyfnder o 20 darlleniad o 52. Yn y strategaeth gydosod de novo, ni thynnwyd rhanbarthau genomig fel y paralogau prolin-glwtamad (PE) a prolin-prolin glwtamad (PPE) ailadroddus iawn.
Asesir ansawdd y cynulliad de novo drwy'r biblinell QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), sy'n hwyluso adnewyddu'r contig a Mapio genom cyfeirio M. bovis AF2122/97 (rhif mynediad NCBI LT708304.1) (gweler Tabl Atodol 1 am baramedrau ansawdd).
Gyda chymorth y biblinell vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), mae ffeil FASTQ yr M. bovis sydd newydd ei ddilyniannu o ddilyniannu Illumina yn cael ei chymharu â genom cyfeirio M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Yn ôl argymhellion arfer gorau'r Pecyn Cymorth Dadansoddi Genome (GATK) 53, 54, 55, cymhwyswch baramedrau hidlo safonol neu sgoriau màs amrywiadol ar gyfer ail-raddnodi. Mae'r canlyniadau'n cael eu hidlo gan ddefnyddio'r sgôr màs SAMtools isaf o 150 ac AC = 2. Defnyddiwch Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) hefyd i wirio'r darlleniadau i ddiystyru halogiad. Mae'r biblinell vSNP a ddefnyddir i fapio i strategaethau dilyniannu yn ein gwaith yn archwilio cyfres o SNPs a thargedau wedi'u diffinio, ac mae hefyd yn eithrio senarios haint cymysg. Mae'r cwmpas genom darllen yn well na 99% (Tabl Atodol 1).
Er mwyn osgoi gwallau mapio ac SNPs anghywir, hidlwch amrywiad allan yn yr achosion canlynol: (1) mae'n cael ei gefnogi gan lai nag 20 o ddarlleniadau, (2) mae'n cael ei ganfod gydag amlder o lai na 0.9, (3) mae mewn o leiaf un Strain, ond o leiaf mae bylchau mewn straen arall. Defnyddiwyd y gwyliwr genomig integredig (IGV) fersiwn 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 i wirio SNPs a safleoedd yn weledol gyda phroblemau mapio neu aliniad. Gan fod y genynnau proline-glwtamad (PE) a proline-proline glwtamad (PPE) wedi'u dyblygu'n fawr ac yn rhan o deulu aml-genyn, maent yn hawdd eu camddeall gan ddilyniannu a chamfapio Illumina, felly maent yn cael eu ffafrio. Tynnodd llif gwaith biowybodeg mycobacteriaidd aelodau o'r cyfadeilad twbercwlosis wrth ddefnyddio'r strategaeth o fapio i ddilyniannu i gadarnhau SNPs. Felly, fe wnaethom hidlo genynnau ac indels PE/PPE o'r dadansoddiad.
Yn ôl Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), mae pob SNP wedi'i rannu'n gategorïau swyddogaethol. Defnyddir y biblinell SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) i gasglu canlyniadau SNP (newidiadau cyfystyr neu anghystyr). Crëwyd cronfa ddata newydd o genom Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Perfformiwyd yr aliniad lluosog genom craidd gan ddefnyddio Parsnp v1.2, sydd ar gael ar hyn o bryd yn https://github.com/marbl/parsnp57, gan ddefnyddio 69 o gydosodiadau genom/drafft cyflawn (gyda'r opsiwn -c) a defnyddir M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) fel cyfeirnod. Perfformiwyd pedwar aliniad lluosog craidd: dim ond aelodau'r cymhlyg clonio Eu2 (n = 37), gan gynnwys holl aelodau'r cymhlyg clonio Ewropeaidd (n = 44), gan gynnwys pwynt cyffordd y cymhlyg clonio Ewropeaidd ac Affricanaidd (n = 51), a chynnwys yr holl Mycobacterium bovis yn yr astudiaeth hon (n = 70).
Defnyddir yr aliniad craidd a gynhyrchir gan Parsnp i gasglu'r goeden ffylogenetig tebygolrwydd mwyaf (ML) gan ddefnyddio CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 gan ddefnyddio RAxML, a pherfformio 1000 o atgynhyrchiadau dan arweiniad.
Defnyddir tri algorithm ac offeryn biowybodeg gwahanol i wirio am bresenoldeb digwyddiadau ailgyfuno ochr yn ochr: meddalwedd SplitsTree4, piblinell Gubbins (llinach ddiduedd trwy ailgyfuno mewn dilyniannau niwcleotid), a meddalwedd RDP4 (rhaglen canfod ailgyfuno, fersiwn beta 4.101).
Defnyddir y dull dadelfennu hollti a weithredwyd yn SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 i gyfrifo'r rhwydwaith ffylogenetig di-wreiddiau, gan ddefnyddio prawf Phi ar gyfer gwirio ystadegol, a'r trothwy arwyddocâd yw p = 0.05. Defnyddir dadansoddiad aml-aliniad craidd Parsnp fel mewnbwn, a gwireddir y dadelfennu hollti fel safon rhwydwaith.
Mae piblinell Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) yn rhedeg gyda pharamedrau diofyn fel ffordd arall o werthuso effaith ailgyfuno ar Mycobacterium bovis. Mae'r algorithm a weithredir yn y biblinell yn ail-greu'r llinach clôn berthnasol Mae genom/drafft cyflawn ein set ddata a'r genom cyfeirio (buchol AF2122/97, LT708304.1) yn gydfuddiannol; ac yn sganio safle'r SNP ar bob cangen o'r goeden i ganfod y clwstwr SNP sy'n cynrychioli'r digwyddiad ailgyfuno. Sero'r gangen Tybiwch nad oes digwyddiad ailgyfuno, sy'n golygu y dylai'r SNPs sy'n digwydd ar y gangen gael eu dosbarthu'n gyfartal. Defnyddir yr aliniad lluosog craidd o Parsnp a'r goeden ML â'r sgôr orau o RAxML fel ffeiliau mewnbwn.
Yn olaf, er mwyn cadarnhau'r digwyddiad ad-drefnu a awgrymwyd gan biblinell Gubbins, mae'r chwe algorithm a weithredwyd yn RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 a SiScan66) yn cael eu cymhwyso i aliniad lluosog craidd Parsnp o dan osodiadau diofyn. Penderfynon ni fod yn rhaid i o leiaf dri o'r algorithmau a weithredwyd yn RDP4 ddangos signal pwysig yn gyson i wirio pob digwyddiad ailgyfuno.
O ystyried bod meddalwedd Gubbins ac RDP ill dau yn chwilio am signalau ailgyfuno trwy wirio'r aliniadau lluosog craidd mewn ffenestr hyd at 500 bp, a chadarnhau na fydd cynnwys genynnau PE/PPE yn ystod cydosod de novo yn ymyrryd â'r signalau ailgyfuno a geir, gwneir dadansoddiad pellach trwy wirio homolinerwydd cyfagosrwydd y genyn sy'n nodi'r digwyddiad ailgyfuno. Adeiladwyd y map synlinear gan ddefnyddio'r genom cyflawn gan ddefnyddio aliniad MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) i eithrio trawsleoliadau neu wrthdroadau genom lleol. Yn ogystal, defnyddiwyd y genom cyfan i gynnal dadansoddiad homolinerwydd ar y dilyniant asid amino trwy'r gweinydd gwe SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Dadansoddiad mwy manwl o'r set ddata genom a gafwyd o system twbercwlosis aml-letywr Portiwgal yw gwirio polymorffedd y genynnau a grybwyllir yn y llenyddiaeth. Y genynnau hyn yw 37,38 a'r genyn sy'n amgodio 3R a gafwyd gan yr hynafiaid MTBC trwy gydrannau system HGT (atgyweirio, dyblygu ac ailgyfuno DNA) 39. Defnyddiwch ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) a defnyddiwch DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) i gyfrifo amrywiaeth genynnau ac amrywiaeth niwcleotid (π) a mewnbwn paramedr prawf niwtral D Tajima.
Cafwyd coeden ffylogenetig tebygolrwydd mwyaf (ML) yn seiliedig ar 69 o ynysyddion a genomau cyfeirio Mycoplasma bovis (Ffigur 2A). O'i gymharu â choed yn seiliedig ar un genyn neu goed yn seiliedig ar aml-locws, mae'r strategaeth hon yn caniatáu cynhyrchu coed mwy pwerus nad ydynt yn dal amrywioldeb y genom cyfan ac felly'n arddangos gallu is i wahaniaethu rhwng rhywogaethau 68,69. Mae strwythur topolegol y goeden ML fel arfer yn gyson â dosbarthiad cymhleth cloniau. Mae genom Eu2 wedi'i glystyru mewn cangen, ac mae genom Af1 hefyd wedi'i glystyru gyda'i gilydd (Ffigur 2A). Mae'r canlyniad hefyd yn gyson â'r berthynas esblygiadol hysbys o Mycobacterium bovis, hynny yw, mae gwahaniaeth mawr rhwng yr aelod Eu1 a'r grŵp sy'n cynnwys yr holl gymhlethdodau a genomau clonal eraill, ond nid yw'r cymhlyg clonal 30 wedi'i nodi. Gellir esbonio'r anghysondeb bach rhwng y cymhlyg clonal a'r berthynas a welwyd ar y goeden ffylogenetig gan y ffaith bod y cymhlyg clonal yn cael ei ddisgrifio yn seiliedig ar ranbarthau genomig penodol, tra bod y goeden ffylogenetig yn seiliedig ar aliniadau lluosog o genom craidd sy'n cynrychioli'r genom cyfan.
Mae'r goeden ffylogenetig tebygolrwydd mwyaf (GTR) wedi'i hadeiladu yn seiliedig ar aliniad genom craidd genom Mycobacterium bovis cyn (A) ac ar ôl (B) tynnu'r safle ailgyfuno. Mae lliwiau'r canghennau'n cynrychioli'r cymhlyg clôn Mycobacterium bovis: Ewrop 1 yw porffor, Ewrop 2 yw coch, Ewrop 3 yw glas, Affrica 1 yw oren, ac Affrica 2 yw gwyrdd. Mae'r goeden wedi'i gwreiddio a'i llunio i raddfa, a mesurir hyd y gangen fel amnewidiad ar gyfer pob safle.
Disgrifir y cyfadeilad Mycobacterium tuberculosis fel un sydd wedi esblygu'n glonaidd, ac mae'r rhan fwyaf o'r dystiolaeth a gronnwyd dros y blynyddoedd yn cefnogi'r syniad na fydd digwyddiadau HGT ac ailgyfuno parhaus yn digwydd ar y lefel ganfyddadwy o MTBC15,17,18.
Mae gwaith blaenorol wedi dangos y gallai fod ailgyfuno cyfyngedig rhwng straeniau MTBC20,21, tra bod eraill wedi methu â nodi digwyddiadau ailgyfuno mesuradwy70,71. Ail-drafodwch y mater hwn gan ganolbwyntio ar Mycobacterium bovis, sy'n wahanol i'r gwaith blaenorol a ystyriodd Mycobacterium tuberculosis yn unig 70,71; neu ystyriwch MTBC yn ei gyfanrwydd, gyda bron dim M. bovis yn cynrychioli 20; neu ystyriwch ffracsiynau gwartheg cyfyngol yn unig. Yn y set ddata mycobacteria, yn y gwaith hwn, mae cyfanswm o 70 straen, sy'n cynrychioli pob cyfadeilad clonal, a ddefnyddir i sgrinio am ailgyfuno. Mae'r set ddata wedi'i graddio yn ôl pedwar lefel gronnus: (1) aelodau Eu2, (2) pob aelod o gymhlyg clôn Ewropeaidd (h.y. Ewrop), (3) cymhlyg clôn Ewropeaidd ac Affricanaidd (Eu + Af) a (4) y Casgliadau data cyfan (gan gynnwys genomau nad ydynt wedi'u cynnwys mewn unrhyw gymhlygion clonio a ddisgrifiwyd eisoes).
I astudio'r ddamcaniaeth hon ymhellach, perfformiwyd rhwydwaith hollt-ddadelfennu i asesu absenoldeb digwyddiadau ailgyfuno rhwng genomau, oherwydd gall y dull hwn ddelweddu'r berthynas hynafol rhwng unigolion ac arddangos signalau ffylogenetig gwrthgyferbyniol. Cadarnhaodd pob un o'r pedair set ddata yn y dadansoddiad fodolaeth dolenni yn y rhwydwaith (hynny yw, ardaloedd nad ydynt yn cydgyfeirio i mewn i un goeden), ond nid oes gan brawf Phi unrhyw gefnogaeth ystadegol (Eu2, p = 0.0956; Ewrop, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; y set ddata gyfan p = 0.2451), sy'n darparu tystiolaeth wael o fodolaeth digwyddiadau aildrefnu (Ffigur 3A-D).
Yn Ewrop 2 genom (n = 37) (A), genom Ewropeaidd (n = 44) (B), genom Ewropeaidd ac Affricanaidd (n = 51) (C) a'r set ddata gyfan (n = 70) (D).
Ar ôl y dadansoddiad hwn, a chan ystyried yr arsylwadau cylchol ym mhob rhwydwaith, cymhwyswyd yr algorithm ail-greu a weithredwyd ym mhiblinell Gubbins i ail-greu'r llinach clonal ac i ategu'r amcangyfrif o effaith yr ailgyfuno ar genom M. bovis. Casglwch nifer cronnus y digwyddiadau ailgyfuno, y digwyddodd y rhan fwyaf ohonynt mewn canghennau terfynol (hynny yw, mewn un genom) (Tabl 2). Mae'r dangosyddion hyn yn dangos cysondeb y set ddata gyfan ac yn nodi bod amlder digwyddiadau ailgyfuno 200 i 300 gwaith yn fwy na mwtaniadau. Unwaith y bydd y paramedr rho/theta sy'n cynrychioli cyfraddau cymharol ailgyfuno a mwtaniadau pwynt ar y gangen yn ymddangos rhwng 0.0037 a 0.0056 (Tabl 3). Yn ddiweddar, dangosodd y gwaith cyhoeddedig o'r straen 38 M. bovis werth rho/theta uwch (rho/theta = 0.1) na'r hyn a gafwyd yn y set ddata hon, ond defnyddiodd gwaith Patané a'i gydweithwyr gydosod yn seiliedig ar gyfeirio i gasglu paramedrau ailgyfuno. Mae manylyn gweithdrefnol, oherwydd y weithdrefn gydosod, wedi'i gysylltu â nifer y digwyddiadau ailgyfuno tybiedig yn y gangen derfynol.
Nesaf, mae'r paramedr r/m yn cynrychioli'r gymhareb amrywiaeth o ailgyfuno a chyflwyno mwtaniad, ac mae ei werth cyfartalog rhwng 0.025 a 0.037, sy'n dangos, o'i gymharu â mwtaniadau, bod gan ailgyfuno effaith gyffredinol is ar amrywiaeth genetig M. bovis (Tabl 3)). Ar gyfer cymhariaeth helaeth, defnyddiwyd dull tebyg i amcangyfrif y paramedr r/m ar gyfer y set ddata MTBC sy'n cynnwys 23 genom, gan ddangos gwerth cyfartalog o 0.48620, tra ar gyfer set ddata 38 M. bovis Patané a'i gydweithwyr, profodd mai'r gwerth cyfartalog yw 0.98. Yn yr astudiaeth gyntaf, dim ond dau o'r 23 genom a gynhwyswyd yng ngwaith M. bovis (M. bovis BCG a'r straen cyfeirio), felly gall y gwerth a gafwyd fod yn rhagfarnllyd oherwydd gorfynegiant genom M. tuberculosis. Yn yr ail adroddiad, cafodd y poblogaethau Mycobacterium bovis a ddadansoddwyd eu hadfer yn bennaf o'r Unol Daleithiau a gwesteiwyr da byw. Mewn cyferbyniad, yn ein set ddata ni, cynrychiolir mwy o leoliadau daearyddol a rhywogaethau gwesteiwr, a defnyddir genomau wedi'u grwpio i wahanol gymhlygion clonal gyda gwahanol nodweddion genetig poblogaeth hefyd, gan sicrhau gwybodaeth ddyfnach ac ehangach am y Boblogaeth. Mae'r gwahaniaeth gwerth cyfartalog r/m a geir gyda'n set ddata ni yn gyson â'r cysyniad bod graddfa'r ailgyfuno yn amrywio'n fawr rhwng y llinachau a neilltuwyd i'r un rhywogaeth dacsonomig, felly mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gallai'r cymhlyg clôn M. bovis arddangos gwahaniaethau ailgyfuno. Mae'r effaith hefyd fel yr awgrymwyd gan Didelot a Maiden72. Serch hynny, bydd ehangu'r set ddata hon yn sylweddol trwy gynnwys nifer fwy o genomau M. bovis yn caniatáu eglurhad pellach o'r pwynt hwn. Mae'r paramedrau r/m a rho/theta yn dangos amrywioldeb rhwng canghennau, ac mae'r canlyniad hwn yn gyson ag adroddiadau ar rywogaethau bacteriol eraill72,73.
Yn olaf, er mwyn cadarnhau'r digwyddiadau ad-drefnu a nodwyd gan biblinell Gubbins, defnyddiwyd chwe algorithm gwahanol yn y feddalwedd RDP4 i brofi gwahanol gymhariaethau craidd yn annibynnol. Yn fyd-eang, cadarnhawyd llai na hanner y digwyddiadau a nodwyd gan Gubbins gan RDP4 (Tablau 4 a 5). O ystyried y set ddata gyfan, cadarnhawyd tri digwyddiad ailgyfuno, dau yn cynnwys nodau mewnol a'r llall yn cynnwys un genom mewn cangen derfynol, na ellid aseinio cyfadeiladau clonal ar eu cyfer (Tablau 4 a 5). Gall nodi digwyddiadau mewn canghennau terfynol ddangos bod yr ailgyfuno yn dal i fynd rhagddo mewn straeniau cyfoes o M. bovis neu fod y canlyniad wedi'i gamleoli70. Yn y rhanbarth ailgyfuno damcaniaethol hwn, mae gan oddeutu 20% o'r safleoedd niwcleotidau heb eu diffinio (N), gan effeithio felly ar y signal ailgyfuno (Ffigur Atodol 2). Yn ogystal, mae'r rhanbarth hwn yn effeithio ar y genyn rrs, gan amgodio'r RNA ribosomal 16S y disgwylir iddo fod wedi'i gadw'n fawr, felly gall y signal ailgyfuno tybiedig hwn fod yn ganlyniad i wallau dilyniannu neu gamliniad. Yna perfformiwyd yr aliniad genom cyfan rhwng Mb0003 a Mycobacterium bovis AF2122/97, a chadarnhawyd bodolaeth niwcleotidau ac SNPs heb eu diffinio, felly nid oedd y problemau posibl yn gysylltiedig â'r aliniad anghywir oherwydd y wybodaeth fiolegol a weithredwyd yn y gwaith hwn. Ymddangosodd ar ôl dysgu'r rhaglen.
Ni chanfuwyd unrhyw fylchau na niwcleotidau heb eu diffinio yn rhanbarthau ailgyfuno'r nodau mewnol (Ffigurau 4 a 5). O ran y digwyddiadau hyn, mae un yn cynnwys genom Eu2 yn unig ac yn effeithio ar y genyn pks12, sy'n amgodio synthase polyketide posibl; tra bod y llall wedi'i gofrestru yn genom Eu1 ac yn effeithio ar y genyn narX sy'n amgodio reductase nitrad posibl (Tabl 4). Yn gyffredinol, mae'r dadansoddiad ailgyfuno yn dangos bod nifer gyfyngedig o ddarnau ailgyfuno gyda chefnogaeth ystadegol, ac mae'r dangosyddion a gasglwyd yn dangos bod gan yr ailgyfuno effaith isel ar linach M. bovis. Disgwylir i'r signal ailgyfuno fod yn isel, ond mae'n bwysig gwahaniaethu rhwng y signal esblygiad gwirioneddol a'r sŵn cefndir, sy'n dasg heriol. Er mwyn lleihau'r signal sŵn a gyflwynir gan broblemau cydosod a chamgymaru seiliedig ar gyfeirio 70, 71, cafodd yr holl weddill ac eithrio'r genom cyflawn eu cydosod o'r dechrau, a gwiriwyd a sicrhawyd ansawdd y cydosod gan ddadansoddiad piblinell QUAST (Tabl Atodol 1). Yn ogystal, cynhaliwyd cyfres o ddadansoddiadau atodol i ddarparu cadernid a chywirdeb yr arolwg cyffredinol. Felly, gwerthuswyd ansawdd dilyniannu genynnau narX a pks12 trwy fapio darlleniadau yn erbyn Mycobacterium bovis AF2122/97. Cadarnhawyd y safle SNP a argymhellwyd yn y rhanbarth ailgyfuno trwy gymhwyso'r meini prawf a grybwyllir yn yr adran dull (o leiaf 20 darlleniad ac amlder newid o 0.9). Cadarnhawyd polymorffedd y genyn narX yn llawn yn y ddau genom (Mb1792361 a Mb7240415; 2.3%) a genomau'r genom pks12: genynnau Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, a Mb12. Fodd bynnag, ar gyfer y genom Mb2043, nid yw chwech o'r wyth safle yn bodloni'r maen prawf dyfnder darllen oherwydd bod yr SNP yn cael ei gefnogi gan uchafswm o 17 darlleniad, sydd islaw'r gwerth torbwynt sefydledig o 20. Felly, gellir cadarnhau ailgyfuno chwe genom (8.6%) yn y safle genom hwn (Ffigurau 4 a 5).
Mae'r delweddu manwl o aliniad rhanbarth ailgyfuno set ddata Mycobacterium bovis yn effeithio ar y genyn narX sy'n amgodio nitrad reductase posibl. Ni chanfuwyd unrhyw fylchau na niwcleotidau heb eu diffinio yn rhanbarth ailgyfuno'r nodau mewnol. Mae'r digwyddiad penodol hwn wedi'i gofrestru yn genom Eu1. Gwerthuswyd ansawdd dilyniannu'r genyn narX trwy blotio darlleniadau Mycobacterium bovis AF2122/97. Cadarnhewch leoliad yr SNP a argymhellir yn yr ardal ailgyfuno trwy gymhwyso'r meini prawf a grybwyllir yn yr adran dull (o leiaf 20 darlleniad ac amlder newid o 0.9). Cadarnhawyd polymorffedd y genyn narX yn llawn yng ngenomau Mb1792361 a Mb7240415 (2.3%).
Delweddu manwl o aliniad rhanbarth ailgyfuno set ddata Mycoplasma bovis sy'n effeithio ar y genyn pks12. Ni chanfuwyd unrhyw fylchau na niwcleotidau heb eu diffinio yn rhanbarth ailgyfuno'r nodau mewnol. O ran y digwyddiad sy'n effeithio ar y genyn pks12 sy'n amgodio synthase polyketide posibl, dim ond genom Eu2 sydd ynddo. Gwerthuswyd ansawdd dilyniannu pks12 trwy fapio darllen Mycobacterium bovis AF2122/97. Cadarnhewch y lleoliad SNP a argymhellir yn yr ardal ailgyfuno trwy gymhwyso'r meini prawf a grybwyllir yn yr adran dull (o leiaf 20 darlleniad ac amlder newid o 0.9). Mae polymorffismau genomau Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, a Mb1960 wedi'u cadarnhau'n llawn.
Mae gan enynnau PE a PPE ranbarthau ailadroddus sy'n hawdd eu camddarllen gan ddilyniannu a chamfapio Illumina, felly fel arfer cânt eu dileu o lif gwaith biowybodeg aelodau M. tuberculosis dim ond wrth ddefnyddio'r strategaeth mapio-i-ddilyniant. Mae'r casgliad o ddigwyddiadau ailgyfuno a gymhwysir yn y gwaith hwn yn seiliedig ar gydosod de novo heb hidlo PE/PPE allan. Credwn, trwy weithredu tri dull ac algorithmau cyflenwol gwahanol trwy SplitsTree, piblinell Gubbins a meddalwedd RDP4, fod y strategaethau a gymhwysir yn gadarn i brosesu a hidlo'r rhanbarthau wedi'u hail-drefnu a achosir gan signalau gwall. Fodd bynnag, er mwyn gwahardd ymyrraeth y genyn PE/PPE ar y feddalwedd Gubbins ac RDP4 i nodi clystyrau SNP, ac felly nodi'r rhanbarthau ailgyfuno a gynigiwyd i effeithio ar y genynnau narX a pks12, archwiliwyd cymdogaeth y genynnau hyn (Ffig. Atodol 3–5). Yn M. bovis AF2122/97, mae'r genyn narX wedi'i wahanu gan narK2 a Mb1764c, tra bod pks12 wedi'i amgylchynu gan Mb2075c e Mb2073c (Ffigur Atodol 3-5). Mae'r map a gynhyrchwyd gan ddefnyddio map synline MAUVE o'r genom cyflawn yn darparu gwybodaeth am gadwraeth ac aildrefnu dilyniant genynnau, gan ddangos pedwar bloc colinear, a dim arwyddion o drawsleoliad na gwrthdroad genom. Yn ogystal, profodd y dadansoddiad ategu gyda'r dilyniant asid amino yr homologi ym mhob genom cyflawn, ac ni chanfuwyd unrhyw PE/PPE yn rhanbarthau cyfagos narX na pks12. Ar gyfer narX, mae gan un genom (Mb0030) sgôr synystyriaeth is oherwydd bod y genyn narX wedi'i adnabod fel dau ddarn (darnau 1891 a 1890). Ar gyfer pks12, oherwydd tebygrwyddau, dangosodd Mb0030 a Mb003 sgoriau synlinearedd is, tra bod pks12 wedi'i adnabod mewn dau a thri darn, yn y drefn honno, yn cynrychioli gwahanol barthau o'r protein (Ffigur Atodol 3-5). Gan ystyried y wybodaeth hon, a meddalwedd Gubbins ac RDP4 ill dau yn cynnal dadansoddiad, gwirio aliniad lluosog y craidd o'r uchafswm o 500 bp yn y ffenestr, cadarnhawyd na fydd y genyn PE/PPE yn ymyrryd â'r signal ailgyfuno sy'n effeithio ar narX a pks12.
Er y gellir ystyried bod y signalau ailgyfuno a ganfuwyd yn y set ddata hon yn weddilliol, mae'n wir na ellir diystyru ailgyfuno yn M. bovis, felly dylai barhau i fod yn destun dadansoddiad pellach, lle mae genomau cyfan o wahanol senarios epidemiolegol yn cael eu dilyniannu i Bwysig.
Ni arweiniodd cymharu'r coed ffylogenetig ML a gafwyd cyn ac ar ôl cywiriad ailgyfuno (Ffigur 2A, B) at newidiadau sylweddol yn y berthynas ffylogenetig a gasglwyd, ac roedd y straeniau M. bovis wedi'u clystyru yn yr un grŵp.
Ar ôl mapio 42 o ddarlleniadau M. bovis newydd eu dilyniannu gyda genom cyfeirio M. bovis AF2122/97, cafwyd aliniad SNP yn cynnwys 1816 o safleoedd polymorffig. Mae'r rhan fwyaf o'r SNPs (87.1%) wedi'u lleoli yn y rhanbarth codio, ac mae'r genynnau yr effeithir arnynt wedi'u nodweddu yn ôl y categorïau swyddogaethol a ddangosir yn Bovilist (Ffigur 6A, B). Gan ystyried cyfanswm y genynnau ym mhob categori swyddogaethol, dangosodd y genynnau yn y categori "metaboledd lipid" fwy o SNPs, ac yna "wal gell a phrosesau celloedd" a "metaboledd canolradd ac anadlu", gan ddatgelu eu bod yn esblygiad M. bovis.
Dadansoddiad hierarchaidd o'r set ddata M. bovis o Bortiwgal (n = 42). Cyfanswm y nifer o SNPs cofrestredig a'r genynnau yr effeithir arnynt ar gyfer pob categori swyddogaethol (A). Cyfanswm y newidiadau cyfystyr ac anghystyr a gofrestrwyd yn ôl categori swyddogaeth (B).
Ar raddfa fyd-eang, mae'r gymhareb dN/dS gyfartalog yn well nag 1.5, sy'n dangos mai'r pwysau esblygiadol byd-eang yw cael gwared ar y cyflwr hynafol ac mae'n cynrychioli senario dewis puro cadarnhaol (amrywiol neu gyfeiriedig) a/neu hamddenol. Yng nghategorïau "firwlens, dadwenwyno, addasu", "dilyniannau mewnosod a ffagau", a "proteinau rheoleiddio", mae mwy na dwy ran o dair o SNPs yn anghyson (Ffigur 6B).
Ym mhob categori, mae genynnau gyda nifer o SNPs, gan arwain at gyfradd mwtaniad gyfartalog (hynny yw, yr SNP cyfartalog fesul genyn) sy'n fwy nag 1 (Ffigur 6A). Mae gan Pks12 (Mb2074c) gyda 15 SNP a fas (Mb2553c) gydag 8 SNP werthoedd mwtaniad uwch. Mae'r ddau enyn hyn yn ymwneud â metaboledd asid brasterog. Mae'r genyn pks yn amgodio polycetid synthase (PKS), sef ensym amlswyddogaethol sy'n ymwneud â biosynthesis lipid wal gell mycobacteriaidd74,75. Mae'r genyn hwn yn amgodio polypeptid amlswyddogaethol sy'n ymwneud â synthesis mycocetidau74,76. Mae'r genyn fas yn ymwneud â synthesis asid mycolig. Mae'r ddau enyn hyn yn chwarae rhan bwysig ym miosynthesis y wal gell sydd mewn cysylltiad â'r gwesteiwr.
Er mwyn astudio esblygiad Mycobacterium bovis ymhellach, dadansoddwyd dau set o enynnau penodol. Nododd gweithiau a gyhoeddwyd yn flaenorol gan ddefnyddio cyfansoddiad dilyniant a dulliau ffylogenetig enynnau a gafwyd gan hynafiaid MTBC trwy HGT cyn arallgyfeirio37,38. Rhestrir y genynnau hyn yn Nhabl Atodol 2. Dadansoddwyd dosbarthiad SNP cyfanswm o 77 o enynnau a allai fod yn gysylltiedig â HGT, a nodwyd 26 o safleoedd polymorffig, a arweiniodd yn y rhan fwyaf o achosion (78%) at newidiadau anghyson (NS) (Tabl Atodol 2). Dangosodd gwaith blaenorol ar y genom MTBC fod y rhanbarth HGT tybiedig yn arddangos cymhareb SNP NS uwch o'i gymharu â gweddill y genom. Os yw rhywun yn meddwl bod y rhanbarthau ailgyfuno hyn wedi'u caffael gan hynafiaid MTBC, ac felly, eu bod yn gor-gynrychioli polymorffismau hynafol, yna disgwylir i gyfran y newidiadau cyfyson fod yn uwch, oherwydd disgwylir i amnewidiadau NS gael eu dileu trwy ddetholiad negyddol oherwydd gall newidiadau asid amino newid swyddogaeth y protein. Felly, mae ein canlyniadau'n dangos y gallai'r canlyniadau swyddogaethol ddeillio o ddisodli genynnau tebyg i HGT, sy'n adlewyrchu eu pwysigrwydd ar gyfer amrywiaeth genetig addasol werthfawr.
Ochr yn ochr â'r dadansoddiad hwn, archwiliwyd y genynnau sy'n amgodio cydrannau'r system 3R (atgyweirio, dyblygu ac ailgyfuno DNA) yn drylwyr yn unol â'r rhestr a gyhoeddwyd yn flaenorol gan dos Vultos a chydweithwyr (2008)39. Ni ellir arsylwi'n uniongyrchol ar gyfnewid darnau DNA union yr un fath, er y gall fod yn broses gyffredin pan fydd bacteria cysylltiedig yn gysylltiedig, fel yn achos y set ddata hon; yn ogystal, gall y broses hon fod yn allweddol i ddulliau atgyweirio DNA72, felly chwarae rhan mewn ailgyfuno homologaidd. Nodwyd cyfanswm o 26 o safleoedd polymorffig wedi'u dosbarthu gan 54 o enynnau (Tabl Atodol 3). Yn y set hon o enynnau, roedd newidiadau NS yn cyfrif am tua 65% o'r canlyniadau, sy'n gyson ag adroddiadau blaenorol ar straenau Mycobacterium tuberculosis.
Amser postio: Hydref-21-2021