Ташаккур ба шумо барои боздид аз табиат. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки версияи навтари браузерро истифода баред (ё ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Ҳамзамон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтҳоро бидуни услуб ва JavaScript намоиш медиҳем.
Пайдарпайвандии геном соҳаи тадқиқоти бемориҳои сироятиро дубора эҳё кард, эпидемиология, патогенез, таъсири мутақобилаи мизбон ва патоген ва раванди эволютсиониро, ки ба патогенҳо гузошта шудааст, ошкор кард. Маҷмааи Mycobacterium tuberculosis (MTBC) Mycobacterium bovis-ро яке аз аъзои мутобиқшавандаи ҳайвоноти худ мешуморад, ки боиси бемории сил (сил) дар ширхӯрони заминӣ мегардад ва модели хоси эволютсияи бактерияҳо мебошад. Мисли дигар аъзои MTBC, Mycobacterium bovis як патогени ба таври қатъӣ клононидашуда, оҳиста таҳаввулшаванда аст ва баръало ҳеҷ аломати рекомбинатсия ё интиқоли генҳои уфуқӣ вуҷуд надорад. Дар ин кор, мо геномикаи муќоисавиро ба маљмўи маълумоти пурраи пайдарпаии геномї (WGS) истифода мебарем, ки аз 70 сар чорвои М. аз зотњои гуногун (Аврупо ва Африка) иборат аст, то дар бораи гуногунии генетикии чорво М. Қувваи эволютсионї ба даст орем. Барои арзёбии аломатҳои азнавташкилдиҳӣ се усули гуногун истифода мешавад. Дар саросари ҷаҳон, шумораи ками рӯйдодҳои рекомбинатсия бо ду усули мустақил бо дастгирии устувор муайян ва тасдиқ карда шудаанд. Бо вуҷуди ин, дар муқоиса бо мутатсия, рекомбинатсия ба гуногунии M. bovis (умумӣ r/m = 0,037) таъсири заифтар дорад. Тафовути миёнаи r/m, ки дар маҷмӯаи клоналии Mycobacterium bovis дар маҷмӯи маълумоти мо ба даст оварда шудааст, ба консепсияи умумӣ мувофиқ аст, ки дараҷаи рекомбинатсия дар байни наслҳои ба як намуди таксономӣ таъиншуда метавонад хеле фарқ кунад. Дар асоси ин кор, рекомбинатсияро дар Mycobacterium bovis истисно кардан мумкин нест, аз ин рӯ он бояд мавзӯи кӯшишҳои минбаъда дар тадқиқоти муқоисавии геномикӣ бошад, ки дар он WGS маҷмӯи маълумоти калон аз сенарияҳои гуногуни эпидемиологӣ дар саросари ҷаҳон муҳим аст. Пас аз он дар маҷмӯаи маълумоти хурдтари Mycobacterium bovis (n = 42) аз паҳншавии бисёр мизбони бемории сил таҳлили иловагӣ гузаронида шуд ва зиёда аз 1,800 локус муайян карда шуд, ки ҳадди аққал як штамм як полиморфизми нуклеотидро (SNP) нишон дод. Аксарияти онҳо (87,1%) дар минтақаи рамзгузорӣ ҷойгиранд ва таносуби ҷаҳонии тағироти синонимӣ (dN/dS) аз 1,5 зиёд аст, ки ин нишон медиҳад, ки интихоби мусбат қувваи муҳими эволютсионие мебошад, ки ба M. bovis таъсир мерасонад. Ҳиссаи бештари SNP-ҳо дар генҳои бой аз категорияҳои функсионалии "метаболизми липидҳо", "девори ҳуҷайра ва равандҳои ҳуҷайра" ва "метаболизми мобайнӣ ва нафаскашӣ" ошкор карда шуданд, ки потенсиали онҳоро дар биология ва эволютсияи аҳамияти Mycobacterium bovis ошкор мекунанд. Бодиққат ба генҳо дар аҷдодони MTBC, ки ба интиқоли генҳои уфуқӣ майл доранд ва ба системаи 3R (таъмир, репликатсия ва рекомбинатсия) дохил мешаванд, арзиши миёнаи манфии озмоиши нейтралии D Taijima-ро нишон медиҳад, ки сканери интихобии гузаштаро нишон медиҳад. бо мизбон чанг кунед.
Маҷмӯи Mycobacterium tuberculosis (MTBC) яке аз таксонҳои муваффақтарини патогенҳои бактериявӣ ва як ҳолати маъмулии эволютсияи бактерияҳо мебошад. Аъзоёни он дар сатҳи геномӣ (> 99%)1,2 шахсияти ҳайратангези баланди нуклеотидҳо нишон медиҳанд. Экотипҳои гуногуни MTBC метавонанд боиси бемории сил (сил), ки бемории грануломатозӣ мебошад, дар доираи васеи намудҳои мизбон аз микро-ширхӯрон то одамон3,4,5. Холо ба комплекс одамон дохиланд [М. Туберкулез (Mtb), Mycobacterium africanum] ва микроорганизмҳои ба ҳайвонот мутобиқшуда (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium mongee, Mycobacterium, Mycobacterium "micobacterium miysanium, шимпанзе» ва «дасси») 5,6. M. canettii (инчунин бо номи "Nodobacter glabrata" маълум аст) Шахсияти миёнаи нуклеотидҳо бо микобактерияҳои дар боло зикршуда 98% -ро ташкил медиҳад ва корҳои муқоисавии геномикӣ нишон доданд, ки M. canettii ва боқимондаи MTBC ба наздикӣ аз аҷдоди умумӣ ҷудо шудаанд.7 Бо назардошти ин консепсия, баъзе муаллифони M.MT8.
MTBC ба таври мунтазам ҳамчун як маҷмааи қатъии клоналӣ тавсиф карда мешавад ва сохтори популятсияи он ба таври возеҳ бо коҳиши гуногунрангӣ, монеаҳо, сканкунии интихобӣ ва драфти генетикӣ танзим карда мешавад9,10. Фарз мекунем, ки эволютсияи мураккаби клоналӣ, ба монанди полиморфизмҳои гумшуда бо роҳи рекомбинатсия барқарор карда намешаванд. Дар асоси ин асос, рӯйдодҳои пайдарпайи ҳазфи геномии минтақаи дифференсиалӣ (RD) ва TbD1 (минтақаи мушаххаси Mtb несткунии 1) ҳамчун аломатҳои молекулавии эволютсияи MTBC2,5,11 пешниҳод карда шуданд. Кори геномикаи муқоисавӣ ва пайдарпайии тамоми геномҳо (WGS) тақсимоти аъзоёни аз ҷониби инсон мутобиқшуда ба нӯҳ наслро дастгирӣ мекунад (Mycobacterium tuberculosis L1 то L4, L7 ва L8; ва Mycobacterium africanum L5, L6 ва L9), хатҳои L2 то L4 минтақаи муштарак тоза карда шуданд2,11b. Илова бар ин, аъзоёни мутобиқшудаи ҳайвонот пешниҳод карда мешаванд, ки як аҷдоди умумӣ дошта бошанд, ки онро бо ҳазфкунии хоси клад дар RD7, RD8, RD9 ва RD102, 5 ва 14 муайян мекунанд.
Интиқоли генҳои уфуқӣ (HGT) ва рӯйдодҳои рекомбинатсия камёб ҳисобида мешаванд ва дар аҷдодони MTBC рух медиҳанд, на таърихи гуногуни тамоми аъзои MTBC15,16,17. Ду гузориши аввали Ҳьюз ва ҳамкорон (2002) ва Гутакер ва ҳамкорон (2006) пешниҳод карданд, ки рӯйдодҳои рекомбинатсия метавонанд ба ташаккули полиморфизмҳое, ки дар штаммҳои M. tuberculosis-ро қайд мекунанд18,19 кӯмак расонанд. Сабабҳои ошкор набудани рекомбинатсия дар MTBC инҳоянд: (1) раванди механикӣ ва гум шудани қобилияти HGT; (2) кам будани ҳодисаҳои HGT; (3) ҳеҷ гуна имкони рӯйдодҳои рекомбинатсия дар чароғдони MTBC вуҷуд надорад14,17. Ба наздикӣ, баъзе таҳқиқоти пайдарпайии геномҳои пурра (WGS), ки ба штамми MTBC 20 ва Mycobacterium bovis 21 татбиқ карда шуданд, далелҳои рекомбинатсияро пешниҳод карданд, ки аввалин шуда нишон дод, ки штаммҳои MTBC аксар вақт порчаҳои хурди ДНК-ро мубодила мекунанд, аммо аз сабаби маҳдуд будани тағирёбии пайдарпаии нуклеотидҳо, ин ҳодисаҳо то ҳол мушоҳида намешаванд.
Mycobacterium bovis узви маъмултарини MTBC аз чорво (асосан чорвои калони шохдор) барқарор карда мешавад, гарчанде ки онро аз ҳайвоноти ваҳшии озод ва панҷарадор ҷудо кардан мумкин аст4,22,23,24. M. bovis ба панҷ комплекси асосии клоналӣ табдил ёфт [Аврупо 1 (Eu1), Аврупо 2 (Eu2), Аврупо 3 (Eu3), Африқо 1 (Af1) ва Африқо 2 (Af2)], мувофиқи профили сполиготипизатсия, несткунии мушаххас ва полиморфизмҳои ягонаи нуклеотидҳо (SNPs) дар 282, генҳои мушаххас. Ин комплексҳои клоналӣ сохтори гуногуни популятсияи Mycobacterium bovis ва робитаи онро бо минтақаҳои ҷуғрофӣ нишон медиҳанд. Илова бар ин, кори WGS ба наздикӣ аз ҷониби Зимпел ва ҳамкорон (2020) анҷом додашуда филогенияро дар асоси SNP-и Mycobacterium bovis бо зиёда аз 1,900 геном тарҳрезӣ карданд, ки нишон медиҳад, ки ҳадди аққал чаҳор наслҳои гуногун мавҷуданд (бо номи Lb1 то Lb1 то Lb4), онҳо комилан мувофиқат намекунанд, ҳарчанд мураккабии ҷуғрофии қаблӣ муайян карда шаванд. тасдиқ 30. Ин муаллифон таҳлили дифференсиалии филогения ва таърихи молекуляриро анҷом доданд, аммо рекомбинатсияро омӯхтанд30.
Корҳои қаблӣ бо истифода аз усулҳои гуногуни молекулавӣ, аз қабили сполиготипсозӣ, MIRU-VNTR (микобактерияи такрории такрории воҳиди тағирёбандаи рақами такрорӣ) ва чопкунии охирини SNP сатҳи муайяни гуногунии генетикиро дар байни штаммҳои M. bovis 31,32,33, 34,35 ошкор карданд. Тафриқаи варианти генетикӣ як воситаи муҳими омӯзиши эпидемиологияи бемориҳо гардид, ки барои дарки амиқи патогенез, вирулентӣ ва интиқоли беморӣ муфид аст. Пайдоиши усули WGS имкон медиҳад, ки омилҳои эволютсионие, ки геномҳои Mycobacterium bovis дар раванди мутобиқшавӣ ва устуворӣ ба мизбонҳо ва сенарияҳои эпидемиологии гуногун гузоштаанд, ошкор карда шаванд.
Дар ин кор, мо таҳлили муқоисавии геномиро дар маҷмӯаҳои гуногуни Mycoplasma bovis (n=70), аз ҷумла изолятҳо аз комплексҳои гуногуни клоналӣ, барои ба даст овардани фаҳмиш дар бораи раванди эволютсияи Mycoplasma bovis, махсусан барои ҳалли муносибатҳои филогенетикӣ ва рӯйдодҳои рекомбинатсия истифода мебарем. Ҳамчун илова ба ин таҳлил, маҷмӯи зермаълумоти изолятҳои M. bovis (n = 42), ки аз минтақаи хуб тавсифшудаи бемории сил дар Португалия гирифта шудааст 31,36 барои муайян кардани шахсияти ғайримуқаррарӣ Тавозуни байни таносуби нисбии ҳис (dN) ба синоними (dS) нуклеотидҳо, инчунин саҳми нуклеотидҳои дар эволютсияи мушаххас зикршуда таҳқиқ карда шуд. адабиёт, онҳо 37,38 аз ҷониби аҷдодони MTBC тавассути HGT ба даст оварда шудаанд, ва рамзгузории 3R (таъмири ДНК, репликатсия ва рекомбинатсия) ҷузъҳои генофонди системаи 39. Интихоби генҳои тавассути HGT ба даст, зеро онҳо метавонанд polymorphisms қадим намояндагӣ мекунанд, бинобар ин интизор меравад, ки онҳо метавонанд ҳиссаи бештари тағйироти синонимӣ дошта бошанд. Генҳое, ки ба системаи 3R дохил карда шудаанд, интихоб карда шуданд, зеро кори қаблӣ дар штаммҳои M. tuberculosis интихоби умумии манфӣ/тозакуниро нишон дод, ки дар ин генҳо кор мекунанд ва онҳо метавонанд дар эволютсия нақши муҳим дошта бошанд. Аз ин сабаб, бо назардошти он, ки маҷмӯаи маълумоти мо аз Португалия танҳо геномҳои комплекси клонҳои аврупоӣ 2 ва штаммҳоеро дар бар мегирад, ки комплекси клонҳоро таъин накардаанд, мо тасмим гирифтем, ки маълумоти геномҳои дастраси оммаро дохил кунем, то дар ниҳоят намояндаи тамоми комплексҳои клонро ба даст орем ва устуворӣ ва фарогирии натиҷаҳоро беҳтар кунем.
42 геномҳои пайдарпайи навтаъсиси Mycoplasma bovis аз саҳнаи эндемикии бисёрсоҳаи сили Португалия (тафсилоти дар поён овардашуда), ки қаблан аз нуқтаи назари эпидемиологӣ тавсиф шуда буданд36, маркази ин кор мебошанд. Бо дарназардошти он, ки маҷмӯаи маълумот аз Португалия танҳо намояндагони маҷмӯаҳои клонҳои Аврупои 2 ва штаммҳои бидуни комплексҳои таъиншуда дорад, барои васеъ кардани маҷмӯи маълумот, ки ҳамаи намояндагони комплексҳои клонҳои M. bovis-ро дар бар мегирад, маълумоти ба таври оммавӣ дастраси пайдарпайии геном илова карда шудааст. Аз ин рӯ, дар ин кор се манбаи маълумот оид ба пайдарпайии геномҳо истифода шуданд: маҷмӯи пурра/лоиҳаи геном, то 10 скаффолдҳо дар NCBI (Маркази миллии иттилооти биотехнология) нигоҳ дошта мешаванд (n = 15 изолят); дар SRA нигоҳ дошта мешавад (Файли Illumina fastq аз бойгонии хондани пайдарпаӣ) гуногунии мураккаби клонҳои M. bovis (n = 12 изолят) -ро ифода мекунад30; ва 42 геномҳои пайдарпай аз Португалия. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) аз ҷустуҷӯи NCBI хориҷ карда шуд. M. bovis AF2122/97 одатан ҳамчун геноми истинод барои дохил шудан ба маҷмӯи маълумот истифода мешавад. Аз сабаби дастрас набудани оммаи тамоми пайдарпаии геном, ки аз ҷониби маҷмааи клонкунии African 1 муаррифӣ шудааст ва шумораи ками геномҳо аз штаммҳои намояндагии Af2 ва Eu1, дар ин ҳолатҳо маълумоти аслии пайдарпайии аз ҷониби SRA пешниҳодшуда истифода мешуданд. Кори Зимпел ва ҳамкорони ӯ (2020) барои муайян кардани геном аз маҷмааи клонкунии дар боло зикршуда кӯмак кард ва ба интихоби Mycobacterium bovis барои дохил шудан ба маҷмӯи маълумот кӯмак кард. Барои Eu3, танҳо як намуди геном тавсиф карда шудааст (Брангер ва дигарон, 2020), аз ин рӯ геноме, ки мо дохил мекунем, намояндаи алоҳидаи комплекси Eu3 мебошад.
Дар саросари ҷаҳон, ин маҷмӯаи маълумот 70 чорвои калони шохдори M. bovis, ки аз 8 намуди мизбон ҷудо карда шудаанд, аз соли 1985 то 2016 дар 12 кишвари ҷаҳон паҳн шудаанд. 36 намуд ҳамчун Eu2, 7 намуд Eu1, 1 намуд Eu3, 3 намуд Af1, 4 намуд Af2 ва 19 намуд ба ҳеҷ гуна маҷмааи клобон (дар ҷадвали думҳо) дохил намешаванд. Маълумоти муфассал (аз ҷумла рақами дохилшавӣ)-и Mycobacterium bovis, ки дар ин тадқиқот истифода мешавад, дар Ҷадвали 1 ва Ҷадвали иловагии 1 нишон дода шудааст.
42 геномҳои нави пайдарпайии Mycobacterium bovis аз нуқтаҳои доғҳои бемории сили ҳайвоноти Португалия ва дар тӯли зиёда аз 12 сол паҳншуда маркази ин тадқиқот мебошанд, зеро системаҳои эҳтимолии бемориҳои ҳайвоноти ваҳшӣ ва чорво мунтазам назорат карда мешаванд 31,36 (Расми 1). Тибқи расмиёти минбаъда, ин штаммҳо аз чорвои калони шохдор (n = 14), охуи сурх (n = 16) ва хуки ваҳшӣ (n = 12) аз соли 2003 то 2015 ҷудо карда шуданд: мувофиқи дастурҳои протоколи тавсияшуда ҳайвонҳоро ҷамъоварӣ ва коркард кунед Намунаҳои бофтаҳо дар Дастури ҳайвоноти заминии OIE мавҷуданд ва дар Stonebrensen-Jen pyruvate миёна сахт ва моеъ. Фарҳангҳо дар ҳарорати 37 ° C инкубатсия карда мешаванд ва нашъунамои онҳо дар як ҳафта як маротиба дар тӯли на камтар аз 12 ҳафта тафтиш карда мешавад. Колонияҳо бевосита дар маҳлули глицерин дар -80ºC нигоҳ дошта мешаванд. Дар муҳити интихобии Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), намунаҳои аслии бойгонӣ аз як гузаргоҳи ягонаи in vitro in vitro барои ба даст овардани ДНК-и барномаи WGS гузаронида шуданд. Барои ин, маҳлули захираи парвариши яхкардашуда бо 5% пирувати натрий ва 10% ADS (50 г альбумин, 20 г глюкоза, 8,5 г хлориди натрий дар 1 л об) дар Middlebrook 7H9 дар ҳарорати 37 ° C Retrain бой карда шуд. Пас аз 4 ҳафтаи нашъунамо, миёна нав карда шуд ва фарҳанг мунтазам то мушоҳидаи нашъунамо назорат карда шуд. Ҳуҷайраҳо тавассути центрифуга ҷамъоварӣ карда шуданд, пеллет дар шӯри 500 мкл фосфати буферӣ (PBS) дубора боздошта шуд, дар 99 °C барои 30 дақиқа тафсонда, центрифуга карда шуд ва супернатант дар -20 °C то WGS нигоҳ дошта шуд. Ҳама равандҳо дар иншооти сатҳи 3 бехатарии биологӣ гузаронида мешаванд.
Китобхонаи геномҳои ҷуфтшудаи WGS бо истифода аз индекси беназири ҳар як намунаи ДНК омода карда мешавад ва барои пайдарпайӣ технологияи Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 намуна) ва HiSeq (2 × 150 pb) (ду изолят) (Eurofins Genomics, Олмон) -ро истифода мебарад. Мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда, барои тартиб додани ДНК-и геномӣ аз Illumina Genome Analyzer бо замимаи модули дутарафа истифода баред ва барои сохтани китобхона маҷмӯаи Nextera XT DNA Library Prep аз Illumina истифода баред.
Бо дарназардошти маълумоти барқароршуда аз SRA (n = 12), идентификатсияи комплекси клон метавонад ҳамчун метамаълумоти нашрияи мувофиқ 30, 41, 43 истифода шавад. Ҳангоми баррасии геноми мукаммал, ба истиснои Mycobacterium bovis AF2122/97 ва Mycobacterium bovis, ки узвҳои 3601 ва E. 25, 29, мутаносибан, он бо геноми пурраи Mycobacterium tuberculosis H37Rv (рақами воридшавии NCBI NC_000962.3) якхела аст. Ҳамоҳангсозии геном бо истифода аз MAFFT (барномаи ҳамбастагии чандкаратаи аминокислотаҳо ё пайдарпаии нуклеотидҳо, версияи 7.458) ва параметри -addfragments48 анҷом дода мешавад. Сипас, набудани комплексҳои гуногуни клоналӣ ва/ё мавҷудияти хусусиятҳои SNP-ро ҷустуҷӯ кунед.
Mycobacterium bovis (n = 42) ва нусхаҳои аслии тарҳи геномҳои ҷамъшуда (n = 3) комплексро бо геноми истинод ба Mycobacterium tuberculosis H37Rv тавассути лӯлаи vSNP ва мавҷудияти несткунӣ ва/ё хусусиятҳои SNP-и клонҳои гуногун мутобиқ мекунанд Ҷустуҷӯ анҷом дода шуд.
Аз набудани хусусиятҳо ва/ё мавҷудият/набудани профилҳои SNP ва сполиготипӣ маълумот ҷамъоварӣ кунед, то маълумоти геномиро ба маҷмааи клоналии мувофиқ таъин кунед. Барои чор маҷлиси лоиҳавӣ, профили сполиготипиро метавон хулоса кард, аз ин рӯ онҳо ба гурӯҳи "мураккаб нест" дохил карда шудаанд.
Ҷараёни кории биоинформатика, ки пас аз ин кор пас аз он аз монтаж ва харитасозӣ то стратегияи истинод бо ҳадафи таҳқиқи рӯйдодҳои рекомбинатсия ва полиморфизмҳои мушаххаси геномӣ оғоз мешавад. Дар расми 1 ҷадвали ҷараёни қадамҳои зерин оварда шудааст. Барои таҳлили рекомбинатсия, ҳама геномҳо барои баланд бардоштани устувории хулосаҳо ва нишондиҳандаҳои алоқаманд истифода мешаванд.
Бо мақсади кам кардани хатогиҳо дар тавлиди пайдарпаии консенсуси геномӣ, мо аввал маҷмӯаи де ново ба даст овардем ва сипас ҳамоҳангсозии сершумори аслӣ ба даст овардем. Қубури Unicycler дар айни замон дар https://github.com/rrwick/Unicycler49 дастрас аст ва барои иҷрои де-новои 54 геномҳои пайдарпай истифода мешавад (42 файли пайдарпай ва 12 файли fastq аз SRA барқароршуда). Хулоса, пеш аз васлкунӣ аз сифр, таҳлили сифати хониш дар версияи FastQC 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) ва версияи Trimmomatic 0.36 анҷом дода шуд (опсияи "буридани адаптерҳо ва дигар пайдарпаии рӯшноӣ аз хондан" ва "Коридани пойгоҳҳо аз охири сифати хониш, агар нигоҳ доштани сифати хониш аз 2 паст бошад") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Сипас, SPAdes optimiser49 барои васлкунии геномҳо ва версияи Pilon 1.1851 барои оптимизатсияи пас аз васлкунӣ истифода шуд. Барои роҳ надодан ба васлшавии нодуруст режими консервативии пулакӣ интихоб карда шуд ва андозаи k-mer аз 20% то 95% дарозии хондан ҷустуҷӯ ва интихоб карда шуд. Дастурҳои SPAdes-ро риоя кунед ва андозаи хонданро ба назар гиред, контигҳои аз 300 bp хурдтарро нест кунед ва умқи фарогирии 20 хонишро аз 52 муқаррар кунед. Дар стратегияи де-ново, минтақаҳои геномӣ ба монанди паралогҳои такроршавандаи пролин-глутамат (PE) ва пролин-пролин глутамат (PPE) хориҷ карда нашуданд.
Сифати василаи де-ново тавассути лӯлаи QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), ки ба таҷдиди контиг ва геноми истинод ба M. bovis AF2122/97 (рақами пайвастшавии NCBI LT708304.1) мусоидат мекунад (ниг. Барои параметрҳои сифат 1) арзёбӣ мешавад.
Бо ёрии лӯлаи vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), файли FASTQ-и M. bovis навтаъсисшуда аз пайдарпайии Illumina бо геноми истинод ба M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) муқоиса карда мешавад. Мувофиқи тавсияҳои беҳтарини таҷрибавии Toolkit Analysis Genome (GATK) 53, 54, 55 параметрҳои филтрҳои стандартӣ ё холҳои массаи вариантро барои аз нав калибризатсия истифода баред. Натиҷаҳо бо истифода аз пасттарин холҳои оммавии SAMtools 150 ва AC = 2 филтр карда мешаванд. Ҳамчунин Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) -ро барои тафтиши хонишҳо истифода баред, то ифлосшавиро истисно кунед. Қубури vSNP, ки барои харитасозии стратегияҳои пайдарпай дар кори мо истифода мешавад, як қатор SNP ва ҳадафҳои муайяншударо меомӯзад ва инчунин сенарияҳои сирояти омехтаро истисно мекунад. Фарогирии геноми хондашуда аз 99% беҳтар аст (Ҷадвали иловагӣ 1).
Барои роҳ надодан ба хатогиҳои харитасозӣ ва SNP-ҳои нодуруст, вариантро дар ҳолатҳои зерин филтр кунед: (1) онро камтар аз 20 хониш дастгирӣ мекунад, (2) он бо басомади камтар аз 0,9 пайдо мешавад, (3) он ҳадди аққал дар як Штамм мавҷуд аст, аммо ҳадди аққал дар штамм дигар холигоҳҳо мавҷуданд. Намоишгари ҳамгирошудаи геномикӣ (IGV) версияи 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 барои ба таври визуалӣ тафтиш кардани SNPҳо ва мавқеъҳо бо мушкилоти харитасозӣ ё ҳамоҳангсозӣ истифода шудааст. Азбаски генҳои пролин-глутамат (PE) ва пролин-пролин глутамат (PPE) хеле такрор мешаванд ва як қисми оилаи бисёр ген мебошанд, онҳо бо пайдарпаии Illumina ва нодуруст харитасозии онҳо ба осонӣ нодуруст фаҳмида мешаванд, аз ин рӯ ба онҳо бартарӣ дода мешавад. Ҷараёни кори биоинформатикаи микобактериалӣ ҳангоми истифодаи стратегияи SNP барои тасдиқи маҷмааи силро хориҷ карданд. Аз ин рӯ, мо генҳо ва инделҳоро аз таҳлил филтр кардем.
Мувофиқи Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), ҳама SNPҳо ба категорияҳои функсионалӣ тақсим мешаванд. Қубури SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) барои муайян кардани оқибатҳои SNP (тағйироти синонимӣ ё синонимӣ) истифода мешавад. Махзани нави геноми Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1) таъсис дода шуд.
Ҳамоҳангсозии сершумори геноми аслӣ бо истифода аз Parsnp v1.2, ки ҳоло дар https://github.com/marbl/parsnp57 дастрас аст, бо истифода аз 69 геномҳои мукаммал/ҷамъбасти лоиҳа (бо опсияи -c) анҷом дода шуд ва M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) ҳамчун истинод истифода мешавад. Чаҳор ҳамоҳангсозии сершумори аслӣ анҷом дода шуд: танҳо аъзои маҷмааи клонсозии Eu2 (n = 37), аз ҷумла ҳамаи аъзои маҷмааи клонсозии аврупоӣ (n = 44), аз ҷумла нуқтаи пайвасти комплекси клонсозии Аврупо ва Африқо (n = 51) ва ҳама Mycobacterium bovis дар ин таҳқиқот (n = 70) дохил карда шуданд.
Ҳамоҳангсозии аслӣ, ки аз ҷониби Parsnp тавлид шудааст, барои муайян кардани дарахти филогенетикии максималӣ (ML) бо истифода аз CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 бо истифода аз RAxML ва иҷрои 1000 такрори роҳнамо истифода мешавад.
Барои санҷидани мавҷудияти ҳодисаҳои рекомбинатсия дар баробари се алгоритми гуногун ва абзори биоинформатика истифода мешаванд: нармафзори SplitsTree4, қубури Губбинс (насаби беғараз тавассути рекомбинатсия дар пайдарпаии нуклеотидҳо) ва нармафзори RDP4 (барномаи муайянкунии рекомбинатсия, версияи бета 4.101).
Усули тақсимкунии тақсимот, ки дар SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 амалӣ карда мешавад, барои ҳисоб кардани шабакаи филогенетикии бе реша бо истифода аз санҷиши Phi барои санҷиши оморӣ истифода мешавад ва ҳадди аҳамиятнокӣ p = 0,05 аст. Таҳлили асосии бисёрсоҳаи Parsnp ҳамчун вуруд истифода мешавад ва таҷзияи тақсимшавӣ ҳамчун стандарти шабака амалӣ карда мешавад.
Губбинс қубури v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 бо параметрҳои пешфарз ҳамчун роҳи дигари арзёбии таъсири рекомбинатсия ба Mycobacterium bovis кор мекунад. Алгоритме, ки дар қубур амалӣ карда мешавад, насли дахлдори клонро барқарор мекунад. AF2122/97, LT708304.1) мутақобила мебошанд ва мавқеи SNP-ро дар ҳар як шохаи дарахт скан кунед, то кластери SNP-ро, ки ҳодисаи рекомбинатсияро ифода мекунад, муайян кунед, ки ин маънои онро дорад, ки SNP-ҳо дар шохаҳо баробар тақсим карда мешаванд Дарахти ML аз RAxML ҳамчун файлҳои воридотӣ истифода мешаванд.
Ниҳоят, барои тасдиқи ҳодисаи азнавташкилдиҳии аз ҷониби лӯлаи Губбинс пешниҳодшуда, шаш алгоритми дар RDP467 татбиқшуда (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 ва SiScan66) ба ҳамоҳангсозии асосии чандкаратаи Parsnp дар зери танзимоти пешфарз татбиқ карда мешаванд. Мо муайян кардем, ки ҳадди аққал се алгоритми дар RDP4 татбиқшуда бояд пайваста сигнали муҳимро барои тафтиши ҳар як ҳодисаи рекомбинатсия нишон диҳанд.
Бо дарназардошти он, ки ҳам Губбинс ва ҳам нармафзори RDP сигналҳои рекомбинатсияро тавассути тафтиши ҳамбастагии сершумори аслӣ дар равзанаи то 500 bp ҷустуҷӯ мекунанд ва тасдиқ мекунанд, ки дохил кардани генҳои PE/PPE ҳангоми монтажи де ново ба сигналҳои рекомбинатсияи пайдошуда халал намерасонад, таҳлили минбаъда тавассути гомолинеарӣ анҷом дода мешавад, ки наздикии генбиниро тафтиш кунед. Харитаи синлайнерӣ бо истифода аз геноми мукаммал бо истифода аз ҳамоҳангсозии MAUVE-мулти-геномӣ (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) барои истисно кардани транслокатсия ё инверсияи геномҳои маҳаллӣ сохта шудааст. Илова бар ин, тамоми геном барои анҷом додани таҳлили гомолинарӣ дар пайдарпаии аминокислотаҳо тавассути веб-сервери SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) истифода шуд.
Таҳлили амиқтари маҷмӯаи маълумоти геномӣ, ки аз системаи бисёрсоҳаи сили Португалия гирифта шудааст, тафтиши полиморфизми генҳои дар адабиёт зикршуда мебошад. Ин генҳо 37,38 ва ген рамзгузории 3R мебошанд, ки аз ҷониби аҷдодони MTBC тавассути ҷузъҳои системаи HGT (таъмири ДНК, репликатсия ва рекомбинатсия) ба даст оварда шудаанд 39. ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) истифода баред ва DnaSP v6.12.03 (http://www.clustal.org/clustal2/) истифода баред (http://www.ube/diversitet). гуногунии нуклеотидҳо (π) ва вуруди параметри санҷиши нейтралии D Tajima.
Дарахти филогенетикии максималии эҳтимолӣ (ML) дар асоси 69 изолятҳои Mycoplasma bovis ва геномҳои истинод ба даст оварда шуд (Расми 2А). Дар муқоиса бо дарахтони як ген ё дарахтони бисёрсоҳавӣ, ин стратегия имкон медиҳад, ки дарахтони тавонотаре тавлид шаванд, ки тағирёбии тамоми геномро дарбар намегиранд ва аз ин рӯ қобилияти камтари табъиз байни намудҳо 68,69 нишон медиҳанд. Сохтори топологии дарахти ML одатан ба таснифоти мураккаби клонҳо мувофиқат мекунад. Геномҳои Eu2 дар шоха ҷамъ шудаанд ва геноми Af1 низ дар якҷоягӣ ҷамъ шудаанд (расми 2А). Натиҷа инчунин ба робитаи эволютсионии маълуми Mycobacterium bovis мувофиқат мекунад, яъне байни узви Eu1 ва гурӯҳи иборат аз ҳама дигар комплексҳо ва геномҳои клоналӣ фарқияти калон вуҷуд дорад, аммо комплекси клоналӣ 30 муайян карда нашудааст. Мутобиқати хурди байни комплекси клоналӣ ва муносибати дар дарахти филогенетикӣ мушоҳидашударо бо он шарҳ додан мумкин аст, ки комплекси клоналӣ дар асоси минтақаҳои мушаххаси геномӣ тавсиф шудааст, дар ҳоле ки дарахти филогенетикӣ ба ҳамбастагии сершумори геномҳои аслӣ, ки тамоми геномро намояндагӣ мекунанд, асос ёфтааст.
Дарахти эҳтимолии максималии филогенетикӣ (GTR) дар асоси ҳамоҳангсозии геномҳои асосии геноми Mycobacterium bovis пеш аз (A) ва пас аз (B) хориҷ кардани макони рекомбинатсия сохта шудааст. Рангҳои шоха маҷмӯи клонҳои Mycobacterium bovis -ро ифода мекунанд: Аврупо 1 арғувон, Аврупо 2 сурх, Аврупо 3 кабуд, Африқо 1 норанҷӣ ва Африқо 2 сабз аст. Дарахт решакан ва ба миқёс кашида мешавад ва дарозии шоха ҳамчун ивазкунандаи ҳар як сайт чен карда мешавад.
Маҷмааи Mycobacterium tuberculosis ҳамчун клоналӣ таҳаввулшуда тавсиф карда мешавад ва аксари далелҳои дар тӯли солҳо ҷамъшуда ақидаро дастгирӣ мекунанд, ки рӯйдодҳои давомдори HGT ва рекомбинатсия дар сатҳи муайяншавандаи MTBC15,17,18 рух намедиҳанд.
Корҳои қаблӣ нишон доданд, ки байни штаммҳои MTBC метавонад рекомбинатсияи маҳдуд бошад20,21, дар ҳоле ки дигарон натавонистанд рӯйдодҳои рекомбинатсияи ченшавандаро муайян кунанд70,71. Ин масъаларо бо таваҷҷуҳ ба Mycobacterium bovis, ки аз кори қаблӣ, ки танҳо Mycobacterium tuberculosis 70,71 баррасӣ кардааст, фарқ мекунад, дубора баррасӣ кунед; ё MTBC-ро дар маҷмӯъ баррасӣ кунед, ки қариб ки M. bovis 20-ро ифода намекунад; ё танхо фракцияхои махдудкунандаи чорворо ба назар гиранд. Маҷмӯи маълумоти микобактерияҳо, дар ин кор, ҳамагӣ 70 штамм мавҷуданд, ки ҳама комплексҳои клониро намояндагӣ мекунанд, ки барои рекомбинатсия истифода мешаванд. Маҷмӯи маълумот аз рӯи чаҳор сатҳи ҷамъшуда миқёс карда мешавад: (1) аъзои Eu2, (2) ҳама аъзои маҷмааи клонҳои аврупоӣ (яъне Аврупо), (3) маҷмӯаи клонҳои аврупоӣ ва африқоӣ (Eu + Af) ва (4) тамоми маҷмӯаҳои маълумот (аз ҷумла геномҳое, ки ба ягон комплекси клонкунии аллакай тавсифшуда дохил карда нашудаанд).
Барои омӯзиши минбаъдаи ин гипотеза, шабакаи тақсимшудаи таҷзия барои арзёбии мавҷуд набудани рӯйдодҳои рекомбинатсия дар байни геномҳо анҷом дода шуд, зеро ин усул метавонад муносибати аҷдодии байни шахсони алоҳидаро тасаввур кунад ва сигналҳои филогенетикии мухолифро нишон диҳад. Ҳама чаҳор маҷмӯи додаҳо дар таҳлил мавҷудияти ҳалқаҳоро дар шабака тасдиқ карданд (яъне минтақаҳое, ки ба як дарахти ягона муттаҳид намешаванд), аммо санҷиши Phi дастгирии оморӣ надорад (Eu2, p = 0,0956; Аврупо, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; тамоми маҷмӯи маълумот далелҳои мавҷудияти 2 p = 1) ё мавҷудияти сусти 2 p45 мебошад. рӯйдодҳо (Расми 3A-D).
Дар Аврупо 2 геном (n = 37) (A), геномҳои аврупоӣ (n = 44) (B), геномҳои аврупоӣ ва африқоӣ (n = 51) (C) ва тамоми маҷмӯи маълумот (n = 70) (D).
Баъди ин тахлил ва бо назардошти мушохидахои цикли дар хамаи шабакахо алгоритми реконструкцияе, ки дар газопроводи Губбинс татбик карда шудааст, барои аз нав сохтани хати клоналй ва пурра намудани баходихии таъсири рекомбинатсия ба геноми М. Миқдори умумии ҳодисаҳои рекомбинатсияро, ки аксари онҳо дар шохаҳои терминалӣ (яъне дар як геном) рух додаанд, хулоса кунед (Ҷадвали 2). Ин нишондиҳандаҳо мувофиқати тамоми маҷмӯи маълумотро нишон медиҳанд ва нишон медиҳанд, ки басомади ҳодисаҳои рекомбинатсия нисбат ба мутатсияҳо аз 200 то 300 маротиба зиёд аст. Пас аз он ки параметри rho/theta, ки суръати нисбии рекомбинатсия ва мутатсияҳои нуқтаҳоро дар шоха ифода мекунад, байни 0,0037 ва 0,0056 ба назар мерасад (Ҷадвали 3). Ба наздикӣ, кори нашршудаи штамми 38 M. bovis арзиши баландтари rho/theta (rho/theta = 0.1) нисбат ба он ки дар ин маҷмӯаи додаҳо ба даст оварда шудааст, нишон дод, аммо кори Патане ва ҳамкорон ассамблеяро дар асоси истинод ба истинод ба параметрҳои рекомбинатсия истифода бурданд. филиали терминал.
Баъдан, параметри r/m таносуби гуногунии воридкунии рекомбинатсия ва мутатсияро ифода мекунад ва арзиши миёнаи он аз 0,025 то 0,037 мебошад, ки нишон медиҳад, ки дар муқоиса бо мутатсия, рекомбинатсия ба гуногунии генетикии M. bovis таъсири камтар дорад (Ҷадвали 3)). Барои муқоисаи васеъ, усули шабеҳ барои арзёбии параметри r/m барои маҷмӯи додаҳои MTBC, ки аз 23 геном иборат аст, истифода шуд, ки арзиши миёнаи 0,48620-ро нишон медиҳад, дар ҳоле ки барои Патане ва ҳамкасбони 38 M. bovis, он арзиши миёнаи 0,98 аст. Дар таҳқиқоти аввал, танҳо дутои 23 геномҳои ба кори M. bovis дохилшуда (M. bovis BCG ва штамми истинод), аз ин рӯ, арзиши бадастомада метавонад аз сабаби аз ҳад зиёд ифода кардани геноми M. tuberculosis ғаразнок бошад. Дар гузориши дуюм, популятсияҳои Mycobacterium bovis таҳлилшуда асосан аз Иёлоти Муттаҳида ва мизбонони чорво барқарор карда шуданд. Баръакси ин, дар маҷмӯаи маълумоти мо, маконҳои бештари ҷуғрофӣ ва намудҳои мизбон муаррифӣ карда мешаванд ва геномҳои ба комплексҳои гуногуни клоналӣ гурӯҳбандӣшуда бо хусусиятҳои генетикии популятсия низ истифода мешаванд ва ба ин васила ба дониши амиқтар ва васеътари Популятсия ноил мешаванд. Фарқи арзиши миёнаи r/m, ки бо маҷмӯаи маълумоти мо ба даст оварда шудааст, ба консепсия мувофиқат мекунад, ки дараҷаи рекомбинатсия дар байни наслҳои ба як намуди таксономӣ таъиншуда хеле фарқ мекунад, бинобар ин ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки комплекси клони M. bovis метавонад фарқиятҳои рекомбинатсияро нишон диҳад. Бо вуҷуди ин, ба таври назаррас васеъ кардани ин маҷмӯаи маълумот тавассути дохил кардани шумораи бештари геномҳои M. bovis имкон медиҳад, ки ин нукта боз ҳам равшантар шавад. Ҳарду параметрҳои r/m ва rho/theta фарқияти байни шохаҳоро нишон медиҳанд ва ин натиҷа бо гузоришҳо дар бораи дигар намудҳои бактерияҳо мувофиқат мекунад72,73.
Ниҳоят, барои тасдиқи рӯйдодҳои азнавташкилдиҳӣ, ки аз ҷониби лӯлаи Губбинс муайян карда шудааст, дар нармафзори RDP4 шаш алгоритми гуногун барои мустақилона санҷидани муқоисаҳои асосии гуногун истифода шуданд. Дар саросари ҷаҳон, камтар аз нисфи ҳодисаҳои муайянкардаи Губбинс аз ҷониби RDP4 тасдиқ карда шуданд (Ҷадвалҳои 4 ва 5). Бо назардошти тамоми маҷмӯи маълумот, се ҳодисаи рекомбинатсия тасдиқ карда шуд, ки ду гиреҳи дохилӣ ва дигаре бо иштироки як геном дар шохаи терминал, ки барои онҳо комплексҳои клоналӣ таъин карда намешаванд (Ҷадвалҳои 4 ва 5). Муайян кардани ҳодисаҳо дар шохаҳои терминал метавонад нишон диҳад, ки рекомбинатсия дар штаммҳои муосири M. bovis идома дорад ё натиҷа нодуруст ҷойгир шудааст70. Дар ин минтақаи рекомбинатсияи гипотетикӣ, тақрибан 20% мавқеъҳо нуклеотидҳои номуайян (N) доранд, ки ба сигнали рекомбинатсия таъсир мерасонанд (Расми иловагӣ 2). Илова бар ин, ин минтақа ба гени rrs таъсир мерасонад, ки РНК-и рибосомаи 16S-ро рамзгузорӣ мекунад, ки интизор меравад хеле ҳифз карда шавад, аз ин рӯ ин сигнали рекомбинатсияи тахминӣ метавонад натиҷаи хатогиҳои пайдарпайӣ ё номувофиқӣ бошад. Пас аз он тамоми ҳамоҳангии геномӣ байни Mb0003 ва Mycobacterium bovis AF2122/97 анҷом дода шуд ва мавҷудияти нуклеотидҳо ва SNP-ҳои номуайян тасдиқ карда шуд, аз ин рӯ мушкилоти эҳтимолии марбут ба ҳамоҳангсозии нодуруст аз сабаби иттилооти биологии дар ин кор татбиқшуда пас аз омӯзиши барнома пайдо нашуд.
Дар минтақаҳои рекомбинатсияи гиреҳҳои дохилӣ ягон холӣ ё нуклеотидҳои номуайян ёфт нашуд (Расмҳои 4 ва 5). Дар робита ба ин ҳодисаҳо, яке танҳо геноми Eu2-ро дар бар мегирад ва ба гени pks12 таъсир мерасонад, ки синтазаи эҳтимолии поликетидиро рамзгузорӣ мекунад; дар ҳоле ки дигаре дар геноми Eu1 сабт шудааст ва ба гени narX таъсир мерасонад, ки редуктазаи эҳтимолии нитратро рамзгузорӣ мекунад (Ҷадвали 4). Умуман, тањлили рекомбинатсия нишон медињад, ки шумораи мањдуди порчањои рекомбинатсия бо дастгирии оморї мављуд аст ва нишондињандањои хулосабарорї нишон медињанд, ки рекомбинатсия ба насли М.бовис таъсири кам дорад. Интизор меравад, ки сигнали рекомбинатсия паст бошад, аммо муҳим аст, ки сигнали таҳаввулоти ҳақиқӣ аз садои замина, ки вазифаи душвор аст, фарқ кунад. Барои кам кардани сигнали садое, ки дар асоси ассамблея ва мушкилоти номувофиқӣ 70, 71 ворид карда шудааст, ҳама боқимондаҳо, ба истиснои геноми мукаммал аз сифр ҷамъ карда шуданд ва сифати васлкунӣ тавассути таҳлили қубури QUAST тафтиш ва таъмин карда шуд (Ҷадвали иловагӣ 1). Илова бар ин, як қатор таҳлилҳои иловагӣ барои таъмини устуворӣ ва саҳеҳии тадқиқоти умумӣ гузаронида шуданд. Аз ин рӯ, сифати пайдарпайии генҳои narX ва pks12 тавассути харитаи хониш бар зидди Mycobacterium bovis AF2122/97 арзёбӣ карда шуд. Мавқеи тавсияшудаи SNP дар минтақаи рекомбинатсия бо истифодаи меъёрҳои дар фасли усул зикршуда тасдиқ карда шуд (ҳадди ақал 20 хониш ва басомади тағирёбии 0,9). Полиморфизми гени narX дар ду геном (Mb1792361 ва Mb7240415; 2,3%) ва геномҳои геноми pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17176es, Mb17176es ва Mb17175es пурра тасдиқ карда шуд. Бо вуҷуди ин, барои геноми Mb2043, шаш аз ҳашт мавқеъ ба меъёри умқи хониш мувофиқат намекунанд, зеро SNP бо ҳадди аксар 17 хондан дастгирӣ карда мешавад, ки аз арзиши муқарраршудаи 20 аст. Аз ин рӯ, рекомбинатсияи шаш геном (8,6%) дар ин макони геном метавонад тасдиқ карда шавад (Рақмҳои 4 ва 5).
Визуалнамоии муфассали ҳамоҳангсозии минтақаи рекомбинатсияи маҷмӯаи додаҳои Mycobacterium bovis ба гени narX таъсир мерасонад, ки редуктазаи эҳтимолии нитратро рамзгузорӣ мекунад. Дар минтақаи рекомбинатсияи гиреҳҳои дохилӣ ягон холӣ ё нуклеотидҳои номуайян ёфт нашуд. Ин ҳодисаи мушаххас дар геноми Eu1 сабт шудааст. Сифати пайдарпайии гени narX тавассути нақшаи хондани Mycobacterium bovis AF2122/97 арзёбӣ шуд. Ҷойгиршавии тавсияшудаи SNP-ро дар минтақаи рекомбинатсия бо истифода аз меъёрҳои дар фасли усул зикршуда тасдиқ кунед (ҳадди ақал 20 хониш ва басомади тағирёбии 0,9). Полиморфизми гени narX дар геномҳои Mb1792361 ва Mb7240415 (2,3%) пурра тасдиқ карда шуд.
Визуализатсияи муфассали ҳамоҳангсозии минтақаи рекомбинатсияи маҷмӯаи додаҳои Mycoplasma bovis, ки ба гени pks12 таъсир мерасонад. Дар минтақаи рекомбинатсияи гиреҳҳои дохилӣ ягон холӣ ё нуклеотидҳои номуайян ёфт нашуд. Дар бораи ҳодисае, ки ба гени pks12, ки синтазаи имконпазири поликетидро рамзгузорӣ мекунад, таъсир мерасонад, он танҳо геноми Eu2-ро дар бар мегирад. Сифати пайдарпайии pks12 тавассути харитаи хондани Mycobacterium bovis AF2122/97 арзёбӣ шуд. Ҷойгиршавии тавсияшудаи SNP-ро дар минтақаи рекомбинатсия бо истифода аз меъёрҳои дар фасли усул зикршуда тасдиқ кунед (ҳадди ақал 20 хониш ва басомади тағирёбии 0,9). Полиморфизмҳои геномҳои Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 ва Mb1960 пурра тасдиқ карда шудаанд.
Генҳои PE ва PPE минтақаҳои такроршаванда доранд, ки бо пайдарпайии Illumina ва нодуруст харитаи нодуруст хонда мешаванд, аз ин рӯ онҳо одатан аз ҷараёни кории биоинформатикаи аъзоёни M. tuberculosis танҳо ҳангоми истифодаи стратегияи харитасозӣ ба пайдарпай тоза карда мешаванд. Хулосаи рӯйдодҳои рекомбинатсия, ки дар ин кор истифода мешаванд, ба маҷлиси де нав бидуни филтр кардани PE/PPE асос ёфтааст. Мо боварӣ дорем, ки тавассути татбиқи се усул ва алгоритмҳои гуногуни иловагӣ тавассути SplitsTree, Gubbins лӯлаи ва нармафзори RDP4, стратегияҳои татбиқшаванда барои коркард ва филтр кардани минтақаҳои азнавташкилшуда, ки аз сигналҳои хатогӣ ба вуҷуд омадаанд, устувор мебошанд. Аммо, барои истисно кардани дахолати гени PE / PPE ба Gubbins ва нармафзори RDP4 барои муайян кардани кластерҳои SNP ва аз ин рӯ муайян кардани минтақаҳои рекомбинатсия, ки ба генҳои narX ва pks12 таъсир мерасонанд, ҳамсоягии ин генҳо тафтиш карда шуд (Расми иловагӣ 3-5). Дар M. bovis AF2122/97, гени narX бо narK2 ва Mb1764c ҷудо карда шудааст, дар ҳоле ки pks12 бо Mb2075c e Mb2073c иҳота шудааст (Расми иловагӣ 3-5). Харитае, ки бо истифода аз харитаи синлинии MAUVE геноми мукаммал сохта шудааст, маълумотро дар бораи нигоҳдорӣ ва азнавташкилдиҳии пайдарпайии генҳо медиҳад, ки чаҳор блоки коллинеариро нишон медиҳад ва аломатҳои транслокатсия ё инверсияи геномро нишон намедиҳад. Илова бар ин, таҳлили комплементатсия бо пайдарпаии аминокислотаҳо гомологияро дар ҳама геномҳои мукаммал исбот кард ва дар минтақаҳои ҳамсояи narX ё pks12 ягон PE/PPE ёфт нашуд. Барои narX, як геном (Mb0030) дорои холҳои синонимӣ камтар аст, зеро гени narX ҳамчун ду порча муайян карда шудааст (порчаҳои 1891 ва 1890). Барои pks12, аз сабаби шабоҳатҳо, Mb0030 ва Mb003 холҳои пасттарини синлинариро нишон доданд, дар ҳоле ки pks12 мутаносибан дар ду ва се порча муайян карда шуд, ки доменҳои гуногуни сафедаро намояндагӣ мекунанд (Расми иловагӣ 3-5). Бо дарназардошти ин маълумот ва нармафзори Gubbins ва RDP4 ҳарду таҳлилро анҷом медиҳанд, ҳамоҳангии асосии чандкаратаи ҳадди аксар 500 bp дар тирезаро тафтиш мекунанд, мо тасдиқ кардем, ки гени PE / PPE ба сигнали рекомбинатсия, ки ба narX ва pks12 таъсир мерасонад, халал намерасонад.
Ҳарчанд сигналҳои рекомбинатсия, ки дар ин маҷмӯаи додаҳо ошкор шудаанд, метавонанд боқимонда ҳисобида шаванд, дуруст аст, ки рекомбинатсия дар M. bovisро истисно кардан мумкин нест, аз ин рӯ он бояд мавзӯи таҳлили минбаъда бошад, ки дар он тамоми геномҳо аз сенарияҳои гуногуни эпидемиологӣ пайдарпай ба Муҳим аст.
Муқоисаи дарахтони филогенетикии ML, ки пеш аз ислоҳи рекомбинатсия ва пас аз ислоҳи рекомбинатсия ба даст оварда шудаанд (Расми 2А, В) ба тағйироти назаррас дар робитаи филогенетикии тахминшуда оварда нарасонд ва штаммҳои M. bovis дар як гурӯҳ гурӯҳбандӣ карда шуданд.
Пас аз харитасозии 42-и нави пайдарпайи M. bovis бо геномҳои истинодшудаи M. bovis AF2122/97, ҳамоҳангии SNP, ки 1816 мавқеъи полиморфӣ дорад, ба даст омад. Аксарияти SNPs (87,1%) дар минтақаи рамзгузорӣ ҷойгиранд ва генҳои зарардида мувофиқи категорияҳои функсионалии дар Bovilist нишон додашуда тавсиф карда мешаванд (Расми 6A, B). Бо дарназардошти шумораи умумии генҳо дар ҳар як категорияи функсионалӣ, генҳо дар категорияи "метаболизми липидҳо" бештар SNP-ро нишон доданд, пас аз он "процессҳои девори ҳуҷайра ва ҳуҷайраҳо" ва "мубодилаи мобайнӣ ва нафаскашӣ" нишон доданд, ки онҳо дар эволютсияи M. bovis мебошанд.
Таҳлили иерархивии маҷмӯи додаҳои M. bovis аз Португалия (n = 42). Шумораи умумии SNP-ҳои ба қайд гирифташуда ва генҳои зарардида барои ҳар як категорияи функсионалӣ (A). Шумораи умумии тағиротҳои синонимӣ ва ғайрисинонимӣ, ки аз рӯи категорияи функсия ба қайд гирифта шудаанд (B).
Дар миқёси ҷаҳонӣ, таносуби миёнаи dN/dS аз 1,5 беҳтар аст, ки ин нишон медиҳад, ки фишори эволютсионии ҷаҳонӣ барои раҳоӣ аз давлати аҷдодӣ аст ва сенарияи интихоби мусбат (диверсификатсия ё равонашуда) ва/ё озодии поксозӣ мебошад. Дар категорияҳои "вирулентӣ, детоксикатсия, мутобиқшавӣ", "пайвандҳои воридшавӣ ва фагҳо" ва "протеинҳои танзимкунанда" зиёда аз се ду ҳиссаи SNPҳо синоним нестанд (Расми 6B).
Дар ҳама категорияҳо генҳо бо SNP-ҳои сершумор мавҷуданд, ки дар натиҷа суръати миёнаи мутатсия (яъне SNP миёнаи як ген) аз 1 зиёдтар аст (Расми 6А). Pks12 (Mb2074c) бо 15 SNP ва fas (Mb2553c) бо 8 SNP дорои арзишҳои баланди мутатсия мебошанд. Ҳардуи ин генҳо дар мубодилаи кислотаҳои равғанӣ иштирок мекунанд. Ген pks поликетид синтазаро (PKS) рамзгузорӣ мекунад, ки як ферменти бисёрфунксионалӣ дар биосинтези липидҳои девори ҳуҷайраи микобактериявӣ иштирок мекунад74,75. Ин ген як полипептидҳои бисёрфунксионалиро рамзгузорӣ мекунад, ки дар синтези микокетидҳо иштирок мекунад74,76. Дар синтези кислотаи миколикӣ гени fas иштирок мекунад. Ҳардуи ин генҳо дар биосинтези девори ҳуҷайра дар тамос бо мизбон нақши муҳим доранд.
Барои омӯзиши минбаъдаи эволютсияи Mycobacterium bovis, ду маҷмӯи генҳои мушаххас таҳлил карда шуданд. Корҳои қаблан нашршуда бо истифода аз таркиби пайдарпай ва усулҳои филогенетикӣ генҳоро муайян карданд, ки аз ҷониби аҷдодони MTBC тавассути HGT пеш аз диверсификатсия ба даст оварда шудаанд37,38. Ин генҳо дар Ҷадвали иловагии 2 номбар шудаанд. Тақсимоти SNP дар маҷмӯъ 77 ген, ки метавонанд бо HGT алоқаманд бошанд, таҳлил карда шуданд ва 26 макони полиморфӣ муайян карда шуданд, ки дар аксари ҳолатҳо (78%) боиси тағироти ғайрисинонимӣ (NS) шуданд (Ҷадвали иловагӣ 2). Корҳои қаблӣ оид ба геномҳои MTBC нишон доданд, ки минтақаи тахминии HGT нисбат ба боқимондаи геном таносуби баландтари NS SNP-ро нишон медиҳад. Агар касе фикр кунад, ки ин минтақаҳои рекомбинатсияро аҷдодони MTBC ба даст овардаанд ва аз ин рӯ, онҳо полиморфизмҳои қадимиро аз ҳад зиёд муаррифӣ мекунанд, пас таносуби тағиротҳои синонимӣ баландтар аст, зеро интизор меравад, ки ивазкунии NS тавассути интихоби манфӣ аз сабаби тағирёбии кислотаи аминокислотаҳо бартараф карда шавад, метавонад вазифаи сафедаҳоро тағир диҳад. Аз ин рӯ, натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки оқибатҳои функсионалӣ метавонанд аз иваз кардани генҳои HGT монанд бошанд, ки аҳамияти онҳоро барои гуногунии генетикии мутобиқшавандаи арзишманд инъикос мекунад.
Дар баробари ин таҳлил, генҳои рамзгузори ҷузъҳои системаи 3R (таъмир, репликатсия ва рекомбинатсия) мувофиқи рӯйхате, ки қаблан аз ҷониби дос Вултос ва ҳамкорон (2008) нашр шуда буд, пурра тафтиш карда шуданд. Мубодилаи порчаҳои якхелаи ДНК-ро мустақиман мушоҳида кардан мумкин нест, гарчанде ки он метавонад як раванди зуд-зуд ҳангоми ҷалби бактерияҳои ба ҳам наздик, масалан дар мавриди ин маҷмӯи маълумот бошад; илова бар ин, ин раванд метавонад калиди усулҳои таъмири ДНК бошад72, бинобар ин дар рекомбинатсияи гомологӣ нақш мебозад. Ҳамагӣ 26 мавқеи полиморфӣ, ки аз ҷониби 54 ген тақсим карда шудаанд, муайян карда шуданд (Ҷадвали иловагӣ 3). Дар ин маҷмӯи генҳо, тағиротҳои NS тақрибан 65% оқибатҳоро ташкил медиҳанд, ки бо гузоришҳои қаблӣ дар бораи штаммҳои Mycobacterium tuberculosis мувофиқ аст.
Вақти интишор: октябр-21-2021