Tapadh leibh airson tadhal air Nature. Tha taic chuingealaichte aig an dreach brabhsair a tha thu a’ cleachdadh airson CSS. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu dreach nas ùire den bhrabhsair (no gun cuir thu dheth am modh co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). Aig an aon àm, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh sinn a’ taisbeanadh làraichean às aonais stoidhlichean agus JavaScript.
Tha sreath-ghinean air ath-bheothachadh a thoirt do raon rannsachaidh ghalaran gabhaltach, a’ nochdadh epidemio-eòlas ghalaran, pathogenesis, eadar-obrachadh aoigh-pathogen, agus am pròiseas mean-fhàsach a tha air a chuir air pathogens. Tha an co-thàth Mycobacterium tuberculosis (MTBC) a’ meas Mycobacterium bovis mar aon de na buill atharrachail bheathaichean aige a dh’ adhbhraicheas a’ chath-chìche (TB) ann am mamalan talmhaidh, agus tha e na mhodail àbhaisteach de mean-fhàs bacterial. Coltach ri buill MTBC eile, thathas a’ gabhail ris gur e pathogen a tha air a chlònadh gu teann, a tha ag atharrachadh gu slaodach, a th’ ann am Mycobacterium bovis, agus gu follaiseach chan eil comharradh sam bith ann air ath-chur no gluasad gine còmhnard. San obair seo, bidh sinn a’ cur genomics coimeasach an sàs ann an seata dàta sreath genome slàn (WGS) air a dhèanamh suas de 70 crodh M. bho dhiofar shliochdan (Roinn Eòrpa agus Afraga) gus lèirsinn fhaighinn air iomadachd ginteil cumhachd mean-fhàsach crodh M. Tha trì diofar dhòighean air an cleachdadh gus comharran ath-eagrachaidh a mheasadh. Gu cruinneil, chaidh àireamh bheag de thachartasan ath-chur a chomharrachadh agus a dhearbhadh le dà dhòigh neo-eisimeileach le taic làidir. A dh’ aindeoin sin, an taca ri mùthaidhean, tha buaidh nas laige aig ath-chur air iomadachd M. bovis (r/m iomlan = 0.037). Tha an diofar cuibheasach r/m a fhuaireadh ann an co-thàthadh clònail Mycobacterium bovis anns an t-seata dàta againn a rèir a’ bhun-bheachd choitcheann gum faod ìre an ath-chur atharrachadh gu mòr eadar na loidhnichean a tha air an sònrachadh don aon ghnè tacsonamach. Stèidhichte air an obair seo, chan urrainnear ath-chur ann am Mycobacterium bovis a dhiùltadh, agus mar sin bu chòir dha a bhith na chuspair air oidhirpean a bharrachd ann an rannsachadh genomics coimeasach san àm ri teachd, anns a bheil WGS de sheataichean dàta mòra bho dhiofar shuidheachaidhean epidemio-eòlach air feadh an t-saoghail deatamach. Chaidh mion-sgrùdadh a bharrachd a dhèanamh an uairsin air an t-seata dàta Mycobacterium bovis nas lugha (n = 42) bhon tricead TB ioma-aoigheachd, agus chaidh còrr air 1,800 loci a chomharrachadh, agus sheall co-dhiù aon shreath polymorphism niucleotide singilte (SNP). Tha a’ mhòr-chuid (87.1%) suidhichte anns an roinn còdaidh, agus tha an co-mheas cruinneil de atharrachaidhean neo-cho-chiallach (dN/dS) de atharrachaidhean co-chiallach nas àirde na 1.5, a’ nochdadh gur e taghadh adhartach feachd mean-fhàsach cudromach a tha air a chuir an gnìomh air M. bovis. Chaidh co-roinn nas àirde de SNPan a lorg ann an ginean a tha beairteach ann an roinnean gnìomhach de “metabolism lipid”, “balla cealla agus pròiseasan ceallach”, agus “metabolism eadar-mheadhanach agus anail”, a’ nochdadh an comas ann am bith-eòlas agus mean-fhàs cudromachd Mycobacterium bovis. Tha sùil nas mionaidiche air na ginean anns na sinnsearan MTBC a tha buailteach do ghluasad gine còmhnard agus a tha air an gabhail a-steach anns an t-siostam 3R (càradh DNA, ath-riochdachadh agus ath-chur) a’ nochdadh luach àicheil cuibheasach cruinneil deuchainn neodrach D Taijima, a tha a’ nochdadh sganadh roghnach san àm a dh’ fhalbh. Tha am bacadh o chionn ghoirid às deidh leudachadh sluaigh fhathast mar am prìomh adhbhar dràibhidh mean-fhàs airson a’ phataigin èigneachail Mycobacterium bovis a bhith a’ sabaid an aghaidh an aoigh.
’S e aon de na tacsaichean as soirbheachaile de pathogens bacteriach a th’ ann an co-thàthadh Mycobacterium tuberculosis (MTBC) agus ’s e cùis àbhaisteach de mean-fhàs bacteriach a th’ ann. Tha dearbh-aithne niùclasaid iongantach àrd aig na buill aige aig an ìre genomic (> 99%)1,2. Faodaidh diofar sheòrsaichean MTBC a’ chnatan mhòr (TB) adhbhrachadh, a tha na ghalar granulomatous gabhaltach, ann an raon farsaing de ghnèithean aoigheachd bho mhicro-mhamailean gu daoine3,4,5. An-dràsta, tha an co-thàthadh a’ toirt a-steach daoine [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] agus pathogens a tha air an atharrachadh gu beathaichean (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" agus "dassie")5,6. M. canettii (ris an canar cuideachd "Nodobacter glabrata") Tha an dearbh-aithne niùclasaid chuibheasach leis na mycobacteria a chaidh ainmeachadh roimhe 98%, agus tha obair genomics coimeasach air sealltainn gu bheil M. canettii agus a’ chòrr de MTBC air dealachadh o chionn ghoirid bhon sinnsear cumanta.7 A’ beachdachadh air a’ bhun-bheachd seo, tha cuid de ùghdaran a’ gairm M. canettii mar Bhall de MTBC 8.
Tha MTBC air a mhìneachadh gu siostamach mar cho-thàthadh clònail teann, agus tha structar a shluaigh air a riaghladh gu soilleir le iomadachd lùghdaichte, cnapan-starra, sganadh roghnach, agus gluasad ginteil9,10. A’ gabhail ris nach gabh mean-fhàs clònail teann iom-fhillte, leithid polymorphisms a tha a dhìth, ath-nuadhachadh le ath-chur. Stèidhichte air a’ bhun-bheachd seo, chaidh tachartasan leantainneach cuir às genomic na sgìre eadar-dhealaichte (RD) agus TbD1 (roinn cuir às sònraichte Mtb 1) a mholadh mar chomharran moileciuil air mean-fhàs MTBC2,5,11. Tha obair genomics coimeasach agus sreath genome iomlan (WGS) a’ toirt taic do roinneadh bhuill atharraichte do dhaoine ann an naoi loidhnichean (Mycobacterium tuberculosis L1 gu L4, L7, agus L8; agus Mycobacterium africanum L5, L6, agus L9), loidhnichean L2 gu L4 a’ roinn cuir às do roinn TbD12,11,12,13. A bharrachd air sin, thathas a’ moladh gum bi sinnsear cumanta aig buill a tha air an atharrachadh gu beathaichean, a tha air a mhìneachadh le sguabadh às sònraichte do chlade ann an RD7, RD8, RD9 agus RD102, 5, agus 14.
Thathas den bheachd gu bheil tachartasan gluasad gine còmhnard (HGT) agus ath-chur tearc agus a’ tachairt ann an sinnsearan MTBC, seach eachdraidh eadar-dhealaichte ball MTBC gu lèir15,16,17. Mhol dà aithisg thràth le Hughes agus co-obraichean (2002) agus Gutacker agus co-obraichean (2006) gum faodadh tachartasan ath-chur cuideachadh le bhith a’ cruthachadh polymorphisms a chomharraicheas loci sònraichte ann an sreathan M. tuberculosis18,19. Is iad na h-adhbharan airson dìth follaiseach ath-chur ann an MTBC: (1) am pròiseas meacanaigeach agus call comas HGT; (2) tearcachd thachartasan HGT; (3) chan eil cothrom ann air tachartasan ath-chur ann an àite MTBC14,17. O chionn ghoirid, tha cuid de sgrùdaidhean sreath-ghine iomlan (WGS) a chaidh a chur an sàs ann an sreath MTBC 20 agus Mycobacterium bovis 21 air fianais a thoirt seachad air ath-chur, a’ chiad fhear a sheall gu bheil sreathan MTBC gu tric ag iomlaid mìrean beaga DNA, ach air sgàth atharrachadh cuibhrichte sreath nucleotide, chan eil na tachartasan sin fhathast air an mothachadh.
’S e Mycobacterium bovis am ball MTBC as cumanta a lorgar bho sprèidh (crodh sa mhòr-chuid), ged a ghabhas a sgaradh bho bheathaichean fiadhaich saor-raoin agus feansaichte cuideachd4,22,23,24. Dh’fhàs M. bovis gu bhith na chòig prìomh cho-thàthaidhean clonal [Eòrpach 1 (Eu1), Eòrpach 2 (Eu2), Eòrpach 3 (Eu3), Afraganach 1 (Af1) agus Afraga 2 (Af2)], a rèir pròifil spoligotyping, cuir às sònraichte agus poileamorfaidhean niùclasaid singilte (SNPn) 25, 26, 27, 28, 29 ann an ginean sònraichte. Tha na co-thàthaidhean clonal seo a’ sealltainn structar eadar-mheasgte sluagh Mycobacterium bovis agus a cheangal ri roinnean cruinn-eòlasach. A bharrachd air an sin, dhealbhaich an obair WGS o chionn ghoirid a rinn Zimpel agus co-obraichean (2020) fìlogenachd stèidhichte air SNP Mycobacterium bovis, le còrr air 1,900 genome, a’ nochdadh gu bheil co-dhiù ceithir loidhnichean eadar-dhealaichte ann (air an ainmeachadh Lb1 gu Lb1 gu Lb4), chan eil iad gu tur co-chòrdail ris an iom-fhillte clonal a chaidh a mhìneachadh roimhe, ged a ghabhas dearbhadh cuideachd air sònrachas cruinn-eòlasach30. Rinn na h-ùghdaran seo mion-sgrùdadh eadar-dhealaichte air fìlogenachd agus cinn-latha moileciuil, ach cha do rinn iad sgrùdadh air ath-cho-chur30.
Nochd obair a rinneadh roimhe a’ cleachdadh diofar dhòighean moileciuil, leithid spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), agus typing SNP o chionn ghoirid ìre àraid de dh’ iomadachd ginteil am measg shreathan M. bovis 31,32,33, 34,35. Tha eadar-dhealachadh atharrachadh ginteil air a thighinn gu bhith na inneal cudromach ann an sgrùdadh epidemio-eòlas ghalaran, a tha cuideachail airson tuigse dhomhainn air pathogenesis, virulence agus sgaoileadh ghalaran. Tha nochdadh dòigh WGS a’ toirt cothrom na factaran dràibhidh mean-fhàsach a chuir genome Mycobacterium bovis an sàs ann am pròiseas atharrachadh agus buanseasmhachd gu diofar aoighean agus suidheachaidhean epidemio-eòlasach fhoillseachadh.
Anns an obair seo, bidh sinn a’ cleachdadh mion-sgrùdadh genomic coimeasach air diofar sheataichean dàta Mycoplasma bovis (n = 70), a’ gabhail a-steach isolates bho dhiofar cho-thàthaidhean clonal, gus lèirsinn fhaighinn air pròiseas mean-fhàsach Mycoplasma bovis, gu sònraichte gus dàimhean fìleogenetach agus tachartasan ath-chur a rèiteach. Mar chur-ris don mhion-sgrùdadh seo, chaidh fo-sheata dàta de isolates M. bovis (n = 42) a fhuaireadh bho sgìre ioma-aoigheachd tuberculosis a chaidh a chomharrachadh gu math ann am Portagal 31,36 a sgrùdadh tuilleadh gus neo-aithneachadh a dhearbhadh. An cothromachadh eadar an co-mheas coimeasach de ionadachadh niùclasaid ciall (dN) gu co-chiallach (dS), a bharrachd air tabhartas mean-fhàsach genomes sònraichte a chaidh ainmeachadh anns an litreachas, tha iad 37,38 air an faighinn le sinnsearan MTBC tro HGT, agus a’ còdachadh phàirtean gine siostam 3R (càradh DNA, ath-riochdachadh agus ath-chur) 39. Tagh ginean a fhuaireadh tro HGT oir is dòcha gu bheil iad a’ riochdachadh polymorphisms àrsaidh, agus mar sin thathar an dùil gum faodadh cuibhreann nas àirde de atharrachaidhean co-chiallach a bhith annta. Chaidh na ginean a tha air an gabhail a-steach san t-siostam 3R a thaghadh leis gun robh obair a rinneadh roimhe air sreathan M. tuberculosis a’ nochdadh taghaidhean àicheil/glanaidh coitcheann a bhios ag obair air na ginean sin, agus is dòcha gu bheil pàirt chudromach aca ann an mean-fhàs 39. Is e amas eile den obair seo a bhith a’ toirt a-mach gu bheil tachartasan ath-eagrachaidh ann. Air an adhbhar seo, leis nach eil anns an t-seata dàta againn à Portagal ach genomaichean co-thàthadh clòn Eòrpach 2 agus na sreathan nach do shònraich an co-thàthadh clòn, chuir sinn romhainn dàta genome a tha ri fhaighinn gu poblach a thoirt a-steach gus riochdaire fhaighinn mu dheireadh de na co-thàthaidhean clòn uile, agus gus neart agus leud nan toraidhean a leasachadh.
Tha 42 genome Mycoplasma bovis air an ath-sheicheamh bho shealladh ioma-aoigheachd dùthchasach Phortagail (mion-fhiosrachadh gu h-ìosal), a chaidh a chomharrachadh roimhe seo bho shealladh epidemio-eòlach36, aig cridhe na h-obrach seo. A’ beachdachadh nach eil anns an t-seata dàta à Portagal ach riochdairean de na co-thàthaidhean clòn Eòrpach 2 agus sreathan às aonais co-thàthaidhean ainmichte, chaidh dàta sreath-ghineamach slàn a tha ri fhaighinn gu poblach a chur ris gus an seata dàta a leudachadh a tha a’ toirt a-steach a h-uile riochdaire de na co-thàthaidhean clòn M. bovis. Mar sin, chaidh trì stòran dàta sreath-ghineamach slàn a chleachdadh san obair seo: cruinneachadh genome iomlan/dreachd, suas ri 10 sgafaill air an stòradh ann an NCBI (Ionad Nàiseanta airson Fiosrachadh Bith-theicneòlais) (n = 15 isolate); air a stòradh ann an SRA (tha am faidhle Illumina fastq den tasglann leughaidh sreath) a’ riochdachadh iomadachd iom-fhillte clònan M. bovis (n = 12 isolate)30; agus 42 genome air an ath-sheicheamh bho Phortagail. Chaidh Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) a thoirmeasg bhon rannsachadh NCBI. Mar as trice, thathas a’ cleachdadh M. bovis AF2122/97 mar ghineam iomraidh airson a ghabhail a-steach don t-seata dàta. Leis nach eil an t-sreath gineam slàn air a riochdachadh leis an iom-fhillte clònaidh African 1 ri fhaighinn don phoball, agus an àireamh bheag de ghineamaichean bho shreathan riochdachail de Af2 agus Eu1, chaidh an dàta sreath tùsail a thug SRA seachad a chleachdadh anns na cùisean sin. Chuidich obair Zimpel agus a cho-obraichean (2020) le bhith a’ comharrachadh a’ ghineam bhon iom-fhillte clònaidh a chaidh ainmeachadh agus chuidich e le bhith a’ taghadh Mycobacterium bovis airson a ghabhail a-steach don t-seata dàta. Airson Eu3, chan eil ach aon seòrsa gineam air a mhìneachadh (Branger et al., 2020), agus mar sin tha an gineam a tha sinn a’ gabhail a-steach na riochdaire air leth den iom-fhillte Eu3.
Gu cruinneil, tha an seata dàta seo a’ toirt a-steach 70 M. bovis crodh a chaidh a sgaradh bho 8 gnèithean aoigheachd, air an sgaoileadh ann an 12 dùthaich bho 1985 gu 2016. Tha 36 gnè air an ainmeachadh mar Eu2, 7 gnèithean mar Eu1, 1 gnè mar Eu3, 3 gnèithean mar Af1, 4 gnèithean mar Af2 agus chan eil 19 co-cheangailte ri co-thàthadh clònail sam bith (mion-fhiosrachadh gu h-ìosal). Tha am fiosrachadh mionaideach (a’ gabhail a-steach an àireamh inntrigidh) de Mycobacterium bovis a chaidh a chleachdadh san sgrùdadh seo air a shealltainn ann an Clàr 1 agus Clàr Leasachail 1.
Tha 42 genome slàn ùr-sheicheamhaichte de Mycobacterium bovis bho phrìomh àiteachan teth a’ chnatan-mhòr ann am Portagal agus air an sgaoileadh airson còrr is 12 bliadhna aig cridhe an sgrùdaidh seo, leis gu bheil siostaman galair fiadh-bheatha is sprèidh air an sgrùdadh gu cunbhalach 31,36 (Figear a bharrachd 1). A rèir modhan-obrach às dèidh sin, chaidh na sreathan seo a sgaradh bho chrodh (n = 14), fèidh ruadh (n = 16) agus torc fiadhaich (n = 12) bho 2003 gu 2015: cruinnich agus làimhsich beathaichean a rèir nan stiùiridhean protocol a thathar a’ moladh. Tha na sampallan clò ann an Leabhar-làimhe Bheathaichean Talmhaidh OIE agus tha iad air an cur ann am meadhan cruaidh agus meadhan leaghaidh pyruvate Stonebrink agus Löwenstein-Jensen. Tha na cultaran air an goir aig 37 °C agus tha fàs air a sgrùdadh aon uair san t-seachdain airson co-dhiù 12 seachdain. Tha na coloinidhean air an stòradh gu dìreach ann am fuasgladh glycerol aig -80ºC. Anns a’ mheadhan roghnach Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), chaidh na sampallan tùsail a chaidh a stòradh a chur tro aon phasgan in vitro in vitro gus DNA a’ phrògraim WGS fhaighinn. Airson seo, chaidh fuasgladh stoc a’ chultair reòta a bheairteachadh le 5% sodium pyruvate agus 10% ADS (50 g albumin, 20 g glùcois, 8.5 g sodium chloride ann an 1 L uisge) air Middlebrook 7H9 aig 37°C Retrain. Às dèidh 4 seachdainean de fhàs, chaidh am meadhan ùrachadh agus chaidh sùil a chumail air a’ chultar gu cunbhalach gus an deach fàs fhaicinn. Chaidh na ceallan a bhuain le bhith gan cur ann an ceudrifugation, chaidh am pellet ath-fhulang ann an 500 µL saline bufaireach fosfáit (PBS), a theasachadh aig 99 °C airson 30 mionaid, gan cuir ann an ceudrifugation, agus chaidh an t-supernatant a stòradh aig -20 °C gus an tèid WGS a dhèanamh. Tha a h-uile modh-obrach air a dhèanamh ann an goireasan bith-shàbhailteachd ìre 3.
Tha leabharlann genome ceann-paidhir WGS air ullachadh le bhith a’ cleachdadh clàr-amais sònraichte gach sampall DNA, agus a’ cleachdadh teicneòlas Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 sampall) agus HiSeq (2 × 150 pb) (dà eiseag) (Eurofins Genomics, a’ Ghearmailt) airson sreath. A rèir stiùiridhean an neach-dèanamh, cleachd an Illumina Genome Analyzer le ceangal modúl dà-cheann gus an DNA genomic a shreath, agus cleachd an Nextera XT DNA Library Prep Kit bho Illumina gus an leabharlann a thogail.
A’ toirt aire don dàta a fhuaireadh bhon SRA (n = 12), faodar comharrachadh an iom-fhillte clòn a chleachdadh mar mheata-dhàta an fhoillseachaidh co-fhreagarrach 30, 41, 43. Nuair a thathar a’ beachdachadh air a’ ghineam iomlan, ach a-mhàin Mycobacterium bovis AF2122/97 agus Mycobacterium bovis 3601, a tha nam buill aithnichte de iom-fhillteachd clònail Eu1 agus Eu3 25, 29, fa leth, tha e an aon rud ris a’ ghineam iomlan de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (àireamh inntrigidh NCBI NC_000962.3). Tha co-thaobhadh a’ ghineam air a dhèanamh a’ cleachdadh MAFFT (prògram co-thaobhadh ioma-fhillte de shreath amino-aigéid no niùclasaid, dreach 7.458) agus paramadair -addfragments48. An uairsin, rannsaich airson neo-làthaireachd iom-fhillteachd clònail eadar-dhealaichte agus/no làthaireachd fheartan SNP.
Tha an Mycobacterium bovis a chaidh a sheicheamh às ùr (n = 42) agus na leughaidhean tùsail den dreachd genome a chaidh a chruinneachadh (n = 3) a’ co-thaobhadh an iom-fhillte leis a’ genome iomraidh Mycobacterium tuberculosis H37Rv tron phìob-loidhne vSNP agus làthaireachd feartan cuir às agus/no SNP de chlònaichean eadar-dhealaichte. Chaidh rannsachadh a dhèanamh.
Cruinnich fiosrachadh bho dìth fheartan agus/no làthaireachd/neo-làthaireachd SNP agus pròifilean spoligotyping gus dàta genomic a shònrachadh don cho-thàthadh clonal co-fhreagarrach. Airson nan ceithir co-chruinneachaidhean dreachd, chan urrainnear am pròifil spoligotyping a thoirt a-mach, agus mar sin tha iad air an toirt a-steach don bhuidheann "gun cho-thàthadh".
Bidh an sruth-obrach bith-fhiosrachaidh a leanas an obair seo a’ tòiseachadh bho chruinneachadh de novo agus mapadh gu ro-innleachd iomraidh, leis an amas tachartasan ath-cho-chur agus poileamorfaidhean sònraichte genome a sgrùdadh. Tha Figear 1 a’ toirt seachad clàr-sruthadh de na ceumannan a leanas. Airson mion-sgrùdadh ath-cho-chur, thathas a’ cleachdadh a h-uile genome gus neart nan co-dhùnaidhean agus comharran co-cheangailte a mheudachadh.
Gus mearachdan a lughdachadh ann an gineadh sreathan co-aontachd genome, fhuair sinn an toiseach cruinneachadh de novo, agus an uairsin fhuair sinn ioma-cho-thaobhadh cridhe. Tha loidhne-phìoban Unicycler ri fhaighinn an-dràsta aig https://github.com/rrwick/Unicycler49 agus tha e air a chleachdadh gus cruinneachadh de novo a dhèanamh air 54 genome sreathichte (42 air an sreathachadh às ùr agus 12 faidhle fastq air an toirt air ais bho SRA). Ann an ùine ghoirid, mus deach a chruinneachadh bhon fhìor thoiseach, chaidh mion-sgrùdadh càileachd leughaidh a dhèanamh ann an FastQC dreach 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), agus Trimmomatic dreach 0.36 (roghainn "a’ gearradh Adapters agus sreathan sònraichte solais eile bho leughaidhean" agus "Gearr bunaitean bho dheireadh an leughaidh, ma tha e nas ìsle na càileachd na stairsnich de 20" air an cur an sàs) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. An uairsin, chaidh SPAdes optimizer49 a chleachdadh airson cruinneachadh genome, agus chaidh Pilon dreach 1.1851 a chleachdadh airson leasachadh às dèidh cruinneachadh. Chaidh modh drochaid glèidhteach a thaghadh gus casg a chur air cruinneachadh ceàrr, agus chaidh meud k-mer a sgrùdadh agus a thaghadh eadar 20% agus 95% den fhad leughaidh. Lean stiùiridhean SPAdes agus beachdaich air meud an leughaidh, cuir às do contigs nas lugha na 300 bp, agus stèidhich gearradh-dheth còmhdach doimhneachd 20 leughaidh de 52. Anns an ro-innleachd cruinneachaidh de novo, cha deach roinnean genomic leithid na paralogan proline-glutamate (PE) agus proline-proline glutamate (PPE) a tha air an ath-aithris gu mòr a thoirt air falbh.
Tha càileachd a’ cho-chruinneachaidh de novo air a mheasadh tron phìob-loidhne QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), a bhios a’ comasachadh ùrachadh an contig agus Mapadh genome iomraidh M. bovis AF2122/97 (àireamh inntrigidh NCBI LT708304.1) (faic Clàr-taice 1 airson paramadairean càileachd).
Le cuideachadh bhon phìob-loidhne vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), tha am faidhle FASTQ den M. bovis a chaidh a sheicheamhachadh o chionn ghoirid bho sheicheamhachadh Illumina air a choimeas ris a’ ghineam iomraidh M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). A rèir nan molaidhean cleachdaidh as fheàrr bhon Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, cuir paramadairean sìoltachain àbhaisteach no sgòran mais atharrachail an sàs airson ath-chalabrachadh. Tha na toraidhean air an sìoladh a’ cleachdadh an sgòr mais SAMtools as ìsle de 150 agus AC = 2. Cleachd Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) cuideachd gus na leughaidhean a sgrùdadh gus truailleadh a dhiùltadh. Bidh am pìob-loidhne vSNP a thathar a’ cleachdadh gus mapadh gu ro-innleachdan sreath san obair againn a’ sgrùdadh sreath de SNPan agus targaidean mìneachaidh, agus cuideachd a’ dùnadh a-mach suidheachaidhean gabhaltachd measgaichte. Tha còmhdach a’ ghineam leughaidh nas fheàrr na 99% (Clàr a bharrachd 1).
Gus mearachdan mapaidh agus SNPan ceàrr a sheachnadh, sìolaich a-mach caochladh anns na cùisean a leanas: (1) tha e air a chumail suas le nas lugha na 20 leughadh, (2) lorgar e le tricead nas lugha na 0.9, (3) tha e ann an co-dhiù aon Strains, ach co-dhiù tha beàrnan ann an strains eile. Chaidh an t-sealladair genomics amalaichte (IGV) dreach 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 a chleachdadh gus SNPan agus suidheachaidhean a dhearbhadh gu fradharcach le duilgheadasan mapaidh no co-thaobhadh. Leis gu bheil na ginean proline-glutamate (PE) agus proline-proline glutamate (PPE) air an dùblachadh gu mòr agus gu bheil iad nam pàirt de theaghlach ioma-ghine, tha iad furasta an tuigsinn le sreath agus mì-mhapadh Illumina, agus mar sin is fheàrr leotha. Thug sruth-obrach bith-fhiosrachaidh mycobacterial air falbh buill den cho-thàthadh tuberculosis nuair a bha iad a’ cleachdadh ro-innleachd mapadh gu sreath gus SNPan a dhearbhadh. Mar sin, shìolaidh sinn a-mach ginean PE/PPE agus indels bhon anailis.
A rèir Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), tha na SNPan uile air an roinn ann an roinnean gnìomhach. Tha loidhne-phìoban SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) air a chleachdadh gus builean SNP a dhearbhadh (atharrachaidhean co-chosmhail no neo-cho-chosmhail). Chruthaich iad stòr-dàta ùr de ghineam Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Chaidh an co-thaobhadh ioma-ghineamach cridhe a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh Parsnp v1.2, a tha ri fhaighinn an-dràsta aig https://github.com/marbl/parsnp57, a’ cleachdadh 69 co-chruinneachaidhean genome/dreachd iomlan (leis an roghainn -c) agus thathas a’ cleachdadh M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) mar iomradh. Chaidh ceithir co-thaobhadh ioma-ghineamach cridhe a dhèanamh: dìreach buill an iom-fhillte clònaidh Eu2 (n = 37), a’ gabhail a-steach a h-uile ball den iom-fhillte clònaidh Eòrpach (n = 44), a’ gabhail a-steach puing ceangail an iom-fhillte clònaidh Eòrpaich is Afraganach (n = 51), agus a’ gabhail a-steach a h-uile Mycobacterium bovis san sgrùdadh seo (n = 70).
Tha an co-thaobhadh cridhe a chaidh a chruthachadh le Parsnp air a chleachdadh gus craobh fìleogenetach an coltachd as motha (ML) a dhearbhadh a’ cleachdadh CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 a’ cleachdadh RAxML, agus gus 1000 ath-riochdachadh treòraichte a dhèanamh.
Bithear a’ cleachdadh trì algairidhean agus innealan bith-fhiosrachaidh eadar-dhealaichte gus sgrùdadh a dhèanamh airson tachartasan ath-choinneachaidh aig an aon àm: bathar-bog SplitsTree4, loidhne-phìoban Gubbins (loidhne-loidhne neo-chlaon tro ath-choinneachadh ann an sreathan niùclasaid), agus bathar-bog RDP4 (prògram lorg ath-choinneachaidh, dreach beta 4.101).
Tha an dòigh-obrach lobhadh-roinnte a chaidh a chur an gnìomh ann an SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 air a chleachdadh gus an lìonra fìleogenetach gun fhreumhan obrachadh a-mach, a’ cleachdadh deuchainn Phi airson dearbhadh staitistigeil, agus is e p = 0.05 an stairsneach cudromachd. Tha mion-sgrùdadh ioma-ailineachaidh bunaiteach Parsnp air a chleachdadh mar chur-a-steach, agus tha an lobhadh-roinnte mar inbhe lìonra air a thoirt gu buil.
Bidh loidhne-phìoban Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) ag obair le paramadairean bunaiteach mar dhòigh eile air measadh a dhèanamh air buaidh ath-chur air Mycobacterium bovis. Bidh an algairim a chaidh a chur an gnìomh anns a’ phìob-phìoban ag ath-chruthachadh an loidhne-chlòn buntainneach. Tha cruinneachadh genome/dreachd iomlan an t-seata dàta againn agus an genome iomraidh (bovine bovid AF2122/97, LT708304.1) an urra ri chèile; agus a’ sganadh suidheachadh an SNP air gach meur den chraoibh gus an cruinneachadh SNP a lorg a tha a’ riochdachadh an tachartais ath-chur. Neoni a’ mheòir. Gabh ris nach eil tachartas ath-chur ann, a tha a’ ciallachadh gum bu chòir na SNPn a tha a’ tachairt air a’ mheur a bhith air an sgaoileadh gu cothromach. Tha an co-thaobhadh ioma-chridhe cridhe bho Parsnp agus a’ chraobh ML leis an sgòr as fheàrr bho RAxML air an cleachdadh mar fhaidhlichean cuir-a-steach.
Mu dheireadh, gus an tachartas ath-eagrachaidh a mhol loidhne-phìoban Gubbins a dhearbhadh, tha na sia algairim a chaidh a chur an gnìomh ann an RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 agus SiScan66) air an cur an sàs ann an co-thaobhadh ioma-chridheach Parsnp fo na roghainnean bunaiteach. Cho-dhùin sinn gum feum co-dhiù trì de na h-algairim a chaidh a chur an gnìomh ann an RDP4 comharra cudromach a nochdadh gu cunbhalach gus gach tachartas ath-cho-chur a dhearbhadh.
A’ beachdachadh gu bheil bathar-bog Gubbins agus RDP le chèile a’ coimhead airson comharran ath-choinneachaidh le bhith a’ sgrùdadh nan iomadh co-thaobhadh bunaiteach ann an uinneag suas ri 500 bp, agus a’ dearbhadh nach cuir toirt a-steach ginean PE/PPE rè co-chruinneachadh de novo bacadh air na comharran ath-choinneachaidh a lorgar, thèid tuilleadh mion-sgrùdaidh a dhèanamh le bhith a’ sgrùdadh co-chosmhaileachd faisg air a’ ghine a tha a’ comharrachadh an tachartais ath-choinneachaidh. Chaidh am mapa co-chosmhail a’ cleachdadh a’ ghìona iomlan a thogail a’ cleachdadh co-thaobhadh MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) gus gluasadan no tionndaidhean genome ionadail a thoirmeasg. A bharrachd air an sin, chaidh an genome gu lèir a chleachdadh gus mion-sgrùdadh co-chosmhaileachd a dhèanamh air an t-sreath amino-aigéid tron fhrithealaiche lìn SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Is e sgrùdadh nas doimhne air an t-seata dàta genome a fhuaireadh bhon t-siostam ioma-aoigheachd tuberculosis Portagail sgrùdadh a dhèanamh air polymorphism nan ginean a tha air an ainmeachadh anns an litreachas. Is iad sin na ginean37,38 agus an gine a tha a’ còdachadh 3R a fhuair sinnsearan MTBC tro phàirtean siostam HGT (càradh, ath-riochdachadh agus ath-chur DNA)39. Cleachd ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) agus cleachd DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) gus iomadachd gine agus iomadachd niùclasaid (π) agus cuir a-steach paramadair deuchainn neodrach D Tajima obrachadh a-mach.
Fhuaireadh craobh fìleogenetach le coltachd as motha (ML) stèidhichte air 69 de dh’eisimpleirean Mycoplasma bovis agus genomaichean iomraidh (Figear 2A). An coimeas ri craobhan stèidhichte air aon ghine no craobhan stèidhichte air ioma-locus, leigidh an ro-innleachd seo le craobhan nas cumhachdaiche a chruthachadh nach eil a’ glacadh caochlaideachd a’ genoma gu lèir agus mar sin a’ nochdadh comas nas ìsle airson eadar-dhealachadh a dhèanamh eadar gnèithean 68,69. Mar as trice bidh structar topaigeach craobh ML a rèir seòrsachadh iom-fhillte chlònaichean. Tha genoma Eu2 air a chruinneachadh ann am meur, agus tha genoma Af1 cuideachd air a chruinneachadh còmhla (Figear 2A). Tha an toradh cuideachd a rèir an dàimh mean-fhàsach aithnichte de Mycobacterium bovis, is e sin, tha eadar-dhealachadh mòr eadar ball Eu1 agus a’ bhuidheann anns a bheil a h-uile co-thàthadh clonal agus genoma eile, ach chan eil an co-thàthadh clonal 30 air a shònrachadh. Faodar an neo-chunbhalachd bheag eadar an co-thàthadh clonal agus an dàimh a chithear air a’ chraobh phylogenetic a mhìneachadh leis gu bheil an co-thàthadh clonal air a mhìneachadh stèidhichte air roinnean genomic sònraichte, agus gu bheil a’ chraobh phylogenetic stèidhichte air iomadh co-thaobhadh de phrìomh genomes a’ riochdachadh a’ genoma gu lèir.
Tha a’ chraobh fìleogenetach leis an coltachd as àirde (GTR) air a togail stèidhichte air co-thaobhadh cridhe a’ ghìoma Mycobacterium bovis ro (A) agus às dèidh (B) toirt air falbh an làrach ath-mheasgaidh. Tha dathan na meòir a’ riochdachadh co-thàthadh clòn Mycobacterium bovis: tha an Roinn Eòrpa 1 purpaidh, tha an Roinn Eòrpa 2 dearg, tha an Roinn Eòrpa 3 gorm, tha Afraga 1 orains, agus tha Afraga 2 uaine. Tha freumh na craoibhe agus air a tarraing gu sgèile, agus tha fad na meòir air a thomhas mar àite airson gach làrach.
Thathas a’ toirt cunntas air co-thàthadh Mycobacterium tuberculosis mar rud a chaidh a leasachadh gu clonal, agus tha a’ mhòr-chuid den fhianais a chruinnich thar nam bliadhnaichean a’ toirt taic don bheachd nach tachair tachartasan HGT agus ath-chuingealachaidh leantainneach aig an ìre a ghabhas lorg de MTBC15,17,18.
Tha obair a rinneadh roimhe air sealltainn gum faodadh ath-cho-chur cuibhrichte a bhith eadar sreathan MTBC20,21, agus nach do shoirbhich le cuid eile tachartasan ath-cho-chur tomhaiste a chomharrachadh70,71. Ath-bhruidhinn air a’ chùis seo le fòcas air Mycobacterium bovis, a tha eadar-dhealaichte bhon obair a rinneadh roimhe nach do bheachdaich ach air Mycobacterium tuberculosis70,71; no beachdaich air MTBC gu h-iomlan, le cha mhòr nach eil M. bovis a’ riochdachadh20; no beachdaich air bloighean crodh cuibhrichte a-mhàin. Anns an t-seata dàta mycobacteria, san obair seo, tha 70 sreath gu h-iomlan, a’ riochdachadh a h-uile co-thàthadh clonal, air an cleachdadh gus sgrìonadh airson ath-cho-chur. Tha an seata dàta air a sgèileadh a rèir ceithir ìrean cruinnichte: (1) buill Eu2, (2) a h-uile ball de cho-thàthadh clonal Eòrpach (ie An Roinn Eòrpa), (3) co-thàthadh clonal Eòrpach is Afraganach (Eu + Af) agus (4) na cruinneachaidhean dàta gu lèir (a’ gabhail a-steach genomes nach eil air an toirt a-steach ann an co-thàthaidhean clonal sam bith a chaidh a mhìneachadh mar-thà).
Gus an teòiridh seo a sgrùdadh tuilleadh, chaidh lìonra roinnte-loisgidh a dhèanamh gus measadh a dhèanamh air dìth thachartasan ath-cho-chur eadar genomes, leis gum faod an dòigh seo an dàimh shinnsireil eadar daoine fa leth a dhèanamh follaiseach agus comharran fìleogenetach connspaideach a thaisbeanadh. Dhearbh na ceithir seataichean dàta san anailis gu robh lùban anns an lìonra (is e sin, raointean nach eil a’ tighinn còmhla ann an aon chraoibh), ach chan eil taic staitistigeil aig deuchainn Phi (Eu2, p = 0.0956; An Roinn Eòrpa, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; an seata dàta gu lèir p = 0.2451), a tha a’ toirt seachad fianais bochd airson gu bheil tachartasan ath-eagrachaidh ann (Figear 3A-D).
Anns an Roinn Eòrpa 2 ghineam (n = 37) (A), gineam Eòrpach (n = 44) (B), gineam Eòrpach is Afraganach (n = 51) (C) agus an seata dàta gu lèir (n = 70) (D).
Às dèidh na mion-sgrùdaidh seo, agus a’ toirt aire do na beachdan cearcallach anns na lìonraidhean uile, chaidh an algairim ath-thogail a chaidh a chur an gnìomh ann am pìob-loidhne Gubbins a chur an sàs gus an loidhne-chlòn ath-thogail agus gus cur ris an tuairmse air buaidh an ath-chur air genome M. bovis. Thoir a-mach an àireamh chruinnichte de thachartasan ath-chur, a’ mhòr-chuid dhiubh a thachair ann am meuran crìochnachaidh (is e sin, ann an aon genome) (Clàr 2). Tha na comharran seo a’ sealltainn cunbhalachd an t-seata dàta gu lèir agus a’ nochdadh gu bheil tricead thachartasan ath-chur 200 gu 300 uair nas motha na tricead mùthaidhean. Cho luath ‘s a nochdas am paramadair rho/theta a tha a’ riochdachadh nan ìrean coimeasach de ath-chur agus mùthaidhean puing air a’ mheur eadar 0.0037 agus 0.0056 (Clàr 3). O chionn ghoirid, sheall an obair a chaidh fhoillseachadh air a’ ghnè 38 M. bovis luach rho/theta nas àirde (rho/theta = 0.1) na an luach a fhuaireadh san t-seata dàta seo, ach chleachd obair Patané agus a cho-obraichean cruinneachadh stèidhichte air iomradh gus paramadairean ath-cheangail a dhearbhadh. Tha mion-fhiosrachadh modh-obrach, mar thoradh air a’ mhodh-obrach cruinneachaidh, air a bhith co-cheangailte ri pailteas thachartasan ath-cheangail a tha fo amharas anns a’ mheur deireannach.
An ath rud, tha am paramadair r/m a’ riochdachadh co-mheas iomadachd ath-chur agus toirt a-steach mùthaidhean, agus tha a luach cuibheasach eadar 0.025 agus 0.037, a’ nochdadh, an taca ri mùthaidhean, gu bheil buaidh iomlan nas ìsle aig ath-chur air iomadachd ginteil M. bovis (Clàr 3)). Airson coimeas farsaing, chaidh dòigh coltach ris a chleachdadh gus am paramadair r/m a mheasadh airson an t-seata dàta MTBC air a dhèanamh suas de 23 genome, a’ sealltainn luach cuibheasach de 0.48620, agus airson seata dàta 38 M. bovis aig Patané agus a cho-obraichean, dhearbh e gur e 0.98 an luach cuibheasach. Anns a’ chiad sgrùdadh, cha robh ach dhà de na 23 genome a chaidh a ghabhail a-steach ann an obair M. bovis (M. bovis BCG agus an strain iomraidh), agus mar sin is dòcha gu bheil an luach a fhuaireadh claon air sgàth cus-chur genome M. tuberculosis. Anns an dàrna aithisg, chaidh na sluaghan Mycobacterium bovis a chaidh a sgrùdadh fhaighinn air ais sa mhòr-chuid bho na Stàitean Aonaichte agus aoighean sprèidh. An coimeas ri sin, anns an t-seata dàta againn, tha barrachd àiteachan cruinn-eòlasach agus gnèithean aoigheachd air an riochdachadh, agus thathas a’ cleachdadh genomaichean air an cruinneachadh ann an diofar cho-thàthaidhean clonal le feartan ginteil sluaigh eadar-dhealaichte, agus mar sin a’ coileanadh eòlas sluaigh nas doimhne agus nas fharsainge. Tha an diofar luach cuibheasach r/m a fhuaireadh leis an t-seata dàta againn a rèir a’ bhun-bheachd gu bheil an ìre ath-chur gu math eadar-dhealaichte eadar na loidhnichean a chaidh a shònrachadh don aon ghnè tacsonamach, agus mar sin tha na toraidhean seo a’ nochdadh gum faodadh eadar-dhealachaidhean ath-chur a bhith aig co-thàthadh clòn M. bovis. Tha a’ bhuaidh cuideachd mar a mhol Didelot & Maiden72. A dh’aindeoin sin, le bhith a’ leudachadh an t-seata dàta seo gu mòr le bhith a’ toirt a-steach àireamh nas motha de genomaichean M. bovis leigidh sin le soilleireachadh a bharrachd air a’ phuing seo. Tha an dà chuid paramadairean r/m agus rho/theta a’ sealltainn caochlaideachd eadar geugan, agus tha an toradh seo a rèir aithisgean air gnèithean bacterial eile72,73.
Mu dheireadh, gus na tachartasan ath-eagrachaidh a chomharraich loidhne-phìoban Gubbins a dhearbhadh, chaidh sia algairidhean eadar-dhealaichte a chleachdadh ann am bathar-bog RDP4 gus coimeasan ioma-chridheach eadar-dhealaichte a dhearbhadh gu neo-eisimeileach. Gu cruinneil, chaidh nas lugha na leth de na tachartasan a chomharraich Gubbins a dhearbhadh le RDP4 (Clàran 4 agus 5). A’ beachdachadh air an t-seata dàta gu lèir, chaidh trì tachartasan ath-cho-chur a dhearbhadh, dhà a’ toirt a-steach nodan a-staigh agus am fear eile a’ toirt a-steach aon genome ann am meur crìochnachaidh, nach b’ urrainnear co-thàthaidhean clonal a shònrachadh dhaibh (Clàran 4 agus 5). Dh’ fhaodadh comharrachadh thachartasan ann am meuran crìochnachaidh a bhith a’ nochdadh gu bheil an ath-cho-chur fhathast a’ dol air adhart ann an sreathan co-aimsireil M. bovis no gu bheil an toradh air a chur ceàrr70. Anns an roinn ath-cho-chur mac-meanmnach seo, tha niùclasaidean neo-mhìnichte (N) aig timcheall air 20% de na suidheachaidhean, agus mar sin a’ toirt buaidh air a’ chomharra ath-cho-chur (Figear a bharrachd 2). A bharrachd air an sin, tha an roinn seo a’ toirt buaidh air a’ ghine rrs, a’ còdachadh an RNA ribosomal 16S a thathar an dùil a bhith air a ghleidheadh gu mòr, agus mar sin is dòcha gur e toradh mhearachdan sreath no mì-thaobhadh a th’ anns a’ chomharra ath-cho-chur seo. An uairsin chaidh co-thaobhadh iomlan a’ ghìoma eadar Mb0003 agus Mycobacterium bovis AF2122/97 a dhèanamh, agus chaidh dearbhadh gu robh niùclasaid agus SNPan neo-mhìnichte ann, agus mar sin cha robh na duilgheadasan a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ris an co-thaobhadh ceàrr mar thoradh air an fhiosrachadh bith-eòlasach a chaidh a chur an gnìomh san obair seo. Nochd e às dèidh dhomh am prògram ionnsachadh.
Cha deach beàrnan no niùclasaid neo-mhìnichte a lorg ann an roinnean ath-cho-chur nan nodan a-staigh (Figearan 4 agus 5). A thaobh nan tachartasan sin, chan eil ach genome Eu2 ann an aon dhiubh agus tha e a’ toirt buaidh air a’ ghine pks12, a tha a’ còdachadh synthase polyketide a dh’fhaodadh a bhith ann; agus tha am fear eile clàraichte ann an genome Eu1 agus a’ toirt buaidh air a’ ghine narX a tha a’ còdachadh nitrate reductase a dh’fhaodadh a bhith ann (Clàr 4). San fharsaingeachd, tha an anailis ath-cho-chur a’ sealltainn gu bheil àireamh chuingealaichte de bhloighean ath-cho-chur ann le taic staitistigeil, agus tha na comharran a chaidh a thoirt a-mach a’ nochdadh gu bheil buaidh bheag aig an ath-cho-chur air loidhne M. bovis. Thathar an dùil gum bi an comharra ath-cho-chur ìosal, ach tha e cudromach an fhìor chomharra mean-fhàs a dhealachadh bhon fhuaim chùl-fhiosrachaidh, rud a tha na obair dhùbhlanach. Gus an comharra fuaim a chaidh a thoirt a-steach le duilgheadasan co-chruinneachaidh agus mì-cho-fhreagarrachd stèidhichte air iomradh 70, 71 a lughdachadh, chaidh a h-uile càil eile ach a-mhàin an genome iomlan a chruinneachadh bhon fhìor thoiseach, agus chaidh càileachd a’ cho-chruinneachaidh a sgrùdadh agus a dhèanamh cinnteach le mion-sgrùdadh loidhne-phìoban QUAST (Clàr a bharrachd 1). A bharrachd air sin, chaidh sreath de mhion-sgrùdaidhean a bharrachd a dhèanamh gus dèanamh cinnteach à neart agus cruinneas an sgrùdaidh iomlan. Mar sin, chaidh càileachd sreath nan ginean narX agus pks12 a mheasadh le bhith a’ mapadh leughaidh an aghaidh Mycobacterium bovis AF2122/97. Chaidh an suidheachadh SNP a thathar a’ moladh anns an roinn ath-cho-chur a dhearbhadh le bhith a’ cur an sàs na slatan-tomhais a chaidh ainmeachadh anns an earrann modh-obrach (co-dhiù 20 leughadh agus tricead atharrachaidh 0.9). Chaidh ioma-mhorfachd a’ ghine narX a dhearbhadh gu h-iomlan anns an dà ghineam (Mb1792361 agus Mb7240415; 2.3%) agus ginean a’ ghineam pks12: ginean Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, agus Mb12. Ach, airson a’ ghineam Mb2043, chan eil sia de na h-ochd suidheachaidhean a’ coinneachadh ris an slatan-tomhais doimhneachd leughaidh leis gu bheil an SNP air a chumail suas le 17 leughaidhean aig a’ char as àirde, a tha nas ìsle na an luach gearraidh stèidhichte de 20. Mar sin, faodar ath-chur sia gineam (8.6%) aig an làrach gineam seo a dhearbhadh (Figearan 4 agus 5).
Tha an dealbh mionaideach de cho-thaobhadh roinn ath-chur an t-seata dàta Mycobacterium bovis a’ toirt buaidh air a’ ghine narX a bhios a’ còdachadh nitrate reductase a dh’fhaodadh a bhith ann. Cha deach beàrnan no niùclasaidean neo-mhìnichte a lorg ann an roinn ath-chur nan nódan a-staigh. Tha an tachartas sònraichte seo clàraichte ann an genome Eu1. Chaidh càileachd sreath a’ ghine narX a mheasadh le bhith a’ plotadh leughaidhean Mycobacterium bovis AF2122/97. Dearbhaich an t-àite SNP a thathar a’ moladh anns an raon ath-chur le bhith a’ cur an sàs na slatan-tomhais a chaidh ainmeachadh anns an earrann modh (co-dhiù 20 leughadh agus tricead atharrachaidh 0.9). Chaidh polymorphism a’ ghine narX a dhearbhadh gu h-iomlan ann an genomes Mb1792361 agus Mb7240415 (2.3%).
Sealladh mionaideach air co-thaobhadh roinn ath-chur an t-seata dàta Mycoplasma bovis a’ toirt buaidh air a’ ghine pks12. Cha deach beàrnan no niùclasaid neo-mhìnichte a lorg ann an roinn ath-chur nan nódan a-staigh. A thaobh an tachartais a’ toirt buaidh air a’ ghine pks12 a tha a’ còdachadh synthase polyketide a dh’fhaodadh a bhith ann, chan eil ann ach genome Eu2. Chaidh càileachd sreath pks12 a mheasadh le mapadh leughaidh Mycobacterium bovis AF2122/97. Dearbhaich an t-àite SNP a thathar a’ moladh anns an raon ath-chur le bhith a’ cur an sàs na slatan-tomhais a chaidh ainmeachadh anns an earrann modh (co-dhiù 20 leughadh agus tricead atharrachaidh 0.9). Chaidh polymorphisms genomes Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, agus Mb1960 a dhearbhadh gu h-iomlan.
Tha roinnean ath-aithriseach aig ginean PE agus PPE a tha furasta an leughadh ceàrr le sreath-sgrùdadh agus mapadh ceàrr Illumina, agus mar sin mar as trice chan eil iad air an toirt às an t-sruth-obrach bith-fhiosrachaidh de bhuill M. tuberculosis ach nuair a thathar a’ cleachdadh an ro-innleachd mapadh-gu-sreath. Tha an co-dhùnadh mu thachartasan ath-chur a chaidh a chur an sàs san obair seo stèidhichte air cruinneachadh de novo gun PE/PPE a shìoladh a-mach. Tha sinn a’ creidsinn, le bhith a’ cur an gnìomh trì dòighean agus algairidhean co-phàirteach eadar-dhealaichte tro SplitsTree, loidhne-phìoban Gubbins agus bathar-bog RDP4, gu bheil na ro-innleachdan a chaidh a chur an sàs làidir ann a bhith a’ giullachd agus a’ sìoladh nan roinnean ath-eagraichte air adhbhrachadh le comharran mearachd. Ach, gus casg a chuir air bacadh a’ ghine PE/PPE air bathar-bog Gubbins agus RDP4 gus cruinneachaidhean SNP a chomharrachadh, agus mar sin comharrachadh nan roinnean ath-chur a thathar a’ moladh a bheir buaidh air na ginean narX agus pks12, chaidh nàbachd nan ginean sin a sgrùdadh (Figear a bharrachd 3–5). Ann am M. bovis AF2122/97, tha an gine narX air a sgaradh le narK2 agus Mb1764c, agus tha pks12 air a chuairteachadh le Mb2075c agus Mb2073c (Figear a bharrachd 3-5). Tha am mapa a chaidh a chruthachadh a’ cleachdadh mapa co-shìnte MAUVE den genome iomlan a’ toirt seachad fiosrachadh mu ghleidheadh agus ath-rèiteachadh sreath gine, a’ sealltainn ceithir blocaichean co-loidhneach, agus gun chomharran air gluasad no tionndadh a’ genome. A bharrachd air an sin, dhearbh an anailis co-phàirteachaidh leis an t-sreath amino-aigéid an co-chosmhaileachd anns na genomes iomlan uile, agus cha deach PE/PPE a lorg anns na roinnean faisg air làimh de narX no pks12. Airson narX, tha sgòr co-shìnte nas ìsle aig aon genome (Mb0030) leis gun deach an gine narX a chomharrachadh mar dhà phìos (pìosan 1891 agus 1890). A thaobh pks12, air sgàth choimeasgaidhean, sheall Mb0030 agus Mb003 sgòran co-loidhneachd nas ìsle, agus chaidh pks12 a chomharrachadh ann an dà agus trì pìosan, fa leth, a’ riochdachadh raointean eadar-dhealaichte den phròtain (Figear a bharrachd 3-5). A’ toirt aire don fhiosrachadh seo, agus bathar-bog Gubbins agus RDP4 le chèile a’ dèanamh mion-sgrùdadh, a’ sgrùdadh co-thaobhadh ioma-chridhe an 500 bp as àirde san uinneig, dhearbh sinn nach cuir an gine PE/PPE bacadh air a’ chomharra ath-cho-thàthaidh a bheir buaidh air narX agus pks12.
Ged a dh’ fhaodadh na comharran ath-chothlamadh a chaidh a lorg san t-seata dàta seo a bhith air am meas mar chomharran fuigheall, tha e fìor nach gabh ath-chothlamadh ann am M. bovis a dhiùltadh, agus mar sin bu chòir leantainn air adhart le tuilleadh mion-sgrùdaidh, anns am bi genomaichean slàn bho dhiofar shuidheachaidhean epidemio-eòlasach air an sreathrachadh gu Cudromach.
Cha do lean coimeas eadar craobhan fìleogenetach ML a fhuaireadh ro agus às dèidh ceartachadh ath-cho-chur (Figear 2A, B) gu atharrachaidhean mòra anns a’ chàirdeas fìleogenetach a chaidh a thoirt a-mach, agus bha na sreathan M. bovis air an cruinneachadh san aon bhuidheann.
Às dèidh mapadh 42 leughaidhean M. bovis a chaidh an sreath ùr a dhèanamh orra leis a’ ghineam iomraidh de M. bovis AF2122/97, fhuaireadh co-thaobhadh SNP anns an robh 1816 suidheachadh polymorphic. Tha a’ mhòr-chuid de SNPn (87.1%) suidhichte anns an roinn còdaidh, agus tha na ginean air a bheil buaidh air an comharrachadh a rèir nan roinnean gnìomh a chithear ann am Bovilist (Figear 6A, B). A’ toirt aire don àireamh iomlan de ghinean anns gach roinn gnìomh, sheall na ginean anns an roinn “metabolism lipid” barrachd SNPn, agus an uairsin “balla cealla agus pròiseasan cealla” agus “metabolism eadar-mheadhanach agus anail”, a’ nochdadh gu bheil iad ann an mean-fhàs M. bovis.
Mion-sgrùdadh ìreachail air seata dàta M. bovis à Portagal (n = 42). An àireamh iomlan de SNPan clàraichte agus ginean air a bheil buaidh airson gach roinn-gnìomh (A). An àireamh iomlan de atharrachaidhean co-chiallach agus neo-cho-chiallach clàraichte a rèir roinn-gnìomh (B).
Air sgèile chruinneil, tha an co-mheas dN/dS cuibheasach nas fheàrr na 1.5, a tha a’ nochdadh gur e an cuideam mean-fhàsach cruinneil faighinn cuidhteas an staid shinnsireil agus a’ riochdachadh suidheachadh roghainn glanaidh adhartach (iomadaichte no stiùirichte) agus/no socair. Anns na roinnean “puinnseantachd, dì-phuinnseanachadh, atharrachadh”, “sreathan cuir a-steach agus phages”, agus “pròtainean riaghlaidh”, tha còrr air dà thrian de SNPs neo-cho-fhaclach (Figear 6B).
Anns a h-uile roinn, tha ginean ann le iomadh SNP, agus mar thoradh air sin tha ìre mùthaidh chuibheasach (is e sin, an SNP chuibheasach gach gine) nas motha na 1 (Figear 6A). Tha luachan mùthaidh nas àirde aig Pks12 (Mb2074c) le 15 SNP agus fas (Mb2553c) le 8 SNP. Tha an dà ghine seo an sàs ann am metabolism searbhag geir. Tha an gine pks a’ còdachadh polyketide synthase (PKS), a tha na einnseim ioma-ghnìomhach a tha an sàs ann am biosynthesis lipid balla cealla mycobacterial74,75. Tha an gine seo a’ còdachadh polypeptide ioma-ghnìomhach a tha an sàs ann an co-chur mycoketides74,76. Tha an gine fas an sàs ann an co-chur searbhag mycolic. Tha pàirt chudromach aig an dà ghine seo ann am biosynthesis balla na cealla ann an conaltradh ris an aoigh.
Gus tuilleadh sgrùdaidh a dhèanamh air mean-fhàs Mycobacterium bovis, chaidh dà sheata de ghinean sònraichte a sgrùdadh. Chomharraich obraichean a chaidh fhoillseachadh roimhe a’ cleachdadh co-dhèanamh sreath agus dòighean fìleogenetach ginean a fhuair sinnsearan MTBC tro HGT mus deach an iomadachadh37,38. Tha na ginean seo air an liostadh ann an Clàr a bharrachd 2. Chaidh sgaoileadh SNP de 77 ginean gu h-iomlan a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ri HGT a sgrùdadh, agus chaidh 26 làrach polymorphic a chomharrachadh, a thug gu buil atharrachaidhean neo-cho-fhaclach (NS) sa mhòr-chuid de chùisean (78%) (Clàr a bharrachd 2). Sheall obair roimhe air genome MTBC gu bheil co-mheas NS SNP nas àirde aig roinn HGT a tha fo amharas an taca ris a’ chòrr den genome. Ma tha neach den bheachd gun deach na roinnean ath-cho-chur seo fhaighinn le sinnsearan MTBC, agus mar sin, gu bheil iad a’ riochdachadh cus polymorphisms àrsaidh, thathar an dùil gum bi co-roinn nan atharrachaidhean co-fhaclach nas àirde, leis gu bheil dùil gun tèid cuir às do mhalairt NS le taghadh àicheil air sgàth atharrachaidhean amino-aigéid a dh’ fhaodadh gnìomh a’ phròtain atharrachadh. Mar sin, tha na toraidhean againn a’ nochdadh gum faodadh na builean gnìomhach tighinn bho bhith a’ cur ginean coltach ri HGT an àite ginean coltach ri HGT, a tha a’ nochdadh an cudromachd airson iomadachd ginteil atharrachail luachmhor.
Aig an aon àm ris a’ mhion-sgrùdadh seo, chaidh sgrùdadh mionaideach a dhèanamh air na ginean a tha a’ còdachadh phàirtean an t-siostaim 3R (càradh, ath-riochdachadh agus ath-chur DNA) a rèir an liosta a chaidh fhoillseachadh roimhe le dos Vultos agus co-obraichean (2008)39. Chan urrainnear iomlaid earrannan DNA co-ionann fhaicinn gu dìreach, ged a dh’ fhaodadh gur e pròiseas tric a th’ ann nuair a tha bacteria dlùth-cheangailte an sàs, leithid ann an cùis an t-seata dàta seo; a bharrachd air an sin, is dòcha gur e am pròiseas seo an iuchair do dhòighean càraidh DNA72, agus mar sin a’ cluich pàirt ann an ath-chur homologous. Chaidh 26 suidheachadh polymorphic gu h-iomlan air an sgaoileadh le 54 ginean a chomharrachadh (Clàr Taiceil 3). Anns an t-seata seo de ghinean, bha atharrachaidhean NS a’ dèanamh suas mu 65% de na builean, a tha a rèir aithisgean roimhe air sreathan Mycobacterium tuberculosis.
Àm puist: 21 Dàmhair 2021