Nature'ı ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünde CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, tarayıcınızın daha yeni bir sürümünü kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Aynı zamanda, sürekli destek sağlamak için, stil ve JavaScript içermeyen siteleri de görüntüleyeceğiz.
Genom dizilimi, hastalık epidemiyolojisini, patogenezi, konak-patojen etkileşimlerini ve patojenlere yüklenen evrimsel süreci ortaya çıkararak bulaşıcı hastalık araştırmaları alanını yeniden canlandırdı. Mycobacterium tuberculosis kompleksi (MTBC), Mycobacterium bovis'i karasal memelilerde tüberküloza (TB) neden olan hayvan adaptif üyelerinden biri olarak görür ve bakteriyel evrimin tipik bir modelidir. Diğer MTBC üyeleri gibi, Mycobacterium bovis'in de kesinlikle klonlanmış, yavaşça evrimleşen bir patojen olduğu varsayılır ve açıkça rekombinasyon veya yatay gen transferi belirtisi yoktur. Bu çalışmada, sığır M.'nin genetik çeşitliliğine dair içgörüler elde etmek için farklı soyağaçlarından (Avrupa ve Afrika) 70 sığır M.'den oluşan bir tüm genom dizisi (WGS) veri setine karşılaştırmalı genomik uyguladık. Evrimsel güç. Yeniden organizasyon belirtilerini tahmin etmek için üç farklı yöntem kullanıldı. Dünya genelinde, iki bağımsız yöntemle sağlam destekle az sayıda rekombinasyon olayı tanımlanmış ve doğrulanmıştır. Bununla birlikte, mutasyonlarla karşılaştırıldığında rekombinasyonun M. bovis çeşitliliği üzerinde daha zayıf bir etkisi vardır (genel r/m = 0,037). Veri setimizdeki Mycobacterium bovis klonal kompleksinde elde edilen fark r/m ortalaması, aynı taksonomik türe atanan soylar arasında rekombinasyon derecesinin büyük ölçüde değişebileceği genel kavramıyla tutarlıdır. Bu çalışmaya dayanarak, Mycobacterium bovis'te rekombinasyon göz ardı edilemez, bu nedenle dünya çapında farklı epidemiyolojik senaryolardan büyük veri setlerinin WGS'sinin hayati önem taşıdığı gelecekteki karşılaştırmalı genomik araştırmalarda daha fazla çabanın konusu olmalıdır. Daha sonra, çoklu konak TB yaygınlığına ait daha küçük Mycobacterium bovis veri kümesi (n = 42) üzerinde ek bir analiz gerçekleştirildi ve en az bir suşun tek nükleotid polimorfizmi (SNP) gösterdiği 1.800'den fazla lokus tanımlandı. Bunların çoğu (%87,1) kodlama bölgesinde yer almaktadır ve eşanlamlı değişikliklerin eşanlamlı olmayan değişikliklerin küresel oranı (dN/dS) 1,5'i aşmaktadır; bu da pozitif seçilimin M. bovis üzerinde önemli bir evrimsel güç olduğunu göstermektedir. "Lipit metabolizması", "hücre duvarı ve hücresel süreçler" ve "ara metabolizma ve solunum" işlevsel kategorileri açısından zengin genlerde daha yüksek oranda SNP tespit edilmiş olup, bu genlerin Mycobacterium bovis'in biyolojisi ve evrimindeki önemini ortaya koymaktadır. Yatay gen transferine yatkın olan ve 3R (DNA onarımı, replikasyonu ve rekombinasyonu) sistemine dahil olan MTBC atalarındaki genlere daha yakından bakıldığında, geçmişteki seçici taramaları gösteren Taijima D nötr testinin küresel ortalama negatif değeri ortaya çıkıyor. Popülasyon genişlemesinden sonraki son darboğaz, zorunlu patojen Mycobacterium bovis'in konakçıya karşı savaşması için hala ana evrimsel itici faktördür.
Mycobacterium tuberculosis kompleksi (MTBC), bakteriyel patojenlerin en başarılı taksonlarından biri ve tipik bir bakteriyel evrim örneğidir. Üyeleri genom düzeyinde şaşırtıcı derecede yüksek nükleotit benzerliği gösterir (> %99)1,2. Farklı MTBC ekotipleri, mikro memelilerden insanlara kadar çok çeşitli konak türlerinde bulaşıcı bir granülomatöz hastalık olan tüberküloza (TB) neden olabilir3,4,5. Kompleks şu anda insanları [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] ve hayvanlara adapte olmuş patojenleri (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" ve "dassie") içermektedir5,6. M. canettii (aynı zamanda "Nodobacter glabrata" olarak da bilinir) Yukarıda adı geçen mikobakterilerle ortalama nükleotid özdeşliği %98'dir ve karşılaştırmalı genomik çalışmaları, M. canettii ve MTBC'nin geri kalanının yakın zamanda ortak atadan ayrıldığını göstermiştir.7 Bu kavramı göz önünde bulundurarak, bazı yazarlar M. canettii'yi MTBC 8 Üyesi olarak adlandırmaktadır.
MTBC sistematik olarak sıkı klonal bir kompleks olarak tanımlanır ve popülasyon yapısı açıkça azalmış çeşitlilik, darboğazlar, seçici tarama ve genetik sürüklenme tarafından yönetilir9,10. Eksik polimorfizmler gibi karmaşık sıkı klonal evrim varsayıldığında, rekombinasyonla geri yüklenemez. Bu varsayıma dayanarak, farklı bölgenin (RD) genomik delesyonu ve TbD1'in (Mtb'ye özgü delesyon 1 bölgesi) ardışık olayları, MTBC evriminin moleküler belirteçleri olarak önerilmiştir2,5,11. Karşılaştırmalı genomik ve tüm genom dizileme (WGS) çalışmaları, insana adapte olmuş üyelerin dokuz soya (Mycobacterium tuberculosis L1 ila L4, L7 ve L8; ve Mycobacterium africanum L5, L6 ve L9) bölünmesini destekler; L2 ila L4 soyu TbD1 bölgesini paylaşır2,11,12,13. Ayrıca, hayvanlara adapte olmuş üyelerin, RD7, RD8, RD9 ve RD102, 5 ve 14'teki klad-spesifik delesyonlarla tanımlanan ortak bir atayı paylaştığı ileri sürülmektedir.
Yatay gen transferi (HGT) ve rekombinasyon olayları nadir olarak kabul edilir ve MTBC üyelerinin farklı geçmişinden ziyade MTBC'nin atalarında meydana gelir15,16,17. Hughes ve çalışma arkadaşları (2002) ile Gutacker ve çalışma arkadaşları (2006) tarafından hazırlanan iki erken rapor, rekombinasyon olaylarının M. tuberculosis suşlarında belirli bölgeleri işaretleyen polimorfizmlerin şekillenmesine yardımcı olabileceğini öne sürmüştür18,19. MTBC'de rekombinasyonun bariz eksikliğinin nedenleri şunlardır: (1) HGT'nin mekanik süreci ve yeteneğinin kaybı; (2) HGT olaylarının nadir olması; (3) MTBC nişinde rekombinasyon olayı olasılığı olmaması14,17. Son zamanlarda MTBC suşu 20 ve Mycobacterium bovis 21'e uygulanan bazı tüm genom dizileme (WGS) çalışmaları, rekombinasyonun kanıtlarını sağlamıştır; bu, MTBC suşlarının genellikle küçük DNA parçalarını değiştirdiğini, ancak sınırlı nükleotid dizisi varyasyonu nedeniyle bu olayların hala fark edilmediğini gösteren ilk çalışmadır.
Mycobacterium bovis, çiftlik hayvanlarından (çoğunlukla sığır) en sık elde edilen MTBC üyesidir; ancak serbest gezen ve çitle çevrili yabani hayvanlardan da izole edilebilir4,22,23,24. M. bovis, spoligotipleme profiline, spesifik delesyonlara ve belirli genlerdeki tek nükleotid polimorfizmlerine (SNP'ler) (25, 26, 27, 28, 29) göre beş ana klonal komplekse [Avrupa 1 (Eu1), Avrupa 2 (Eu2), Avrupa 3 (Eu3), Afrika 1 (Af1) ve Afrika 2 (Af2)] evrimleşmiştir. Bu klonal kompleksler, Mycobacterium bovis popülasyonunun çeşitli yapısını ve coğrafi bölgelerle ilişkisini göstermektedir. Ek olarak, Zimpel ve işbirlikçileri (2020) tarafından yürütülen son WGS çalışması, 1.900'den fazla genom içeren Mycobacterium bovis'in SNP'sine dayalı bir filogeni tasarladı ve bu da en az dört farklı soy hattının (Lb1'den Lb1'e ve Lb4'e kadar) olduğunu gösteriyor. Coğrafi özgüllük de doğrulanabilse de, bunlar daha önce tanımlanmış klonal kompleks ile tamamen tutarlı değil. Bu yazarlar filogeni ve moleküler tarihlemenin diferansiyel analizini gerçekleştirdiler, ancak rekombinasyonu incelemediler.
Spoligotipleme, MIRU-VNTR (mikobakteriyel serpiştirilmiş tekrar birimi-değişken tandem tekrar sayısı) ve son SNP tiplemesi gibi farklı moleküler teknikler kullanan önceki çalışmalar, M. bovis suşları 31,32,33,34,35 arasında belirli bir düzeyde genetik çeşitlilik olduğunu ortaya koymuştur. Genetik varyasyonun farklılaştırılması, hastalık epidemiyolojisinin incelenmesinde önemli bir araç haline gelmiş ve patogenez, virülans ve hastalık bulaşmasının derinlemesine anlaşılmasına yardımcı olmuştur. WGS yönteminin ortaya çıkışı, Mycobacterium bovis genomunun farklı konaklara ve epidemiyolojik senaryolara adaptasyon ve kalıcılık sürecinde dayattığı evrimsel itici faktörleri ortaya çıkarma olanağı sağlamaktadır.
Bu çalışmada, Mycoplasma bovis'in evrimsel sürecine dair içgörüler elde etmek, özellikle filogenetik ilişkileri ve rekombinasyon olaylarını çözmek için, farklı klonal komplekslerden izolatlar da dahil olmak üzere çeşitli Mycoplasma bovis veri kümeleri (n=70) üzerinde karşılaştırmalı genomik analiz kullanıyoruz. Bu analize ek olarak, Portekiz'deki iyi karakterize edilmiş çok konaklı tüberküloz bölgesinden elde edilen M. bovis izolatlarının (n = 42) bir alt veri kümesi 31,36 kimliksizlik çıkarımı yapmak için daha fazla araştırıldı. Duyu (dN) ile eşanlamlı (dS) nükleotid ikamelerinin göreceli oranı ile literatürde belirtilen spesifik genomların evrimsel katkısı arasındaki denge, 37,38 MTBC ataları tarafından HGT yoluyla elde edilir ve 3R (DNA onarımı, replikasyonu ve rekombinasyonu) sistem gen bileşenlerini kodlar 39. HGT yoluyla elde edilen genleri seçin çünkü eski polimorfizmleri temsil edebilirler, bu nedenle daha yüksek oranda eşanlamlı değişiklik içerebilecekleri beklenir. 3R sistemine dahil edilen genler, M. tuberculosis suşları üzerinde yapılan önceki çalışmaların, bu genler üzerinde etkili olan genel negatif/arındırma seçimlerini göstermesi ve bunların evrimde önemli bir rol oynayabilmesi nedeniyle seçilmiştir 39. Bu çalışmanın bir diğer amacı da yeniden yapılanma olaylarının varlığını ortaya koymaktır. Bu nedenle, Portekiz'den aldığımız veri setinin yalnızca Avrupa klon kompleksi 2'nin genomlarını ve klon kompleksini atamamış suşları içerdiğini göz önünde bulundurarak, tüm klon komplekslerini temsil eden bir sonuç elde etmek ve sonuçların sağlamlığını ve kapsamını artırmak için herkese açık genom verilerini dahil etmeye karar verdik.
Portekiz'deki endemik çok konaklı tüberküloz sahnesinden (ayrıntılar aşağıda) daha önce epidemiyolojik bir bakış açısıyla karakterize edilmiş 42 yeni dizilenmiş Mycoplasma bovis genomu (ayrıntılar aşağıda), bu çalışmanın merkezinde yer almaktadır. Portekiz'den gelen veri setinin yalnızca Avrupa 2 klon kompleksinin ve belirlenmiş kompleksleri olmayan suşların temsilcilerini içerdiği göz önüne alındığında, M. bovis klon komplekslerinin tüm temsilcilerini içeren veri setini genişletmek için kamuya açık tüm genom dizileme verileri eklenmiştir. Bu nedenle, bu çalışmada üç tüm genom dizileme veri kaynağı kullanılmıştır: tam/taslak genom derlemesi, NCBI'da (Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi) saklanan 10'a kadar iskele (n = 15 izolat); SRA'da saklanan (dizi okuma arşivinin Illumina fastq dosyası) M. bovis klonlarının karmaşık çeşitliliğini temsil eder (n = 12 izolat)30; ve Portekiz'den yeni dizilenmiş 42 genom. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) NCBI aramasından hariç tutuldu. M. bovis AF2122/97 genellikle veri setine dahil edilecek referans genom olarak kullanılır. African 1 klonlama kompleksi tarafından temsil edilen tüm genom dizisinin kamuya açık olmaması ve Af2 ve Eu1'in temsili suşlarından gelen genom sayısının az olması nedeniyle, bu durumlarda SRA tarafından sağlanan orijinal dizileme verileri kullanıldı. Zimpel ve işbirlikçilerinin çalışması (2020), yukarıda belirtilen klonlama kompleksinden genomun tanımlanmasına ve veri setine dahil edilmek üzere Mycobacterium bovis'in seçilmesine yardımcı oldu. Eu3 için yalnızca bir genom tipi tanımlanmıştır (Branger ve ark., 2020), bu nedenle dahil ettiğimiz genom Eu3 kompleksinin ayrı bir temsilcisidir.
Dünya genelinde, bu veri seti 1985-2016 yılları arasında 12 ülkeye dağılmış, 8 konak türünden izole edilmiş 70 sığır M. bovis'ini içermektedir. 36 tür Eu2, 7 tür Eu1, 1 tür Eu3, 3 tür Af1, 4 tür Af2 olarak belirlenmiş ve 19 tür herhangi bir klonal komplekse atfedilememiştir (ayrıntılar aşağıdadır). Bu çalışmada kullanılan Mycobacterium bovis'in ayrıntılı bilgileri (erişim numarası dahil) Tablo 1 ve Ek Tablo 1'de gösterilmektedir.
Bu çalışmanın merkezinde, Portekiz'in hayvan tüberkülozu sıcak noktalarından elde edilen ve 12 yıldan uzun süredir dağıtılan 42 yeni dizilenmiş Mycobacterium bovis tam genomu bulunmaktadır; olası yaban hayatı-hayvan hastalık sistemleri düzenli olarak izlenmektedir 31,36 (Ek Şekil 1). Daha sonraki prosedürlere göre, bu suşlar 2003'ten 2015'e kadar sığırlardan (n = 14), kızıl geyiklerden (n = 16) ve yaban domuzlarından (n = 12) izole edilmiştir: hayvanları önerilen protokol yönergelerine uygun olarak toplayın ve işleyin. Doku örnekleri OIE Kara Hayvanları El Kitabı'nda yer almaktadır ve Stonebrink ve Löwenstein-Jensen pirüvat katı besiyerine ve sıvı besiyerine aşılanmıştır. Kültürler 37 °C'de inkübe edilir ve büyüme en az 12 hafta boyunca haftada bir kontrol edilir. Koloniler doğrudan -80 °C'de bir gliserol çözeltisinde saklanır. Mycobacterium seçici besiyerinde (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), orijinal arşivlenmiş örnekler WGS programının DNA'sını elde etmek için in vitro tek bir in vitro pasajdan geçirildi. Bunun için dondurulmuş kültür stok çözeltisi, 37°C'de Middlebrook 7H9 üzerinde %5 sodyum pirüvat ve %10 ADS (1 L suda 50 g albümin, 20 g glikoz, 8,5 g sodyum klorür) ile zenginleştirildi. Yeniden eğitme. 4 haftalık büyümeden sonra, besiyeri yenilendi ve büyüme gözlenene kadar kültür düzenli olarak izlendi. Hücreler santrifüjleme ile toplandı, pelet 500 µL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edildi, 99 °C'de 30 dakika ısıtıldı, santrifüjlendi ve üstteki sıvı WGS'ye kadar -20 °C'de saklandı. Tüm prosedürler seviye 3 biyogüvenlik tesislerinde gerçekleştirildi.
WGS eşleştirilmiş uç genom kütüphanesi, her DNA örneğinin benzersiz indeksi kullanılarak hazırlanır ve dizileme için Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 örnek) ve HiSeq (2 × 150 pb) (iki izolat) teknolojisi (Eurofins Genomics, Almanya) kullanılır. Üreticinin talimatlarına göre, genomik DNA'yı dizilemek için çift uçlu modül eklentili Illumina Genom Analiz Cihazını ve kütüphaneyi oluşturmak için Illumina'nın Nextera XT DNA Kütüphane Hazırlık Kitini kullanın.
SRA'dan elde edilen veriler (n = 12) dikkate alındığında, klon kompleksinin tanımlanması ilgili yayınların 30, 41, 43 meta verileri olarak kullanılabilir. Eu1 ve Eu3 klonal kompleksinin 25, 29 üyeleri olarak tanınan Mycobacterium bovis AF2122/97 ve Mycobacterium bovis 3601 hariç, tüm genom dikkate alındığında, Mycobacterium tuberculosis H37Rv'nin (NCBI erişim numarası NC_000962.3) tüm genomuyla aynıdır. Genom hizalaması, MAFFT (amino asit veya nükleotid dizisinin çoklu hizalama programı, sürüm 7.458) ve -addfragments48 parametresi kullanılarak gerçekleştirilir. Ardından, farklı klonal komplekslerin yokluğu ve/veya SNP özelliklerinin varlığı aranır.
Yeni dizilenen Mycobacterium bovis (n = 42) ve birleştirilen genom taslağının orijinal okumaları (n = 3), kompleksi vSNP hattı ve farklı klonların delesyon ve/veya SNP özelliklerinin varlığı aracılığıyla referans genom Mycobacterium tuberculosis H37Rv ile hizalar. Bir arama yürütüldü.
Genomik verileri ilgili klonal komplekse atamak için özellik eksikliğinden ve/veya SNP ve spoligotipleme profillerinin varlığından/yokluğundan bilgi toplayın. Dört taslak derleme için spoligotipleme profili çıkarılamadığı için "karmaşıklık yok" grubuna dahil edilmiştir.
Bu çalışmada izlenen biyoenformatik iş akışı, rekombinasyon olaylarını ve spesifik genom polimorfizmlerini keşfetme amacıyla, sıfırdan derleme ve bir referans stratejisine eşleme ile başlar. Şekil 1, izlenen adımların akış şemasını sunmaktadır. Rekombinasyon analizi için, çıkarımların ve ilgili göstergelerin sağlamlığını artırmak amacıyla tüm genomlar kullanılır.
Genom konsensüs dizilerinin oluşturulmasındaki hataları azaltmak için önce sıfırdan birleştirme, ardından çekirdek çoklu hizalamaları elde ettik. Unicycler işlem hattı şu anda https://github.com/rrwick/Unicycler49 adresinde mevcuttur ve 54 dizilenmiş genomun (42 yeni dizilenmiş ve SRA'dan kurtarılan 12 fastq dosyası) sıfırdan birleştirilmesi için kullanılır. Kısacası, sıfırdan birleştirmeden önce, okuma kalitesi analizi FastQC sürüm 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) ve Trimmomatic sürüm 0.36'da ("Okumalardan Adaptörleri ve diğer aydınlatmaya özgü dizileri kesme" ve "Eşik kalitesi 20'den düşükse, okumanın sonundan bazları kesme" seçenekleri uygulanmıştır) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ardından, genom birleştirme için SPAdes optimiser49 ve birleştirme sonrası optimizasyon için Pilon sürüm 1.1851 kullanılmıştır. Hatalı birleştirmeyi önlemek için muhafazakar bir köprüleme modu seçilmiş ve k-mer boyutu aranarak okuma uzunluğunun %20 ile %95'i arasında bir değer seçilmiştir. SPAdes yönergelerini izleyin ve okuma boyutunu göz önünde bulundurun, 300 bp'den küçük kontigleri silin ve 52'lik 20 okuma derinliği kapsama sınırını belirleyin. De novo birleştirme stratejisinde, yüksek oranda tekrarlanan prolin-glutamat (PE) ve prolin-prolin glutamat (PPE) paralogları gibi genomik bölgeler çıkarılmadı.
Yeni bir araya getirmenin kalitesi, bitişik bitkilerin ve M. bovis AF2122/97 referans genomunun (NCBI erişim numarası LT708304.1) yenilenmesini kolaylaştıran QUAST boru hattı (http://quast.sourceforge.net/quast.html) aracılığıyla değerlendirilir. Haritalama (kalite parametreleri için Ek Tablo 1'e bakın).
vSNP boru hattının (https://github.com/USDA-VS/vSNP) yardımıyla, Illumina dizilemesinden yeni dizilenen M. bovis'in FASTQ dosyası, M. bovis AF2122/97 referans genomu (LT708304.1) ile karşılaştırılır. Genom Analizi Araç Takımı'nın (GATK) 53, 54, 55 en iyi uygulama önerilerine göre, yeniden kalibrasyon için standart filtre parametreleri veya varyant kütle puanları uygulanır. Sonuçlar, en düşük SAMtools kütle puanı olan 150 ve AC = 2 kullanılarak filtrelenir. Ayrıca, kontaminasyonu elemek için okumaları kontrol etmek üzere Kraken'ı (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) kullanın. Çalışmamızda dizi stratejilerine eşleme yapmak için kullanılan vSNP boru hattı, bir dizi tanımlanmış SNP ve hedefi inceler ve ayrıca karışık enfeksiyon senaryolarını hariç tutar. Okunan genom kapsamı %99'dan daha iyidir (Ek Tablo 1).
Haritalama hatalarından ve yanlış SNP'lerden kaçınmak için, aşağıdaki durumlarda bir varyantı filtreleyin: (1) 20'den az okuma ile destekleniyor, (2) 0,9'dan daha düşük bir sıklıkta bulunuyor, (3) en az bir Suşta bulunuyor, ancak en azından başka bir suşta boşluklar var. Eşleme veya hizalama sorunları olan SNP'leri ve pozisyonları görsel olarak doğrulamak için entegre genomik görüntüleyici (IGV) sürüm 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 kullanıldı. Prolin-glutamat (PE) ve prolin-prolin glutamat (PPE) genleri yüksek oranda kopyalandığı ve çok genli bir ailenin parçası olduğu için, Illumina dizilemesi ve yanlış eşlemesi tarafından kolayca yanlış anlaşılabilirler, bu nedenle tercih edilirler. Mikobakteriyel biyoenformatik iş akışı, SNP'leri doğrulamak için dizilemede eşleme stratejisini kullanırken tüberküloz kompleksinin üyelerini kaldırdı. Bu nedenle PE/PPE genlerini ve eklemelerini analizden filtreledik.
Bovilist'e (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) göre, tüm SNP'ler işlevsel kategorilere ayrılır. SNP sonuçlarını (eş anlamlı veya eş anlamlı olmayan değişiklikler) çıkarmak için SnpEff veri tabanı (https://pcingola.github.io/SnpEff/) kullanılır. Mycobacterium bovis AF2122/97 genomunun (LT708304.1) yeni bir veritabanı oluşturuldu.
Çekirdek genom çoklu hizalaması, şu anda https://github.com/marbl/parsnp57 adresinde bulunan Parsnp v1.2 kullanılarak, 69 tam genom/taslak derleme (-c seçeneğiyle) kullanılarak gerçekleştirildi ve M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) referans olarak kullanıldı. Dört çekirdek çoklu hizalaması gerçekleştirildi: yalnızca Eu2 klonlama kompleksinin üyeleri (n = 37), Avrupa klonlama kompleksinin tüm üyeleri (n = 44), Avrupa ve Afrika klonlama kompleksinin birleşim noktası (n = 51) ve bu çalışmaya tüm Mycobacterium bovis dahil edildi (n = 70).
Parsnp tarafından oluşturulan çekirdek hizalaması, RAxML kullanılarak CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 kullanılarak maksimum olabilirlik (ML) filogenetik ağacının çıkarılması ve 1000 yönlendirilmiş replikasyonun gerçekleştirilmesi için kullanılır.
Paralel olarak rekombinasyon olaylarının varlığını kontrol etmek için üç farklı algoritma ve biyoenformatik aracı kullanıldı: SplitsTree4 yazılımı, Gubbins (nükleotid dizilerinde rekombinasyon yoluyla tarafsız soy) boru hattı ve RDP4 (rekombinasyon tespit programı, sürüm beta 4.101) yazılımı.
SplitsTree4 v4.15.1'de (http://www.splitstree.org/)59 uygulanan bölünmüş ayrıştırma yöntemi, istatistiksel doğrulama için Phi testi kullanılarak köksüz filogenetik ağı hesaplamak için kullanılır ve anlamlılık eşiği p = 0,05'tir. Parsnp'nin çekirdek çoklu hizalama analizi girdi olarak kullanılır ve ağ standardı olarak bölünmüş ayrıştırma gerçekleştirilir.
Gubbins boru hattı v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60), rekombinasyonun Mycobacterium bovis üzerindeki etkisini değerlendirmenin başka bir yolu olarak varsayılan parametrelerle çalışır. Boru hattında uygulanan algoritma, ilgili klon soyunu yeniden oluşturur. Veri setimizin ve referans genomunun (sığır bovid AF2122/97, LT708304.1) tam genomu/taslak derlemesi karşılıklıdır; ve rekombinasyon olayını temsil eden SNP kümesini tespit etmek için ağacın her bir dalındaki SNP'nin konumunu tarayın. Dalın sıfırı Rekombinasyon olayı olmadığını varsayın; bu, dalda meydana gelen SNP'lerin eşit olarak dağıtılması gerektiği anlamına gelir. Parsnp'den çekirdek çoklu hizalama ve RAxML'den en iyi puan alan ML ağacı giriş dosyaları olarak kullanılır.
Son olarak, Gubbins boru hattının önerdiği yeniden düzenleme olayını doğrulamak için, RDP467'de uygulanan altı algoritma (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 ve SiScan66), varsayılan ayarlar altında Parsnp'nin çekirdek çoklu hizalamasına uygulanır. RDP4'te uygulanan algoritmalardan en az üçünün, her bir rekombinasyon olayını doğrulamak için sürekli olarak önemli bir sinyal göstermesi gerektiğini belirledik.
Hem Gubbins hem de RDP yazılımlarının, 500 bp'ye kadar bir pencerede çekirdek çoklu hizalamalarını kontrol ederek rekombinasyon sinyallerini aradığı ve de novo birleştirme sırasında PE/PPE genlerinin dahil edilmesinin bulunan rekombinasyon sinyallerine müdahale etmeyeceğini doğruladığı göz önüne alındığında, daha ileri analizler, rekombinasyon olayını tanımlayan genin yakın çevresinde homolinearite kontrolü kullanılarak yapılır. Yerel genom translokasyonlarını veya inversiyonlarını hariç tutmak için tüm genomu kullanan sinlinear harita, MAUVE çoklu genom hizalaması (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) kullanılarak oluşturulmuştur. Ayrıca, SyntTax web sunucusu (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) aracılığıyla amino asit dizisi üzerinde homolinearite analizi yapmak için tüm genom kullanılmıştır.
Portekiz çok konaklı tüberküloz sisteminden elde edilen genom veri setinin daha derinlemesine bir analizi, literatürde belirtilen genlerin polimorfizmini kontrol etmektir. Bu genler 37,38 ve MTBC ataları tarafından HGT (DNA onarımı, replikasyonu ve rekombinasyonu) sistem bileşenleri 39 aracılığıyla elde edilen 3R'yi kodlayan gendir. Gen çeşitliliğini ve nükleotit çeşitliliğini (π) ve Tajima'nın D nötr test parametresi girdisini hesaplamak için ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) ve DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) kullanın.
69 Mycoplasma bovis izolatı ve referans genomlarına dayalı bir maksimum olabilirlik (ML) filogenetik ağacı elde edildi (Şekil 2A). Tek gen tabanlı ağaçlar veya çok lokus tabanlı ağaçlarla karşılaştırıldığında, bu strateji tüm genomun değişkenliğini yakalamayan ve bu nedenle türler arasında ayrım yapma yeteneği daha düşük olan daha güçlü ağaçların oluşturulmasına olanak tanır 68,69. ML ağacının topolojik yapısı genellikle klonların karmaşık sınıflandırmasıyla tutarlıdır. Eu2 genomu bir dalda kümelenmiştir ve Af1 genomu da birlikte kümelenmiştir (Şekil 2A). Sonuç ayrıca Mycobacterium bovis'in bilinen evrimsel ilişkisiyle de tutarlıdır, yani Eu1 üyesi ile diğer tüm klonal kompleksler ve genomlardan oluşan grup arasında büyük bir fark vardır, ancak klonal kompleks 30 belirtilmemiştir. Klonal kompleks ile filogenetik ağaçta gözlenen ilişki arasındaki küçük tutarsızlık, klonal kompleksin spesifik genomik bölgelere göre tanımlanması, filogenetik ağacın ise tüm genomu temsil eden çekirdek genomların çoklu hizalamalarına dayanmasıyla açıklanabilir.
Maksimum olasılık filogenetik ağacı (GTR), rekombinasyon bölgesinin çıkarılmasından önce (A) ve sonra (B) Mycobacterium bovis genomunun çekirdek genom hizalamasına dayanarak oluşturulmuştur. Dal renkleri Mycobacterium bovis klon kompleksini temsil eder: Avrupa 1 mor, Avrupa 2 kırmızı, Avrupa 3 mavi, Afrika 1 turuncu ve Afrika 2 yeşildir. Ağaç köklendirilmiş ve ölçekli olarak çizilmiş ve dal uzunluğu her bölge için bir yedek olarak ölçülmüştür.
Mycobacterium tuberculosis kompleksi klonal olarak evrimleşmiş olarak tanımlanmaktadır ve yıllar içinde toplanan kanıtların çoğu, devam eden HGT ve rekombinasyon olaylarının MTBC'nin tespit edilebilir seviyesinde gerçekleşmeyeceği fikrini desteklemektedir15,17,18.
Önceki çalışmalar MTBC suşları arasında sınırlı rekombinasyon olabileceğini göstermiştir20,21, diğerleri ise ölçülebilir rekombinasyon olaylarını tanımlamada başarısız olmuştur70,71. Bu konuyu, yalnızca Mycobacterium tuberculosis'i dikkate alan önceki çalışmalardan farklı olarak Mycobacterium bovis'e odaklanarak yeniden tartışın70,71; veya MTBC'yi neredeyse hiç M. bovis'in 20'yi temsil etmediği bir bütün olarak ele alın; veya yalnızca kısıtlayıcı sığır fraksiyonlarını dikkate alın. Bu çalışmada mikobakteri veri kümesi, rekombinasyonu taramak için kullanılan tüm klonal kompleksleri temsil eden toplam 70 suş içermektedir. Veri kümesi dört kümülatif düzeye göre ölçeklendirilmiştir: (1) Eu2 üyeleri, (2) tüm Avrupa klon kompleksi üyeleri (yani Avrupa), (3) Avrupa ve Afrika klon kompleksi (Eu + Af) ve (4) tüm veri koleksiyonları (daha önce açıklanan hiçbir klonlama kompleksine dahil olmayan genomlar dahil).
Bu hipotezi daha derinlemesine incelemek için, genomlar arasında rekombinasyon olaylarının yokluğunu değerlendirmek üzere bir bölünmüş ayrıştırma ağı gerçekleştirildi; çünkü bu yöntem, bireyler arasındaki atasal ilişkiyi görselleştirebilir ve çelişkili filogenetik sinyaller gösterebilir. Analizdeki dört veri kümesinin tamamı, ağda döngülerin (yani tek bir ağaçta birleşmeyen alanların) varlığını doğruladı, ancak Phi testi istatistiksel olarak desteklenmedi (Eu2, p = 0,0956; Avrupa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; tüm veri kümesi p = 0,2451), bu da yeniden düzenleme olaylarının varlığına dair zayıf bir kanıt sağlıyor (Şekil 3A-D).
Avrupa'da 2 genom (n = 37) (A), Avrupa genomları (n = 44) (B), Avrupa ve Afrika genomları (n = 51) (C) ve tüm veri seti (n = 70) (D).
Bu analizden sonra ve tüm ağlardaki döngüsel gözlemler dikkate alınarak, Gubbins boru hattında uygulanan yeniden yapılandırma algoritması, klonal soy hattını yeniden yapılandırmak ve rekombinasyonun M. bovis genomu üzerindeki etkisinin tahminini desteklemek için uygulandı. Çoğunluğu terminal dallarda (yani tek bir genomda) meydana gelen rekombinasyon olaylarının kümülatif sayısını çıkarın (Tablo 2). Bu göstergeler, tüm veri setinin tutarlılığını gösterir ve rekombinasyon olaylarının sıklığının mutasyonların 200 ila 300 katı olduğunu gösterir. Dal üzerindeki rekombinasyon ve nokta mutasyonlarının göreceli oranlarını temsil eden rho/theta parametresi 0,0037 ile 0,0056 arasında görünmektedir (Tablo 3). Son zamanlarda, 38 M. bovis suşunun yayınlanmış çalışması, bu veri setinde elde edilenden daha yüksek bir rho/theta değeri (rho/theta = 0,1) gösterdi, ancak Patané ve meslektaşlarının çalışması, rekombinasyon parametrelerini çıkarmak için referans tabanlı birleştirmeyi kullandı. Birleştirme prosedüründen kaynaklanan bir prosedür ayrıntısı, terminal daldaki varsayımsal rekombinasyon olaylarının bolluğu ile ilişkilendirilmiştir.
Sonra, r/m parametresi rekombinasyon ve mutasyon girişinin çeşitlilik oranını temsil eder ve ortalama değeri 0,025 ile 0,037 arasındadır ve mutasyonlarla karşılaştırıldığında rekombinasyonun M. bovis'in genetik çeşitliliği üzerinde daha düşük bir genel etkiye sahip olduğunu gösterir (Tablo 3)). Kapsamlı karşılaştırma için, 23 genomdan oluşan MTBC veri seti için r/m parametresini tahmin etmek için benzer bir yöntem kullanıldı ve 0,48620'lik bir ortalama değer gösterdi; Patané ve meslektaşlarının 38 M. bovis veri seti için ise ortalama değerin 0,98 olduğu kanıtlandı. İlk çalışmada, 23 genomdan yalnızca ikisi M. bovis'in çalışmasına dahil edildi (M. bovis BCG ve referans suşu), bu nedenle elde edilen değer M. tuberculosis genomunun aşırı ekspresyonu nedeniyle önyargılı olabilir. İkinci raporda, analiz edilen Mycobacterium bovis popülasyonları çoğunlukla Amerika Birleşik Devletleri'nden ve çiftlik hayvanlarından elde edildi. Bunun aksine, veri setimizde daha fazla coğrafi konum ve konak türü temsil edilmekte ve farklı popülasyon genetik özelliklerine sahip farklı klonal komplekslerde gruplandırılmış genomlar da kullanılmakta, böylece daha derin ve daha geniş bir Popülasyon bilgisi elde edilmektedir. Veri setimizle elde edilen fark r/m ortalama değeri, rekombinasyon derecesinin aynı taksonomik türe atanan soylar arasında büyük ölçüde değiştiği kavramıyla tutarlıdır, bu nedenle bu sonuçlar M. bovis klon kompleksinin rekombinasyon farklılıkları gösterebileceğini göstermektedir. Etki ayrıca Didelot ve Maiden72 tarafından da önerilmektedir. Bununla birlikte, bu veri setinin daha fazla sayıda M. bovis genomu içerecek şekilde önemli ölçüde genişletilmesi, bu noktanın daha fazla açıklığa kavuşturulmasını sağlayacaktır. Hem r/m hem de rho/theta parametreleri dallar arasında değişkenlik göstermektedir ve bu sonuç diğer bakteri türlerine ilişkin raporlarla tutarlıdır72,73.
Son olarak, Gubbins boru hattı tarafından tanımlanan yeniden düzenleme olaylarını doğrulamak için, RDP4 yazılımında farklı çekirdek çoklu karşılaştırmalarını bağımsız olarak test etmek üzere altı farklı algoritma kullanıldı. Küresel olarak, Gubbins tarafından tanımlanan olayların yarısından azı RDP4 tarafından doğrulandı (Tablolar 4 ve 5). Tüm veri seti göz önüne alındığında, ikisi iç düğümleri içeren ve diğeri klonal komplekslerin atanamadığı bir terminal daldaki tek bir genomu içeren üç rekombinasyon olayı doğrulandı (Tablolar 4 ve 5). Terminal dallardaki olayların tanımlanması, rekombinasyonun çağdaş M. bovis suşlarında hala devam ettiğini veya sonucun yanlış yerleştirildiğini gösterebilir70. Bu varsayımsal rekombinasyon bölgesinde, pozisyonların yaklaşık %20'si tanımlanmamış nükleotidlere (N) sahiptir ve bu da rekombinasyon sinyalini etkiler (Ek Şekil 2). Ek olarak, bu bölge, yüksek oranda korunmuş olması beklenen 16S ribozomal RNA'yı kodlayan rrs genini etkiler; bu nedenle, bu olası rekombinasyon sinyali dizileme hatalarından veya yanlış hizalamadan kaynaklanıyor olabilir. Daha sonra, Mb0003 ve Mycobacterium bovis AF2122/97 arasındaki tüm genom hizalaması gerçekleştirildi ve tanımlanmamış nükleotid ve SNP'lerin varlığı doğrulandı; bu nedenle, yanlış hizalamayla ilgili olası sorunlar, bu çalışmada kullanılan biyolojik bilgilerden kaynaklanmamaktadır. Program öğrenildikten sonra ortaya çıkmıştır.
Dahili düğümlerin rekombinasyon bölgelerinde boşluk veya tanımlanmamış nükleotid bulunamadı (Şekil 4 ve 5). Bu olaylarla ilgili olarak, biri yalnızca Eu2 genomunu içerir ve olası bir poliketid sentazı kodlayan pks12 genini etkiler; diğeri ise Eu1 genomunda kayıtlıdır ve olası bir nitrat redüktazı kodlayan narX genini etkiler (Tablo 4). Genel olarak, rekombinasyon analizi istatistiksel olarak desteklenen sınırlı sayıda rekombinasyon parçası olduğunu göstermektedir ve çıkarılan göstergeler rekombinasyonun M. bovis soyu üzerinde düşük bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Rekombinasyon sinyalinin düşük olması beklenmektedir, ancak gerçek evrim sinyalini arka plan gürültüsünden ayırt etmek önemlidir ki bu zorlu bir iştir. Referans tabanlı birleştirme ve uyumsuzluk problemleri 70, 71 tarafından ortaya çıkarılan gürültü sinyalini azaltmak için, tüm genom hariç geri kalan her şey sıfırdan birleştirildi ve birleştirme kalitesi QUAST boru hattı analizi ile kontrol edildi ve sağlandı (Ek Tablo 1). Ayrıca, genel anketin sağlamlığını ve doğruluğunu sağlamak için bir dizi tamamlayıcı analiz gerçekleştirildi. Bu nedenle, narX ve pks12 genlerinin dizileme kalitesi, Mycobacterium bovis AF2122/97'ye karşı okuma haritalaması yapılarak değerlendirildi. Rekombinasyon bölgesindeki önerilen SNP pozisyonu, yöntem bölümünde belirtilen kriterlerin uygulanmasıyla doğrulandı (en az 20 okuma ve 0,9 değişim sıklığı). narX geninin polimorfizmi iki genomda (Mb1792361 ve Mb7240415; %2,3) ve pks12 genomunun genomlarında (Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 ve Mb12 genleri) tamamen doğrulandı. Ancak, Mb2043 genomu için, sekiz pozisyondan altısı okuma derinliği kriterini karşılamıyor çünkü SNP, belirlenen 20 sınır değerinin altında olan maksimum 17 okuma ile destekleniyor. Bu nedenle, bu genom bölgesinde altı genomun (%8,6) rekombinasyonu doğrulanabilir (Şekil 4 ve 5).
Mycobacterium bovis veri setinin rekombinasyon bölgesi hizalamasının ayrıntılı görselleştirilmesi, olası bir nitrat redüktazı kodlayan narX genini etkilemektedir. İç düğümlerin rekombinasyon bölgesinde boşluk veya tanımlanmamış nükleotit bulunmamıştır. Bu özel durum Eu1 genomunda kayıtlıdır. narX geninin dizileme kalitesi, Mycobacterium bovis AF2122/97 okumalarının çizilmesiyle değerlendirilmiştir. Yöntem bölümünde belirtilen kriterleri uygulayarak (en az 20 okuma ve 0,9 değişim sıklığı) rekombinasyon alanındaki önerilen SNP konumunu doğrulayın. narX geninin polimorfizmi, Mb1792361 ve Mb7240415 genomlarında (%2,3) tamamen doğrulanmıştır.
Mycoplasma bovis veri setinin pks12 genini etkileyen rekombinasyon bölgesi hizalamasının ayrıntılı görselleştirilmesi. İç düğümlerin rekombinasyon bölgesinde boşluk veya tanımlanmamış nükleotit bulunmamıştır. Olası poliketid sentazı kodlayan pks12 genini etkileyen olayla ilgili olarak, yalnızca Eu2 genomunu içermektedir. pks12'nin dizileme kalitesi, Mycobacterium bovis AF2122/97'nin okuma haritalaması ile değerlendirilmiştir. Yöntem bölümünde belirtilen kriterleri uygulayarak rekombinasyon alanındaki önerilen SNP konumunu doğrulayın (en az 20 okuma ve 0,9 değişim sıklığı). Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 ve Mb1960 genomlarının polimorfizmleri tamamen doğrulanmıştır.
PE ve PPE genleri, Illumina dizilemesi ve yanlış eşlemesi tarafından kolayca yanlış okunabilen tekrarlayan bölgelere sahiptir, bu nedenle genellikle yalnızca diziye eşleme stratejisi kullanıldığında M. tuberculosis üyelerinin biyoenformatik iş akışından silinirler. Bu çalışmada uygulanan rekombinasyon olaylarının çıkarımı, PE/PPE'yi filtrelemeden de novo birleştirmeye dayanmaktadır. SplitsTree, Gubbins boru hattı ve RDP4 yazılımları aracılığıyla üç farklı tamamlayıcı yöntem ve algoritma uygulayarak, uygulanan stratejilerin hata sinyallerinin neden olduğu yeniden düzenlenmiş bölgelerin işlenmesine ve filtrelenmesine karşı dayanıklı olduğuna inanıyoruz. Bununla birlikte, SNP kümelerini tanımlamak için PE/PPE geninin Gubbins ve RDP4 yazılımlarındaki müdahalesini ve dolayısıyla narX ve pks12 genlerini etkilediği önerilen rekombinasyon bölgelerinin tanımlanmasını dışlamak için, bu genlerin komşuluğu incelenmiştir (Ek Şekil 3–5). M. bovis AF2122/97'de, narX geni narK2 ve Mb1764c tarafından ayrılırken, pks12, Mb2075c ve Mb2073c tarafından çevrelenmiştir (Ek Şekil 3-5). Tüm genomun MAUVE synline haritası kullanılarak oluşturulan harita, gen dizisi korunumu ve yeniden düzenlenmesi hakkında bilgi sağlar ve dört doğrusal blok gösterir ve genom translokasyonu veya inversiyonuna dair hiçbir belirti göstermez. Ayrıca, amino asit dizisiyle yapılan tamamlayıcı analiz, tüm tüm genomlarda homolojiyi kanıtladı ve narX veya pks12'nin bitişik bölgelerinde PE/PPE bulunmadı. narX için, bir genom (Mb0030), narX geni iki parça (parçalar 1891 ve 1890) olarak tanımlandığı için daha düşük bir eşanlamlılık puanına sahiptir. pks12 için, benzerlikler nedeniyle, Mb0030 ve Mb003 daha düşük sinlineerlik puanları sergilerken, pks12 proteinin farklı bölgelerini temsil eden sırasıyla iki ve üç parçada tanımlandı (Ek Şekil 3-5). Bu bilgiyi göz önünde bulundurarak ve Gubbins ile RDP4 yazılımlarının her ikisini de analiz ederek, penceredeki maksimum 500 bp'lik çekirdek çoklu hizalamasını kontrol ederek, PE/PPE geninin narX ve pks12'yi etkileyen rekombinasyon sinyaline müdahale etmeyeceğini doğruladık.
Bu veri setinde tespit edilen rekombinasyon sinyalleri artık olarak değerlendirilebilse de, M. bovis'te rekombinasyonun göz ardı edilemeyeceği doğrudur, bu nedenle farklı epidemiyolojik senaryolardan gelen tüm genomların Önemli olarak dizilendiği daha ileri analizlerin konusu olmaya devam etmelidir.
Rekombinasyon düzeltmesinden önce ve sonra elde edilen ML filogenetik ağaçlarının karşılaştırılması (Şekil 2A, B), çıkarılan filogenetik ilişkide önemli değişikliklere yol açmadı ve M. bovis suşları aynı grupta kümelendi.
42 yeni dizilenmiş M. bovis okumasının M. bovis AF2122/97 referans genomuyla eşleştirilmesinin ardından, 1816 polimorfik pozisyon içeren bir SNP hizalaması elde edildi. SNP'lerin çoğu (%87,1) kodlama bölgesinde yer almakta ve etkilenen genler Bovilist'te gösterilen işlevsel kategorilere göre karakterize edilmektedir (Şekil 6A, B). Her işlevsel kategorideki toplam gen sayısı dikkate alındığında, "lipit metabolizması" kategorisindeki genler daha fazla SNP gösterirken, bunları "hücre duvarı ve hücre süreçleri" ve "ara metabolizma ve solunum" takip etmekte ve bu da M. bovis evriminde yer aldıklarını göstermektedir.
Portekiz'den M. bovis veri setinin hiyerarşik analizi (n = 42). Her işlevsel kategori için kayıtlı SNP ve etkilenen genlerin toplam sayısı (A). İşlev kategorisine göre kayıtlı eşanlamlı ve eşanlamlı olmayan değişikliklerin toplam sayısı (B).
Küresel ölçekte, ortalama dN/dS oranı 1,5'ten iyidir; bu da küresel evrimsel baskının atasal durumdan kurtulma yönünde olduğunu ve olumlu (çeşitlendirilmiş veya yönlendirilmiş) ve/veya rahat bir arınma seçeneği senaryosunu temsil ettiğini gösterir. "Virülans, detoksifikasyon, adaptasyon", "ekleme dizileri ve fajlar" ve "düzenleyici proteinler" kategorilerinde, SNP'lerin üçte ikisinden fazlası eşanlamlı değildir (Şekil 6B).
Tüm kategorilerde, birden fazla SNP'ye sahip genler vardır ve bu da ortalama mutasyon oranının (yani gen başına ortalama SNP) 1'den büyük olmasına neden olur (Şekil 6A). 15 SNP'ye sahip Pks12 (Mb2074c) ve 8 SNP'ye sahip fas (Mb2553c) daha yüksek mutasyon değerlerine sahiptir. Bu genlerin her ikisi de yağ asidi metabolizmasında rol oynar. pks geni, mikobakteriyel hücre duvarı lipid biyosentezinde rol oynayan çok işlevli bir enzim olan poliketid sentazı (PKS) kodlar74,75. Bu gen, mikoketidlerin sentezinde rol oynayan çok işlevli bir polipeptidi kodlar74,76. Fas geni mikolik asit sentezinde rol oynar. Bu genlerin her ikisi de konakla temas halindeki hücre duvarının biyosentezinde önemli bir rol oynar.
Mycobacterium bovis'in evrimini daha detaylı incelemek için iki grup spesifik gen analiz edildi. Dizi kompozisyonu ve filogenetik yöntemler kullanılarak daha önce yayınlanmış çalışmalar, MTBC ataları tarafından çeşitlenmeden önce HGT yoluyla edinilen genleri tanımladı37,38. Bu genler Ek Tablo 2'de listelenmiştir. HGT ile ilişkili olabilecek toplam 77 genin SNP dağılımı analiz edildi ve çoğu durumda (%78) eşanlamlı olmayan (NS) değişikliklere yol açan 26 polimorfik bölge belirlendi (Ek Tablo 2). MTBC genomu üzerinde yapılan önceki çalışmalar, varsayılan HGT bölgesinin genomun geri kalanına kıyasla daha yüksek bir NS SNP oranı sergilediğini göstermiştir. Bu rekombinasyon bölgelerinin MTBC ataları tarafından edinildiği ve dolayısıyla eski polimorfizmleri aşırı temsil ettiği düşünülürse, eş anlamlı değişikliklerin oranının daha yüksek olması beklenir, çünkü amino asit değişiklikleri nedeniyle NS ikamelerinin negatif seçilimle ortadan kalkması beklenir. Bu nedenle, sonuçlarımız işlevsel sonuçların HGT benzeri genlerin yer değiştirmesinden kaynaklanabileceğini ve bu durumun değerli adaptif genetik çeşitlilik açısından önemlerini yansıttığını göstermektedir.
Bu analize paralel olarak, 3R (DNA onarımı, replikasyonu ve rekombinasyonu) sisteminin bileşenlerini kodlayan genler, dos Vultos ve işbirlikçileri (2008)39 tarafından daha önce yayınlanan listeye uygun olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Aynı DNA parçalarının değişimi doğrudan gözlemlenemese de, bu veri kümesinde olduğu gibi yakından ilişkili bakteriler söz konusu olduğunda sık görülen bir süreç olabilir; ayrıca, bu süreç DNA onarım yöntemlerinin anahtarı olabilir72 ve böylece homolog rekombinasyonda rol oynayabilir. 54 gen tarafından dağıtılan toplam 26 polimorfik pozisyon tanımlanmıştır (Ek Tablo 3). Bu gen kümesinde, NS değişiklikleri sonuçların yaklaşık %65'inden sorumludur; bu da Mycobacterium tuberculosis suşları hakkındaki önceki raporlarla tutarlıdır.
Gönderim zamanı: 21 Ekim 2021