ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature เบราว์เซอร์เวอร์ชันที่คุณใช้มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันใหม่กว่า (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในขณะเดียวกัน เพื่อให้มั่นใจว่าการสนับสนุนจะยังคงดำเนินต่อไป เราจะแสดงเว็บไซต์ที่ไม่มีสไตล์และ JavaScript
การหาลำดับจีโนมได้ฟื้นฟูวงการการวิจัยโรคติดเชื้อ เผยให้เห็นถึงระบาดวิทยาของโรค พยาธิกำเนิด ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโฮสต์กับเชื้อก่อโรค และกระบวนการวิวัฒนาการที่เชื้อก่อโรคต้องเผชิญ กลุ่มแบคทีเรีย Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) ถือว่า Mycobacterium bovis เป็นหนึ่งในสมาชิกที่ปรับตัวเข้ากับสัตว์ ซึ่งก่อให้เกิดวัณโรค (TB) ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมบนบก และเป็นแบบจำลองทั่วไปของวิวัฒนาการของแบคทีเรีย เช่นเดียวกับสมาชิก MTBC อื่นๆ Mycobacterium bovis ถูกสันนิษฐานว่าเป็นเชื้อก่อโรคที่ถูกโคลนอย่างเข้มงวดและวิวัฒนาการอย่างช้าๆ และเห็นได้ชัดว่าไม่มีสัญญาณของการรวมตัวกันใหม่หรือการถ่ายโอนยีนในแนวนอน ในงานวิจัยนี้ เราประยุกต์ใช้จีโนมิกส์เชิงเปรียบเทียบกับชุดข้อมูลลำดับจีโนม (WGS) ทั้งหมด ซึ่งประกอบด้วยวัว M. จำนวน 70 ตัว จากสายเลือดที่แตกต่างกัน (ยุโรปและแอฟริกา) เพื่อให้เข้าใจถึงความหลากหลายทางพันธุกรรมของวัว M พลังแห่งวิวัฒนาการ มีการใช้วิธีการที่แตกต่างกันสามวิธีเพื่อประเมินสัญญาณของการปรับโครงสร้างใหม่ ทั่วโลก มีการระบุและยืนยันเหตุการณ์การรวมตัวกันใหม่จำนวนเล็กน้อยด้วยวิธีการอิสระสองวิธีที่มีหลักฐานสนับสนุนที่มั่นคง อย่างไรก็ตาม เมื่อเปรียบเทียบกับการกลายพันธุ์ การรวมตัวกันใหม่มีผลกระทบต่อความหลากหลายของ M. bovis น้อยกว่า (r/m โดยรวม = 0.037) ค่าเฉลี่ย r/m ที่ได้จากโคลนเชิงซ้อนของ Mycobacterium bovis ในชุดข้อมูลของเราสอดคล้องกับแนวคิดทั่วไปที่ว่าระดับของการรวมตัวกันใหม่อาจแตกต่างกันอย่างมากระหว่างสายพันธุ์ที่กำหนดให้กับสปีชีส์ทางอนุกรมวิธานเดียวกัน จากงานวิจัยนี้ การรวมตัวกันใหม่ใน Mycobacterium bovis จึงไม่สามารถตัดออกไปได้ ดังนั้นจึงควรเป็นหัวข้อสำหรับการวิจัยจีโนมิกส์เปรียบเทียบในอนาคต ซึ่ง WGS ของชุดข้อมูลขนาดใหญ่จากสถานการณ์ทางระบาดวิทยาที่แตกต่างกันทั่วโลกมีความสำคัญอย่างยิ่ง จากนั้นจึงทำการวิเคราะห์เพิ่มเติมกับชุดข้อมูล Mycobacterium bovis ขนาดเล็ก (n = 42) จากความชุกของวัณโรคหลายโฮสต์ และพบตำแหน่งมากกว่า 1,800 ตำแหน่ง ซึ่งอย่างน้อยหนึ่งสายพันธุ์มีรูปแบบพหุสัณฐานของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNP) ส่วนใหญ่ (87.1%) อยู่ในบริเวณเข้ารหัส และอัตราส่วนโดยรวมของการเปลี่ยนแปลงที่ไม่เหมือนกัน (dN/dS) ของการเปลี่ยนแปลงที่เหมือนกันมีค่ามากกว่า 1.5 ซึ่งบ่งชี้ว่าการคัดเลือกเชิงบวกเป็นแรงผลักดันสำคัญทางวิวัฒนาการที่ส่งผลต่อ M. bovis ตรวจพบ SNP ในสัดส่วนที่สูงขึ้นในยีนที่อุดมไปด้วยหมวดหมู่การทำงานต่างๆ ได้แก่ "เมแทบอลิซึมของไขมัน" "ผนังเซลล์และกระบวนการของเซลล์" และ "เมแทบอลิซึมและการหายใจขั้นกลาง" ซึ่งเผยให้เห็นศักยภาพของ SNP ในด้านชีววิทยาและวิวัฒนาการของ Mycobacterium bovis เมื่อพิจารณาอย่างใกล้ชิดที่ยีนในบรรพบุรุษ MTBC ที่มีแนวโน้มการถ่ายโอนยีนในแนวนอนและรวมอยู่ในระบบ 3R (การซ่อมแซม การจำลอง และการรวมตัวกันใหม่ของ DNA) เผยให้เห็นค่าลบเฉลี่ยทั่วโลกของการทดสอบ D ที่เป็นกลางของไทจิมะ ซึ่งบ่งชี้ถึงการสแกนแบบเลือกในอดีต ปัญหาคอขวดล่าสุดหลังจากการขยายตัวของประชากรยังคงเป็นปัจจัยขับเคลื่อนวิวัฒนาการหลักที่ทำให้เชื้อก่อโรค Mycobacterium bovis จำเป็นต้องต่อสู้กับโฮสต์
ไมโคแบคทีเรียม ทูเบอร์คูโลซิส คอมเพล็กซ์ (MTBC) เป็นหนึ่งในแท็กซาของแบคทีเรียก่อโรคที่ประสบความสำเร็จมากที่สุด และเป็นกรณีตัวอย่างของวิวัฒนาการของแบคทีเรีย สมาชิกของแท็กซานี้มีความเหมือนกันของนิวคลีโอไทด์ในระดับจีโนมที่สูงอย่างน่าประหลาดใจ (> 99%)1,2 อีโคไทป์ MTBC ที่แตกต่างกันสามารถทำให้เกิดวัณโรค (TB) ซึ่งเป็นโรคติดเชื้อแกรนูโลมาในสิ่งมีชีวิตหลากหลายชนิด ตั้งแต่สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมขนาดเล็กไปจนถึงมนุษย์3,4,5 ปัจจุบัน กลุ่มของแท็กซานี้ประกอบด้วยมนุษย์ [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] และเชื้อก่อโรคที่ปรับตัวเข้ากับสัตว์ (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter , Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" และ "dassie") 5,6 M. canettii (เรียกอีกอย่างว่า "Nodobacter glabrata") ความเหมือนกันของนิวคลีโอไทด์โดยเฉลี่ยกับไมโคแบคทีเรียที่กล่าวถึงข้างต้นคือ 98% และการทำงานด้านจีโนมิกส์เปรียบเทียบแสดงให้เห็นว่า M. canettii และ MTBC ที่เหลือได้แยกออกจากบรรพบุรุษร่วมกันเมื่อไม่นานนี้7 เมื่อพิจารณาแนวคิดนี้ ผู้เขียนบางคนเรียก M. canettii ว่าเป็นสมาชิกของ MTBC 8
MTBC ถูกอธิบายอย่างเป็นระบบว่าเป็นโคลนเชิงซ้อนที่เข้มงวด และโครงสร้างประชากรของมันถูกควบคุมอย่างชัดเจนด้วยความหลากหลายที่ลดลง คอขวด การสแกนแบบเลือก และการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม9,10 สมมติว่าวิวัฒนาการโคลนเชิงซ้อนที่เข้มงวดที่ซับซ้อน เช่น การขาดหายไปของพหุสัณฐานวิทยา ไม่สามารถฟื้นฟูได้ด้วยการรวมตัวใหม่ จากสมมติฐานนี้ เหตุการณ์ต่อเนื่องของการลบจีโนมของบริเวณที่แตกต่าง (RD) และ TbD1 (บริเวณที่ลบเฉพาะ Mtb 1) ได้รับการเสนอให้เป็นเครื่องหมายโมเลกุลของวิวัฒนาการ MTBC2,5,11 งานวิจัยจีโนมิกส์เปรียบเทียบและการหาลำดับจีโนมทั้งหมด (WGS) สนับสนุนการแบ่งสมาชิกที่ปรับตัวเข้ากับมนุษย์ออกเป็นเก้าสายพันธุ์ (Mycobacterium tuberculosis L1 ถึง L4, L7 และ L8; และ Mycobacterium africanum L5, L6 และ L9) สายพันธุ์ L2 ถึง L4 ที่มีการลบร่วมกันของ TbD1 บริเวณ2,11,12,13 นอกจากนี้ สมาชิกที่ปรับตัวเข้ากับสัตว์ยังได้รับการเสนอให้มีบรรพบุรุษร่วมกัน ซึ่งกำหนดโดยการลบออกเฉพาะกลุ่มใน RD7, RD8, RD9 และ RD102, 5 และ 14
เหตุการณ์การถ่ายโอนยีนในแนวนอน (HGT) และการเกิดการรวมตัวใหม่นั้นถือว่าพบได้ยากและเกิดขึ้นในบรรพบุรุษของ MTBC มากกว่าที่จะเกิดขึ้นในประวัติที่แตกต่างกันของสมาชิก MTBC ทั้งหมด15,16,17 รายงานเบื้องต้นสองฉบับโดย Hughes และคณะ (2002) และ Gutacker และคณะ (2006) ชี้ให้เห็นว่าเหตุการณ์การรวมตัวใหม่อาจช่วยกำหนดรูปแบบพหุสัณฐานที่บ่งบอกถึงตำแหน่งเฉพาะในสายพันธุ์ M. tuberculosis18,19 เหตุผลที่ไม่มีการเกิดการรวมตัวใหม่ที่ชัดเจนใน MTBC คือ: (1) กระบวนการทางกลไกและการสูญเสียความสามารถของ HGT; (2) เหตุการณ์ HGT ที่พบได้ยาก; (3) ไม่มีโอกาสที่จะเกิดเหตุการณ์การรวมตัวใหม่ในกลุ่ม MTBC14,17 เมื่อไม่นานมานี้ การศึกษาการจัดลำดับจีโนมทั้งหมด (WGS) ที่นำไปใช้กับสายพันธุ์ MTBC 20 และ Mycobacterium bovis 21 ได้แสดงหลักฐานของการรวมตัวใหม่ โดยเป็นการศึกษาครั้งแรกที่แสดงให้เห็นว่าสายพันธุ์ MTBC มักจะแลกเปลี่ยนชิ้นส่วน DNA ขนาดเล็ก แต่เนื่องจากความแปรผันของลำดับนิวคลีโอไทด์ที่จำกัด เหตุการณ์เหล่านี้จึงยังคงไม่ถูกสังเกตเห็น
ไมโคแบคทีเรียม โบวิส เป็นสมาชิก MTBC ที่พบได้บ่อยที่สุดจากปศุสัตว์ (ส่วนใหญ่ในวัว) แม้ว่าจะสามารถแยกได้จากสัตว์ป่าที่เลี้ยงแบบปล่อยอิสระและสัตว์ป่าที่ถูกล้อมรั้ว4,22,23,24 ไมโคแบคทีเรียม โบวิส ได้วิวัฒนาการเป็นโคลนคอมเพล็กซ์หลัก 5 กลุ่ม [ยูโรเปียน 1 (Eu1), ยูโรเปียน 2 (Eu2), ยูโรเปียน 3 (Eu3), แอฟริกัน 1 (Af1) และแอฟริกา 2 (Af2)] ตามโปรไฟล์สโปลิโกไทป์ การลบออกจำเพาะ และโพลีมอร์ฟิซึมของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 ในยีนจำเพาะ โคลนคอมเพล็กซ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงโครงสร้างที่หลากหลายของประชากรไมโคแบคทีเรียม โบวิส และความสัมพันธ์กับภูมิภาคทางภูมิศาสตร์ นอกจากนี้ งาน WGS ล่าสุดที่ดำเนินการโดย Zimpel และคณะ (2020) ได้ออกแบบวิวัฒนาการสายพันธุ์โดยอาศัย SNP ของ Mycobacterium bovis ซึ่งมีจีโนมมากกว่า 1,900 จีโนม ซึ่งบ่งชี้ว่ามีสายพันธุ์ที่แตกต่างกันอย่างน้อยสี่สายพันธุ์ (ตั้งชื่อจาก Lb1 ถึง Lb1 ถึง Lb4) ซึ่งไม่สอดคล้องกับกลุ่มโคลนที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้อย่างสมบูรณ์ แม้ว่าจะสามารถยืนยันความจำเพาะทางภูมิศาสตร์ได้เช่นกัน30 ผู้เขียนเหล่านี้ได้ทำการวิเคราะห์วิวัฒนาการสายพันธุ์และการหาอายุเชิงโมเลกุลแบบแยกส่วน แต่ไม่ได้ศึกษาการรวมตัวกันใหม่30
งานวิจัยก่อนหน้านี้ที่ใช้เทคนิคทางโมเลกุลต่างๆ เช่น spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) และ SNP typing ล่าสุด เผยให้เห็นความหลากหลายทางพันธุกรรมในระดับหนึ่งในสายพันธุ์ M. bovis 31, 32, 33, 34, 35 การแยกความแตกต่างของความแปรปรวนทางพันธุกรรมได้กลายเป็นเครื่องมือสำคัญในการศึกษาระบาดวิทยาของโรค ซึ่งมีประโยชน์ต่อการทำความเข้าใจเชิงลึกเกี่ยวกับพยาธิกำเนิด ความรุนแรงของโรค และการแพร่กระจายของโรค การเกิดขึ้นของวิธี WGS ทำให้สามารถเปิดเผยปัจจัยขับเคลื่อนวิวัฒนาการที่จีโนมของ Mycobacterium bovis กำหนดขึ้นในกระบวนการปรับตัวและการคงอยู่ของเชื้อโฮสต์และสถานการณ์ทางระบาดวิทยาที่แตกต่างกัน
ในงานนี้ เราใช้การวิเคราะห์จีโนมเชิงเปรียบเทียบจากชุดข้อมูล Mycoplasma bovis ต่างๆ (n=70) รวมถึงการแยกตัวจากคอมเพล็กซ์โคลนต่างๆ เพื่อให้เข้าใจกระบวนการวิวัฒนาการของ Mycoplasma bovis โดยเฉพาะเพื่อแก้ไขความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการและเหตุการณ์การรวมตัวกันใหม่ เพื่อเป็นการเสริมการวิเคราะห์นี้ ได้มีการสำรวจชุดข้อมูลย่อยของการแยกตัวของ M. bovis (n = 42) ที่ได้จากพื้นที่วัณโรคที่มีโฮสต์หลายตัวซึ่งมีลักษณะเฉพาะชัดเจนในประเทศโปรตุเกส 31,36 เพิ่มเติมเพื่ออนุมานความไม่เหมือนกัน ความสมดุลระหว่างอัตราส่วนสัมพันธ์ของเซนส์ (dN) ต่อการแทนที่นิวคลีโอไทด์ที่มีความหมายเหมือนกัน (dS) เช่นเดียวกับการมีส่วนสนับสนุนทางวิวัฒนาการของจีโนมเฉพาะที่กล่าวถึงในเอกสาร พวกมันได้มาจากบรรพบุรุษ MTBC ผ่านทาง HGT และเข้ารหัสส่วนประกอบของยีนระบบ 3R (การซ่อมแซม DNA การจำลองแบบ และการรวมตัวกันใหม่) 39 เลือกยีนที่ได้มาจาก HGT เนื่องจากพวกมันอาจแสดงถึงความหลากหลายทางพันธุกรรมในสมัยโบราณ ดังนั้นจึงคาดว่าพวกมันอาจมีสัดส่วนของการเปลี่ยนแปลงที่มีความหมายเหมือนกันสูงกว่า ยีนที่รวมอยู่ในระบบ 3R ได้รับการคัดเลือกเนื่องจากงานวิจัยก่อนหน้านี้เกี่ยวกับสายพันธุ์ M. tuberculosis บ่งชี้ถึงการคัดเลือกแบบลบ/บริสุทธิ์ทั่วไปที่มีผลต่อยีนเหล่านี้ และอาจมีบทบาทสำคัญในวิวัฒนาการ 39 อีกเป้าหมายหนึ่งของงานวิจัยนี้คือการอนุมานถึงการมีอยู่ของเหตุการณ์การปรับโครงสร้างใหม่ ด้วยเหตุนี้ เมื่อพิจารณาว่าชุดข้อมูลของเราจากโปรตุเกสมีเฉพาะจีโนมของโคลนคอมเพล็กซ์ 2 ของยุโรป และสายพันธุ์ที่ไม่ได้กำหนดให้กับโคลนคอมเพล็กซ์ เราจึงตัดสินใจที่จะรวมข้อมูลจีโนมที่เปิดเผยต่อสาธารณะเพื่อให้ได้ตัวแทนของโคลนคอมเพล็กซ์ทั้งหมด และปรับปรุงความทนทานและขอบเขตของผลลัพธ์
จีโนม Mycoplasma bovis 42 จีโนมที่ถอดรหัสพันธุกรรมใหม่จากวัณโรคหลายโฮสต์ประจำถิ่นในโปรตุเกส (รายละเอียดด้านล่าง) ซึ่งก่อนหน้านี้เคยถูกจำแนกลักษณะจากมุมมองทางระบาดวิทยา36 เป็นหัวใจสำคัญของงานวิจัยนี้ เนื่องจากชุดข้อมูลจากโปรตุเกสมีเพียงตัวแทนของคอมเพล็กซ์โคลน 2 สายพันธุ์ในยุโรปและสายพันธุ์ที่ไม่มีคอมเพล็กซ์ที่กำหนดไว้ จึงได้เพิ่มข้อมูลการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดที่เปิดเผยต่อสาธารณะเพื่อขยายชุดข้อมูลที่ครอบคลุมตัวแทนทั้งหมดของคอมเพล็กซ์โคลน M. bovis ดังนั้น งานวิจัยนี้จึงใช้แหล่งข้อมูลการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดสามแหล่ง ได้แก่ การประกอบจีโนมแบบสมบูรณ์/ร่าง โครงร่างสูงสุด 10 โครงที่เก็บไว้ใน NCBI (ศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ) (n = 15 ไอโซเลต); ที่เก็บไว้ใน SRA (ไฟล์ Illumina fastq ของไฟล์เก็บถาวรการอ่านลำดับพันธุกรรม) แสดงถึงความหลากหลายเชิงซ้อนของโคลน M. bovis (n = 12 ไอโซเลต)30; และจีโนมที่ถอดรหัสพันธุกรรมใหม่ 42 จีโนมจากโปรตุเกส Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ถูกแยกออกจากการค้นหาของ NCBI โดยปกติแล้ว M. bovis AF2122/97 จะถูกใช้เป็นจีโนมอ้างอิงที่จะรวมอยู่ในชุดข้อมูล เนื่องจากลำดับจีโนมทั้งหมดที่แสดงโดย African 1 cloning complex ยังไม่เปิดเผยต่อสาธารณะ และมีจำนวนจีโนมจากสายพันธุ์ที่เป็นตัวแทนของ Af2 และ Eu1 เพียงเล็กน้อย จึงใช้ข้อมูลการจัดลำดับเบสดั้งเดิมที่ SRA จัดหาให้ในกรณีเหล่านี้ ผลงานของ Zimpel และคณะ (2020) ช่วยในการระบุจีโนมจาก clening complex ดังกล่าว และช่วยคัดเลือก Mycobacterium bovis เพื่อรวมอยู่ในชุดข้อมูล สำหรับ Eu3 มีการอธิบายจีโนมเพียงประเภทเดียว (Branger et al., 2020) ดังนั้นจีโนมที่เรารวมไว้จึงเป็นตัวแทนของ Eu3 complex แยกต่างหาก
ชุดข้อมูลนี้ประกอบด้วยเชื้อ M. bovis ในโคจำนวน 70 ตัวที่แยกได้จากเชื้อโฮสต์ 8 ชนิด กระจายอยู่ใน 12 ประเทศทั่วโลก ตั้งแต่ปี พ.ศ. 2528 ถึง พ.ศ. 2559 โดยมี 36 ชนิดที่กำหนดเป็น Eu2, 7 ชนิดที่กำหนดเป็น Eu1, 1 ชนิดที่กำหนดเป็น Eu3, 3 ชนิดที่กำหนดเป็น Af1, 4 ชนิดที่กำหนดเป็น Af2 และ 19 ชนิดที่ไม่เกี่ยวข้องกับโคลนใดๆ (รายละเอียดด้านล่าง) ข้อมูลโดยละเอียด (รวมถึงหมายเลข accession) ของเชื้อ Mycobacterium bovis ที่ใช้ในการศึกษานี้แสดงไว้ในตารางที่ 1 และตารางเสริมที่ 1
จีโนมทั้งหมดของเชื้อ Mycobacterium bovis ที่ถูกถอดรหัสพันธุกรรมใหม่ 42 รายการ จากแหล่งระบาดของวัณโรคในสัตว์ในโปรตุเกส ซึ่งกระจายตัวมานานกว่า 12 ปี เป็นศูนย์กลางของการศึกษานี้ เนื่องจากได้มีการตรวจสอบระบบโรคสัตว์ป่าและปศุสัตว์ที่อาจเกิดขึ้นอย่างสม่ำเสมอ (31, 36) (รูปเสริม 1) ตามขั้นตอนที่ตามมา เชื้อเหล่านี้ถูกแยกได้จากโค (n = 14) กวางแดง (n = 16) และหมูป่า (n = 12) ตั้งแต่ปี พ.ศ. 2546 ถึง พ.ศ. 2558: รวบรวมและจัดการสัตว์ตามแนวทางปฏิบัติที่แนะนำ ตัวอย่างเนื้อเยื่ออยู่ในคู่มือสัตว์บกของ OIE และได้รับการเพาะเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อไพรูเวตแข็งและอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวของ Stonebrink และ Löwenstein-Jensen เชื้อจะถูกบ่มเพาะที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส และตรวจสอบการเจริญเติบโตสัปดาห์ละครั้งเป็นเวลาอย่างน้อย 12 สัปดาห์ เก็บโคโลนีไว้ในสารละลายกลีเซอรอลที่อุณหภูมิ -80 องศาเซลเซียสโดยตรง ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Mycobacterium แบบเลือกสรร (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) ตัวอย่างที่เก็บถาวรดั้งเดิมถูกส่งผ่านหลอดทดลองแบบ in vitro ครั้งเดียวเพื่อเก็บ DNA ของโครงการ WGS โดยการเติมสารละลายสต็อกเชื้อแช่แข็งด้วยโซเดียมไพรูเวต 5% และ ADS 10% (อัลบูมิน 50 กรัม, กลูโคส 20 กรัม, โซเดียมคลอไรด์ 8.5 กรัม ในน้ำ 1 ลิตร) บน Middlebrook 7H9 ที่อุณหภูมิ 37°C Retrain หลังจากการเจริญเติบโตเป็นเวลา 4 สัปดาห์ อาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกเปลี่ยนใหม่ และมีการเฝ้าติดตามการเจริญเติบโตอย่างสม่ำเสมอจนกระทั่งสังเกตเห็น เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยง นำตะกอนเซลล์กลับมาแขวนลอยในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ซาไลน์ (PBS) ปริมาตร 500 ไมโครลิตร ให้ความร้อนที่ 99°C เป็นเวลา 30 นาที ปั่นเหวี่ยง และเก็บส่วนใสไว้ที่อุณหภูมิ -20°C จนกระทั่งถึง WGS ขั้นตอนทั้งหมดดำเนินการในโรงงานชีวนิรภัยระดับ 3
คลังข้อมูลจีโนมปลายคู่ WGS จัดทำขึ้นโดยใช้ดัชนีเฉพาะของตัวอย่างดีเอ็นเอแต่ละตัวอย่าง และใช้เทคโนโลยี Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 ตัวอย่าง) และ HiSeq (2 × 150 pb) (สองไอโซเลต) (Eurofins Genomics ประเทศเยอรมนี) สำหรับการหาลำดับเบส ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ให้ใช้เครื่องวิเคราะห์จีโนม Illumina พร้อมโมดูลปลายคู่เพื่อจัดลำดับดีเอ็นเอจีโนม และใช้ชุดเตรียม DNA Library ของ Nextera XT จาก Illumina เพื่อสร้างคลังข้อมูล
เมื่อพิจารณาจากข้อมูลที่รวบรวมได้จาก SRA (n = 12) การระบุคอมเพล็กซ์โคลนสามารถใช้เป็นข้อมูลเมตาของเอกสารเผยแพร่ที่เกี่ยวข้อง 30, 41, 43 เมื่อพิจารณาจีโนมที่สมบูรณ์ ยกเว้น Mycobacterium bovis AF2122/97 และ Mycobacterium bovis 3601 ซึ่งเป็นสมาชิกที่ได้รับการยอมรับของคอมเพล็กซ์โคลน Eu1 และ Eu3 25, 29 ตามลำดับ จะเหมือนกับจีโนมที่สมบูรณ์ของ Mycobacterium tuberculosis H37Rv (หมายเลขเข้าถึง NCBI NC_000962.3) การจัดเรียงจีโนมดำเนินการโดยใช้ MAFFT (โปรแกรมจัดเรียงกรดอะมิโนหรือลำดับนิวคลีโอไทด์หลายตัว เวอร์ชัน 7.458) และพารามิเตอร์ -addfragments48 จากนั้นค้นหาการไม่มีคอมเพล็กซ์โคลนที่แตกต่างกัน และ/หรือการมีอยู่ของลักษณะ SNP
ลำดับใหม่ของ Mycobacterium bovis (n = 42) และการอ่านต้นฉบับของร่างจีโนมที่ประกอบขึ้น (n = 3) จัดเรียงคอมเพล็กซ์ให้ตรงกับจีโนมอ้างอิง Mycobacterium tuberculosis H37Rv ผ่านทางท่อ vSNP และการมีอยู่ของการลบและ/หรือคุณสมบัติ SNP ของโคลนต่างๆ ได้ดำเนินการค้นหา
รวบรวมข้อมูลจากการขาดคุณสมบัติ และ/หรือการมี/ไม่มีโปรไฟล์ SNP และ spoligotyping เพื่อกำหนดข้อมูลจีโนมให้กับคอมเพล็กซ์โคลนที่เกี่ยวข้อง สำหรับชุดร่างทั้งสี่ชุด ไม่สามารถอนุมานโปรไฟล์ spoligotyping ได้ ดังนั้นจึงรวมอยู่ในกลุ่ม "ไม่มีความซับซ้อน"
ขั้นตอนการทำงานด้านชีวสารสนเทศศาสตร์ที่ตามมาในงานนี้เริ่มต้นจากการประกอบและการทำแผนที่แบบ de novo เข้ากับกลยุทธ์อ้างอิง โดยมีเป้าหมายเพื่อสำรวจเหตุการณ์การรวมตัวใหม่และความหลากหลายทางพันธุกรรมของจีโนมที่เฉพาะเจาะจง รูปที่ 1 แสดงผังงานของขั้นตอนต่างๆ ที่ปฏิบัติตาม สำหรับการวิเคราะห์การรวมตัว จีโนมทั้งหมดจะถูกใช้เพื่อเพิ่มความทนทานของการอนุมานและตัวบ่งชี้ที่เกี่ยวข้อง
เพื่อลดข้อผิดพลาดในการสร้างลำดับจีโนมคอนเซนซัส เราจึงได้ลำดับเบสแบบ de novo assembly ก่อน จากนั้นจึงได้ลำดับเบสแบบ core multiple alignment ปัจจุบันมี Unicycler pipeline อยู่ที่ https://github.com/rrwick/Unicycler49 และใช้สำหรับประกอบจีโนมแบบ de novo 54 จีโนมที่เรียงลำดับแล้ว (ไฟล์ที่เรียงลำดับใหม่ 42 ไฟล์ และไฟล์ fastq ที่กู้คืนจาก SRA 12 ไฟล์) โดยสรุป ก่อนการประกอบชิ้นส่วนตั้งแต่ต้น ได้มีการวิเคราะห์คุณภาพการอ่านใน FastQC เวอร์ชัน 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) และ Trimmomatic เวอร์ชัน 0.36 (ใช้ตัวเลือก "ตัดอะแดปเตอร์และลำดับแสงเฉพาะอื่นๆ จากการอ่าน" และ "ตัดฐานจากจุดสิ้นสุดการอ่าน หากคุณภาพต่ำกว่าเกณฑ์ 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50 จากนั้นจึงใช้ SPAdes optimizer49 สำหรับการประกอบจีโนม และใช้ Pilon เวอร์ชัน 1.1851 สำหรับการปรับแต่งประสิทธิภาพหลังการประกอบ เลือกโหมดบริดจ์แบบอนุรักษ์นิยมเพื่อหลีกเลี่ยงการประกอบชิ้นส่วนที่ไม่ถูกต้อง และค้นหาและเลือกขนาด k-mer ระหว่าง 20% ถึง 95% ของความยาวการอ่าน ปฏิบัติตามแนวทาง SPAdes และพิจารณาขนาดการอ่าน ลบคอนติกที่เล็กกว่า 300 bp และกำหนดค่าการตัดขาดการครอบคลุมความลึกการอ่าน 20 ที่ 52 ในกลยุทธ์การประกอบ de novo บริเวณจีโนม เช่น พาราล็อกโพรลีน-กลูตาเมต (PE) และโพรลีน-โพรลีนกลูตาเมต (PPE) ที่มีการทำซ้ำสูงจะไม่ถูกลบออก
คุณภาพของการประกอบใหม่จะได้รับการประเมินผ่านทาง QUAST pipeline (http://quast.sourceforge.net/quast.html) ซึ่งช่วยอำนวยความสะดวกในการต่ออายุของ contig และการทำแผนที่จีโนมอ้างอิง M. bovis AF2122/97 (หมายเลขเข้าถึง NCBI LT708304.1) (ดูตารางเสริม 1 สำหรับพารามิเตอร์คุณภาพ)
ด้วยความช่วยเหลือของ vSNP pipeline (https://github.com/USDA-VS/vSNP) ไฟล์ FASTQ ของ M. bovis ที่เพิ่งถอดรหัสจาก Illumina sequencing จะถูกนำไปเปรียบเทียบกับจีโนมอ้างอิง M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)) ตามคำแนะนำแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดของ Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55 ให้ใช้พารามิเตอร์ตัวกรองมาตรฐานหรือคะแนนมวลแปรผันสำหรับการปรับเทียบใหม่ ผลลัพธ์จะถูกกรองโดยใช้คะแนนมวล SAMtools ต่ำสุดที่ 150 และ AC = 2 นอกจากนี้ ให้ใช้ Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) เพื่อตรวจสอบค่าที่อ่านได้เพื่อตัดการปนเปื้อน vSNP pipeline ที่ใช้ในการจับคู่กลยุทธ์การถอดรหัสในงานของเราจะตรวจสอบชุด SNP และเป้าหมายที่กำหนดไว้ และไม่รวมสถานการณ์การติดเชื้อแบบผสม ค่าการครอบคลุมจีโนมที่อ่านได้ดีกว่า 99% (ตารางเสริม 1)
เพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดในการแมปและ SNP ที่ไม่ถูกต้อง ให้กรองตัวแปรออกในกรณีต่อไปนี้: (1) มีการอ่านค่าน้อยกว่า 20 ครั้ง (2) พบด้วยความถี่น้อยกว่า 0.9 (3) อยู่ในสายพันธุ์อย่างน้อยหนึ่งสายพันธุ์ แต่มีช่องว่างในสายพันธุ์อื่นอย่างน้อยหนึ่งสายพันธุ์ โปรแกรม Integrated Genomics Viewer (IGV) เวอร์ชัน 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 ถูกใช้เพื่อตรวจสอบ SNP และตำแหน่งด้วยสายตาที่มีปัญหาในการแมปหรือการจัดตำแหน่ง เนื่องจากยีนโปรลีน-กลูตาเมต (PE) และโปรลีน-โปรลีนกลูตาเมต (PPE) มีจำนวนซ้ำกันมากและเป็นส่วนหนึ่งของกลุ่มยีนหลายยีน จึงทำให้เข้าใจผิดได้ง่ายจากการจัดลำดับและการจับคู่ที่ไม่ถูกต้องของ Illumina ดังนั้นจึงเป็นที่นิยมใช้ เวิร์กโฟลว์ชีวสารสนเทศของไมโคแบคทีเรียจะกำจัดสมาชิกของวัณโรคเมื่อใช้กลยุทธ์การแมปเพื่อจัดลำดับเพื่อยืนยัน SNP ดังนั้นเราจึงกรองยีน PE/PPE และอินเดลออกจากการวิเคราะห์
ตามข้อมูลของ Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) SNP ทั้งหมดจะถูกแบ่งออกเป็นหมวดหมู่ฟังก์ชัน มีการใช้ SnpEff pipeline (https://pcingola.github.io/SnpEff/) เพื่ออนุมานผลลัพธ์ของ SNP (การเปลี่ยนแปลงที่มีความหมายเหมือนกันหรือไม่มีความหมายเหมือนกัน) ได้สร้างฐานข้อมูลใหม่ของจีโนม Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1)
การจัดตำแหน่งจีโนมแกนหลักหลายชุดดำเนินการโดยใช้ Parsnp เวอร์ชัน 1.2 ซึ่งปัจจุบันมีให้บริการที่ https://github.com/marbl/parsnp57 โดยใช้จีโนม/ชุดประกอบร่างที่สมบูรณ์ 69 ชุด (พร้อมตัวเลือก -c) และใช้ M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) เป็นข้อมูลอ้างอิง มีการจัดตำแหน่งจีโนมแกนหลักสี่ชุด ได้แก่ เฉพาะสมาชิกของคอมเพล็กซ์โคลนนิ่ง Eu2 (n = 37) ซึ่งรวมถึงสมาชิกทั้งหมดของคอมเพล็กซ์โคลนนิ่งยุโรป (n = 44) รวมถึงจุดเชื่อมต่อของคอมเพล็กซ์โคลนนิ่งยุโรปและแอฟริกา (n = 51) และรวมถึง Mycobacterium bovis ทั้งหมดในการศึกษานี้ (n = 70)
การจัดตำแหน่งแกนกลางที่สร้างโดย Parsnp จะถูกใช้เพื่ออนุมานต้นไม้วิวัฒนาการที่มีความน่าจะเป็นสูงสุด (ML) โดยใช้ CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 โดยใช้ RAxML และดำเนินการจำลองแบบมีคำแนะนำ 1,000 ครั้ง
มีการใช้อัลกอริทึมและเครื่องมือชีวสารสนเทศสามแบบที่แตกต่างกันเพื่อตรวจสอบการมีอยู่ของเหตุการณ์การรวมตัวใหม่แบบขนาน ได้แก่ ซอฟต์แวร์ SplitsTree4, ไปป์ไลน์ Gubbins (ลำดับวงศ์ตระกูลที่ไม่เอนเอียงผ่านการรวมตัวกันใหม่ในลำดับนิวคลีโอไทด์) และซอฟต์แวร์ RDP4 (โปรแกรมตรวจจับการรวมตัวกัน เวอร์ชันเบตา 4.101)
วิธีการแยกย่อยแบบแยกส่วนที่ใช้ใน SplitsTree4 เวอร์ชัน 4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 ถูกนำมาใช้เพื่อคำนวณเครือข่ายวิวัฒนาการแบบไร้ราก โดยใช้การทดสอบ Phi เพื่อการตรวจสอบทางสถิติ และเกณฑ์ความสำคัญคือ p = 0.05 การวิเคราะห์การจัดตำแหน่งหลายตำแหน่งของ Parsnp หลักจะถูกใช้เป็นข้อมูลนำเข้า และการแยกย่อยแบบแยกส่วนนี้จะกลายเป็นมาตรฐานเครือข่าย
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 ทำงานด้วยพารามิเตอร์เริ่มต้นเป็นอีกวิธีหนึ่งในการประเมินผลกระทบของการรวมตัวกันใหม่บน Mycobacterium bovis อัลกอริทึมที่ใช้ในไปป์ไลน์จะสร้างวงศ์โคลนที่เกี่ยวข้องขึ้นใหม่ การประกอบจีโนม/ร่างที่สมบูรณ์ของชุดข้อมูลของเราและจีโนมอ้างอิง (bovine bovid AF2122/97, LT708304.1) จะทำงานร่วมกัน และสแกนตำแหน่งของ SNP บนแต่ละสาขาของต้นไม้เพื่อตรวจจับคลัสเตอร์ SNP ที่แสดงถึงเหตุการณ์การรวมตัวกันใหม่ ศูนย์ของสาขา สมมติว่าไม่มีเหตุการณ์การรวมตัวกันใหม่ ซึ่งหมายความว่า SNP ที่เกิดขึ้นบนสาขาควรกระจายอย่างเท่าเทียมกัน การจัดเรียงแกนหลักหลายรายการจาก Parsnp และต้นไม้ ML ที่ได้รับคะแนนสูงสุดจาก RAxML จะถูกใช้เป็นไฟล์อินพุต
สุดท้ายนี้ เพื่อยืนยันเหตุการณ์การจัดระเบียบใหม่ที่แนะนำโดย Gubbins pipeline อัลกอริทึมทั้งหกที่ใช้ใน RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 และ SiScan66) จะถูกนำไปใช้กับการจัดตำแหน่งหลายรายการหลักของ Parsnp ภายใต้การตั้งค่าเริ่มต้น เราได้กำหนดว่าอัลกอริทึมอย่างน้อยสามตัวที่ใช้ใน RDP4 จะต้องแสดงสัญญาณสำคัญอย่างสม่ำเสมอเพื่อยืนยันเหตุการณ์การรวมตัวใหม่แต่ละครั้ง
เมื่อพิจารณาว่าซอฟต์แวร์ Gubbins และ RDP ค้นหาสัญญาณการรวมตัวใหม่โดยการตรวจสอบการจัดเรียงตัวของแกนกลางหลายตำแหน่งในหน้าต่างที่มีความยาวสูงสุด 500 bp และยืนยันว่าการรวมยีน PE/PPE ระหว่างการประกอบตัวใหม่จะไม่รบกวนสัญญาณการรวมตัวใหม่ที่พบ การวิเคราะห์เพิ่มเติมจึงดำเนินการโดยใช้ homolinearity ตรวจสอบบริเวณใกล้เคียงของยีนเพื่อระบุเหตุการณ์การรวมตัวใหม่ แผนที่ซิงลิเนียร์ที่ใช้จีโนมทั้งหมดถูกสร้างขึ้นโดยใช้การจัดเรียงตัวของ MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) เพื่อแยกการเคลื่อนย้ายหรือการกลับด้านของจีโนมในพื้นที่ นอกจากนี้ จีโนมทั้งหมดยังถูกนำมาใช้เพื่อทำการวิเคราะห์ homolinearity ของลำดับกรดอะมิโนผ่านเว็บเซิร์ฟเวอร์ SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/)
การวิเคราะห์ชุดข้อมูลจีโนมที่ได้จากระบบวัณโรคหลายโฮสต์ของโปรตุเกสอย่างละเอียดยิ่งขึ้น คือการตรวจสอบความหลากหลายทางพันธุกรรมของยีนที่กล่าวถึงในเอกสาร ยีนเหล่านี้คือ 37, 38 และยีนที่เข้ารหัส 3R ซึ่งได้จากบรรพบุรุษของ MTBC ผ่านส่วนประกอบของระบบ HGT (การซ่อมแซม การจำลองแบบ และการรวมตัวกันใหม่ของดีเอ็นเอ) 39 ใช้ ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) และใช้ DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) เพื่อคำนวณความหลากหลายของยีนและความหลากหลายของนิวคลีโอไทด์ (π) และอินพุตพารามิเตอร์การทดสอบ Tajima's D neutral
แผนภูมิวิวัฒนาการพันธุกรรมแบบความน่าจะเป็นสูงสุด (ML) ที่ได้จากการแยกเชื้อ Mycoplasma bovis จำนวน 69 ตัวอย่างและจีโนมอ้างอิง (รูปที่ 2A) เมื่อเปรียบเทียบกับแผนภูมิวิวัฒนาการพันธุกรรมแบบยีนเดี่ยวหรือแบบหลายตำแหน่ง กลยุทธ์นี้ช่วยให้สามารถสร้างแผนภูมิวิวัฒนาการที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น ซึ่งไม่ครอบคลุมความแปรปรวนของจีโนมทั้งหมด ดังนั้นจึงมีความสามารถในการแยกแยะระหว่างสปีชีส์ 68, 69 ที่ต่ำกว่า โครงสร้างโทโพโลยีของแผนภูมิวิวัฒนาการพันธุกรรมแบบ ML มักจะสอดคล้องกับการจำแนกประเภทโคลนที่ซับซ้อน จีโนมของ Eu2 จะรวมกลุ่มกันเป็นกิ่ง และจีโนมของ Af1 ก็รวมกลุ่มกันเช่นกัน (รูปที่ 2A) ผลลัพธ์ยังสอดคล้องกับความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการที่ทราบกันดีของ Mycobacterium bovis กล่าวคือ มีความแตกต่างอย่างมากระหว่างสมาชิก Eu1 และกลุ่มที่ประกอบด้วยคอมเพล็กซ์โคลนและจีโนมอื่นๆ ทั้งหมด แต่ไม่ได้ระบุคอมเพล็กซ์โคลน 30 ความไม่สอดคล้องกันเล็กน้อยระหว่างคอมเพล็กซ์โคลนและความสัมพันธ์ที่สังเกตได้บนต้นไม้วิวัฒนาการสามารถอธิบายได้จากข้อเท็จจริงที่ว่าคอมเพล็กซ์โคลนได้รับการอธิบายโดยอิงตามภูมิภาคจีโนมที่เฉพาะเจาะจง ในขณะที่ต้นไม้วิวัฒนาการมีพื้นฐานอยู่บนการจัดเรียงหลายตำแหน่งของจีโนมหลักที่แสดงถึงจีโนมทั้งหมด
ต้นไม้วิวัฒนาการพันธุกรรมที่มีความน่าจะเป็นสูงสุด (GTR) สร้างขึ้นโดยอาศัยการจัดเรียงจีโนมหลักของจีโนมของแบคทีเรียไมโคแบคทีเรียม โบวิส ก่อน (A) และหลัง (B) การกำจัดจุดรวมพันธุ์ สีของกิ่งก้านแสดงถึงกลุ่มโคลนของแบคทีเรียไมโคแบคทีเรียม โบวิส: ยุโรป 1 เป็นสีม่วง ยุโรป 2 เป็นสีแดง ยุโรป 3 เป็นสีน้ำเงิน แอฟริกา 1 เป็นสีส้ม และแอฟริกา 2 เป็นสีเขียว ต้นไม้ถูกวาดรากและวาดตามมาตราส่วน และวัดความยาวของกิ่งก้านเพื่อแทนที่ตำแหน่งแต่ละจุด
แบคทีเรียกลุ่ม Mycobacterium tuberculosis ได้รับการอธิบายว่ามีวิวัฒนาการแบบโคลน และหลักฐานส่วนใหญ่ที่สะสมมาตลอดหลายปีสนับสนุนแนวคิดที่ว่าเหตุการณ์ HGT และการรวมตัวกันใหม่ที่กำลังดำเนินอยู่จะไม่เกิดขึ้นที่ระดับ MTBC15,17,18 ที่ตรวจพบได้
งานวิจัยก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าอาจมีการรวมตัวกันใหม่อย่างจำกัดระหว่างสายพันธุ์ MTBC20,21 ขณะที่สายพันธุ์อื่นๆ ไม่สามารถระบุเหตุการณ์การรวมตัวกันใหม่ที่วัดได้70,71 ให้พิจารณาประเด็นนี้อีกครั้งโดยเน้นที่ Mycobacterium bovis ซึ่งแตกต่างจากงานวิจัยก่อนหน้านี้ที่พิจารณาเฉพาะ Mycobacterium tuberculosis 70,71 หรือพิจารณา MTBC โดยรวม โดยแทบไม่มี M. bovis เป็นตัวแทน 20 หรือพิจารณาเฉพาะกลุ่มโคที่จำกัด ชุดข้อมูลไมโคแบคทีเรียในงานวิจัยนี้มีสายพันธุ์ทั้งหมด 70 สายพันธุ์ ซึ่งเป็นตัวแทนของกลุ่มโคลนทั้งหมด ที่ใช้ในการคัดกรองการรวมตัวกันใหม่ ชุดข้อมูลนี้ถูกปรับขนาดตามระดับสะสมสี่ระดับ ได้แก่ (1) สมาชิก Eu2 (2) สมาชิกกลุ่มโคลนยุโรปทั้งหมด (เช่น ยุโรป) (3) กลุ่มโคลนยุโรปและแอฟริกา (Eu + Af) และ (4) คอลเลกชันข้อมูลทั้งหมด (รวมถึงจีโนมที่ไม่รวมอยู่ในกลุ่มโคลนใดๆ ที่ได้อธิบายไว้แล้ว)
เพื่อศึกษาสมมติฐานนี้เพิ่มเติม จึงได้ดำเนินการเครือข่ายการแยกตัวแบบย่อยสลาย (split-decomposition network) เพื่อประเมินการไม่มีเหตุการณ์การรวมตัวกันใหม่ระหว่างจีโนม เนื่องจากวิธีนี้สามารถแสดงภาพความสัมพันธ์ระหว่างบรรพบุรุษของแต่ละบุคคลและแสดงสัญญาณวิวัฒนาการทางพันธุกรรมที่ขัดแย้งกัน ชุดข้อมูลทั้งสี่ชุดในการวิเคราะห์ยืนยันการมีอยู่ของลูปในเครือข่าย (กล่าวคือ พื้นที่ที่ไม่ได้บรรจบกันเป็นต้นไม้ต้นเดียว) แต่การทดสอบ Phi ไม่มีข้อมูลทางสถิติสนับสนุน (Eu2, p = 0.0956; ยุโรป, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; ชุดข้อมูลทั้งหมด p = 0.2451) ซึ่งให้หลักฐานที่ไม่เพียงพอสำหรับการเกิดเหตุการณ์การจัดระเบียบใหม่ (รูปที่ 3A-D)
ในยุโรปมีจีโนม 2 อัน (n = 37) (A) จีโนมของยุโรป (n = 44) (B) จีโนมของยุโรปและแอฟริกา (n = 51) (C) และชุดข้อมูลทั้งหมด (n = 70) (D)
หลังจากการวิเคราะห์นี้ และพิจารณาการสังเกตการณ์แบบวนซ้ำในทุกเครือข่าย อัลกอริทึมการสร้างใหม่ที่นำมาใช้ใน Gubbins pipeline ได้ถูกนำไปใช้เพื่อสร้างสายพันธุ์โคลนและเพื่อเสริมการประเมินผลกระทบของการรวมตัวกันใหม่ต่อจีโนมของ M. bovis อนุมานจำนวนเหตุการณ์การรวมตัวกันใหม่สะสม ซึ่งส่วนใหญ่เกิดขึ้นที่กิ่งปลาย (นั่นคือในจีโนมเดียว) (ตารางที่ 2) ตัวบ่งชี้เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงความสอดคล้องของชุดข้อมูลทั้งหมด และบ่งชี้ว่าความถี่ของเหตุการณ์การรวมตัวกันใหม่นั้นสูงกว่าการกลายพันธุ์ 200 ถึง 300 เท่า เมื่อพารามิเตอร์ rho/theta ซึ่งแสดงถึงอัตราการรวมตัวกันใหม่และการกลายพันธุ์แบบจุดบนกิ่งปรากฏว่าอยู่ระหว่าง 0.0037 ถึง 0.0056 (ตารางที่ 3) เมื่อไม่นานมานี้ ผลงานตีพิมพ์ของสายพันธุ์ 38 M. bovis แสดงให้เห็นค่า rho/theta ที่สูงกว่า (rho/theta = 0.1) มากกว่าค่าที่ได้จากชุดข้อมูลนี้ แต่ผลงานของ Patané และเพื่อนร่วมงานใช้การประกอบตามการอ้างอิงเพื่ออนุมานพารามิเตอร์การรวมตัวใหม่ รายละเอียดตามขั้นตอนอันเนื่องมาจากขั้นตอนการประกอบนั้นมีความเกี่ยวข้องกับเหตุการณ์การรวมตัวใหม่ที่อาจเกิดขึ้นมากมายในสาขาปลายทาง
ต่อไป พารามิเตอร์ r/m แสดงถึงอัตราส่วนความหลากหลายของการรวมตัวกันใหม่และการกลายพันธุ์ โดยมีค่าเฉลี่ยอยู่ระหว่าง 0.025 ถึง 0.037 ซึ่งบ่งชี้ว่าเมื่อเทียบกับการกลายพันธุ์ การรวมตัวกันมีผลกระทบโดยรวมต่อความหลากหลายทางพันธุกรรมของ M. bovis น้อยกว่า (ตารางที่ 3) เพื่อการเปรียบเทียบอย่างละเอียด จึงได้ใช้วิธีการที่คล้ายกันเพื่อประมาณค่าพารามิเตอร์ r/m สำหรับชุดข้อมูล MTBC ซึ่งประกอบด้วยจีโนม 23 รายการ ซึ่งแสดงค่าเฉลี่ย 0.48620 ในขณะที่ชุดข้อมูล M. bovis 38 รายการของ Patané และคณะ พบว่าค่าเฉลี่ยคือ 0.98 ในการศึกษาครั้งแรก มีเพียงสองจีโนมจาก 23 จีโนมที่รวมอยู่ในงานวิจัยของ M. bovis (BCG ของ M. bovis และสายพันธุ์อ้างอิง) ดังนั้นค่าที่ได้อาจมีความลำเอียงเนื่องจากการแสดงออกของจีโนม M. tuberculosis มากเกินไป ในรายงานฉบับที่สอง ประชากรของเชื้อ Mycobacterium bovis ที่วิเคราะห์ส่วนใหญ่มาจากสหรัฐอเมริกาและสัตว์พาหะ ในทางตรงกันข้าม ชุดข้อมูลของเรามีการระบุตำแหน่งทางภูมิศาสตร์และชนิดพันธุ์ของสัตว์พาหะมากขึ้น และยังมีการใช้จีโนมที่จัดกลุ่มเป็นกลุ่มโคลนที่แตกต่างกันซึ่งมีลักษณะทางพันธุกรรมของประชากรที่แตกต่างกัน ทำให้ได้ความรู้เกี่ยวกับประชากรที่ลึกซึ้งและกว้างขวางยิ่งขึ้น ค่าเฉลี่ย r/m ที่ได้จากชุดข้อมูลของเราสอดคล้องกับแนวคิดที่ว่าระดับการรวมตัวกันใหม่แตกต่างกันอย่างมากระหว่างสายพันธุ์ที่กำหนดให้กับสปีชีส์ทางอนุกรมวิธานเดียวกัน ดังนั้นผลลัพธ์เหล่านี้จึงบ่งชี้ว่ากลุ่มโคลนของเชื้อ M. bovis อาจแสดงความแตกต่างของการรวมตัวกันใหม่ ผลกระทบดังกล่าวยังเป็นไปตามที่ Didelot & Maiden แนะนำไว้72 อย่างไรก็ตาม การขยายชุดข้อมูลนี้อย่างมีนัยสำคัญโดยการเพิ่มจีโนมของเชื้อ M. bovis จำนวนมากขึ้นจะช่วยให้สามารถอธิบายประเด็นนี้ได้อย่างกระจ่างยิ่งขึ้น ทั้งพารามิเตอร์ r/m และ rho/theta แสดงให้เห็นถึงความแปรปรวนระหว่างสาขา และผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับรายงานเกี่ยวกับแบคทีเรียชนิดอื่นๆ72,73
สุดท้าย เพื่อยืนยันเหตุการณ์การจัดระเบียบใหม่ที่ระบุโดย Gubbins pipeline จึงมีการใช้อัลกอริทึมที่แตกต่างกันหกแบบในซอฟต์แวร์ RDP4 เพื่อทดสอบการเปรียบเทียบหลายแกนหลักที่แตกต่างกันอย่างอิสระ ทั่วโลก เหตุการณ์ที่ Gubbins ระบุได้น้อยกว่าครึ่งหนึ่งได้รับการยืนยันโดย RDP4 (ตารางที่ 4 และ 5) เมื่อพิจารณาชุดข้อมูลทั้งหมด พบเหตุการณ์การรวมตัวใหม่สามเหตุการณ์ที่ได้รับการยืนยัน สองเหตุการณ์เกี่ยวข้องกับโหนดภายใน และอีกเหตุการณ์หนึ่งเกี่ยวข้องกับจีโนมเดียวในกิ่งปลาย ซึ่งไม่สามารถระบุคอมเพล็กซ์โคลนได้ (ตารางที่ 4 และ 5) การระบุเหตุการณ์ในกิ่งปลายอาจบ่งชี้ว่าการรวมตัวใหม่ยังคงดำเนินอยู่ในสายพันธุ์ M. bovis ร่วมสมัย หรือผลลัพธ์อาจไม่ถูกต้อง70 ในบริเวณการรวมตัวใหม่ตามสมมติฐานนี้ ประมาณ 20% ของตำแหน่งมีนิวคลีโอไทด์ (N) ที่ไม่ถูกกำหนด ซึ่งส่งผลกระทบต่อสัญญาณการรวมตัวใหม่ (ภาพเสริมที่ 2) นอกจากนี้ บริเวณนี้ยังส่งผลต่อยีน rrs ซึ่งเข้ารหัส 16S ribosomal RNA ซึ่งคาดว่าจะมีการอนุรักษ์ไว้สูง ดังนั้นสัญญาณการรวมตัวใหม่นี้อาจเป็นผลมาจากข้อผิดพลาดในการจัดลำดับหรือการจัดเรียงตัวที่ไม่ถูกต้อง จากนั้นจึงดำเนินการจัดเรียงตัวของจีโนมทั้งหมดระหว่าง Mb0003 และ Mycobacterium bovis AF2122/97 และยืนยันการมีอยู่ของนิวคลีโอไทด์และ SNP ที่ไม่ชัดเจน ดังนั้นปัญหาที่อาจเกิดขึ้นเกี่ยวกับการจัดตัวที่ไม่ถูกต้องจึงไม่ได้เกิดจากข้อมูลทางชีววิทยาที่ใช้ในงานวิจัยนี้ ซึ่งปรากฏหลังจากเรียนรู้โปรแกรม
ไม่พบช่องว่างหรือนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ระบุในบริเวณรีคอมบิเนชั่นของโหนดภายใน (รูปที่ 4 และ 5) สำหรับเหตุการณ์เหล่านี้ เหตุการณ์หนึ่งมีเพียงจีโนม Eu2 และส่งผลกระทบต่อยีน pks12 ซึ่งเข้ารหัสเอนไซม์โพลีคีไทด์ซินเทสที่เป็นไปได้ ในขณะที่อีกเหตุการณ์หนึ่งลงทะเบียนอยู่ในจีโนม Eu1 และส่งผลกระทบต่อยีน narX ซึ่งเข้ารหัสเอนไซม์ไนเตรตรีดักเทสที่เป็นไปได้ (ตารางที่ 4) โดยทั่วไป การวิเคราะห์รีคอมบิเนชั่นแสดงให้เห็นว่ามีชิ้นส่วนรีคอมบิเนชั่นจำนวนจำกัดที่มีข้อมูลทางสถิติสนับสนุน และตัวบ่งชี้ที่อนุมานได้บ่งชี้ว่ารีคอมบิเนชั่นมีผลกระทบต่ำต่อวงศ์ตระกูล M. bovis คาดว่าสัญญาณรีคอมบิเนชั่นจะอยู่ในระดับต่ำ แต่สิ่งสำคัญคือต้องแยกแยะสัญญาณวิวัฒนาการที่แท้จริงออกจากสัญญาณรบกวนพื้นหลัง ซึ่งเป็นงานที่ท้าทาย เพื่อลดสัญญาณรบกวนที่เกิดจากการประกอบอ้างอิงและปัญหาความไม่ตรงกัน 70, 71 ส่วนที่เหลือทั้งหมดยกเว้นจีโนมที่สมบูรณ์ถูกประกอบขึ้นใหม่ทั้งหมด และตรวจสอบคุณภาพการประกอบโดยการวิเคราะห์แบบไปป์ไลน์ QUAST (ตารางเสริม 1) นอกจากนี้ ยังมีการวิเคราะห์เพิ่มเติมหลายชุดเพื่อยืนยันความทนทานและความถูกต้องของแบบสำรวจโดยรวม ดังนั้น คุณภาพการจัดลำดับยีน narX และ pks12 จึงถูกประเมินโดยการทำ read mapping กับ Mycobacterium bovis AF2122/97 ตำแหน่ง SNP ที่แนะนำในบริเวณ recombination ได้รับการยืนยันโดยใช้เกณฑ์ที่ระบุไว้ในส่วนของวิธีการ (อย่างน้อย 20 ครั้ง และความถี่การเปลี่ยนแปลง 0.9) ความหลากหลายทางพันธุกรรมของยีน narX ได้รับการยืนยันอย่างสมบูรณ์ในจีโนมทั้งสอง (Mb1792361 และ Mb7240415; 2.3%) และจีโนมของจีโนม pks12 ได้แก่ ยีน Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 และ Mb12 อย่างไรก็ตาม สำหรับจีโนม Mb2043 ตำแหน่ง 6 ใน 8 ตำแหน่งไม่ตรงตามเกณฑ์ความลึกของการอ่าน เนื่องจาก SNP รองรับการอ่านได้สูงสุด 17 ครั้ง ซึ่งต่ำกว่าค่าตัดขาดที่กำหนดไว้ที่ 20 ดังนั้น จึงสามารถยืนยันการรวมตัวกันใหม่ของจีโนมทั้ง 6 จีโนม (8.6%) ที่ตำแหน่งจีโนมนี้ (รูปที่ 4 และ 5)
การแสดงภาพโดยละเอียดของการจัดตำแหน่งบริเวณรีคอมบิเนชั่นของชุดข้อมูล Mycobacterium bovis มีผลต่อยีน narX ซึ่งเข้ารหัสไนเตรตรีดักเทสที่เป็นไปได้ ไม่พบช่องว่างหรือนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ระบุในบริเวณรีคอมบิเนชั่นของโหนดภายใน เหตุการณ์นี้ถูกบันทึกไว้ในจีโนม Eu1 คุณภาพการจัดลำดับของยีน narX ได้รับการประเมินโดยการพล็อตการอ่านของ Mycobacterium bovis AF2122/97 ยืนยันตำแหน่ง SNP ที่แนะนำในบริเวณรีคอมบิเนชั่นโดยใช้เกณฑ์ที่ระบุไว้ในส่วนของวิธีการ (อย่างน้อย 20 ครั้ง และความถี่การเปลี่ยนแปลง 0.9) โพลีมอร์ฟิซึมของยีน narX ได้รับการยืนยันอย่างสมบูรณ์ในจีโนมของ Mb1792361 และ Mb7240415 (2.3%)
ภาพแสดงรายละเอียดการจัดตำแหน่งบริเวณรีคอมบิเนชั่นของชุดข้อมูล Mycoplasma bovis ที่มีผลต่อยีน pks12 ไม่พบช่องว่างหรือนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ระบุในบริเวณรีคอมบิเนชั่นของโหนดภายใน สำหรับเหตุการณ์ที่ส่งผลกระทบต่อยีน pks12 ซึ่งเข้ารหัสโพลีคีไทด์ซินเทสที่เป็นไปได้ พบว่ามีเพียงจีโนม Eu2 เท่านั้น คุณภาพการเรียงลำดับของ pks12 ได้รับการประเมินโดยการทำแผนที่การอ่านของ Mycobacterium bovis AF2122/97 ยืนยันตำแหน่ง SNP ที่แนะนำในบริเวณรีคอมบิเนชั่นโดยใช้เกณฑ์ที่ระบุไว้ในส่วนวิธีการ (อย่างน้อย 20 ครั้ง และความถี่การเปลี่ยนแปลง 0.9) โพลีมอร์ฟิซึมของจีโนม Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 และ Mb1960 ได้รับการยืนยันอย่างสมบูรณ์แล้ว
ยีน PE และ PPE มีบริเวณที่ซ้ำกันซึ่งอ่านค่าผิดพลาดได้ง่ายจากการจัดลำดับและการจับคู่ผิดพลาดของ Illumina ดังนั้นจึงมักถูกลบออกจากขั้นตอนการทำงานทางชีวสารสนเทศของสมาชิก M. tuberculosis เมื่อใช้กลยุทธ์การจับคู่ลำดับ การอนุมานเหตุการณ์การรวมตัวใหม่ในงานวิจัยนี้อาศัยการประกอบใหม่โดยไม่กรอง PE/PPE ออก เราเชื่อว่าด้วยการใช้วิธีการและอัลกอริทึมเสริมสามแบบที่แตกต่างกันผ่าน SplitsTree, Gubbins pipeline และซอฟต์แวร์ RDP4 กลยุทธ์ที่ใช้มีความทนทานต่อการประมวลผลและกรองบริเวณที่จัดตัวใหม่ซึ่งเกิดจากสัญญาณผิดพลาด อย่างไรก็ตาม เพื่อตัดการรบกวนของยีน PE/PPE บนซอฟต์แวร์ Gubbins และ RDP4 เพื่อระบุกลุ่ม SNP และเพื่อระบุบริเวณการรวมตัวใหม่ที่คาดว่าจะส่งผลต่อยีน narX และ pks12 จึงมีการตรวจสอบบริเวณใกล้เคียงของยีนเหล่านี้ (รูปที่ 3-5 เพิ่มเติม) ใน M. bovis AF2122/97 ยีน narX ถูกแยกโดย narK2 และ Mb1764c ขณะที่ pks12 ถูกล้อมรอบด้วย Mb2075c และ Mb2073c (ภาพเสริม 3-5) แผนที่ที่สร้างโดยใช้แผนที่ MAUVE synline ของจีโนมที่สมบูรณ์ให้ข้อมูลเกี่ยวกับการอนุรักษ์และการจัดเรียงลำดับยีนใหม่ โดยแสดงบล็อก collinear สี่บล็อก และไม่มีสัญญาณของการเคลื่อนย้ายหรือการกลับด้านของจีโนม นอกจากนี้ การวิเคราะห์การเติมเต็มด้วยลำดับกรดอะมิโนยังพิสูจน์ความคล้ายคลึงกันในจีโนมที่สมบูรณ์ทั้งหมด และไม่พบ PE/PPE ในบริเวณที่อยู่ติดกันของ narX หรือ pks12 สำหรับ narX จีโนมหนึ่ง (Mb0030) มีคะแนนความพ้องความหมายต่ำกว่า เนื่องจากยีน narX ถูกระบุว่าเป็นชิ้นส่วนสองชิ้น (ชิ้นส่วน 1891 และ 1890) สำหรับ pks12 เนื่องจากมีความคล้ายคลึงกัน Mb0030 และ Mb003 แสดงคะแนนซินลิเนียริตีที่ต่ำกว่า ในขณะที่ pks12 ถูกระบุเป็นสองและสามส่วนตามลำดับ ซึ่งแสดงถึงโดเมนที่แตกต่างกันของโปรตีน (ภาพเสริม 3-5) เมื่อพิจารณาข้อมูลนี้ ทั้งซอฟต์แวร์ Gubbins และ RDP4 จะทำการวิเคราะห์และตรวจสอบการจัดเรียงตัวของแกนกลางที่ความยาวสูงสุด 500 bp ในหน้าต่าง เรายืนยันว่ายีน PE/PPE จะไม่รบกวนสัญญาณการรวมตัวใหม่ที่ส่งผลต่อ narX และ pks12
แม้ว่าสัญญาณการรวมตัวใหม่ที่ตรวจพบในชุดข้อมูลนี้อาจถือเป็นสัญญาณที่เหลืออยู่ แต่ก็เป็นความจริงที่ว่าไม่สามารถตัดการรวมตัวใหม่ใน M. bovis ออกไปได้ ดังนั้นจึงควรยังคงเป็นหัวข้อของการวิเคราะห์เพิ่มเติม ซึ่งจีโนมทั้งหมดจากสถานการณ์ระบาดวิทยาที่แตกต่างกันจะถูกจัดลำดับให้มีความสำคัญ
การเปรียบเทียบต้นไม้วิวัฒนาการ ML ที่ได้มาก่อนและหลังการแก้ไขการรวมตัวใหม่ (รูปที่ 2A, B) ไม่ได้นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในความสัมพันธ์วิวัฒนาการที่อนุมานได้ และสายพันธุ์ M. bovis ก็จัดกลุ่มอยู่ในกลุ่มเดียวกัน
หลังจากทำแผนที่ยีน M. bovis ที่มีลำดับเบสใหม่ 42 ยีน เข้ากับจีโนมอ้างอิงของ M. bovis AF2122/97 พบว่ามีตำแหน่ง SNP ที่มีตำแหน่งพหุสัณฐาน 1,816 ตำแหน่ง SNP ส่วนใหญ่ (87.1%) อยู่ในบริเวณเข้ารหัส และยีนที่ได้รับผลกระทบจะถูกจำแนกตามหมวดหมู่การทำงานที่แสดงใน Bovilist (รูปที่ 6A, B) เมื่อพิจารณาจำนวนยีนทั้งหมดในแต่ละหมวดหมู่การทำงาน ยีนในหมวดหมู่ "เมแทบอลิซึมของไขมัน" แสดง SNP มากกว่า รองลงมาคือ "ผนังเซลล์และกระบวนการของเซลล์" และ "เมแทบอลิซึมและการหายใจขั้นกลาง" ซึ่งแสดงให้เห็นว่ายีนเหล่านี้อยู่ในวิวัฒนาการของ M. bovis
การวิเคราะห์ลำดับชั้นของชุดข้อมูล M. bovis จากโปรตุเกส (n = 42) จำนวน SNP ที่ลงทะเบียนทั้งหมดและยีนที่ได้รับผลกระทบสำหรับแต่ละหมวดหมู่การทำงาน (A) จำนวนการเปลี่ยนแปลงที่เหมือนกันและไม่เหมือนกันทั้งหมดที่ลงทะเบียนตามหมวดหมู่การทำงาน (B)
ในระดับโลก อัตราส่วน dN/dS เฉลี่ยดีกว่า 1.5 ซึ่งบ่งชี้ว่าแรงกดดันจากวิวัฒนาการทั่วโลกคือการกำจัดสถานะบรรพบุรุษ และแสดงถึงสถานการณ์ทางเลือกในการทำให้บริสุทธิ์ในเชิงบวก (หลากหลายหรือมุ่งเป้าหมาย) และ/หรือผ่อนคลาย ในหมวดหมู่ของ "ความรุนแรง การล้างพิษ การปรับตัว" "ลำดับการแทรกและฟาจ" และ "โปรตีนควบคุม" SNP มากกว่าสองในสามเป็นชนิดที่ไม่เหมือนกัน (รูปที่ 6B)
ในทุกหมวดหมู่ มียีนที่มี SNP หลายตัว ส่งผลให้อัตราการกลายพันธุ์เฉลี่ย (นั่นคือ SNP เฉลี่ยต่อยีน) มากกว่า 1 (รูปที่ 6A) ยีน Pks12 (Mb2074c) ที่มี SNP 15 ตัว และยีน fas (Mb2553c) ที่มี SNP 8 ตัว มีค่าการกลายพันธุ์สูงกว่า ยีนทั้งสองนี้เกี่ยวข้องกับกระบวนการเมแทบอลิซึมของกรดไขมัน ยีน pks เข้ารหัส polyketide synthase (PKS) ซึ่งเป็นเอนไซม์หลายหน้าที่ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ไขมันของผนังเซลล์ไมโคแบคทีเรีย74,75 ยีนนี้เข้ารหัส polypeptide หลายหน้าที่ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ mycoketides74,76 ยีน fas เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์กรดไมโคลิก ยีนทั้งสองนี้มีบทบาทสำคัญในกระบวนการชีวสังเคราะห์ของผนังเซลล์ที่สัมผัสกับโฮสต์
เพื่อศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับวิวัฒนาการของเชื้อ Mycobacterium bovis จึงมีการวิเคราะห์ยีนจำเพาะสองชุด งานวิจัยที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้โดยใช้วิธีการจัดลำดับเบสและวิวัฒนาการทางพันธุกรรมได้ระบุยีนที่บรรพบุรุษของ MTBC ได้รับมาผ่าน HGT ก่อนการกระจายพันธุ์37,38 ยีนเหล่านี้แสดงอยู่ในตารางเสริม 2 การวิเคราะห์การกระจายตัวของ SNP ของยีนทั้งหมด 77 ยีนที่อาจเกี่ยวข้องกับ HGT ได้ถูกวิเคราะห์ และพบตำแหน่งพหุสัณฐาน 26 ตำแหน่ง ซึ่งในกรณีส่วนใหญ่ (78%) ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงแบบไม่พ้อง (NS) (ตารางเสริม 2) งานวิจัยก่อนหน้านี้เกี่ยวกับจีโนม MTBC แสดงให้เห็นว่าบริเวณ HGT ที่สันนิษฐานไว้มีอัตราส่วน SNP ของ NS สูงกว่าจีโนมส่วนที่เหลือ หากเราคิดว่าบริเวณการรวมตัวใหม่เหล่านี้ได้รับมาจากบรรพบุรุษของ MTBC และด้วยเหตุนี้จึงแสดงถึงความหลากหลายทางพันธุกรรมโบราณมากเกินไป สัดส่วนของการเปลี่ยนแปลงที่เหมือนกันน่าจะสูงขึ้น เนื่องจากคาดว่าการแทนที่ NS จะถูกกำจัดโดยการคัดเลือกเชิงลบเนื่องจากการเปลี่ยนแปลงของกรดอะมิโน อาจเปลี่ยนแปลงการทำงานของโปรตีน ดังนั้น ผลการศึกษาของเราชี้ให้เห็นว่าผลกระทบทางการทำงานอาจเกิดจากการแทนที่ยีนที่คล้ายกับ HGT ซึ่งสะท้อนให้เห็นถึงความสำคัญของยีนเหล่านี้ต่อความหลากหลายทางพันธุกรรมเชิงปรับตัวที่มีคุณค่า
ควบคู่ไปกับการวิเคราะห์นี้ ยีนที่เข้ารหัสองค์ประกอบของระบบ 3R (การซ่อมแซม การจำลองแบบ และการรวมตัวกันใหม่ของดีเอ็นเอ) ได้รับการตรวจสอบอย่างละเอียดตามรายการที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้โดย dos Vultos และคณะ (2008)39 การแลกเปลี่ยนชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เหมือนกันไม่สามารถสังเกตได้โดยตรง แม้ว่าอาจเป็นกระบวนการที่เกิดขึ้นบ่อยครั้งเมื่อมีแบคทีเรียที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด เช่นในกรณีของชุดข้อมูลนี้ นอกจากนี้ กระบวนการนี้อาจเป็นกุญแจสำคัญในวิธีการซ่อมแซมดีเอ็นเอ72 ดังนั้นจึงมีบทบาทในการรวมตัวกันใหม่ของโฮโมโลกัส พบตำแหน่งพหุสัณฐานทั้งหมด 26 ตำแหน่งที่กระจายโดยยีน 54 ยีน (ตารางเสริม 3) ในชุดยีนนี้ การเปลี่ยนแปลงของ NS มีส่วนทำให้เกิดผลกระทบประมาณ 65% ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้เกี่ยวกับสายพันธุ์ของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis
เวลาโพสต์: 21 ต.ค. 2564