Vă mulțumim că ați vizitat Nature. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați o versiune mai nouă a browserului (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). În același timp, pentru a asigura asistență continuă, vom afișa site-uri fără stiluri și JavaScript.
Secvențierea genomului a revitalizat domeniul cercetării bolilor infecțioase, dezvăluind epidemiologia bolilor, patogeneza, interacțiunile gazdă-agent patogen și procesul evolutiv impus agenților patogeni. Complexul Mycobacterium tuberculosis (MTBC) consideră Mycobacterium bovis ca fiind unul dintre membrii săi adaptativi la animale care cauzează tuberculoza (TB) la mamiferele terestre și este un model tipic de evoluție bacteriană. La fel ca alți membri MTBC, se presupune că Mycobacterium bovis este un agent patogen strict clonat, cu evoluție lentă, și evident nu există niciun semn de recombinare sau transfer orizontal de gene. În această lucrare, aplicăm genomica comparativă unui set de date cu secvență a genomului întreg (WGS) compus din 70 de M. bovine din pedigree-uri diferite (Europa și Africa) pentru a obține informații despre diversitatea genetică a M. bovine. Puterea evolutivă. Trei metode diferite sunt utilizate pentru a estima semnele de reorganizare. La nivel global, un număr mic de evenimente de recombinare au fost identificate și confirmate prin două metode independente cu suport solid. Cu toate acestea, în comparație cu mutațiile, recombinarea are un efect mai slab asupra diversității M. bovis (r/m general = 0,037). Diferența medie r/m obținută în complexul clonal al Mycobacterium bovis din setul nostru de date este în concordanță cu conceptul general conform căruia gradul de recombinare poate varia foarte mult între liniile celulare atribuite aceleiași specii taxonomice. Pe baza acestei lucrări, recombinarea la Mycobacterium bovis nu poate fi exclusă, așa că ar trebui să facă obiectul unor eforturi suplimentare în viitoarele cercetări de genomică comparativă, în care WGS (Working Growth Seed - Grupa de lucru pentru genomică) a seturilor mari de date din diferite scenarii epidemiologice din întreaga lume este crucială. O analiză suplimentară a fost apoi efectuată asupra setului de date mai mic Mycobacterium bovis (n = 42) din prevalența tuberculozei multi-gazdă și au fost identificate peste 1.800 de loci, dintre care cel puțin o tulpină a prezentat un polimorfism cu un singur nucleotid (SNP). Majoritatea (87,1%) sunt localizate în regiunea codificatoare, iar raportul global al modificărilor nesinonime (dN/dS) ale modificărilor sinonime depășește 1,5, indicând faptul că selecția pozitivă este o forță evolutivă importantă exercitată asupra M. bovis. O proporție mai mare de SNP-uri a fost detectată în gene bogate în categorii funcționale de „metabolism lipidic”, „procese celulare și ale peretelui celular” și „metabolism și respirație intermediare”, dezvăluind potențialul lor în biologia și evoluția importanței Mycobacterium bovis. O privire mai atentă asupra genelor din strămoșii MTBC care sunt predispuși la transfer orizontal de gene și incluși în sistemul 3R (repararea, replicarea și recombinarea ADN-ului) relevă valoarea medie negativă globală a testului D neutru Taijima, care indică o scanare selectivă anterioară. Recentul blocaj după expansiunea populației este încă principalul factor evolutiv pentru agentul patogen obligatoriu Mycobacterium bovis de a lupta împotriva gazdei.
Complexul Mycobacterium tuberculosis (MTBC) este unul dintre cei mai de succes taxoni de agenți patogeni bacterieni și un caz tipic de evoluție bacteriană. Membrii săi prezintă o identitate nucleotidică surprinzător de ridicată la nivel genomic (> 99%)1,2. Diferite ecotipuri de MTBC pot cauza tuberculoză (TB), care este o boală granulomatoasă infecțioasă, la o gamă largă de specii gazdă, de la micromamifere la oameni3,4,5. În prezent, complexul include oameni [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] și agenți patogeni adaptați la animale (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, „Bacillus chimpanzee” și „dassie”)5,6. M. canettii (cunoscut și sub numele de „Nodobacter glabrata”) Identitatea medie a nucleotidelor cu micobacteriile menționate anterior este de 98%, iar studiile de genomică comparativă au arătat că M. canettii și restul MTBC s-au separat recent de strămoșul comun.7 Având în vedere acest concept, unii autori numesc M. canettii Membru al MTBC 8.
MTBC este descris sistematic ca un complex clonal strict, iar structura populației sale este în mod clar guvernată de diversitate redusă, blocaje, scanare selectivă și drift genetic9,10. Presupunând că evoluția clonală strictă complexă, cum ar fi polimorfismele lipsă, nu poate fi restaurată prin recombinare. Pe baza acestei premise, evenimentele consecutive ale deleției genomice a regiunii diferențiale (RD) și TbD1 (regiunea 1 cu deleție specifică Mtb) au fost propuse ca markeri moleculari ai evoluției MTBC2,5,11. Lucrările de genomică comparativă și secvențiere a întregului genom (WGS) susțin împărțirea membrilor adaptați la om în nouă linii (Mycobacterium tuberculosis L1 până la L4, L7 și L8; și Mycobacterium africanum L5, L6 și L9), liniile L2 până la L4 partajând regiunea TbD1 cu deleție2,11,12,13. În plus, se propune ca membrii adaptați la animale să aibă un strămoș comun, definit prin deleții specifice cladei în RD7, RD8, RD9 și RD102, 5 și 14.
Transferul orizontal de gene (HGT) și evenimentele de recombinare sunt considerate rare și apar la strămoșii MTBC, mai degrabă decât la istoricul diferit al întregului membru MTBC15,16,17. Două rapoarte timpurii realizate de Hughes și colaboratorii (2002) și Gutacker și colaboratorii (2006) au sugerat că evenimentele de recombinare pot ajuta la modelarea polimorfismelor care marchează loci specifici în tulpinile de M. tuberculosis18,19. Motivele pentru lipsa evidentă a recombinării în MTBC sunt: (1) procesul mecanic și pierderea capacității HGT; (2) raritatea evenimentelor HGT; (3) nu există nicio șansă de evenimente de recombinare în nișa MTBC14,17. Recent, unele studii de secvențiere a întregului genom (WGS) aplicate tulpinii MTBC 20 și Mycobacterium bovis 21 au furnizat dovezi ale recombinării, primele care arată că tulpinile MTBC schimbă adesea fragmente mici de ADN, dar din cauza variației limitate a secvenței nucleotidice, aceste evenimente încă nu sunt observate.
Mycobacterium bovis este cel mai frecvent membru al MTBC recuperat de la animale (în principal bovine), deși poate fi izolat și de la animale sălbatice crescute în libertate și ținute în împrejmuiri4,22,23,24. M. bovis a evoluat în cinci complexe clonale majore [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) și Africa 2 (Af2)], conform profilului de spoligotipare, delețiilor specifice și polimorfismelor cu un singur nucleotid (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 în gene specifice. Aceste complexe clonale demonstrează structura diversă a populației de Mycobacterium bovis și asocierea acesteia cu regiunile geografice. În plus, studiul WGS recent realizat de Zimpel și colaboratorii (2020) a conceput o filogenie bazată pe SNP-ul Mycobacterium bovis, cu peste 1.900 de genomuri, indicând existența a cel puțin patru linii diferite (denumite Lb1 până la Lb1 și Lb4), acestea nefiind complet în concordanță cu complexul clonal definit anterior, deși specificitatea geografică poate fi, de asemenea, confirmată30. Acești autori au efectuat analize diferențiale ale filogeniei și datarea moleculară, dar nu au studiat recombinarea30.
Studiile anterioare care au utilizat diferite tehnici moleculare, cum ar fi spoligotiparea, MIRU-VNTR (unități repetitive intercalate cu micobacterii - număr variabil de repetiții în tandem) și tipizarea recentă a SNP-urilor au relevat un anumit nivel de diversitate genetică în rândul tulpinilor de M. bovis 31,32,33, 34,35. Diferențierea variației genetice a devenit un instrument important în studiul epidemiologiei bolilor, fiind utilă pentru înțelegerea aprofundată a patogenezei, virulenței și transmiterii bolilor. Apariția metodei WGS oferă posibilitatea de a dezvălui factorii evolutivi determinanți impuși de genomul Mycobacterium bovis în procesul de adaptare și persistență la diferite gazde și scenarii epidemiologice.
În această lucrare, folosim analiza genomică comparativă pe diverse seturi de date Mycoplasma bovis (n=70), inclusiv izolate din diferite complexe clonale, pentru a obține informații despre procesul evolutiv al Mycoplasma bovis, în special pentru a rezolva relațiile filogenetice și evenimentele de recombinare. Ca o completare a acestei analize, un subset de date de izolate M. bovis (n = 42) obținute dintr-o zonă bine caracterizată cu tuberculoză multi-gazdă din Portugalia 31,36 a fost explorat în continuare pentru a deduce non-identitatea. Echilibrul dintre raportul relativ al substituțiilor nucleotidice sens (dN) și sinonime (dS), precum și contribuția evolutivă a genomurilor specifice menționate în literatura de specialitate, acestea fiind 37,38 obținute de strămoșii MTBC prin HGT și codifică componentele genei sistemului 3R (repararea, replicarea și recombinarea ADN-ului) 39. Alegem genele obținute prin HGT deoarece acestea pot reprezenta polimorfisme antice, așa că este de așteptat ca acestea să conțină o proporție mai mare de modificări sinonime. Genele incluse în sistemul 3R au fost selectate deoarece studiile anterioare asupra tulpinilor de M. tuberculosis au indicat selecții generale negative/de purificare care acționează asupra acestor gene și care pot juca un rol important în evoluție 39. Un alt obiectiv al acestei lucrări este de a deduce existența unor evenimente de reorganizare. Din acest motiv, având în vedere că setul nostru de date din Portugalia conține doar genomurile complexului de clone europene 2 și tulpinile cărora nu le-a fost atribuit complexul de clone, am decis să includem date genomice disponibile public pentru a obține în final o reprezentare a tuturor complexelor de clone și pentru a îmbunătăți robustețea și amploarea rezultatelor.
42 de genomuri Mycoplasma bovis nou secvențiate din scena endemică portugheză a tuberculozei multi-gazdă (detalii mai jos), caracterizate anterior dintr-o perspectivă epidemiologică36, reprezintă centrul acestei lucrări. Având în vedere că setul de date din Portugalia conține doar reprezentanți ai complexelor de 2 clone europene și tulpini fără complexe desemnate, au fost adăugate date de secvențiere a întregului genom disponibile public pentru a extinde setul de date care include toți reprezentanții complexelor de clone M. bovis. Prin urmare, în această lucrare au fost utilizate trei surse de date de secvențiere a întregului genom: asamblarea completă/în schiță a genomului, până la 10 schele stocate în NCBI (Centrul Național pentru Informații Biotehnologice) (n = 15 izolate); stocate în SRA (fișierul Illumina fastq al arhivei de citire a secvențelor) reprezintă diversitatea complexă a clonelor M. bovis (n = 12 izolate)30; și 42 de genomuri nou secvențiate din Portugalia. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) a fost exclus din căutarea NCBI. M. bovis AF2122/97 este de obicei utilizat ca genom de referință pentru a fi inclus în setul de date. Datorită indisponibilității publice a întregii secvențe a genomului reprezentate de complexul de clonare African 1 și a numărului mic de genomuri din tulpini reprezentative de Af2 și Eu1, în aceste cazuri au fost utilizate datele de secvențiere originale furnizate de SRA. Munca lui Zimpel și a colaboratorilor săi (2020) a ajutat la identificarea genomului din complexul de clonare menționat anterior și a contribuit la selectarea Mycobacterium bovis pentru includerea în setul de date. Pentru Eu3, este descris un singur tip de genom (Branger et al., 2020), astfel încât genomul pe care îl includem este un reprezentant separat al complexului Eu3.
La nivel global, acest set de date include 70 de specii de M. bovis la bovine, izolate din 8 specii gazdă, distribuite în 12 țări între 1985 și 2016. 36 de specii sunt desemnate ca Eu2, 7 specii sunt Eu1, 1 specie este Eu3, 3 specii sunt Af1, 4 specii sunt Af2 și 19 nu sunt atribuibile niciunui complex clonal (detalii mai jos). Informațiile detaliate (inclusiv numărul de acces) despre Mycobacterium bovis utilizate în acest studiu sunt prezentate în Tabelul 1 și în Tabelul suplimentar 1.
42 de genomuri întregi de Mycobacterium bovis, recent secvențiate, din focarele de tuberculoză animală din Portugalia și distribuite de mai bine de 12 ani, reprezintă centrul acestui studiu, deoarece sistemele potențiale de boli între animalele sălbatice și animale au fost monitorizate în mod regulat 31,36 (Fig. suplimentară 1). Conform procedurilor ulterioare, aceste tulpini au fost izolate de la bovine (n = 14), cerbi roșii (n = 16) și mistreț (n = 12) din 2003 până în 2015: colectați și manipulați animalele în conformitate cu ghidurile protocolului recomandate. Probele de țesut se află în Manualul OIE pentru Animale Terestre și sunt inoculate pe mediu solid și mediu lichid cu piruvat Stonebrink și Löwenstein-Jensen. Culturile sunt incubate la 37 °C, iar creșterea este verificată o dată pe săptămână timp de cel puțin 12 săptămâni. Coloniile sunt depozitate direct într-o soluție de glicerol la -80ºC. În mediul selectiv pentru Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), probele originale arhivate au fost trecute printr-o singură pasaj in vitro pentru a obține ADN-ul programului WGS. Pentru aceasta, soluția stoc de cultură congelată a fost îmbogățită cu 5% piruvat de sodiu și 10% ADS (50 g albumină, 20 g glucoză, 8,5 g clorură de sodiu în 1 L apă) pe Middlebrook 7H9 la 37°C (Retrain). După 4 săptămâni de creștere, mediul a fost reînnoit, iar cultura a fost monitorizată periodic până când s-a observat creșterea. Celulele au fost recoltate prin centrifugare, peleta a fost resuspendată în 500 µL soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), încălzită la 99°C timp de 30 de minute, centrifugată, iar supernatantul a fost depozitat la -20°C până la WGS. Toate procedurile sunt efectuate în instalații de biosecuritate de nivel 3.
Biblioteca de genom WGS cu capete pereche este preparată folosind indexul unic al fiecărei probe de ADN și utilizează tehnologiile Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 de probe) și HiSeq (2 × 150 pb) (două izolate) (Eurofins Genomics, Germania) pentru secvențiere. Conform instrucțiunilor producătorului, utilizați analizorul de genom Illumina cu modul cu două capete atașat pentru a secvenția ADN-ul genomic și utilizați kitul de pregătire a bibliotecii de ADN Nextera XT de la Illumina pentru a construi biblioteca.
Luând în considerare datele recuperate din SRA (n = 12), identificarea complexului clonal poate fi utilizată ca metadate ale publicației corespunzătoare 30, 41, 43. Atunci când se ia în considerare genomul complet, cu excepția Mycobacterium bovis AF2122/97 și Mycobacterium bovis 3601, care sunt membri recunoscuți ai complexului clonal Eu1 și Eu3 25, 29, respectiv, acesta este același cu genomul complet al Mycobacterium tuberculosis H37Rv (număr de acces NCBI NC_000962.3). Alinierea genomului se efectuează folosind MAFFT (program de aliniere multiplă a secvențelor de aminoacizi sau nucleotide, versiunea 7.458) și parametrul -addfragments48. Apoi, se caută absența diferitelor complexe clonale și/sau prezența caracteristicilor SNP.
Secvențierea recentă a genomului Mycobacterium bovis (n = 42) și citirile originale ale versiunii preliminare asamblate a genomului (n = 3) aliniază complexul cu genomul de referință Mycobacterium tuberculosis H37Rv prin intermediul conductei vSNP și prezența caracteristicilor de deleție și/sau SNP ale diferitelor clone. A fost efectuată o căutare.
Colectați informații din lipsa caracteristicilor și/sau prezența/absența SNP-urilor și a profilurilor de spoligotipare pentru a atribui date genomice complexului clonal corespunzător. Pentru cele patru ansambluri preliminare, profilul de spoligotipare nu poate fi dedus, așa că acestea sunt incluse în grupul „fără complexitate”.
Fluxul de lucru bioinformatic urmat în cadrul acestei lucrări începe de la asamblarea de novo și maparea la o strategie de referință, cu scopul de a explora evenimentele de recombinare și polimorfismele genomului specific. Figura 1 oferă o schemă logică a pașilor urmați. Pentru analiza recombinării, toate genomurile sunt utilizate pentru a crește robustețea inferențelor și a indicatorilor aferenți.
Pentru a reduce erorile în generarea secvențelor consens ale genomului, am obținut mai întâi asamblarea de novo, iar apoi am obținut alinieri multiple de bază. Canalul Unicycler este disponibil în prezent la https://github.com/rrwick/Unicycler49 și este utilizat pentru a efectua asamblarea de novo a 54 de genomuri secvențiate (42 nou secvențiate și 12 fișiere fastq recuperate din SRA). Pe scurt, înainte de asamblarea de la zero, analiza calității citirii a fost efectuată în FastQC versiunea 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) și Trimmomatic versiunea 0.36 (se aplică opțiunile „tăierea adaptoarelor și a altor secvențe specifice iluminării din citiri” și „Tăierea bazelor de la sfârșitul citirii, dacă este mai mică decât pragul de calitate de 20”) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Apoi, s-a utilizat SPAdes optimizer49 pentru asamblarea genomului, iar Pilon versiunea 1.1851 a fost utilizat pentru optimizarea post-asamblare. A fost selectat un mod de bridging conservator pentru a evita asamblarea incorectă, iar dimensiunea k-mer a fost căutată și selectată între 20% și 95% din lungimea citită. Urmați instrucțiunile SPAdes și luați în considerare dimensiunea citită, ștergeți contigurile mai mici de 300 pb și stabiliți o limită de acoperire a adâncimii de citire de 20 de 52. În strategia de asamblare de novo, regiunile genomice, cum ar fi paralogii prolină-glutamat (PE) și prolină-prolină glutamat (PPE), extrem de repetitivi, nu au fost eliminați.
Calitatea asamblării de novo este evaluată prin intermediul conductei QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), care facilitează reînnoirea contigului și maparea genomului de referință M. bovis AF2122/97 (numărul de acces NCBI LT708304.1) (vezi tabelul suplimentar 1 pentru parametrii de calitate).
Cu ajutorul conductei vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), fișierul FASTQ al M. bovis nou secvențiat din secvențierea Illumina este comparat cu genomul de referință M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Conform recomandărilor de bune practici ale Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, se aplică parametri standard de filtrare sau scoruri de masă ale variantelor pentru recalibrare. Rezultatele sunt filtrate folosind cel mai mic scor de masă SAMtools de 150 și AC = 2. De asemenea, se utilizează Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) pentru a verifica citirile și a exclude contaminarea. Conducta vSNP utilizată pentru maparea la strategiile de secvențiere în lucrarea noastră examinează o serie de SNP-uri și ținte definite și exclude, de asemenea, scenariile de infecție mixtă. Acoperirea genomului citit este mai bună de 99% (Tabelul suplimentar 1).
Pentru a evita erorile de mapare și SNP-urile greșite, filtrați o variantă în următoarele cazuri: (1) este susținută de mai puțin de 20 de citiri, (2) se găsește cu o frecvență mai mică de 0,9, (3) se află în cel puțin o tulpină, dar există cel puțin lacune într-o altă tulpină. Instrumentul de vizualizare a genomicii integrate (IGV) versiunea 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 a fost utilizat pentru a verifica vizual SNP-urile și pozițiile cu probleme de mapare sau aliniere. Deoarece genele prolin-glutamat (PE) și prolin-prolin glutamat (PPE) sunt foarte duplicate și fac parte dintr-o familie multi-genică, acestea sunt ușor de înțeles greșit de secvențierea și maparea greșită Illumina, așa că sunt preferate. Fluxul de lucru bioinformatică micobacteriană a eliminat membrii complexului tuberculos atunci când s-a utilizat strategia de mapare la secvență pentru a confirma SNP-urile. Prin urmare, am filtrat genele PE/PPE și indelețiile din analiză.
Conform Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), toate SNP-urile sunt împărțite în categorii funcționale. Canalul SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) este utilizat pentru a deduce consecințele SNP-urilor (modificări sinonime sau nesinonime). A fost creată o nouă bază de date a genomului Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Alinierea multiplă a genomului central a fost efectuată folosind Parsnp v1.2, disponibil în prezent la https://github.com/marbl/parsnp57, folosind 69 de genomuri complete/ansambluri draft (cu opțiunea -c) și M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) este utilizat ca referință. Au fost efectuate patru alinieri multiple de bază: doar membrii complexului de clonare Eu2 (n = 37), incluzând toți membrii complexului de clonare european (n = 44), inclusiv punctul de joncțiune dintre complexul de clonare european și african (n = 51) și include toate genele Mycobacterium bovis în acest studiu (n = 70).
Alinierea nucleului generată de Parsnp este utilizată pentru a deduce arborele filogenetic de maximă probabilitate (ML) folosind CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 folosind RAxML și pentru a efectua 1000 de replicări ghidate.
Trei algoritmi și instrumente bioinformatice diferiți sunt utilizați pentru a verifica prezența evenimentelor de recombinare în paralel: software-ul SplitsTree4, pipeline-ul Gubbins (linie imparțială prin recombinare în secvențe de nucleotide) și software-ul RDP4 (program de detectare a recombinării, versiunea beta 4.101).
Metoda de descompunere divizată implementată în SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 este utilizată pentru a calcula rețeaua filogenetică fără rădăcini, utilizând testul Phi pentru verificare statistică, iar pragul de semnificație este p = 0,05. Analiza multi-aliniere de bază a Parsnp este utilizată ca intrare, iar descompunerea divizată ca standard de rețea este realizată.
Canalul Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) rulează cu parametri impliciți ca o altă modalitate de a evalua impactul recombinării asupra Mycobacterium bovis. Algoritmul implementat în canal reconstruiește linia de clone relevantă. Ansamblul complet al genomului/versiuni preliminare al setului nostru de date și genomul de referință (bovid bovin AF2122/97, LT708304.1) sunt reciproc compatibile; și scanează poziția SNP-ului pe fiecare ramură a arborelui pentru a detecta clusterul de SNP care reprezintă evenimentul de recombinare. Zero-ul ramurii. Presupunem că nu există niciun eveniment de recombinare, ceea ce înseamnă că SNP-urile care apar pe ramură ar trebui să fie distribuite uniform. Alinierea multiplă de bază din Parsnp și arborele ML cu cel mai bun scor din RAxML sunt utilizate ca fișiere de intrare.
În final, pentru a confirma evenimentul de reorganizare sugerat de pipeline-ul Gubbins, cei șase algoritmi implementați în RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 și SiScan66) sunt aplicați la alinierea multiplă de bază a Parsnp în setările implicite. Am stabilit că cel puțin trei dintre algoritmii implementați în RDP4 trebuie să demonstreze în mod constant un semnal important pentru a verifica fiecare eveniment de recombinare.
Având în vedere că atât software-ul Gubbins, cât și cel RDP caută semnale de recombinare prin verificarea alinierilor multiple de bază într-o fereastră de până la 500 pb și confirmând că includerea genelor PE/PPE în timpul asamblării de novo nu va interfera cu semnalele de recombinare găsite, se efectuează o analiză suplimentară prin verificarea omoliniarității în vecinătatea genei care identifică evenimentul de recombinare. Harta sinliniară folosind genomul complet a fost construită folosind alinierea MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) pentru a exclude translocațiile sau inversiunile genomului local. În plus, întregul genom a fost utilizat pentru a efectua analiza omoliniarității asupra secvenței de aminoacizi prin intermediul serverului web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
O analiză mai aprofundată a setului de date genomice obținute din sistemul portughez multi-gazdă pentru tuberculoză are ca scop verificarea polimorfismului genelor menționate în literatura de specialitate. Aceste gene sunt 37, 38 și gena care codifică 3R, obținută de strămoșii MTBC prin componentele sistemului HGT (repararea, replicarea și recombinarea ADN-ului) 39. Se utilizează ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) și DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) pentru a calcula diversitatea genelor și diversitatea nucleotidelor (π) și parametrul de test D neutru introdus de Tajima.
A fost obținut un arbore filogenetic de probabilitate maximă (ML) bazat pe 69 de izolate de Mycoplasma bovis și genomuri de referință (Figura 2A). Comparativ cu arborii bazați pe o singură genă sau pe arborii bazați pe locusuri multiple, această strategie permite generarea unor arbori mai puternici, care nu surprind variabilitatea întregului genom și, prin urmare, prezintă o capacitate mai mică de a discrimina între specii 68,69. Structura topologică a arborelui ML este de obicei în concordanță cu clasificarea complexă a clonelor. Genomul Eu2 este grupat într-o ramură, iar genomul Af1 este, de asemenea, grupat împreună (Figura 2A). Rezultatul este, de asemenea, în concordanță cu relația evolutivă cunoscută a Mycobacterium bovis, adică există o mare diferență între membrul Eu1 și grupul format din toate celelalte complexe și genomuri clonale, dar complexul clonal 30 nu este specificat. Mica inconsistență dintre complexul clonal și relația observată pe arborele filogenetic poate fi explicată prin faptul că complexul clonal este descris pe baza unor regiuni genomice specifice, în timp ce arborele filogenetic se bazează pe alinieri multiple ale genomurilor de bază reprezentând întregul genom.
Arborele filogenetic de maximă probabilitate (GTR) este construit pe baza alinierii genomului central al genomului Mycobacterium bovis înainte (A) și după (B) îndepărtarea situsului de recombinare. Culorile ramurilor reprezintă complexul clonal Mycobacterium bovis: Europa 1 este violet, Europa 2 este roșie, Europa 3 este albastră, Africa 1 este portocalie și Africa 2 este verde. Arborele are rădăcini și este desenat la scară, iar lungimea ramurii este măsurată ca înlocuire pentru fiecare situs.
Complexul Mycobacterium tuberculosis este descris ca evoluat clonal, iar majoritatea dovezilor acumulate de-a lungul anilor susțin ideea că evenimentele de HGT și recombinare în curs nu vor apărea la nivelul detectabil de MTBC15,17,18.
Studii anterioare au arătat că poate exista o recombinare limitată între tulpinile de MTBC20,21, în timp ce altele nu au reușit să identifice evenimente de recombinare măsurabile70,71. Rediscutați această problemă concentrându-vă pe Mycobacterium bovis, ceea ce este diferit de studiul anterior care a luat în considerare doar Mycobacterium tuberculosis70,71; sau luați în considerare MTBC în ansamblu, aproape fără M. bovis reprezentând 20; sau luați în considerare doar fracțiile restrictive de bovine. În setul de date privind micobacteriile, în această lucrare, există un total de 70 de tulpini, reprezentând toate complexele clonale, utilizate pentru screening-ul recombinării. Setul de date este scalat în funcție de patru niveluri cumulative: (1) membri Eu2, (2) toți membrii complexului clonal european (adică Europa), (3) complexul clonal european și african (Eu + Af) și (4) întreaga colecție de date (inclusiv genomurile care nu sunt incluse în niciun complex de clonare deja descris).
Pentru a studia în continuare această ipoteză, a fost realizată o rețea de descompunere divizată pentru a evalua absența evenimentelor de recombinare între genomuri, deoarece această metodă poate vizualiza relația ancestrală dintre indivizi și poate afișa semnale filogenetice conflictuale. Toate cele patru seturi de date din analiză au confirmat existența buclelor în rețea (adică zone care nu converg într-un singur arbore), dar testul Phi nu are suport statistic (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; întregul set de date p = 0,2451), ceea ce oferă dovezi slabe pentru existența evenimentelor de reorganizare (Figura 3A-D).
În Europa 2 genomuri (n = 37) (A), genomuri europene (n = 44) (B), genomuri europene și africane (n = 51) (C) și întregul set de date (n = 70) (D).
După această analiză și luând în considerare observațiile ciclice din toate rețelele, algoritmul de reconstrucție implementat în conducta Gubbins a fost aplicat pentru a reconstrui linia clonală și pentru a suplimenta estimarea efectului recombinării asupra genomului M. bovis. Se deduce numărul cumulativ de evenimente de recombinare, majoritatea având loc în ramificații terminale (adică într-un singur genom) (Tabelul 2). Acești indicatori arată consistența întregului set de date și indică faptul că frecvența evenimentelor de recombinare este de 200 până la 300 de ori mai mare decât cea a mutațiilor. Odată ce parametrul rho/theta, care reprezintă ratele relative de recombinare și mutațiile punctuale pe ramură, pare a fi între 0,0037 și 0,0056 (Tabelul 3). Recent, lucrările publicate asupra tulpinii 38 de M. bovis au demonstrat o valoare rho/theta mai mare (rho/theta = 0,1) decât cea obținută în acest set de date, dar lucrarea lui Patané și a colegilor săi a utilizat asamblarea bazată pe referințe pentru a deduce parametrii de recombinare. Un detaliu procedural, datorat procedurii de asamblare, a fost asociat cu abundența evenimentelor de recombinare presupuse în ramura terminală.
În continuare, parametrul r/m reprezintă raportul de diversitate dintre recombinări și introducerea mutațiilor, iar valoarea sa medie este cuprinsă între 0,025 și 0,037, indicând faptul că, în comparație cu mutațiile, recombinarea are un impact general mai mic asupra diversității genetice a M. bovis (Tabelul 3). Pentru o comparație extinsă, o metodă similară a fost utilizată pentru a estima parametrul r/m pentru setul de date MTBC compus din 23 de genomuri, arătând o valoare medie de 0,48620, în timp ce pentru setul de date M. bovis al lui Patané și colegilor săi, cu 38 de genomuri, s-a demonstrat că valoarea medie este de 0,98. În primul studiu, doar două dintre cele 23 de genomuri au fost incluse în lucrarea M. bovis (M. bovis BCG și tulpina de referință), astfel încât valoarea obținută poate fi distorsionată din cauza supraexprimării genomului M. tuberculosis. În al doilea raport, populațiile de Mycobacterium bovis analizate au fost recuperate în principal din Statele Unite și din gazdele animale domestice. În schimb, în setul nostru de date, sunt reprezentate mai multe locații geografice și specii gazdă și sunt utilizate și genomuri grupate în diferite complexe clonale cu diferite caracteristici genetice ale populației, obținându-se astfel o cunoaștere mai profundă și mai amplă a populației. Valoarea medie r/m a diferenței obținută cu setul nostru de date este în concordanță cu conceptul conform căruia gradul de recombinare variază foarte mult între liniile atribuite aceleiași specii taxonomice, astfel încât aceste rezultate indică faptul că complexul de clone M. bovis poate prezenta diferențe de recombinare. Impactul este, de asemenea, așa cum a sugerat Didelot & Maiden72. Cu toate acestea, extinderea semnificativă a acestui set de date prin includerea unui număr mai mare de genomuri M. bovis va permite o clarificare suplimentară a acestui punct. Atât parametrii r/m, cât și rho/theta prezintă variabilitate între ramuri, iar acest rezultat este în concordanță cu rapoartele despre alte specii bacteriene72,73.
În cele din urmă, pentru a confirma evenimentele de reorganizare identificate de pipeline-ul Gubbins, șase algoritmi diferiți au fost utilizați în software-ul RDP4 pentru a testa independent diferite multi-comparații de bază. La nivel global, mai puțin de jumătate din evenimentele identificate de Gubbins au fost confirmate de RDP4 (Tabelele 4 și 5). Luând în considerare întregul set de date, au fost confirmate trei evenimente de recombinare, două implicând noduri interne, iar celălalt implicând un singur genom într-o ramură terminală, pentru care nu au putut fi atribuite complexe clonale (Tabelele 4 și 5). Identificarea evenimentelor în ramurile terminale poate indica faptul că recombinarea este încă în desfășurare în tulpinile contemporane de M. bovis sau rezultatul este plasat greșit70. În această regiune ipotetică de recombinare, aproximativ 20% din poziții au nucleotide (N) nedefinite, afectând astfel semnalul de recombinare (Figura suplimentară 2). În plus, această regiune afectează gena rrs, care codifică ARN-ul ribozomal 16S, despre care se așteaptă să fie foarte conservat, astfel încât acest presupus semnal de recombinare poate fi rezultatul unor erori de secvențiere sau al unei alinieri greșite. Apoi a fost efectuată alinierea întregului genom între Mb0003 și Mycobacterium bovis AF2122/97, iar existența nucleotidelor și SNP-urilor nedefinite a fost confirmată, astfel încât posibilele probleme legate de alinierea greșită nu s-au datorat informațiilor biologice implementate în această lucrare, apărute după învățarea programului.
Nu s-au găsit lacune sau nucleotide nedefinite în regiunile de recombinare ale nodurilor interne (Figurile 4 și 5). În ceea ce privește aceste evenimente, unul conține doar genomul Eu2 și afectează gena pks12, care codifică o posibilă poliketid sintază; în timp ce celălalt este înregistrat în genomul Eu1 și afectează gena narX care codifică o posibilă nitrat reductază (Tabelul 4). În general, analiza recombinării arată că există un număr limitat de fragmente de recombinare cu suport statistic, iar indicatorii deduși indică faptul că recombinarea are un impact redus asupra liniei M. bovis. Semnalul de recombinare este de așteptat să fie scăzut, dar este important să se distingă semnalul de evoluție real de zgomotul de fundal, ceea ce reprezintă o sarcină dificilă. Pentru a reduce semnalul de zgomot introdus de asamblarea bazată pe referințe și problemele de nepotrivire 70, 71, toate celelalte, cu excepția genomului complet, au fost asamblate de la zero, iar calitatea asamblării a fost verificată și asigurată prin analiza conductei QUAST (Tabelul suplimentar 1). În plus, au fost efectuate o serie de analize suplimentare pentru a asigura robustețea și acuratețea studiului general. Prin urmare, calitatea secvențierii genelor narX și pks12 a fost evaluată prin cartografierea prin citire împotriva Mycobacterium bovis AF2122/97. Poziția SNP recomandată în regiunea de recombinare a fost confirmată prin aplicarea criteriilor menționate în secțiunea de metodă (cel puțin 20 de citiri și o frecvență de modificare de 0,9). Polimorfismul genei narX a fost pe deplin confirmat în cele două genomuri (Mb1792361 și Mb7240415; 2,3%) și în genomurile genomului pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 și Mb12. Totuși, pentru genomul Mb2043, șase din cele opt poziții nu îndeplinesc criteriul de adâncime de citire, deoarece SNP-ul este susținut de un maxim de 17 citiri, ceea ce este sub valoarea limită stabilită de 20. Prin urmare, se poate confirma recombinarea a șase genomuri (8,6%) la acest situs al genomului (Figurile 4 și 5).
Vizualizarea detaliată a alinierii regiunii de recombinare a setului de date Mycobacterium bovis afectează gena narX care codifică o posibilă nitrat reductază. Nu s-au găsit lacune sau nucleotide nedefinite în regiunea de recombinare a nodurilor interne. Acest eveniment particular este înregistrat în genomul Eu1. Calitatea secvențierii genei narX a fost evaluată prin reprezentarea grafică a citirilor Mycobacterium bovis AF2122/97. Confirmați locația SNP recomandată în zona de recombinare aplicând criteriile menționate în secțiunea metodă (cel puțin 20 de citiri și o frecvență de modificare de 0,9). Polimorfismul genei narX a fost pe deplin confirmat în genomurile Mb1792361 și Mb7240415 (2,3%).
Vizualizare detaliată a alinierii regiunii de recombinare a setului de date Mycoplasma bovis care afectează gena pks12. Nu s-au găsit lacune sau nucleotide nedefinite în regiunea de recombinare a nodurilor interne. În ceea ce privește evenimentul care afectează gena pks12 care codifică posibila poliketid sintază, aceasta conține doar genomul Eu2. Calitatea secvențierii pks12 a fost evaluată prin cartografierea prin citire a genei Mycobacterium bovis AF2122/97. Confirmați locația SNP recomandată în zona de recombinare aplicând criteriile menționate în secțiunea metodă (cel puțin 20 de citiri și o frecvență de modificare de 0,9). Polimorfismele genomurilor Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 și Mb1960 au fost confirmate complet.
Genele PE și PPE au regiuni repetitive care sunt ușor de citit greșit de secvențierea și maparea greșită Illumina, așa că acestea sunt de obicei șterse din fluxul de lucru bioinformatic al membrilor M. tuberculosis numai atunci când se utilizează strategia de mapare la secvență. Inferența evenimentelor de recombinare aplicată în această lucrare se bazează pe asamblarea de novo fără filtrarea PE/PPE. Considerăm că prin implementarea a trei metode și algoritmi complementari diferiți prin SplitsTree, pipeline-ul Gubbins și software-ul RDP4, strategiile aplicate sunt robuste la procesarea și filtrarea regiunilor reorganizate cauzate de semnale de eroare. Cu toate acestea, pentru a exclude interferența genei PE/PPE asupra software-ului Gubbins și RDP4 pentru identificarea clusterelor de SNP și, prin urmare, identificarea regiunilor de recombinare propuse să afecteze genele narX și pks12, a fost examinată vecinătatea acestor gene (Fig. suplimentară 3-5). În M. bovis AF2122/97, gena narX este separată de narK2 și Mb1764c, în timp ce pks12 este înconjurată de Mb2075c și Mb2073c (Figura suplimentară 3-5). Harta generată folosind harta sinlinică MAUVE a genomului complet oferă informații despre conservarea și rearanjarea secvenței genelor, arătând patru blocuri coliniare și niciun semn de translocație sau inversie a genomului. În plus, analiza complementării cu secvența de aminoacizi a dovedit omologia în toate genomurile complete și nu s-a găsit PE/PPE în regiunile adiacente ale narX sau pks12. Pentru narX, un genom (Mb0030) are un scor de sinonimie mai mic deoarece gena narX a fost identificată ca două fragmente (fragmentele 1891 și 1890). Pentru pks12, datorită similarităților, Mb0030 și Mb003 au prezentat scoruri de sinliniaritate mai mici, în timp ce pks12 a fost identificat în două, respectiv trei fragmente, reprezentând domenii diferite ale proteinei (Figura suplimentară 3-5). Luând în considerare aceste informații, precum și faptul că atât software-ul Gubbins, cât și cel RDP4 efectuează analize, verificând alinierea multiplă de bază la maximum 500 pb în fereastră, am confirmat că gena PE/PPE nu va interfera cu semnalul de recombinare care afectează narX și pks12.
Deși semnalele de recombinare detectate în acest set de date pot fi considerate reziduale, este adevărat că recombinarea la M. bovis nu poate fi exclusă, așadar ar trebui să continue să facă obiectul unor analize suplimentare, în care genomuri întregi din diferite scenarii epidemiologice sunt secvențiate până la Important.
Compararea arborilor filogenetici ML obținuți înainte și după corecția recombinării (Figura 2A, B) nu a condus la modificări semnificative în relația filogenetică dedusă, iar tulpinile de M. bovis au fost grupate în același grup.
După maparea a 42 de secvențe noi de citiri ale genei M. bovis cu genomul de referință al genei M. bovis AF2122/97, s-a obținut o aliniere a SNP-urilor conținând 1816 poziții polimorfice. Majoritatea SNP-urilor (87,1%) sunt localizate în regiunea codificatoare, iar genele afectate sunt caracterizate conform categoriilor funcționale prezentate în Bovilist (Figura 6A, B). Luând în considerare numărul total de gene din fiecare categorie funcțională, genele din categoria „metabolismul lipidic” au prezentat mai multe SNP-uri, urmate de genele „peretele celular și procesele celulare” și „metabolismul și respirația intermediară”, dezvăluind că acestea se află în evoluția M. bovis.
Analiza ierarhică a setului de date M. bovis din Portugalia (n = 42). Numărul total de SNP-uri înregistrate și gene afectate pentru fiecare categorie funcțională (A). Numărul total de modificări sinonime și nesinonime înregistrate pe categorii funcționale (B).
La scară globală, raportul mediu dN/dS este mai bun de 1,5, ceea ce indică faptul că presiunea evolutivă globală este de a scăpa de starea ancestrală și reprezintă un scenariu pozitiv (diversificat sau direcționat) și/sau relaxat de alegere a purificării. În categoriile „virulență, detoxifiere, adaptare”, „secvențe de inserție și fagi” și „proteine reglatoare”, mai mult de două treimi din SNP-uri sunt nesinonime (Figura 6B).
În toate categoriile, există gene cu SNP-uri multiple, rezultând o rată medie de mutație (adică SNP-ul mediu per genă) mai mare de 1 (Figura 6A). Pks12 (Mb2074c) cu 15 SNP-uri și fas (Mb2553c) cu 8 SNP-uri au valori de mutație mai mari. Ambele gene sunt implicate în metabolismul acizilor grași. Gena pks codifică policetid sintaza (PKS), care este o enzimă multifuncțională implicată în biosinteza lipidelor peretelui celular micobacterian74,75. Această genă codifică un polipeptid multifuncțional implicat în sinteza micoketidelor74,76. Gena fas este implicată în sinteza acidului micolic. Ambele gene joacă un rol important în biosinteza peretelui celular în contact cu gazda.
Pentru a studia în continuare evoluția Mycobacterium bovis, au fost analizate două seturi de gene specifice. Lucrările publicate anterior, care utilizează metode de compoziție a secvențelor și filogenetice, au identificat gene care au fost dobândite de strămoșii MTBC prin HGT înainte de diversificare37,38. Aceste gene sunt enumerate în Tabelul suplimentar 2. A fost analizată distribuția SNP a unui total de 77 de gene care pot fi legate de HGT și au fost identificate 26 de situsuri polimorfice, care în majoritatea cazurilor (78%) au dus la modificări nesinonime (NS) (Tabelul suplimentar 2). Lucrările anterioare asupra genomului MTBC au demonstrat că presupusa regiune HGT prezintă un raport SNP NS mai mare în comparație cu restul genomului. Dacă se consideră că aceste regiuni de recombinare au fost dobândite de strămoșii MTBC și, prin urmare, reprezintă în exces polimorfisme antice, atunci proporția modificărilor sinonime este de așteptat să fie mai mare, deoarece substituțiile NS sunt eliminate prin selecție negativă, deoarece modificările aminoacizilor pot schimba funcția proteinei. Prin urmare, rezultatele noastre indică faptul că consecințele funcționale pot proveni din înlocuirea genelor de tip HGT, ceea ce reflectă importanța lor pentru o diversitate genetică adaptivă valoroasă.
În paralel cu această analiză, genele care codifică componentele sistemului 3R (repararea, replicarea și recombinarea ADN-ului) au fost examinate temeinic în conformitate cu lista publicată anterior de dos Vultos și colaboratorii (2008)39. Schimbul de fragmente de ADN identice nu poate fi observat direct, deși poate fi un proces frecvent atunci când sunt implicate bacterii strâns înrudite, cum ar fi în cazul acestui set de date; în plus, acest proces poate fi cheia metodelor de reparare a ADN-ului72, jucând astfel un rol în recombinarea omoloagă. Au fost identificate un total de 26 de poziții polimorfice distribuite de 54 de gene (Tabelul suplimentar 3). În acest set de gene, modificările NS au reprezentat aproximativ 65% din consecințe, ceea ce este în concordanță cu rapoartele anterioare privind tulpinile de Mycobacterium tuberculosis.
Data publicării: 21 oct. 2021