Dziękujemy za odwiedzenie strony Nature. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Jednocześnie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witryny bez stylów i JavaScriptu.
Sekwencjonowanie genomu ożywiło badania nad chorobami zakaźnymi, ujawniając epidemiologię chorób, patogenezę, interakcje gospodarz-patogen oraz proces ewolucyjny patogenów. Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) uznaje Mycobacterium bovis za jednego ze swoich adaptacyjnych przedstawicieli zwierzęcych, który wywołuje gruźlicę (TB) u ssaków lądowych i stanowi typowy model ewolucji bakterii. Podobnie jak inni przedstawiciele MTBC, Mycobacterium bovis jest uważany za ściśle sklonowany, wolno ewoluujący patogen i nie wykazuje ewidentnych oznak rekombinacji ani horyzontalnego transferu genów. W niniejszej pracy stosujemy genomikę porównawczą do zbioru danych sekwencji całego genomu (WGS) składającego się z 70 osobników bydła M. z różnych rodowodów (Europa i Afryka), aby uzyskać wgląd w różnorodność genetyczną bydła M. Moc ewolucyjna. Do oszacowania oznak reorganizacji zastosowano trzy różne metody. Globalnie, niewielka liczba zdarzeń rekombinacji została zidentyfikowana i potwierdzona dwiema niezależnymi metodami o solidnym poparciu. Niemniej jednak, w porównaniu z mutacjami, rekombinacja ma słabszy wpływ na różnorodność M. bovis (ogólny r/m = 0,037). Różnica średnia r/m uzyskana w kompleksie klonalnym Mycobacterium bovis w naszym zestawie danych jest zgodna z ogólną koncepcją, że stopień rekombinacji może się znacznie różnić między liniami przypisanymi do tego samego gatunku taksonomicznego. Na podstawie tej pracy, rekombinacji u Mycobacterium bovis nie można wykluczyć, więc powinna być przedmiotem dalszych wysiłków w przyszłych badaniach genomiki porównawczej, w których WGS dużych zestawów danych z różnych scenariuszy epidemiologicznych na całym świecie jest kluczowe. Następnie przeprowadzono dodatkową analizę na mniejszym zestawie danych Mycobacterium bovis (n = 42) z rozpowszechnienia gruźlicy u wielu żywicieli i zidentyfikowano ponad 1800 loci, z których co najmniej jeden szczep wykazał pojedynczy polimorfizm nukleotydu (SNP). Większość (87,1%) znajduje się w regionie kodującym, a globalny stosunek zmian niesynonimicznych (dN/dS) do zmian synonimicznych przekracza 1,5, co wskazuje, że selekcja pozytywna jest ważną siłą ewolucyjną wywieraną na M. bovis. Większy odsetek SNP wykryto w genach bogatych w kategorie funkcjonalne „metabolizmu lipidów”, „ściany komórkowej i procesów komórkowych” oraz „pośredniego metabolizmu i oddychania”, co ujawnia ich potencjał w biologii i ewolucji znaczenia Mycobacterium bovis. Bliższe przyjrzenie się genom u przodków MTBC, które są podatne na poziomy transfer genów i są włączone do systemu 3R (naprawa, replikacja i rekombinacja DNA), ujawnia globalną średnią ujemną wartość neutralnego testu D Taijimy, co wskazuje na przeszłe selektywne skanowanie. Niedawne wąskie gardło po ekspansji populacji jest nadal głównym czynnikiem ewolucyjnym, który obligatoryjnie zmusza patogen Mycobacterium bovis do walki z gospodarzem.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) to jeden z najskuteczniejszych taksonów patogenów bakteryjnych i typowy przykład ewolucji bakterii. Jego członkowie wykazują zaskakująco wysoką identyczność nukleotydów na poziomie genomowym (> 99%)1,2. Różne ekotypy MTBC mogą powodować gruźlicę (TB), która jest zakaźną chorobą ziarniniakową, u szerokiego spektrum gatunków żywicieli, od mikro-ssaków po ludzi3,4,5. Obecnie kompleks obejmuje ludzi [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] oraz patogeny przystosowane do życia zwierząt (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, Bacillus chimpanzee i Dassie)5,6. M. canettii (znana również jako „Nodobacter glabrata”) Średnia identyczność nukleotydów z wyżej wymienionymi prątkami wynosi 98%, a prace z zakresu genomiki porównawczej wykazały, że M. canettii i reszta MTBC niedawno oddzieliły się od wspólnego przodka.7 Biorąc pod uwagę tę koncepcję, niektórzy autorzy nazywają M. canettii członkiem MTBC 8.
MTBC jest systematycznie opisywany jako ścisły kompleks klonalny, a jego struktura populacji jest wyraźnie regulowana przez zmniejszoną różnorodność, wąskie gardła, selektywne skanowanie i dryf genetyczny9,10. Zakładając złożoną ścisłą ewolucję klonalną, taką jak brakujące polimorfizmy, nie można odtworzyć poprzez rekombinację. W oparciu o to założenie, kolejne zdarzenia genomowej delecji regionu różnicowego (RD) i TbD1 (regionu delecji 1 specyficznego dla Mtb) zostały zaproponowane jako molekularne markery ewolucji MTBC2,5,11. Prace z zakresu genomiki porównawczej i sekwencjonowania całego genomu (WGS) potwierdzają podział członków przystosowanych do życia przez człowieka na dziewięć linii (Mycobacterium tuberculosis L1–L4, L7 i L8; oraz Mycobacterium africanum L5, L6 i L9), przy czym linie L2–L4 mają wspólny region delecji TbD12,11,12,13. Ponadto proponuje się, aby członkowie przystosowani do życia jako zwierzęta mieli wspólnego przodka, którego określają specyficzne dla kladu delecje w RD7, RD8, RD9 oraz RD102, 5 i 14.
Horyzontalny transfer genów (HGT) i zdarzenia rekombinacji są uważane za rzadkie i występują u przodków MTBC, a nie w odmiennej historii całego członka MTBC15,16,17. Dwa wczesne raporty autorstwa Hughesa i współpracowników (2002) oraz Gutackera i współpracowników (2006) sugerują, że zdarzenia rekombinacji mogą pomagać w kształtowaniu polimorfizmów, które oznaczają specyficzne loci w szczepach M. tuberculosis18,19. Przyczynami oczywistego braku rekombinacji w MTBC są: (1) proces mechaniczny i utrata zdolności HGT; (2) rzadkość zdarzeń HGT; (3) brak możliwości wystąpienia zdarzeń rekombinacji w niszy MTBC14,17. Niedawno przeprowadzone badania sekwencjonowania całego genomu (WGS) dotyczące szczepu MTBC 20 i Mycobacterium bovis 21 dostarczyły dowodów na rekombinację. Były to pierwsze badania, które wykazały, że szczepy MTBC często wymieniają się małymi fragmentami DNA. Jednak ze względu na ograniczoną zmienność sekwencji nukleotydowej zdarzenia te nadal nie zostały zauważone.
Mycobacterium bovis to najczęściej izolowany przedstawiciel MTBC u zwierząt gospodarskich (głównie bydła), choć można go również wyizolować od dzikich zwierząt hodowanych na wolnym wybiegu i w ogrodzonym terenie4,22,23,24. Mycobacterium bovis wyewoluowało w pięć głównych kompleksów klonalnych [Europejski 1 (Eu1), Europejski 2 (Eu2), Europejski 3 (Eu3), Afrykański 1 (Af1) i Afryka 2 (Af2)], zgodnie z profilem spoligotypowania, specyficznymi delecjami i polimorfizmami pojedynczego nukleotydu (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 w określonych genach. Te kompleksy klonalne pokazują zróżnicowaną strukturę populacji Mycobacterium bovis i jej związek z regionami geograficznymi. Ponadto, niedawne prace WGS przeprowadzone przez Zimpela i współpracowników (2020) zaprojektowały filogenezę opartą na SNP Mycobacterium bovis, obejmującym ponad 1900 genomów, co wskazuje na istnienie co najmniej czterech różnych linii (nazwanych od Lb1 do Lb1 do Lb4). Nie są one w pełni zgodne z wcześniej zdefiniowanym kompleksem klonalnym, chociaż można również potwierdzić ich specyficzność geograficzną30. Autorzy przeprowadzili analizę różnicową filogenezy i datowanie molekularne, ale nie badali rekombinacji30.
Wcześniejsze prace z wykorzystaniem różnych technik molekularnych, takich jak spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) oraz niedawne typowanie SNP (Single-Poly-Performance Type), ujawniły pewien poziom zróżnicowania genetycznego wśród szczepów M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Różnicowanie zmienności genetycznej stało się ważnym narzędziem w badaniach epidemiologii chorób, co jest pomocne w dogłębnym zrozumieniu patogenezy, wirulencji i transmisji chorób. Pojawienie się metody WGS umożliwia ujawnienie czynników ewolucyjnych, narzuconych przez genom Mycobacterium bovis w procesie adaptacji i przetrwania w różnych żywicielach i scenariuszach epidemiologicznych.
W tej pracy wykorzystujemy porównawczą analizę genomiczną różnych zestawów danych Mycoplasma bovis (n=70), w tym izolatów z różnych kompleksów klonalnych, aby uzyskać wgląd w proces ewolucji Mycoplasma bovis, w szczególności w celu wyjaśnienia powiązań filogenetycznych i zdarzeń rekombinacji. Jako uzupełnienie tej analizy, podzbiór danych izolatów M. bovis (n = 42) uzyskanych z dobrze scharakteryzowanego obszaru gruźlicy wielożywicielowej w Portugalii 31,36 został dodatkowo zbadany w celu wywnioskowania braku identyczności. Równowaga między względnym stosunkiem podstawień nukleotydów sensownych (dN) do synonimicznych (dS), a także ewolucyjny wkład określonych genomów wymienionych w literaturze, są one 37,38 uzyskane przez przodków MTBC za pomocą HGT i kodują składniki genów systemu 3R (naprawa, replikacja i rekombinacja DNA) 39. Wybierz geny uzyskane za pomocą HGT, ponieważ mogą one reprezentować starożytne polimorfizmy, więc oczekuje się, że mogą zawierać większy odsetek zmian synonimicznych. Geny wchodzące w skład systemu 3R zostały wybrane, ponieważ wcześniejsze prace nad szczepami M. tuberculosis wskazywały na ogólną selekcję negatywną/oczyszczającą, która działa na te geny i może odgrywać ważną rolę w ewolucji39. Kolejnym celem tej pracy jest wywnioskowanie istnienia zdarzeń reorganizacyjnych. Z tego powodu, biorąc pod uwagę, że nasz zbiór danych z Portugalii zawiera jedynie genomy europejskiego kompleksu klonów 2 oraz szczepów, które nie przypisały kompleksu klonów, zdecydowaliśmy się uwzględnić publicznie dostępne dane genomowe, aby ostatecznie uzyskać reprezentatywne dane dla wszystkich kompleksów klonów oraz poprawić solidność i zakres wyników.
42 nowo zsekwencjonowane genomy Mycoplasma bovis pochodzące z portugalskiej sceny endemicznej gruźlicy wielożywicielowej (szczegóły poniżej), wcześniej scharakteryzowane z perspektywy epidemiologicznej36, stanowią istotę niniejszej pracy. Biorąc pod uwagę, że zbiór danych z Portugalii zawiera jedynie przedstawicieli europejskich kompleksów 2-klonowych i szczepów bez wyznaczonych kompleksów, dodano publicznie dostępne dane sekwencjonowania całego genomu, aby rozszerzyć zbiór danych obejmujący wszystkich przedstawicieli kompleksów klonów M. bovis. Dlatego w niniejszej pracy wykorzystano trzy źródła danych sekwencjonowania całego genomu: kompletny/roboczy montaż genomu, do 10 rusztowań przechowywanych w NCBI (Narodowym Centrum Informacji Biotechnologicznej) (n = 15 izolatów); przechowywanych w SRA (plik Illumina fastq archiwum odczytów sekwencji) reprezentujących złożoną różnorodność klonów M. bovis (n = 12 izolatów)30; oraz 42 nowo zsekwencjonowane genomy z Portugalii. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) został wykluczony z wyszukiwania NCBI. M. bovis AF2122/97 jest zazwyczaj używany jako genom referencyjny do uwzględnienia w zbiorze danych. Ze względu na brak publicznej dostępności pełnej sekwencji genomu reprezentowanej przez kompleks klonowania African 1 oraz niewielką liczbę genomów reprezentatywnych szczepów Af2 i Eu1, w tych przypadkach wykorzystano oryginalne dane sekwencjonowania dostarczone przez SRA. Praca Zimpela i jego współpracowników (2020) pomogła w identyfikacji genomu z wyżej wymienionego kompleksu klonowania i w wyborze Mycobacterium bovis do uwzględnienia w zbiorze danych. Dla Eu3 opisano tylko jeden typ genomu (Branger i in., 2020), więc uwzględniony przez nas genom jest oddzielnym przedstawicielem kompleksu Eu3.
W skali globalnej, ten zestaw danych obejmuje 70 osobników bydła Mycobacterium bovis wyizolowanych z 8 gatunków żywicieli, rozprzestrzenionych w 12 krajach w latach 1985–2016. 36 gatunków oznaczono jako Eu2, 7 gatunków jako Eu1, 1 gatunek jako Eu3, 3 gatunki jako Af1, 4 gatunki jako Af2, a 19 gatunków nie jest przypisanych do żadnego kompleksu klonalnego (szczegóły poniżej). Szczegółowe informacje (w tym numer akcesyjny) na temat Mycobacterium bovis wykorzystane w niniejszym badaniu przedstawiono w tabeli 1 i tabeli uzupełniającej 1.
42 nowo zsekwencjonowane całe genomy Mycobacterium bovis z portugalskich ognisk gruźlicy zwierząt, rozprzestrzenione od ponad 12 lat, stanowią centrum tego badania, ponieważ potencjalne systemy chorób dzikich zwierząt i zwierząt gospodarskich były regularnie monitorowane31,36 (Rys. uzupełniający 1). Zgodnie z kolejnymi procedurami szczepy te wyizolowano od bydła (n = 14), jeleni szlachetnych (n = 16) i dzików (n = 12) w latach 2003–2015: zwierzęta należy zbierać i obchodzić się z nimi zgodnie z zalecanymi wytycznymi protokołu. Próbki tkanek znajdują się w Podręczniku zwierząt lądowych OIE i są posiewane na podłożu stałym i płynnym z pirogronianu Stonebrink i Löwenstein-Jensen. Hodowle inkubuje się w temperaturze 37°C, a wzrost sprawdza się raz w tygodniu przez co najmniej 12 tygodni. Kolonie przechowuje się bezpośrednio w roztworze glicerolu w temperaturze -80°C. W selektywnym podłożu Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) oryginalne zarchiwizowane próbki przepuszczono przez pojedynczy pasaż in vitro w celu uzyskania DNA programu WGS. W tym celu zamrożony roztwór macierzysty hodowli wzbogacono 5% pirogronianu sodu i 10% ADS (50 g albuminy, 20 g glukozy, 8,5 g chlorku sodu w 1 l wody) na podłożu Middlebrook 7H9 w temperaturze 37°C. Po 4 tygodniach wzrostu podłoże odnowiono, a hodowlę regularnie monitorowano do momentu zaobserwowania wzrostu. Komórki zebrano przez wirowanie, osad zawieszono ponownie w 500 µl buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS), ogrzewano w temperaturze 99°C przez 30 minut, odwirowano, a supernatant przechowywano w temperaturze -20°C do momentu WGS. Wszystkie procedury przeprowadzane są w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3.
Biblioteka genomu parzystego WGS jest przygotowywana z wykorzystaniem unikalnego indeksu każdej próbki DNA i technologii Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 próbek) oraz HiSeq (2 × 150 pb) (dwa izolaty) (Eurofins Genomics, Niemcy) do sekwencjonowania. Zgodnie z instrukcją producenta, do sekwencjonowania genomowego DNA należy użyć analizatora genomu Illumina z modułem dwustronnym, a do konstrukcji biblioteki zestawu Nextera XT DNA Library Prep Kit firmy Illumina.
Biorąc pod uwagę dane odzyskane z SRA (n = 12), identyfikację kompleksu klonów można wykorzystać jako metadane odpowiedniej publikacji 30, 41, 43. Biorąc pod uwagę cały genom, z wyjątkiem Mycobacterium bovis AF2122/97 i Mycobacterium bovis 3601, które są uznanymi członkami kompleksu klonalnego Eu1 i Eu3 odpowiednio 25, 29, jest on taki sam jak cały genom Mycobacterium tuberculosis H37Rv (numer akcesyjny NCBI NC_000962.3). Wyrównanie genomu przeprowadzono za pomocą programu MAFFT (program do wielokrotnego wyrównywania sekwencji aminokwasów lub nukleotydów, wersja 7.458) z parametrem -addfragments48. Następnie poszukano braku różnych kompleksów klonalnych i/lub obecności cech SNP.
Nowo zsekwencjonowany Mycobacterium bovis (n = 42) i oryginalne odczyty projektu złożonego genomu (n = 3) porównują kompleks z genomem referencyjnym Mycobacterium tuberculosis H37Rv poprzez kanał vSNP i obecność cech delecji i/lub SNP różnych klonów. Przeprowadzono wyszukiwanie.
Zbierz informacje na podstawie braku cech i/lub obecności/braku SNP oraz profili spoligotypowania, aby przypisać dane genomiczne do odpowiedniego kompleksu klonalnego. W przypadku czterech projektów nie można wywnioskować profilu spoligotypowania, dlatego zostały one zaliczone do grupy „brak złożoności”.
Proces bioinformatyczny realizowany w ramach tej pracy rozpoczyna się od złożenia de novo i mapowania na strategię referencyjną, w celu zbadania zdarzeń rekombinacji i specyficznych polimorfizmów genomu. Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy kolejnych kroków. Do analizy rekombinacji wykorzystywane są wszystkie genomy, aby zwiększyć solidność wnioskowania i powiązanych wskaźników.
Aby zredukować błędy w generowaniu sekwencji konsensusowych genomu, najpierw uzyskaliśmy montaż de novo, a następnie dopasowania wielokrotne rdzeni. Potok Unicycler jest obecnie dostępny pod adresem https://github.com/rrwick/Unicycler49 i służy do przeprowadzenia montażu de novo 54 zsekwencjonowanych genomów (42 nowo zsekwencjonowanych i 12 plików fastq odzyskanych z SRA). Krótko mówiąc, przed montażem od podstaw przeprowadzono analizę jakości odczytu w programie FastQC w wersji 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) oraz Trimmomatic w wersji 0.36 (zastosowano opcje „wycinanie adapterów i innych sekwencji specyficznych dla oświetlenia z odczytów” oraz „wycinanie baz z końca odczytu, jeśli jakość jest niższa niż próg 20”) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Następnie do montażu genomu użyto optymalizatora SPAdes49, a do optymalizacji po montażu programu Pilon w wersji 1.1851. Wybrano konserwatywny tryb mostkowania, aby uniknąć nieprawidłowego montażu, a rozmiar k-meru został przeszukany i wybrany w zakresie od 20% do 95% długości odczytu. Postępuj zgodnie z wytycznymi SPAdes i weź pod uwagę rozmiar odczytu, usuń kontigi mniejsze niż 300 pb i ustal granicę pokrycia głębokości odczytu 20 na poziomie 52. W strategii montażu de novo regiony genomowe, takie jak wysoce powtarzalne paralogi proliny-glutaminianu (PE) i proliny-glutaminianu proliny (PPE), nie zostały usunięte.
Jakość nowego montażu ocenia się za pomocą procesu QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), który ułatwia odnowę kontigu i mapowanie genomu referencyjnego M. bovis AF2122/97 (numer rejestracyjny NCBI LT708304.1) (patrz tabela uzupełniająca 1, aby zapoznać się z parametrami jakości).
Za pomocą potoku vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP) plik FASTQ nowo zsekwencjonowanego M. bovis z sekwencjonowania Illumina jest porównywany z genomem referencyjnym M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Zgodnie z zaleceniami najlepszych praktyk Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, do rekalibracji należy zastosować standardowe parametry filtru lub wyniki mas wariantów. Wyniki są filtrowane przy użyciu najniższego wyniku masowego SAMtools wynoszącego 150 i AC = 2. Użyj również Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) do sprawdzenia odczytów i wykluczenia zanieczyszczenia. Potok vSNP używany do mapowania strategii sekwencjonowania w naszej pracy bada szereg zdefiniowanych SNP i celów, a także wyklucza mieszane scenariusze infekcji. Odczyt genomu obejmuje ponad 99% jego zakresu (Tabela uzupełniająca 1).
Aby uniknąć błędów mapowania i błędnych SNP, odfiltruj wariant w następujących przypadkach: (1) jest poparty przez mniej niż 20 odczytów, (2) jest znaleziony z częstością mniejszą niż 0,9, (3) jest w co najmniej jednym szczepie, ale przynajmniej w innym szczepie są luki. Zintegrowany program do przeglądania genomiki (IGV) w wersji 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 został użyty do wizualnej weryfikacji SNP i pozycji z problemami mapowania lub dopasowania. Ponieważ geny proliny-glutaminianu (PE) i proliny-glutaminianu proliny (PPE) są wysoce zduplikowane i stanowią część rodziny wielogenowej, są łatwo źle zrozumiane przez sekwencjonowanie i błędne mapowanie Illumina, dlatego są preferowane. Przepływ pracy bioinformatyki mykobakteryjnej usunął członków kompleksu gruźlicy podczas stosowania strategii mapowania do sekwencji w celu potwierdzenia SNP. W związku z tym odfiltrowaliśmy geny PE/PPE i indel z analizy.
Według Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) wszystkie polimorfizmy SNP są podzielone na kategorie funkcjonalne. Do wnioskowania o konsekwencjach SNP (zmiany synonimiczne lub niesynonimiczne) używany jest algorytm SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/). Utworzono nową bazę danych genomu Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Wielokrotne dopasowanie genomu rdzeniowego przeprowadzono za pomocą programu Parsnp v1.2, dostępnego obecnie pod adresem https://github.com/marbl/parsnp57, wykorzystując 69 kompletnych genomów/wersji roboczych (z opcją -c), a M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) jako odniesienie. Przeprowadzono cztery wielokrotne dopasowania genomu rdzeniowego: tylko dla członków kompleksu klonowania Eu2 (n = 37), w tym wszystkich członków europejskiego kompleksu klonowania (n = 44), w tym punktu połączenia europejskiego i afrykańskiego kompleksu klonowania (n = 51), a także uwzględniono wszystkie Mycobacterium bovis w tym badaniu (n = 70).
Rdzeń wyrównania wygenerowany przez Parsnp jest używany do wnioskowania o maksymalnym prawdopodobieństwie (ML) drzewa filogenetycznego przy użyciu CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 z wykorzystaniem RAxML i wykonania 1000 kierowanych replikacji.
Do sprawdzenia występowania zdarzeń rekombinacji równolegle zastosowano trzy różne algorytmy i narzędzia bioinformatyczne: oprogramowanie SplitsTree4, potok Gubbins (analiza niezależnego pochodzenia poprzez rekombinację sekwencji nukleotydowych) oraz oprogramowanie RDP4 (program do wykrywania rekombinacji, wersja beta 4.101).
Metoda dekompozycji na podział zaimplementowana w SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 została wykorzystana do obliczenia sieci filogenetycznej bez korzeni, z wykorzystaniem testu Phi do weryfikacji statystycznej, a próg istotności wynosi p = 0,05. Jako dane wejściowe wykorzystano podstawową analizę wielowyrównaniową Parsnp, a dekompozycja na podział jako standard sieciowy.
Potok Gubbins w wersji 2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 działa z domyślnymi parametrami jako inny sposób oceny wpływu rekombinacji na Mycobacterium bovis. Algorytm zaimplementowany w potoku rekonstruuje odpowiednią linię klonów. Kompletny genom/projekt montażu naszego zestawu danych i genom referencyjny (bydlęcy bovid AF2122/97, LT708304.1) są wzajemnie powiązane; i skanuje pozycję SNP na każdej gałęzi drzewa, aby wykryć klaster SNP reprezentujący zdarzenie rekombinacji. Zero gałęzi Załóż, że nie ma zdarzenia rekombinacji, co oznacza, że SNP występujące na gałęzi powinny być równomiernie rozłożone. Jako pliki wejściowe używane są wielokrotne dopasowanie rdzenia z Parsnp i najlepiej ocenione drzewo ML z RAxML.
Na koniec, aby potwierdzić zdarzenie reorganizacji sugerowane przez potok Gubbinsa, sześć algorytmów zaimplementowanych w RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 i SiScan66) jest aplikowanych do wielokrotnych ustawień rdzenia Parsnp przy ustawieniach domyślnych. Ustaliliśmy, że co najmniej trzy algorytmy zaimplementowane w RDP4 muszą konsekwentnie generować ważny sygnał, aby zweryfikować każde zdarzenie rekombinacji.
Biorąc pod uwagę, że zarówno oprogramowanie Gubbins, jak i RDP poszukują sygnałów rekombinacji poprzez sprawdzanie wielokrotnych dopasowań rdzeniowych w oknie do 500 pb i potwierdzając, że włączenie genów PE/PPE podczas montażu de novo nie będzie kolidować z wykrytymi sygnałami rekombinacji, dalsza analiza jest przeprowadzana metodą homolinearności. Sprawdź okolicę genu, identyfikując zdarzenie rekombinacji. Mapa synlinearna z wykorzystaniem całego genomu została skonstruowana za pomocą metody MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html), aby wykluczyć lokalne translokacje lub inwersje genomu. Ponadto, cały genom został wykorzystany do przeprowadzenia analizy homolinearności sekwencji aminokwasowej za pośrednictwem serwera internetowego SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Bardziej szczegółowa analiza zestawu danych genomowych uzyskanych z portugalskiego systemu gruźlicy wielożywicielowej polega na sprawdzeniu polimorfizmu genów wymienionych w literaturze. Geny te to 37, 38 oraz gen kodujący 3R uzyskany przez przodków MTBC poprzez komponenty systemu HGT (naprawy, replikacji i rekombinacji DNA) 39. Użyj ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) i DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) do obliczenia różnorodności genów i różnorodności nukleotydów (π) oraz parametru wejściowego testu neutralnego D Tajimy.
Uzyskano drzewo filogenetyczne metodą maksymalnego prawdopodobieństwa (ML) na podstawie 69 izolatów Mycoplasma bovis i genomów referencyjnych (rysunek 2A). W porównaniu z drzewami opartymi na pojedynczym genie lub drzewami opartymi na wielu locusach, strategia ta pozwala na generowanie bardziej zaawansowanych drzew, które nie uwzględniają zmienności całego genomu i dlatego wykazują gorszą zdolność do rozróżniania gatunków 68 i 69. Topologiczna struktura drzewa ML jest zazwyczaj zgodna ze złożoną klasyfikacją klonów. Genom Eu2 jest skupiony w gałęzi, a genom Af1 również jest skupiony razem (rysunek 2A). Wynik jest również zgodny ze znanym pokrewieństwem ewolucyjnym Mycobacterium bovis, to znaczy istnieje duża różnica między członkiem Eu1 a grupą składającą się z wszystkich innych kompleksów klonalnych i genomów, ale kompleks klonalny 30 nie jest określony. Niewielką niespójność pomiędzy kompleksem klonalnym a relacją zaobserwowaną na drzewie filogenetycznym można wyjaśnić faktem, że kompleks klonalny opisany jest w oparciu o konkretne regiony genomowe, podczas gdy drzewo filogenetyczne opiera się na wielokrotnych dopasowaniach genomów rdzeniowych reprezentujących cały genom.
Drzewo filogenetyczne o maksymalnym prawdopodobieństwie (GTR) konstruowane jest na podstawie dopasowania genomu rdzeniowego Mycobacterium bovis przed (A) i po (B) usunięciu miejsca rekombinacji. Kolory gałęzi reprezentują kompleks klonów Mycobacterium bovis: Europa 1 jest fioletowa, Europa 2 jest czerwona, Europa 3 jest niebieska, Afryka 1 jest pomarańczowa, a Afryka 2 jest zielona. Drzewo jest ukorzenione i narysowane w skali, a długość gałęzi jest mierzona jako zamiennik dla każdego miejsca rekombinacji.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis jest opisywany jako kompleks ewoluujący klonalnie, a większość dowodów zgromadzonych na przestrzeni lat potwierdza tezę, że trwające procesy HGT i rekombinacji nie będą zachodzić na wykrywalnym poziomie MTBC15,17,18.
Poprzednie prace wykazały, że może występować ograniczona rekombinacja między szczepami MTBC20,21, podczas gdy innym nie udało się zidentyfikować mierzalnych zdarzeń rekombinacji70,71. Ponownie omów tę kwestię, koncentrując się na Mycobacterium bovis, co różni się od poprzednich prac, które uwzględniały tylko Mycobacterium tuberculosis70,71; lub rozważ MTBC jako całość, prawie bez M. bovis reprezentującego 20; lub rozważ tylko restrykcyjne frakcje bydła. Zestaw danych dotyczących mykobakterii w tej pracy obejmuje w sumie 70 szczepów, reprezentujących wszystkie kompleksy klonalne, używanych do przesiewu pod kątem rekombinacji. Zestaw danych jest skalowany zgodnie z czterema poziomami kumulacyjnymi: (1) członkowie Eu2, (2) wszyscy członkowie europejskiego kompleksu klonów (tj. Europa), (3) europejski i afrykański kompleks klonów (Eu + Af) i (4) całe zbiory danych (w tym genomy, które nie są uwzględnione w żadnych kompleksach klonowania już opisanych).
Aby zbadać tę hipotezę dalej, przeprowadzono analizę sieci metodą podziału i dekompozycji, aby ocenić brak zdarzeń rekombinacji między genomami, ponieważ metoda ta pozwala na wizualizację pokrewieństwa przodków między osobnikami i wykazanie sprzecznych sygnałów filogenetycznych. Wszystkie cztery zestawy danych w analizie potwierdziły istnienie pętli w sieci (tj. obszarów, które nie zbiegają się w jedno drzewo), ale test Phi nie ma poparcia statystycznego (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; cały zestaw danych p = 0,2451), co dostarcza słabych dowodów na istnienie zdarzeń reorganizacji (rysunek 3A-D).
W Europie 2 genomy (n = 37) (A), genomy europejskie (n = 44) (B), genomy europejskie i afrykańskie (n = 51) (C) oraz cały zestaw danych (n = 70) (D).
Po tej analizie i biorąc pod uwagę cykliczne obserwacje we wszystkich sieciach, algorytm rekonstrukcji zaimplementowany w potoku Gubbinsa został zastosowany do rekonstrukcji linii klonalnej i uzupełnienia oszacowania wpływu rekombinacji na genom M. bovis. Wywnioskuj skumulowaną liczbę zdarzeń rekombinacji, z których większość wystąpiła w gałęziach terminalnych (tj. w pojedynczym genomie) (Tabela 2). Wskaźniki te pokazują spójność całego zestawu danych i wskazują, że częstość zdarzeń rekombinacji jest od 200 do 300 razy większa niż częstość mutacji. Gdy parametr rho/theta reprezentujący względne wskaźniki rekombinacji i mutacji punktowych na gałęzi wydaje się wynosić od 0,0037 do 0,0056 (Tabela 3). Niedawno opublikowana praca dotycząca szczepu 38 M. bovis wykazała wyższą wartość rho/theta (rho/theta = 0,1) niż uzyskana w tym zestawie danych, ale praca Patané i współpracowników wykorzystała montaż oparty na odniesieniach, aby wywnioskować parametry rekombinacji. Szczegół proceduralny, wynikający z procedury montażu, został powiązany z obfitością domniemanych zdarzeń rekombinacji w gałęzi końcowej.
Następnie parametr r/m reprezentuje współczynnik różnorodności rekombinacji i wprowadzenia mutacji, a jego średnia wartość wynosi od 0,025 do 0,037, co wskazuje, że w porównaniu z mutacjami rekombinacja ma mniejszy ogólny wpływ na różnorodność genetyczną M. bovis (Tabela 3). W celu szerszego porównania podobną metodę zastosowano do oszacowania parametru r/m dla zestawu danych MTBC składającego się z 23 genomów, wykazując średnią wartość 0,48620, podczas gdy dla zestawu danych 38 M. bovis Patané i współpracowników średnia wartość wynosi 0,98. W pierwszym badaniu tylko dwa z 23 genomów uwzględniono w pracy M. bovis (M. bovis BCG i szczep referencyjny), więc uzyskana wartość może być obciążona ze względu na nadmierną ekspresję genomu M. tuberculosis. W drugim raporcie analizowane populacje Mycobacterium bovis zostały odzyskane głównie ze Stanów Zjednoczonych i zwierząt gospodarskich. Natomiast w naszym zestawie danych reprezentowanych jest więcej lokalizacji geograficznych i gatunków żywicieli, a także wykorzystywane są genomy pogrupowane w różne kompleksy klonalne o różnych cechach genetycznych populacji, co pozwala na pogłębienie i poszerzenie wiedzy na temat populacji. Różnica wartości średniej r/m uzyskana z naszego zestawu danych jest zgodna z koncepcją, że stopień rekombinacji znacznie różni się między liniami przypisanymi do tego samego gatunku taksonomicznego, zatem wyniki te wskazują, że kompleks klonów M. bovis może wykazywać różnice w rekombinacji. Wpływ jest również taki, jak sugerują Didelot & Maiden72. Niemniej jednak, znaczne rozszerzenie tego zestawu danych poprzez uwzględnienie większej liczby genomów M. bovis pozwoli na dalsze wyjaśnienie tego punktu. Zarówno parametry r/m, jak i rho/theta wykazują zmienność między gałęziami, a wynik ten jest zgodny z raportami dotyczącymi innych gatunków bakterii72,73.
Wreszcie, w celu potwierdzenia zdarzeń reorganizacji zidentyfikowanych przez potok Gubbinsa, w oprogramowaniu RDP4 zastosowano sześć różnych algorytmów do niezależnego testowania różnych wieloporównań rdzeni. Ogólnie rzecz biorąc, mniej niż połowa zdarzeń zidentyfikowanych przez Gubbinsa została potwierdzona przez RDP4 (tabele 4 i 5). Biorąc pod uwagę cały zestaw danych, potwierdzono trzy zdarzenia rekombinacji, dwa obejmujące węzły wewnętrzne, a jedno obejmujące pojedynczy genom w gałęzi terminalnej, dla którego nie można było przypisać kompleksów klonalnych (tabele 4 i 5). Identyfikacja zdarzeń w gałęziach terminalnych może wskazywać, że rekombinacja jest nadal w toku we współczesnych szczepach M. bovis lub że wynik jest błędny70. W tym hipotetycznym regionie rekombinacji około 20% pozycji ma niezdefiniowane nukleotydy (N), co wpływa na sygnał rekombinacji (Rysunek uzupełniający 2). Ponadto region ten wpływa na gen rrs, kodujący rybosomalny RNA 16S, który prawdopodobnie jest wysoce konserwatywny, więc ten domniemany sygnał rekombinacji może być wynikiem błędów sekwencjonowania lub nieprawidłowego dopasowania. Następnie przeprowadzono dopasowanie całego genomu pomiędzy Mb0003 a Mycobacterium bovis AF2122/97, co potwierdziło istnienie niezdefiniowanych nukleotydów i SNP, więc możliwe problemy związane z nieprawidłowym dopasowaniem nie wynikały z informacji biologicznych zaimplementowanych w tej pracy. Pojawiły się one po zapoznaniu się z programem.
Nie stwierdzono luk ani niezdefiniowanych nukleotydów w regionach rekombinacji węzłów wewnętrznych (rysunki 4 i 5). Jeśli chodzi o te zdarzenia, jedno zawiera tylko genom Eu2 i wpływa na gen pks12, który koduje potencjalną syntazę poliketydową; podczas gdy drugie jest zarejestrowane w genomie Eu1 i wpływa na gen narX, który koduje potencjalną reduktazę azotanową (tabela 4). Ogólnie rzecz biorąc, analiza rekombinacji pokazuje, że istnieje ograniczona liczba fragmentów rekombinacji ze wsparciem statystycznym, a wnioskowane wskaźniki wskazują, że rekombinacja ma niewielki wpływ na linię M. bovis. Oczekuje się, że sygnał rekombinacji będzie niski, ale ważne jest odróżnienie prawdziwego sygnału ewolucji od szumu tła, co jest trudnym zadaniem. Aby zredukować szumy generowane przez montaż oparty na referencjach i problemy z niedopasowaniem 70, 71, wszystkie pozostałe sekwencje, z wyjątkiem kompletnego genomu, zostały zmontowane od podstaw, a jakość montażu została sprawdzona i potwierdzona analizą potokową QUAST (Tabela uzupełniająca 1). Ponadto przeprowadzono szereg analiz uzupełniających w celu zapewnienia solidności i dokładności całego badania. W związku z tym jakość sekwencjonowania genów narX i pks12 została oceniona poprzez mapowanie odczytów względem Mycobacterium bovis AF2122/97. Zalecaną pozycję SNP w regionie rekombinacji potwierdzono, stosując kryteria wymienione w sekcji dotyczącej metody (co najmniej 20 odczytów i częstotliwość zmian 0,9). Polimorfizm genu narX został w pełni potwierdzony w dwóch genomach (Mb1792361 i Mb7240415; 2,3%) oraz w genomach genomu pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 i Mb12. Jednak w przypadku genomu Mb2043 sześć z ośmiu pozycji nie spełnia kryterium głębokości odczytu, ponieważ SNP jest wspierany przez maksymalnie 17 odczytów, co jest wartością poniżej ustalonej wartości granicznej 20. W związku z tym rekombinacja sześciu genomów (8,6%) w tym miejscu genomu może zostać potwierdzona (rysunki 4 i 5).
Szczegółowa wizualizacja dopasowania regionu rekombinacji w zestawie danych Mycobacterium bovis wpływa na gen narX, który koduje potencjalną reduktazę azotanową. Nie stwierdzono luk ani niezdefiniowanych nukleotydów w regionie rekombinacji węzłów wewnętrznych. To konkretne zdarzenie jest zarejestrowane w genomie Eu1. Jakość sekwencjonowania genu narX została oceniona poprzez naniesienie odczytów Mycobacterium bovis AF2122/97. Potwierdź zalecaną lokalizację SNP w obszarze rekombinacji, stosując kryteria wymienione w sekcji dotyczącej metody (co najmniej 20 odczytów i częstotliwość zmian 0,9). Polimorfizm genu narX został w pełni potwierdzony w genomach Mb1792361 i Mb7240415 (2,3%).
Szczegółowa wizualizacja dopasowania regionu rekombinacji w zestawie danych Mycoplasma bovis, wpływającego na gen pks12. Nie stwierdzono luk ani niezdefiniowanych nukleotydów w regionie rekombinacji węzłów wewnętrznych. Jeśli chodzi o zdarzenie wpływające na gen pks12, kodujący potencjalną syntazę poliketydową, zawiera on jedynie genom Eu2. Jakość sekwencjonowania pks12 została oceniona poprzez mapowanie odczytów Mycobacterium bovis AF2122/97. Potwierdź zalecaną lokalizację SNP w obszarze rekombinacji, stosując kryteria wymienione w części dotyczącej metody (co najmniej 20 odczytów i częstotliwość zmian 0,9). Polimorfizmy genomów Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 i Mb1960 zostały w pełni potwierdzone.
Geny PE i PPE posiadają powtarzalne regiony, które łatwo błędnie odczytują sekwencjonowanie i mapowanie Illumina, dlatego są one zazwyczaj usuwane z procesu bioinformatycznego dotyczącego członków M. tuberculosis tylko w przypadku zastosowania strategii mapowania do sekwencji. Wnioskowanie o zdarzeniach rekombinacji zastosowane w tej pracy opiera się na montażu de novo bez filtrowania PE/PPE. Uważamy, że dzięki wdrożeniu trzech różnych, uzupełniających się metod i algorytmów za pomocą SplitsTree, potoku Gubbins i oprogramowania RDP4, zastosowane strategie są odporne na przetwarzanie i filtrowanie regionów reorganizacji spowodowanych sygnałami błędów. Jednakże, aby wykluczyć interferencję genu PE/PPE w oprogramowaniu Gubbins i RDP4 w celu identyfikacji klastrów SNP, a tym samym identyfikacji regionów rekombinacji, które rzekomo wpływają na geny narX i pks12, zbadano sąsiedztwo tych genów (rys. uzupełniający 3–5). W M. bovis AF2122/97 gen narX jest rozdzielony przez narK2 i Mb1764c, podczas gdy pks12 jest otoczony przez Mb2075c i Mb2073c (Rysunek uzupełniający 3-5). Mapa wygenerowana przy użyciu mapy synliniowej MAUVE całego genomu dostarcza informacji na temat konserwacji i rearanżacji sekwencji genów, pokazując cztery bloki kolinearne i brak oznak translokacji lub inwersji genomu. Ponadto analiza komplementacji z sekwencją aminokwasową potwierdziła homologię we wszystkich kompletnych genomach i nie stwierdzono obecności PE/PPE w sąsiednich regionach narX ani pks12. W przypadku narX jeden genom (Mb0030) ma niższy wynik synonimii, ponieważ gen narX został zidentyfikowany jako dwa fragmenty (fragmenty 1891 i 1890). W przypadku pks12, ze względu na podobieństwa, Mb0030 i Mb003 wykazywały niższe wyniki synlinearności, podczas gdy pks12 zidentyfikowano odpowiednio w dwóch i trzech fragmentach, reprezentujących różne domeny białka (Rysunek uzupełniający 3-5). Biorąc pod uwagę te informacje, a oprogramowanie Gubbins i RDP4 przeprowadziło analizę i sprawdziło wielokrotność rdzenia o maksymalnej długości 500 pb w oknie, potwierdziliśmy, że gen PE/PPE nie będzie zakłócał sygnału rekombinacji, który wpływa na narX i pks12.
Mimo że sygnały rekombinacji wykryte w tym zestawie danych można uznać za resztkowe, to jednak nie można wykluczyć rekombinacji u M. bovis, więc powinna ona być nadal przedmiotem dalszych analiz, w ramach których całe genomy z różnych scenariuszy epidemiologicznych zostaną zsekwencjonowane do poziomu Ważnego.
Porównanie drzew filogenetycznych ML uzyskanych przed i po korekcie rekombinacji (rysunek 2A, B) nie doprowadziło do istotnych zmian w wnioskowanym pokrewieństwie filogenetycznym, a szczepy M. bovis zostały zgrupowane w tej samej grupie.
Po zmapowaniu 42 nowo zsekwencjonowanych odczytów M. bovis z genomem referencyjnym M. bovis AF2122/97 uzyskano wyrównanie SNP zawierające 1816 pozycji polimorficznych. Większość SNP (87,1%) znajduje się w regionie kodującym, a geny, których to dotyczy, scharakteryzowano zgodnie z kategoriami funkcjonalnymi przedstawionymi w Bovilist (rysunek 6A, B). Biorąc pod uwagę całkowitą liczbę genów w każdej kategorii funkcjonalnej, geny z kategorii „metabolizm lipidów” wykazały więcej SNP, a następnie geny z kategorii „ściana komórkowa i procesy komórkowe” oraz „metabolizm pośredni i oddychanie”, co wskazuje na ich ewolucyjny udział w M. bovis.
Analiza hierarchiczna zbioru danych M. bovis z Portugalii (n = 42). Całkowita liczba zarejestrowanych SNP i genów dotkniętych chorobą dla każdej kategorii funkcjonalnej (A). Całkowita liczba zmian synonimicznych i niesynonimicznych zarejestrowanych według kategorii funkcji (B).
W skali globalnej średni stosunek dN/dS jest lepszy niż 1,5, co wskazuje na globalną presję ewolucyjną zmierzającą do pozbycia się stanu przodków i reprezentuje pozytywny (zróżnicowany lub ukierunkowany) i/lub złagodzony scenariusz wyboru metody oczyszczania. W kategoriach „wirulencja, detoksykacja, adaptacja”, „sekwencje insercyjne i fagi” oraz „białka regulatorowe” ponad dwie trzecie polimorfizmów polimorficznych (SNP) to polimorfizmy niesynonimiczne (ryc. 6B).
We wszystkich kategoriach występują geny z wieloma SNP, co skutkuje średnim wskaźnikiem mutacji (tj. średnią liczbą SNP na gen) większym niż 1 (Rysunek 6A). Pks12 (Mb2074c) z 15 SNP i fas (Mb2553c) z 8 SNP mają wyższe wartości mutacji. Oba te geny biorą udział w metabolizmie kwasów tłuszczowych. Gen pks koduje syntazę poliketydową (PKS), która jest wielofunkcyjnym enzymem biorącym udział w biosyntezie lipidów ściany komórkowej mykobakterii74,75. Gen ten koduje wielofunkcyjny polipeptyd, który bierze udział w syntezie mykoketydów74,76. Gen fas bierze udział w syntezie kwasu mykolowego. Oba te geny odgrywają ważną rolę w biosyntezie ściany komórkowej w kontakcie z gospodarzem.
Aby pogłębić badania nad ewolucją Mycobacterium bovis, przeanalizowano dwa zestawy specyficznych genów. Wcześniej opublikowane prace wykorzystujące skład sekwencji i metody filogenetyczne zidentyfikowały geny, które zostały nabyte przez przodków MTBC poprzez HGT przed dywersyfikacją37,38. Geny te wymieniono w Tabeli Uzupełniającej 2. Przeanalizowano rozkład SNP w sumie 77 genów, które mogą być związane z HGT, i zidentyfikowano 26 miejsc polimorficznych, które w większości przypadków (78%) skutkowały zmianami niesynonimicznymi (NS) (Tabela Uzupełniająca 2). Wcześniejsze prace nad genomem MTBC wykazały, że domniemany region HGT wykazuje wyższy stosunek SNP NS w porównaniu z resztą genomu. Jeśli założymy, że te regiony rekombinacji zostały nabyte przez przodków MTBC, a zatem nadreprezentują one starożytne polimorfizmy, to odsetek zmian synonimicznych powinien być wyższy, ponieważ oczekuje się, że substytucje NS zostaną wyeliminowane przez selekcję negatywną z powodu zmian aminokwasów, które mogą zmieniać funkcję białka. Dlatego nasze wyniki wskazują, że konsekwencje funkcjonalne mogą wynikać z zastąpienia genów podobnych do HGT, co odzwierciedla ich znaczenie dla cennej adaptacyjnej różnorodności genetycznej.
Równolegle z tą analizą, geny kodujące komponenty systemu 3R (naprawa, replikacja i rekombinacja DNA) zostały dokładnie zbadane zgodnie z listą opublikowaną wcześniej przez dos Vultos i współpracowników (2008)39. Wymiany identycznych fragmentów DNA nie można zaobserwować bezpośrednio, chociaż może to być częsty proces, gdy zaangażowane są blisko spokrewnione bakterie, jak w przypadku tego zestawu danych; ponadto proces ten może być kluczem do metod naprawy DNA72, więc odgrywać rolę w rekombinacji homologicznej. Zidentyfikowano łącznie 26 pozycji polimorficznych rozłożonych na 54 geny (Tabela uzupełniająca 3). W tym zestawie genów zmiany NS stanowiły około 65% konsekwencji, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami na temat szczepów Mycobacterium tuberculosis.
Czas publikacji: 21.10.2021