পুনর্মিলন, মিউটেশন এবং ইতিবাচক নির্বাচনের জিনোম-ব্যাপী অনুমান মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের বিভিন্ন চালিকাশক্তিকে অনুপ্রাণিত করে

Nature-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার ভার্সনটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS-এর জন্য সীমিত সমর্থন রয়েছে। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে ব্রাউজারের একটি নতুন সংস্করণ ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্যতা মোড বন্ধ করুন)। একই সাথে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটগুলি প্রদর্শন করব।
জিনোম সিকোয়েন্সিং সংক্রামক রোগ গবেষণার ক্ষেত্রকে পুনরুজ্জীবিত করেছে, রোগের মহামারীবিদ্যা, রোগজীবাণু, হোস্ট-প্যাথোজেন মিথস্ক্রিয়া এবং রোগজীবাণুগুলির উপর আরোপিত বিবর্তন প্রক্রিয়া প্রকাশ করেছে। মাইকোব্যাকটেরিয়াম টিউবারকুলোসিস কমপ্লেক্স (MTBC) মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসকে তার প্রাণী অভিযোজিত সদস্যদের মধ্যে একটি হিসাবে বিবেচনা করে যা স্থলজ স্তন্যপায়ী প্রাণীদের মধ্যে যক্ষ্মা (টিবি) সৃষ্টি করে এবং এটি ব্যাকটেরিয়া বিবর্তনের একটি সাধারণ মডেল। অন্যান্য MTBC সদস্যদের মতো, মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসকে কঠোরভাবে ক্লোন করা, ধীরে ধীরে বিকশিত রোগজীবাণু বলে ধরে নেওয়া হয় এবং স্পষ্টতই পুনর্মিলন বা অনুভূমিক জিন স্থানান্তরের কোনও লক্ষণ নেই। এই কাজে, আমরা গবাদি পশু M. এর জিনগত বৈচিত্র্য সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি পেতে বিভিন্ন বংশধর (ইউরোপ এবং আফ্রিকা) থেকে 70টি গবাদি পশু M. দ্বারা গঠিত একটি সম্পূর্ণ জিনোম সিকোয়েন্স (WGS) ডেটাসেটে তুলনামূলক জিনোমিক্স প্রয়োগ করি। বিবর্তনীয় শক্তি। পুনর্গঠনের লক্ষণগুলি অনুমান করার জন্য তিনটি ভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়। বিশ্বব্যাপী, দৃঢ় সমর্থন সহ দুটি স্বাধীন পদ্ধতি দ্বারা অল্প সংখ্যক পুনর্মিলন ঘটনা চিহ্নিত এবং নিশ্চিত করা হয়েছে। তবুও, মিউটেশনের তুলনায়, M. bovis-এর বৈচিত্র্যের উপর পুনর্মিলনের প্রভাব কম (সামগ্রিক r/m = 0.037)। আমাদের ডেটা সেটে মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের ক্লোনাল কমপ্লেক্সে প্রাপ্ত r/m গড় পার্থক্য এই সাধারণ ধারণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে একই ট্যাক্সোনমিক প্রজাতির জন্য নির্ধারিত বংশের মধ্যে পুনর্মিলনের মাত্রা ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হতে পারে। এই কাজের উপর ভিত্তি করে, মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসে পুনর্মিলনের সম্ভাবনা উড়িয়ে দেওয়া যায় না, তাই ভবিষ্যতের তুলনামূলক জিনোমিক্স গবেষণায় এটি আরও প্রচেষ্টার বিষয় হওয়া উচিত, যেখানে বিশ্বজুড়ে বিভিন্ন মহামারী সংক্রান্ত পরিস্থিতি থেকে বৃহৎ ডেটা সেটের WGS অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। এরপর মাল্টি-হোস্ট টিবি প্রাদুর্ভাব থেকে ছোট মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস ডেটা সেট (n = 42) এর উপর একটি অতিরিক্ত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং 1,800 টিরও বেশি লোকি সনাক্ত করা হয়েছিল, যার মধ্যে কমপক্ষে একটি স্ট্রেন একটি একক নিউক্লিওটাইড পলিমরফিজম (SNP) দেখিয়েছিল। বেশিরভাগ (87.1%) কোডিং অঞ্চলে অবস্থিত, এবং সমার্থক পরিবর্তনের অ-সমার্থক পরিবর্তনের (dN/dS) বিশ্বব্যাপী অনুপাত 1.5 ছাড়িয়ে গেছে, যা ইঙ্গিত করে যে ধনাত্মক নির্বাচন হল M. bovis-এর উপর প্রয়োগ করা একটি গুরুত্বপূর্ণ বিবর্তনীয় শক্তি। "লিপিড বিপাক", "কোষ প্রাচীর এবং কোষীয় প্রক্রিয়া", এবং "মধ্যবর্তী বিপাক এবং শ্বসন" এর কার্যকরী বিভাগ সমৃদ্ধ জিনগুলিতে SNP-এর একটি উচ্চ অনুপাত সনাক্ত করা হয়েছে, যা মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের গুরুত্বের জীববিজ্ঞান এবং বিবর্তনে তাদের সম্ভাব্যতা প্রকাশ করে। MTBC পূর্বপুরুষদের জিনগুলির উপর ঘনিষ্ঠভাবে নজর দেওয়া যা অনুভূমিক জিন স্থানান্তরের প্রবণতা রাখে এবং 3R (DNA মেরামত, প্রতিলিপি এবং পুনর্মিলন) সিস্টেমে অন্তর্ভুক্ত তাইজিমার D নিরপেক্ষ পরীক্ষার বিশ্বব্যাপী গড় নেতিবাচক মান প্রকাশ করে, যা অতীত নির্বাচনী স্ক্যানিং নির্দেশ করে। জনসংখ্যা সম্প্রসারণের পরে সাম্প্রতিক বাধা এখনও বাধ্যতামূলক প্যাথোজেন মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের হোস্টের সাথে লড়াই করার জন্য প্রধান বিবর্তনীয় চালিকাশক্তি।
মাইকোব্যাকটেরিয়াম টিউবারকুলোসিস কমপ্লেক্স (MTBC) হল ব্যাকটেরিয়াজনিত রোগজীবাণুগুলির মধ্যে সবচেয়ে সফল ট্যাক্সা এবং ব্যাকটেরিয়া বিবর্তনের একটি সাধারণ উদাহরণ। এর সদস্যরা জিনোমিক স্তরে আশ্চর্যজনকভাবে উচ্চ নিউক্লিওটাইড পরিচয় দেখায় (> 99%)1,2। বিভিন্ন MTBC ইকোটাইপগুলি ক্ষুদ্র-স্তন্যপায়ী প্রাণী থেকে শুরু করে মানুষ পর্যন্ত বিস্তৃত হোস্ট প্রজাতির যক্ষ্মা (TB) সৃষ্টি করতে পারে, যা একটি সংক্রামক গ্রানুলোমাটাস রোগ। বর্তমানে, এই জটিলটিতে মানুষ [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] এবং প্রাণী-অভিযোজিত রোগজীবাণু (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanze" এবং "dassie") 5,6 অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। M. canettii ("Nodobacter glabrata" নামেও পরিচিত) উপরে উল্লিখিত মাইকোব্যাকটেরিয়ার সাথে নিউক্লিওটাইডের গড় পরিচয় 98%, এবং তুলনামূলক জিনোমিক্সের কাজ দেখিয়েছে যে M. canettii এবং বাকি MTBC সম্প্রতি সাধারণ পূর্বপুরুষ থেকে বিচ্ছিন্ন হয়ে গেছে।7 এই ধারণাটি বিবেচনা করে, কিছু লেখক M. canettii কে MTBC 8 এর সদস্য বলে অভিহিত করেছেন।
MTBC কে পদ্ধতিগতভাবে একটি কঠোর ক্লোনাল জটিল হিসাবে বর্ণনা করা হয়েছে, এবং এর জনসংখ্যা কাঠামো স্পষ্টভাবে হ্রাসকৃত বৈচিত্র্য, বাধা, নির্বাচনী স্ক্যানিং এবং জেনেটিক ড্রিফট দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়9,10। ধরে নিচ্ছি যে জটিল কঠোর ক্লোনাল বিবর্তন, যেমন অনুপস্থিত পলিমরফিজমগুলি পুনর্মিলনের মাধ্যমে পুনরুদ্ধার করা যায় না। এই ধারণার উপর ভিত্তি করে, ডিফারেনশিয়াল অঞ্চল (RD) এবং TbD1 (Mtb নির্দিষ্ট মুছে ফেলা 1 অঞ্চল) এর জিনোমিক মুছে ফেলার ধারাবাহিক ঘটনাগুলিকে MTBC বিবর্তনের আণবিক চিহ্নিতকারী হিসাবে প্রস্তাব করা হয়েছে2,5,11। তুলনামূলক জিনোমিক্স এবং সম্পূর্ণ জিনোম সিকোয়েন্সিং (WGS) কাজ মানব-অভিযোজিত সদস্যদের নয়টি বংশে বিভক্ত করতে সহায়তা করে (মাইকোব্যাকটেরিয়াম টিউবারকুলোসিস L1 থেকে L4, L7, এবং L8; এবং মাইকোব্যাকটেরিয়াম আফ্রিকানাম L5, L6, এবং L9), বংশ L2 থেকে L4 ভাগ করে মুছে ফেলা TbD1 অঞ্চল2,11,12,13। এছাড়াও, প্রাণী অভিযোজিত সদস্যদের একটি সাধারণ পূর্বপুরুষ ভাগ করে নেওয়ার প্রস্তাব করা হয়েছে, যা RD7, RD8, RD9 এবং RD102, 5 এবং 14-এ ক্লেড-নির্দিষ্ট মুছে ফেলার মাধ্যমে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে।
অনুভূমিক জিন স্থানান্তর (HGT) এবং পুনঃসংযোগের ঘটনাগুলিকে বিরল বলে মনে করা হয় এবং MTBC-এর পূর্বপুরুষদের মধ্যে ঘটে, সমগ্র MTBC সদস্যের ইতিহাসের ভিন্নতার পরিবর্তে15,16,17। হিউজেস এবং সহযোগীদের (2002) এবং গুটাকার এবং সহযোগীদের (2006) দুটি প্রাথমিক প্রতিবেদনে পরামর্শ দেওয়া হয়েছে যে পুনর্মিলন ঘটনাগুলি M. টিউবারকুলোসিস স্ট্রেনের নির্দিষ্ট অবস্থান চিহ্নিতকারী পলিমরফিজম গঠনে সহায়তা করতে পারে18,19। MTBC-তে পুনর্মিলনের স্পষ্ট অভাবের কারণগুলি হল: (1) HGT-এর যান্ত্রিক প্রক্রিয়া এবং ক্ষমতা হ্রাস; (2) HGT ইভেন্টগুলির বিরলতা; (3) MTBC নিশে পুনর্মিলনের ঘটনাগুলির কোনও সম্ভাবনা নেই14,17। সম্প্রতি, MTBC স্ট্রেন 20 এবং মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস 21-তে প্রয়োগ করা কিছু সম্পূর্ণ-জিনোম সিকোয়েন্সিং (WGS) গবেষণা পুনর্মিলনের প্রমাণ প্রদান করেছে, যা প্রথম দেখায় যে MTBC স্ট্রেনগুলি প্রায়শই ছোট DNA টুকরো বিনিময় করে, কিন্তু সীমিত নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্স পরিবর্তনের কারণে, এই ঘটনাগুলি এখনও লক্ষ্য করা যায় না।
মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস হল গবাদি পশু (প্রধানত গবাদি পশু) থেকে সবচেয়ে বেশি উদ্ধার হওয়া MTBC সদস্য, যদিও এটি মুক্ত-পরিসর এবং বেড়াযুক্ত বন্য প্রাণী থেকেও বিচ্ছিন্ন করা যেতে পারে4,22,23,24। স্পোলিগোটাইপিং প্রোফাইল অনুসারে, নির্দিষ্ট মুছে ফেলা এবং নির্দিষ্ট জিনে একক নিউক্লিওটাইড পলিমরফিজম (SNPs) 25, 26, 27, 28, 29 অনুসারে, M. bovis পাঁচটি প্রধান ক্লোনাল কমপ্লেক্সে [ইউরোপীয় 1 (Eu1), ইউরোপীয় 2 (Eu2), ইউরোপীয় 3 (Eu3), আফ্রিকান 1 (Af1) এবং আফ্রিকা 2 (Af2)] বিবর্তিত হয়েছে। এই ক্লোনাল কমপ্লেক্সগুলি মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস জনসংখ্যার বৈচিত্র্যময় গঠন এবং ভৌগোলিক অঞ্চলের সাথে এর সম্পর্ক প্রদর্শন করে। এছাড়াও, জিম্পেল এবং সহযোগীদের দ্বারা সম্পাদিত সাম্প্রতিক WGS গবেষণা (২০২০) মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের SNP-এর উপর ভিত্তি করে একটি ফাইলোজেনি ডিজাইন করেছে, যার মধ্যে ১,৯০০ টিরও বেশি জিনোম রয়েছে, যা ইঙ্গিত করে যে কমপক্ষে চারটি ভিন্ন বংশ রয়েছে (Lb1 থেকে Lb1 থেকে Lb4 নামে পরিচিত), তারা পূর্বে সংজ্ঞায়িত ক্লোনাল কমপ্লেক্সের সাথে সম্পূর্ণরূপে সামঞ্জস্যপূর্ণ নয়, যদিও ভৌগোলিক নির্দিষ্টতাও নিশ্চিত করা যেতে পারে30। এই লেখকরা ফাইলোজেনি এবং আণবিক ডেটিং-এর ডিফারেনশিয়াল বিশ্লেষণ করেছেন, কিন্তু পুনর্মিলন30 অধ্যয়ন করেননি।
বিভিন্ন আণবিক কৌশল ব্যবহার করে পূর্ববর্তী কাজ, যেমন স্পোলিগোটাইপিং, MIRU-VNTR (মাইকোব্যাকটেরিয়াল ইন্টারস্পার্সড রিপিট ইউনিট-ভেরিয়েবল ট্যান্ডেম রিপিট নম্বর), এবং সাম্প্রতিক SNP টাইপিং এম. বোভিস স্ট্রেন 31,32,33, 34,35-এর মধ্যে একটি নির্দিষ্ট স্তরের জিনগত বৈচিত্র্য প্রকাশ করেছে। জিনগত বৈচিত্র্যের পার্থক্য রোগ মহামারীবিদ্যার অধ্যয়নে একটি গুরুত্বপূর্ণ হাতিয়ার হয়ে উঠেছে, যা রোগ সৃষ্টি, ভাইরাস এবং রোগ সংক্রমণের গভীরভাবে বোঝার জন্য সহায়ক। WGS পদ্ধতির উত্থান বিভিন্ন হোস্ট এবং মহামারী সংক্রান্ত পরিস্থিতিতে অভিযোজন এবং স্থায়িত্ব প্রক্রিয়ায় মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস জিনোম দ্বারা আরোপিত বিবর্তনীয় চালিকা কারণগুলি প্রকাশ করার সম্ভাবনা প্রদান করে।
এই কাজে, আমরা বিভিন্ন মাইকোপ্লাজমা বোভিস ডেটাসেট (n=70) এর তুলনামূলক জিনোমিক বিশ্লেষণ ব্যবহার করি, যার মধ্যে বিভিন্ন ক্লোনাল কমপ্লেক্স থেকে আইসোলেট অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, মাইকোপ্লাজমা বোভিসের বিবর্তন প্রক্রিয়া সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি অর্জনের জন্য, বিশেষ করে ফাইলোজেনেটিক সম্পর্ক এবং পুনর্মিলনের ঘটনাগুলি সমাধান করার জন্য। এই বিশ্লেষণের পরিপূরক হিসাবে, পর্তুগালের 31,36-এর একটি সু-বৈশিষ্ট্যযুক্ত মাল্টি-হোস্ট যক্ষ্মা এলাকা থেকে প্রাপ্ত M. bovis আইসোলেট (n = 42) এর একটি উপ-ডেটা সেট অ-পরিচয় অনুমান করার জন্য আরও অন্বেষণ করা হয়েছিল। সমার্থক (dS) নিউক্লিওটাইড প্রতিস্থাপনের সাথে ইন্দ্রিয়ের আপেক্ষিক অনুপাত (dN) এর মধ্যে ভারসাম্য, সেইসাথে সাহিত্যে উল্লিখিত নির্দিষ্ট জিনোমের বিবর্তনীয় অবদান, তারা HGT এর মাধ্যমে MTBC পূর্বপুরুষদের দ্বারা প্রাপ্ত 37,38, এবং 3R (DNA মেরামত, প্রতিলিপি এবং পুনর্মিলন) সিস্টেম জিন উপাদান 39 এনকোড করে। HGT এর মাধ্যমে প্রাপ্ত জিনগুলি বেছে নিন কারণ তারা প্রাচীন পলিমরফিজমের প্রতিনিধিত্ব করতে পারে, তাই আশা করা হচ্ছে যে তাদের মধ্যে সমার্থক পরিবর্তনের একটি উচ্চ অনুপাত থাকতে পারে। 3R সিস্টেমে অন্তর্ভুক্ত জিনগুলি নির্বাচন করা হয়েছিল কারণ M. tuberculosis স্ট্রেনের উপর পূর্ববর্তী কাজ সাধারণ নেতিবাচক/পরিশোধন নির্বাচন নির্দেশ করে যা এই জিনগুলির উপর কাজ করে এবং তারা বিবর্তনে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করতে পারে 39। এই কাজের আরেকটি লক্ষ্য হল পুনর্গঠন ঘটনার অস্তিত্ব অনুমান করা। এই কারণে, পর্তুগাল থেকে আমাদের ডেটাসেটে শুধুমাত্র ইউরোপীয় ক্লোন কমপ্লেক্স 2 এর জিনোম এবং ক্লোন কমপ্লেক্স নির্ধারণ না করা স্ট্রেন রয়েছে তা বিবেচনা করে, আমরা অবশেষে সমস্ত ক্লোন কমপ্লেক্সের প্রতিনিধি পেতে এবং ফলাফলের দৃঢ়তা এবং প্রস্থ উন্নত করার জন্য সর্বজনীনভাবে উপলব্ধ জিনোম ডেটা অন্তর্ভুক্ত করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি।
পর্তুগিজ স্থানীয় বহু-হোস্ট যক্ষ্মা দৃশ্য থেকে ৪২টি নতুন সিকোয়েন্সড মাইকোপ্লাজমা বোভিস জিনোম (বিস্তারিত নীচে), যা পূর্বে মহামারী সংক্রান্ত দৃষ্টিকোণ থেকে চিহ্নিত করা হয়েছে, এই কাজের কেন্দ্রবিন্দু। পর্তুগালের ডেটা সেটে শুধুমাত্র ইউরোপীয় ২টি ক্লোন কমপ্লেক্স এবং নির্দিষ্ট কমপ্লেক্স ছাড়াই স্ট্রেনের প্রতিনিধি রয়েছে তা বিবেচনা করে, জনসাধারণের জন্য উপলব্ধ পুরো-জিনোম সিকোয়েন্সিং ডেটা যোগ করা হয়েছে যাতে ডেটা সেটটি প্রসারিত করা হয় যাতে M. bovis ক্লোন কমপ্লেক্সের সমস্ত প্রতিনিধি অন্তর্ভুক্ত থাকে। অতএব, এই কাজে তিনটি সম্পূর্ণ-জিনোম সিকোয়েন্সিং ডেটা উৎস ব্যবহার করা হয়েছে: সম্পূর্ণ/খসড়া জিনোম সমাবেশ, NCBI (ন্যাশনাল সেন্টার ফর বায়োটেকনোলজি ইনফরমেশন) এ সংরক্ষিত ১০টি পর্যন্ত স্ক্যাফোল্ড (n = ১৫টি আইসোলেট); SRA-তে সংরক্ষিত (সিকোয়েন্স রিড আর্কাইভের ইলুমিনা ফাস্টকিউ ফাইল) এম. বোভিস ক্লোনের জটিল বৈচিত্র্যকে প্রতিনিধিত্ব করে (n = ১২টি আইসোলেট)30; এবং পর্তুগাল থেকে ৪২টি নতুন সিকোয়েন্সড জিনোম। মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস BCG (Bacille Calmette-Guerin) NCBI অনুসন্ধান থেকে বাদ দেওয়া হয়েছিল। ডেটাসেটে অন্তর্ভুক্ত করার জন্য সাধারণত M. bovis AF2122/97 একটি রেফারেন্স জিনোম হিসেবে ব্যবহৃত হয়। আফ্রিকান 1 ক্লোনিং কমপ্লেক্স দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা সম্পূর্ণ জিনোম সিকোয়েন্স জনসাধারণের কাছে অনুপলব্ধ থাকার কারণে এবং Af2 এবং Eu1 এর প্রতিনিধিত্বকারী স্ট্রেন থেকে জিনোমের সংখ্যা কম থাকার কারণে, SRA দ্বারা প্রদত্ত মূল সিকোয়েন্সিং ডেটা এই ক্ষেত্রে ব্যবহার করা হয়েছিল। জিম্পেল এবং তার সহযোগীদের কাজ (2020) উপরে উল্লিখিত ক্লোনিং কমপ্লেক্স থেকে জিনোম সনাক্ত করতে সাহায্য করেছিল এবং ডেটা সেটে অন্তর্ভুক্তির জন্য মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস নির্বাচন করতে সাহায্য করেছিল। Eu3 এর জন্য, শুধুমাত্র এক ধরণের জিনোম বর্ণনা করা হয়েছে (Branger et al., 2020), তাই আমরা যে জিনোমটি অন্তর্ভুক্ত করেছি তা Eu3 কমপ্লেক্সের একটি পৃথক প্রতিনিধি।
বিশ্বব্যাপী, এই তথ্য সেটে ১৯৮৫ থেকে ২০১৬ সাল পর্যন্ত ১২টি দেশে বিতরণ করা ৮টি পোষক প্রজাতির ৭০টি গবাদি পশু এম. বোভিস অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। ৩৬টি প্রজাতিকে Eu2, ৭টি প্রজাতিকে Eu1, ১টি প্রজাতিকে Eu3, ৩টি প্রজাতিকে Af1, ৪টি প্রজাতিকে Af2 হিসাবে মনোনীত করা হয়েছে এবং ১৯টি প্রজাতি কোনও ক্লোনাল কমপ্লেক্সের সাথে সম্পর্কিত নয় (বিস্তারিত নীচে দেওয়া হল)। এই গবেষণায় ব্যবহৃত মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের বিস্তারিত তথ্য (অ্যাক্সেশন নম্বর সহ) সারণি ১ এবং পরিপূরক সারণি ১ এ দেখানো হয়েছে।
পর্তুগালের পশু যক্ষ্মা হটস্পট থেকে ১২ বছরেরও বেশি সময় ধরে বিতরণ করা মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের ৪২টি নতুন সিকোয়েন্সড সম্পূর্ণ জিনোম এই গবেষণার কেন্দ্রবিন্দু, কারণ সম্ভাব্য বন্যপ্রাণী-প্রাণীপালন রোগ ব্যবস্থা নিয়মিত পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে ৩১,৩৬ (পরিপূরক চিত্র ১)। পরবর্তী পদ্ধতি অনুসারে, ২০০৩ থেকে ২০১৫ সাল পর্যন্ত গবাদি পশু (n = ১৪), লাল হরিণ (n = ১৬) এবং বন্য শুয়োর (n = ১২) থেকে এই প্রজাতিগুলি আলাদা করা হয়েছিল: প্রস্তাবিত প্রোটোকল নির্দেশিকা অনুসারে প্রাণী সংগ্রহ এবং পরিচালনা করুন। টিস্যু নমুনাগুলি OIE টেরেস্ট্রিয়াল অ্যানিমাল হ্যান্ডবুকে রয়েছে এবং স্টোনব্রিঙ্ক এবং লোভেনস্টাইন-জেনসেন পাইরুভেট কঠিন মাধ্যম এবং তরল মাধ্যমে টিকা দেওয়া হয়। কালচারগুলি ৩৭ ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউবেটেড করা হয় এবং কমপক্ষে ১২ সপ্তাহের জন্য সপ্তাহে একবার বৃদ্ধি পরীক্ষা করা হয়। উপনিবেশগুলি সরাসরি -৮০ ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় গ্লিসারল দ্রবণে সংরক্ষণ করা হয়। মাইকোব্যাকটেরিয়াম সিলেক্টিভ মিডিয়ামে (মিডলব্রুক 7H9, বিডি ডায়াগনস্টিকস), WGS প্রোগ্রামের DNA প্রাপ্ত করার জন্য মূল সংরক্ষণাগারভুক্ত নমুনাগুলিকে একটি একক ইন ভিট্রো প্যাসেজ ইন ভিট্রোর মধ্য দিয়ে পাস করা হয়েছিল। এর জন্য, হিমায়িত কালচার স্টক দ্রবণটি 5% সোডিয়াম পাইরুভেট এবং 10% ADS (50 গ্রাম অ্যালবুমিন, 20 গ্রাম গ্লুকোজ, 1 লিটার জলে 8.5 গ্রাম সোডিয়াম ক্লোরাইড) দিয়ে মিডলব্রুক 7H9-তে 37°C রিট্রেন তাপমাত্রায় সমৃদ্ধ করা হয়েছিল। 4 সপ্তাহের বৃদ্ধির পরে, মাধ্যমটি পুনর্নবীকরণ করা হয়েছিল এবং বৃদ্ধি পর্যবেক্ষণ না করা পর্যন্ত নিয়মিতভাবে কালচার পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। কোষগুলি সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল, পেলেটটি 500 µL ফসফেট বাফার স্যালাইনে (PBS) পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল, 99°C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য উত্তপ্ত করা হয়েছিল, সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং সুপারন্যাট্যান্টকে WGS পর্যন্ত -20 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। সমস্ত প্রক্রিয়া লেভেল 3 জৈবনিরাপত্তা সুবিধাগুলিতে সম্পন্ন করা হয়।
WGS পেয়ারড-এন্ড জিনোম লাইব্রেরি প্রতিটি DNA নমুনার অনন্য সূচক ব্যবহার করে প্রস্তুত করা হয় এবং সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 নমুনা) এবং HiSeq (2 × 150 pb) (দুটি আইসোলেট) প্রযুক্তি (ইউরোফিনস জিনোমিক্স, জার্মানি) ব্যবহার করে। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে, জিনোমিক ডিএনএ সিকোয়েন্স করার জন্য ডাবল-এন্ডেড মডিউল সংযুক্তি সহ Illumina জিনোম বিশ্লেষক ব্যবহার করুন এবং লাইব্রেরি তৈরি করতে Illumina থেকে Nextera XT DNA লাইব্রেরি প্রিপ কিট ব্যবহার করুন।
SRA (n = 12) থেকে উদ্ধার করা তথ্য বিবেচনা করে, ক্লোন কমপ্লেক্সের সনাক্তকরণ সংশ্লিষ্ট প্রকাশনা 30, 41, 43 এর মেটাডেটা হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে। সম্পূর্ণ জিনোম বিবেচনা করার সময়, মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস AF2122/97 এবং মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস 3601 ব্যতীত, যা যথাক্রমে Eu1 এবং Eu3 ক্লোনাল কমপ্লেক্স 25, 29 এর স্বীকৃত সদস্য, এটি মাইকোব্যাকটেরিয়াম টিউবারকুলোসিস H37Rv (NCBI অ্যাকসেসন নম্বর NC_000962.3) এর সম্পূর্ণ জিনোমের মতো। জিনোম অ্যালাইনমেন্ট MAFFT (অ্যামিনো অ্যাসিড বা নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্সের একাধিক অ্যালাইনমেন্ট প্রোগ্রাম, সংস্করণ 7.458) এবং প্যারামিটার -addfragments48 ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়। তারপর, বিভিন্ন ক্লোনাল কমপ্লেক্সের অনুপস্থিতি এবং/অথবা SNP বৈশিষ্ট্যের উপস্থিতি অনুসন্ধান করুন।
নতুন সিকোয়েন্সড মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস (n = 42) এবং একত্রিত জিনোম ড্রাফ্টের মূল পাঠ (n = 3) vSNP পাইপলাইনের মাধ্যমে জটিলটিকে রেফারেন্স জিনোম মাইকোব্যাকটেরিয়াম টিউবারকুলোসিস H37Rv এর সাথে সারিবদ্ধ করে এবং বিভিন্ন ক্লোনের মুছে ফেলা এবং/অথবা SNP বৈশিষ্ট্যের উপস্থিতি অনুসন্ধান করা হয়েছিল।
বৈশিষ্ট্যের অভাব এবং/অথবা SNP এবং স্পোলিগোটাইপিং প্রোফাইলের উপস্থিতি/অনুপস্থিতি থেকে তথ্য সংগ্রহ করে সংশ্লিষ্ট ক্লোনাল কমপ্লেক্সে জিনোমিক ডেটা বরাদ্দ করুন। চারটি খসড়া সমাবেশের জন্য, স্পোলিগোটাইপিং প্রোফাইল অনুমান করা যায় না, তাই এগুলি "কোন জটিলতা নেই" গ্রুপে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে।
এই কাজের পরে জৈব তথ্যপ্রযুক্তির কর্মপ্রবাহ শুরু হয় নতুন করে সমাবেশ এবং ম্যাপিং থেকে শুরু করে একটি রেফারেন্স কৌশল পর্যন্ত, যার লক্ষ্য পুনর্মিলন ঘটনা এবং নির্দিষ্ট জিনোম পলিমরফিজম অন্বেষণ করা। চিত্র 1 অনুসরণ করা পদক্ষেপগুলির একটি ফ্লোচার্ট প্রদান করে। পুনর্মিলন বিশ্লেষণের জন্য, সমস্ত জিনোম ব্যবহার করা হয় অনুমান এবং সম্পর্কিত সূচকগুলির দৃঢ়তা বৃদ্ধি করতে।
জিনোম কনসেনসাস সিকোয়েন্স তৈরিতে ত্রুটি কমাতে, আমরা প্রথমে ডি নভো অ্যাসেম্বলি পেয়েছি, এবং তারপর কোর মাল্টিপল অ্যালাইনমেন্ট পেয়েছি। ইউনিসাইক্লার পাইপলাইনটি বর্তমানে https://github.com/rrwick/Unicycler49 এ উপলব্ধ এবং 54টি সিকোয়েন্সড জিনোমের (42টি নতুন সিকোয়েন্সড এবং SRA থেকে উদ্ধার করা 12টি ফাস্টকিউ ফাইল) ডি নভো অ্যাসেম্বলি সম্পাদন করতে ব্যবহৃত হয়। সংক্ষেপে, স্ক্র্যাচ থেকে অ্যাসেম্বল করার আগে, FastQC সংস্করণ 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), এবং Trimmomatic সংস্করণ 0.36 ("reads থেকে অ্যাডাপ্টার এবং অন্যান্য আলো-নির্দিষ্ট ক্রম কাটা" এবং "20 এর থ্রেশহোল্ড মানের চেয়ে কম হলে পঠনের শেষ থেকে বেস কাটা" বিকল্প প্রয়োগ করা হয়েছে) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50-এ পঠন মানের বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। তারপর, জিনোম অ্যাসেম্বলির জন্য SPAdes optimiser49 ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং পোস্ট-অ্যাসেম্বলি অপ্টিমাইজেশনের জন্য Pilon সংস্করণ 1.1851 ব্যবহার করা হয়েছিল। ভুল অ্যাসেম্বলি এড়াতে একটি রক্ষণশীল ব্রিজিং মোড নির্বাচন করা হয়েছিল, এবং k-mer আকার অনুসন্ধান করা হয়েছিল এবং পঠন দৈর্ঘ্যের 20% থেকে 95% এর মধ্যে নির্বাচন করা হয়েছিল। SPAdes নির্দেশিকা অনুসরণ করুন এবং পঠনের আকার বিবেচনা করুন, 300 bp এর চেয়ে ছোট কন্টিগগুলি মুছে ফেলুন এবং 52 এর 20 পঠন গভীরতার কভারেজ কাটঅফ স্থাপন করুন। ডি নভো অ্যাসেম্বলি কৌশলে, অত্যন্ত পুনরাবৃত্তিমূলক প্রোলাইন-গ্লুটামেট (PE) এবং প্রোলাইন-প্রোলাইন গ্লুটামেট (PPE) প্যারালগগুলির মতো জিনোমিক অঞ্চলগুলি সরানো হয়নি।
ডি নভো অ্যাসেম্বলির মান QUAST পাইপলাইনের (http://quast.sourceforge.net/quast.html) মাধ্যমে মূল্যায়ন করা হয়, যা কন্টিগ এবং M. bovis AF2122/97 রেফারেন্স জিনোম (NCBI অ্যাকসেসন নম্বর LT708304.1) ম্যাপিং পুনর্নবীকরণকে সহজতর করে (মানের পরামিতিগুলির জন্য পরিপূরক সারণি 1 দেখুন)।
vSNP পাইপলাইন (https://github.com/USDA-VS/vSNP) এর সাহায্যে, ইলুমিনা সিকোয়েন্সিং থেকে নতুন সিকোয়েন্স করা M. bovis এর FASTQ ফাইলটি M. bovis AF2122/97 রেফারেন্স জিনোম (LT708304.1)) এর সাথে তুলনা করা হয়েছে। জিনোম অ্যানালাইসিস টুলকিট (GATK) 53, 54, 55 এর সর্বোত্তম অনুশীলন সুপারিশ অনুসারে, পুনঃক্যালিব্রেশনের জন্য স্ট্যান্ডার্ড ফিল্টার প্যারামিটার বা ভেরিয়েন্ট ভর স্কোর প্রয়োগ করুন। ফলাফলগুলি সর্বনিম্ন SAMtools ভর স্কোর 150 এবং AC = 2 ব্যবহার করে ফিল্টার করা হয়। দূষণ বাদ দেওয়ার জন্য রিডিং পরীক্ষা করতে Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) ব্যবহার করুন। আমাদের কাজে ম্যাপ টু সিকোয়েন্স কৌশলগুলির জন্য ব্যবহৃত vSNP পাইপলাইনটি সংজ্ঞায়িত SNP এবং লক্ষ্যগুলির একটি সিরিজ পরীক্ষা করে এবং মিশ্র সংক্রমণের পরিস্থিতিও বাদ দেয়। পঠিত জিনোম কভারেজ 99% এর চেয়ে ভাল (পরিপূরক সারণী 1)।
ম্যাপিং ত্রুটি এবং ভুল SNP এড়াতে, নিম্নলিখিত ক্ষেত্রে একটি রূপ ফিল্টার করুন: (1) এটি 20 টিরও কম রিডিং দ্বারা সমর্থিত, (2) এটি 0.9 এর কম ফ্রিকোয়েন্সি সহ পাওয়া যায়, (3) এটি কমপক্ষে একটি স্ট্রেইনে থাকে, তবে কমপক্ষে অন্য স্ট্রেইনে ফাঁক থাকে। ইন্টিগ্রেটেড জিনোমিক্স ভিউয়ার (IGV) সংস্করণ 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 ম্যাপিং বা অ্যালাইনমেন্ট সমস্যা সহ SNP এবং অবস্থানগুলি দৃশ্যত যাচাই করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। যেহেতু প্রোলাইন-গ্লুটামেট (PE) এবং প্রোলাইন-প্রোলাইন গ্লুটামেট (PPE) জিনগুলি অত্যন্ত ডুপ্লিকেট এবং একটি বহু-জিন পরিবারের অংশ, তাই ইলুমিনা সিকোয়েন্সিং এবং ভুল ম্যাপিং দ্বারা এগুলি সহজেই ভুল বোঝা যায়, তাই এগুলি পছন্দ করা হয়। SNP নিশ্চিত করার জন্য ম্যাপিং টু সিকোয়েন্স কৌশল ব্যবহার করার সময় মাইকোব্যাকটেরিয়াল বায়োইনফরমেটিক্স ওয়ার্কফ্লো টিউবারকুলোসিস কমপ্লেক্সের সদস্যদের সরিয়ে দেয়। অতএব, আমরা বিশ্লেষণ থেকে PE/PPE জিন এবং ইনডেলগুলি ফিল্টার করেছি।
বোভিলিস্ট (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) অনুসারে, সমস্ত SNP গুলিকে কার্যকরী বিভাগে ভাগ করা হয়েছে। SnpEff পাইপলাইন (https://pcingola.github.io/SnpEff/) SNP ফলাফল (সমার্থক বা অ-সমার্থক পরিবর্তন) অনুমান করতে ব্যবহৃত হয়। মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস AF2122/97 জিনোম (LT708304.1) এর একটি নতুন ডাটাবেস তৈরি করা হয়েছে।
কোর জিনোম মাল্টিপল অ্যালাইনমেন্টটি Parsnp v1.2 ব্যবহার করে করা হয়েছিল, যা বর্তমানে https://github.com/marbl/parsnp57 এ উপলব্ধ, 69টি সম্পূর্ণ জিনোম/ড্রাফ্ট অ্যাসেম্বলি (বিকল্প -c সহ) ব্যবহার করে এবং M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) একটি রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছে। চারটি কোর মাল্টিপল অ্যালাইনমেন্ট করা হয়েছিল: শুধুমাত্র Eu2 ক্লোনিং কমপ্লেক্সের সদস্যদের (n = 37), ইউরোপীয় ক্লোনিং কমপ্লেক্সের সমস্ত সদস্যদের (n = 44), ইউরোপীয় এবং আফ্রিকান ক্লোনিং কমপ্লেক্সের সংযোগ বিন্দু (n = 51) সহ, এবং এই গবেষণায় সমস্ত মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল (n = 70)।
Parsnp দ্বারা উৎপন্ন মূল সারিবদ্ধকরণটি RAxML ব্যবহার করে CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 ব্যবহার করে সর্বাধিক সম্ভাবনা (ML) ফাইলোজেনেটিক ট্রি অনুমান করতে এবং 1000টি নির্দেশিত প্রতিলিপি সম্পাদন করতে ব্যবহৃত হয়।
সমান্তরালভাবে পুনর্মিলন ইভেন্টের উপস্থিতি পরীক্ষা করার জন্য তিনটি ভিন্ন অ্যালগরিদম এবং জৈব তথ্যবিদ্যা সরঞ্জাম ব্যবহার করা হয়: SplitsTree4 সফ্টওয়্যার, Gubbins (নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্সে পুনর্মিলনের মাধ্যমে নিরপেক্ষ বংশ) পাইপলাইন, এবং RDP4 (পুনঃমিলন সনাক্তকরণ প্রোগ্রাম, সংস্করণ বিটা 4.101) সফ্টওয়্যার।
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 এ বাস্তবায়িত বিভক্ত পচন পদ্ধতিটি পরিসংখ্যানগত যাচাইয়ের জন্য Phi পরীক্ষা ব্যবহার করে রুটলেস ফাইলোজেনেটিক নেটওয়ার্ক গণনা করতে ব্যবহৃত হয় এবং তাৎপর্যের সীমা হল p = 0.05। Parsnp এর মূল মাল্টি-অ্যালাইনমেন্ট বিশ্লেষণ ইনপুট হিসাবে ব্যবহৃত হয় এবং একটি নেটওয়ার্ক স্ট্যান্ডার্ড হিসাবে বিভক্ত পচন বাস্তবায়ন করা হয়।
মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের উপর পুনর্মিলনের প্রভাব মূল্যায়নের আরেকটি উপায় হিসেবে Gubbins পাইপলাইন v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) ডিফল্ট প্যারামিটার ব্যবহার করে চলে। পাইপলাইনে বাস্তবায়িত অ্যালগরিদম প্রাসঙ্গিক ক্লোন বংশ পুনর্গঠন করে। আমাদের ডেটা সেটের সম্পূর্ণ জিনোম/ড্রাফ্ট অ্যাসেম্বলি এবং রেফারেন্স জিনোম (বোভাইন বোভিড AF2122/97, LT708304.1) পারস্পরিকভাবে সংযুক্ত; এবং পুনর্মিলনের ঘটনাটি উপস্থাপনকারী SNP ক্লাস্টার সনাক্ত করতে গাছের প্রতিটি শাখায় SNP-এর অবস্থান স্ক্যান করুন। শাখার শূন্য ধরে নিন যে কোনও পুনর্মিলনের ঘটনা নেই, যার অর্থ শাখায় ঘটে যাওয়া SNPগুলি সমানভাবে বিতরণ করা উচিত। Parsnp থেকে কোর মাল্টিপল অ্যালাইনমেন্ট এবং RAxML থেকে সেরা স্কোর করা ML ট্রি ইনপুট ফাইল হিসাবে ব্যবহৃত হয়।
অবশেষে, Gubbins পাইপলাইন দ্বারা প্রস্তাবিত পুনর্গঠন ইভেন্টটি নিশ্চিত করার জন্য, RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 এবং SiScan66) এ বাস্তবায়িত ছয়টি অ্যালগরিদম ডিফল্ট সেটিংসের অধীনে Parsnp এর কোর মাল্টিপল অ্যালাইনমেন্টে প্রয়োগ করা হয়েছে। আমরা নির্ধারণ করেছি যে RDP4 এ বাস্তবায়িত কমপক্ষে তিনটি অ্যালগরিদমকে প্রতিটি পুনর্মিলন ইভেন্ট যাচাই করার জন্য ধারাবাহিকভাবে একটি গুরুত্বপূর্ণ সংকেত প্রদর্শন করতে হবে।
গাবিন্স এবং আরডিপি সফটওয়্যার উভয়ই ৫০০ বিপি পর্যন্ত একটি উইন্ডোতে মূল একাধিক সারিবদ্ধতা পরীক্ষা করে পুনঃসংযোগ সংকেত অনুসন্ধান করে এবং ডি নভো অ্যাসেম্বলির সময় PE/PPE জিনের অন্তর্ভুক্তি পাওয়া পুনঃসংযোগ সংকেতগুলিতে হস্তক্ষেপ করবে না তা নিশ্চিত করে, আরও বিশ্লেষণ হোমোলিনিয়ারিটি দ্বারা করা হয়। রিকম্বিনেশন ইভেন্ট সনাক্তকারী জিনের আশেপাশের স্থান পরীক্ষা করুন। স্থানীয় জিনোম ট্রান্সলোকেশন বা ইনভার্সন বাদ দেওয়ার জন্য সম্পূর্ণ জিনোম ব্যবহার করে সিঙ্কলিনিয়ার মানচিত্রটি MAUVE-মাল্টি-জিনোম সারিবদ্ধতা (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। এছাড়াও, SyntTax ওয়েব সার্ভার (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) এর মাধ্যমে অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রম অনুসারে সমলিঙ্গীয়তা বিশ্লেষণ করতে সম্পূর্ণ জিনোম ব্যবহার করা হয়েছিল।
পর্তুগিজ মাল্টি-হোস্ট টিউবারকুলোসিস সিস্টেম থেকে প্রাপ্ত জিনোম ডেটা সেটের আরও গভীর বিশ্লেষণ হল সাহিত্যে উল্লিখিত জিনগুলির পলিমরফিজম পরীক্ষা করা। এই জিনগুলি হল 37,38 এবং HGT (DNA মেরামত, প্রতিলিপি এবং পুনর্মিলন) সিস্টেম উপাদান 39 এর মাধ্যমে MTBC পূর্বপুরুষদের দ্বারা প্রাপ্ত জিন এনকোডিং 3R। জিন বৈচিত্র্য এবং নিউক্লিওটাইড বৈচিত্র্য (π) এবং তাজিমার D নিরপেক্ষ পরীক্ষার প্যারামিটার ইনপুট গণনা করতে ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) এবং DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) ব্যবহার করুন।
৬৯টি মাইকোপ্লাজমা বোভিস আইসোলেট এবং রেফারেন্স জিনোমের উপর ভিত্তি করে একটি সর্বাধিক সম্ভাবনা (ML) ফাইলোজেনেটিক গাছ পাওয়া গেছে (চিত্র 2A)। একক-জিন-ভিত্তিক গাছ বা বহু-লোকাস-ভিত্তিক গাছের তুলনায়, এই কৌশলটি আরও শক্তিশালী গাছের প্রজন্মের অনুমতি দেয় যা সমগ্র জিনোমের পরিবর্তনশীলতা ক্যাপচার করে না এবং তাই 68,69 প্রজাতির মধ্যে পার্থক্য করার ক্ষমতা কম প্রদর্শন করে। ML গাছের টপোলজিক্যাল কাঠামো সাধারণত ক্লোনের জটিল শ্রেণীবিভাগের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। Eu2 এর জিনোম একটি শাখায় ক্লাস্টার করা হয় এবং Af1 এর জিনোমও একসাথে ক্লাস্টার করা হয় (চিত্র 2A)। ফলাফলটি মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের পরিচিত বিবর্তনীয় সম্পর্কের সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ, অর্থাৎ, Eu1 সদস্য এবং অন্যান্য সমস্ত ক্লোনাল কমপ্লেক্স এবং জিনোম নিয়ে গঠিত গোষ্ঠীর মধ্যে একটি বড় পার্থক্য রয়েছে, তবে ক্লোনাল কমপ্লেক্স 30 নির্দিষ্ট করা হয়নি। ক্লোনাল কমপ্লেক্স এবং ফাইলোজেনেটিক ট্রিতে পরিলক্ষিত সম্পর্কের মধ্যে সামান্য অসঙ্গতি ব্যাখ্যা করা যেতে পারে এই সত্য দ্বারা যে ক্লোনাল কমপ্লেক্সটি নির্দিষ্ট জিনোমিক অঞ্চলের উপর ভিত্তি করে বর্ণনা করা হয়েছে, যেখানে ফাইলোজেনেটিক ট্রিটি সমগ্র জিনোমের প্রতিনিধিত্বকারী কোর জিনোমের একাধিক সারিবদ্ধতার উপর ভিত্তি করে।
(A) পুনঃসংযোজন স্থান অপসারণের আগে এবং (B) মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস জিনোমের মূল জিনোম সারিবদ্ধকরণের উপর ভিত্তি করে সর্বাধিক সম্ভাবনা ফাইলোজেনেটিক ট্রি (GTR) তৈরি করা হয়। শাখার রঙগুলি মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস ক্লোন জটিলকে প্রতিনিধিত্ব করে: ইউরোপ 1 বেগুনি, ইউরোপ 2 লাল, ইউরোপ 3 নীল, আফ্রিকা 1 কমলা এবং আফ্রিকা 2 সবুজ। গাছটি মূলযুক্ত এবং স্কেলে টানা হয় এবং প্রতিটি স্থানের প্রতিস্থাপন হিসাবে শাখার দৈর্ঘ্য পরিমাপ করা হয়।
মাইকোব্যাকটেরিয়াম টিউবারকুলোসিস কমপ্লেক্সকে ক্লোনালি বিবর্তিত হিসাবে বর্ণনা করা হয়েছে, এবং বছরের পর বছর ধরে সংগৃহীত বেশিরভাগ প্রমাণ এই ধারণাটিকে সমর্থন করে যে চলমান HGT এবং পুনর্মিলন ঘটনাগুলি MTBC15,17,18 এর সনাক্তযোগ্য স্তরে ঘটবে না।
পূর্ববর্তী কাজ দেখিয়েছে যে MTBC স্ট্রেনের মধ্যে সীমিত পুনঃসমন্বয় থাকতে পারে20,21, যখন অন্যরা পরিমাপযোগ্য পুনঃসমন্বয় ঘটনা সনাক্ত করতে ব্যর্থ হয়েছে70,71। মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের উপর ফোকাস করে এই সমস্যাটি পুনরায় আলোচনা করুন, যা পূর্ববর্তী কাজের থেকে আলাদা যেখানে শুধুমাত্র মাইকোব্যাকটেরিয়াম টিউবারকুলোসিস 70,71 বিবেচনা করা হয়েছিল; অথবা MTBC কে সম্পূর্ণরূপে বিবেচনা করুন, যেখানে প্রায় কোনও M. bovis 20 প্রতিনিধিত্ব করে না; অথবা শুধুমাত্র সীমাবদ্ধ গবাদি পশুর ভগ্নাংশ বিবেচনা করুন। মাইকোব্যাকটেরিয়া ডেটাসেট, এই কাজে, মোট 70 টি স্ট্রেন রয়েছে, যা সমস্ত ক্লোনাল কমপ্লেক্সকে প্রতিনিধিত্ব করে, যা পুনর্সমন্বয়ের জন্য স্ক্রিন করার জন্য ব্যবহৃত হয়। ডেটা সেটটি চারটি ক্রমবর্ধমান স্তর অনুসারে স্কেল করা হয়েছে: (1) Eu2 সদস্য, (2) সমস্ত ইউরোপীয় ক্লোন জটিল সদস্য (অর্থাৎ ইউরোপ), (3) ইউরোপীয় এবং আফ্রিকান ক্লোন জটিল (Eu + Af) এবং (4) সম্পূর্ণ ডেটা সংগ্রহ (জিনোম সহ যা ইতিমধ্যে বর্ণিত কোনও ক্লোন জটিলগুলিতে অন্তর্ভুক্ত নয়)।
এই অনুমানটি আরও অধ্যয়ন করার জন্য, জিনোমের মধ্যে পুনর্মিলন ঘটনার অনুপস্থিতি মূল্যায়ন করার জন্য একটি বিভক্ত-পচন নেটওয়ার্ক সঞ্চালিত হয়েছিল, কারণ এই পদ্ধতিটি ব্যক্তিদের মধ্যে পূর্বপুরুষের সম্পর্ক কল্পনা করতে পারে এবং বিরোধপূর্ণ ফাইলোজেনেটিক সংকেত প্রদর্শন করতে পারে। বিশ্লেষণে চারটি ডেটা সেটই নেটওয়ার্কে লুপের অস্তিত্ব নিশ্চিত করেছে (অর্থাৎ, এমন এলাকা যা একটি একক গাছে একত্রিত হয় না), কিন্তু Phi পরীক্ষার কোনও পরিসংখ্যানগত সমর্থন নেই (Eu2, p = 0.0956; ইউরোপ, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; সম্পূর্ণ ডেটা সেট p = 0.2451), যা পুনর্গঠন ঘটনার অস্তিত্বের জন্য দুর্বল প্রমাণ প্রদান করে (চিত্র 3A-D)।
ইউরোপে ২টি জিনোম (n = ৩৭) (A), ইউরোপীয় জিনোম (n = ৪৪) (B), ইউরোপীয় এবং আফ্রিকান জিনোম (n = ৫১) (C) এবং সম্পূর্ণ ডেটা সেট (n = ৭০) (D)।
এই বিশ্লেষণের পর, এবং সমস্ত নেটওয়ার্কে চক্রীয় পর্যবেক্ষণ বিবেচনা করে, Gubbins পাইপলাইনে বাস্তবায়িত পুনর্গঠন অ্যালগরিদমটি ক্লোনাল বংশ পুনর্গঠন এবং M. bovis জিনোমে পুনর্মিলনের প্রভাবের অনুমানের পরিপূরক হিসাবে প্রয়োগ করা হয়েছিল। পুনর্মিলনের ঘটনাগুলির ক্রমবর্ধমান সংখ্যা অনুমান করুন, যার বেশিরভাগই টার্মিনাল শাখায় (অর্থাৎ, একটি একক জিনোমে) ঘটেছিল (সারণী 2)। এই সূচকগুলি সমগ্র ডেটা সেটের সামঞ্জস্য দেখায় এবং নির্দেশ করে যে পুনর্মিলনের ঘটনাগুলির ফ্রিকোয়েন্সি মিউটেশনের তুলনায় 200 থেকে 300 গুণ বেশি। একবার শাখায় পুনর্মিলন এবং বিন্দু মিউটেশনের আপেক্ষিক হার প্রতিনিধিত্বকারী rho/theta প্যারামিটারটি 0.0037 এবং 0.0056 এর মধ্যে বলে মনে হয় (সারণী 3)। সম্প্রতি, 38 M. bovis স্ট্রেনের প্রকাশিত কাজটি এই ডেটাসেটে প্রাপ্ত মানের তুলনায় উচ্চতর rho/theta মান (rho/theta = 0.1) প্রদর্শন করেছে, কিন্তু Patané এবং তার সহকর্মীদের কাজ পুনর্মিলন পরামিতিগুলি অনুমান করার জন্য রেফারেন্স-ভিত্তিক সমাবেশ ব্যবহার করেছে। সমাবেশ পদ্ধতির কারণে একটি পদ্ধতিগত বিবরণ, টার্মিনাল শাখায় অনুমানমূলক পুনর্মিলন ইভেন্টের প্রাচুর্যের সাথে যুক্ত করা হয়েছে।
এরপর, r/m প্যারামিটারটি পুনর্মিলন এবং মিউটেশন প্রবর্তনের বৈচিত্র্য অনুপাতকে প্রতিনিধিত্ব করে এবং এর গড় মান 0.025 এবং 0.037 এর মধ্যে, যা ইঙ্গিত করে যে মিউটেশনের তুলনায়, পুনর্মিলনের M. bovis (সারণী 3)) এর জিনগত বৈচিত্র্যের উপর সামগ্রিক প্রভাব কম। বিস্তৃত তুলনার জন্য, 23টি জিনোমের সমন্বয়ে গঠিত MTBC ডেটাসেটের জন্য r/m প্যারামিটার অনুমান করার জন্য একটি অনুরূপ পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছিল, যার গড় মান 0.48620 দেখানো হয়েছিল, যেখানে Patané এবং সহকর্মীদের 38টি M. bovis ডেটাসেটের জন্য, এটি প্রমাণিত হয়েছিল যে গড় মান 0.98। প্রথম গবেষণায়, M. bovis (M. bovis BCG এবং রেফারেন্স স্ট্রেন) এর কাজে অন্তর্ভুক্ত 23টি জিনোমের মধ্যে মাত্র দুটি, তাই M. tuberculosis জিনোমের অত্যধিক প্রকাশের কারণে প্রাপ্ত মান পক্ষপাতদুষ্ট হতে পারে। দ্বিতীয় প্রতিবেদনে, বিশ্লেষণ করা মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস জনসংখ্যা মূলত মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র এবং পশুপালন হোস্ট থেকে উদ্ধার করা হয়েছিল। বিপরীতে, আমাদের ডেটা সেটে, আরও ভৌগোলিক অবস্থান এবং হোস্ট প্রজাতি উপস্থাপন করা হয়েছে, এবং বিভিন্ন জনসংখ্যার জেনেটিক বৈশিষ্ট্য সহ বিভিন্ন ক্লোনাল কমপ্লেক্সে বিভক্ত জিনোমগুলিও ব্যবহার করা হয়েছে, এইভাবে আরও গভীর এবং বিস্তৃত জনসংখ্যা জ্ঞান অর্জন করা হয়েছে। আমাদের ডেটা সেটের সাথে প্রাপ্ত পার্থক্য r/m গড় মান এই ধারণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে একই ট্যাক্সোনমিক প্রজাতির জন্য নির্ধারিত বংশের মধ্যে পুনর্মিলনের মাত্রা ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, তাই এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে M. bovis ক্লোন কমপ্লেক্স পুনর্মিলনের পার্থক্য প্রদর্শন করতে পারে। প্রভাবটি Didelot & Maiden72 দ্বারাও প্রস্তাবিত। তবুও, বৃহত্তর সংখ্যক M. bovis জিনোম অন্তর্ভুক্ত করে এই ডেটা সেটটি উল্লেখযোগ্যভাবে প্রসারিত করলে এই বিন্দুটির আরও স্পষ্টীকরণ সম্ভব হবে। r/m এবং rho/theta উভয় পরামিতি শাখাগুলির মধ্যে পরিবর্তনশীলতা দেখায় এবং এই ফলাফল অন্যান্য ব্যাকটেরিয়া প্রজাতির প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ72,73।
অবশেষে, Gubbins পাইপলাইন দ্বারা চিহ্নিত পুনর্গঠন ঘটনাগুলি নিশ্চিত করার জন্য, RDP4 সফ্টওয়্যারে ছয়টি ভিন্ন অ্যালগরিদম ব্যবহার করা হয়েছিল স্বাধীনভাবে বিভিন্ন মূল বহু-তুলনা পরীক্ষা করার জন্য। বিশ্বব্যাপী, Gubbins দ্বারা চিহ্নিত অর্ধেকেরও কম ঘটনা RDP4 দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল (টেবিল 4 এবং 5)। সম্পূর্ণ ডেটা সেট বিবেচনা করে, তিনটি পুনর্মিলন ঘটনা নিশ্চিত করা হয়েছিল, দুটি অভ্যন্তরীণ নোড জড়িত এবং অন্যটি একটি টার্মিনাল শাখায় একটি একক জিনোম জড়িত, যার জন্য ক্লোনাল কমপ্লেক্স নির্ধারণ করা যায়নি (টেবিল 4 এবং 5)। টার্মিনাল শাখাগুলিতে ঘটনাগুলি সনাক্তকরণ ইঙ্গিত দিতে পারে যে সমসাময়িক M. bovis স্ট্রেনে পুনর্মিলন এখনও চলছে অথবা ফলাফলটি ভুল জায়গায় রয়েছে70। এই কাল্পনিক পুনর্মিলন অঞ্চলে, প্রায় 20% অবস্থানে অনির্ধারিত নিউক্লিওটাইড (N) রয়েছে, যার ফলে পুনর্মিলন সংকেত প্রভাবিত হয় (পরিপূরক চিত্র 2)। এছাড়াও, এই অঞ্চলটি rrs জিনকে প্রভাবিত করে, 16S রাইবোসোমাল RNA এনকোড করে যা অত্যন্ত সংরক্ষিত বলে আশা করা হচ্ছে, তাই এই পুটিভেটিভ রিকম্বিনেশন সিগন্যালটি সিকোয়েন্সিং ত্রুটি বা মিসলাইনমেন্টের ফলাফল হতে পারে। তারপর Mb0003 এবং মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস AF2122/97 এর মধ্যে সম্পূর্ণ জিনোম অ্যালাইনমেন্ট করা হয়েছিল, এবং অনির্ধারিত নিউক্লিওটাইড এবং SNP-এর অস্তিত্ব নিশ্চিত করা হয়েছিল, তাই ভুল অ্যালাইনমেন্ট সম্পর্কিত সম্ভাব্য সমস্যাগুলি এই কাজে বাস্তবায়িত জৈবিক তথ্যের কারণে ছিল না। প্রোগ্রামটি শেখার পরে দেখা গেছে।
অভ্যন্তরীণ নোডের পুনঃসংযোগ অঞ্চলে কোনও ফাঁক বা অনির্ধারিত নিউক্লিওটাইড পাওয়া যায়নি (চিত্র 4 এবং 5)। এই ঘটনাগুলির ক্ষেত্রে, একটিতে কেবল Eu2 জিনোম রয়েছে এবং pks12 জিনকে প্রভাবিত করে, যা একটি সম্ভাব্য পলিকেটাইড সিন্থেস এনকোড করে; অন্যটি Eu1 জিনোমে নিবন্ধিত এবং সম্ভাব্য নাইট্রেট রিডাক্টেস এনকোড করে এমন narX জিনকে প্রভাবিত করে (সারণী 4)। সাধারণভাবে, পুনঃসংযোগ বিশ্লেষণ দেখায় যে পরিসংখ্যানগত সহায়তা সহ সীমিত সংখ্যক পুনঃসংযোগ খণ্ড রয়েছে এবং অনুমানিত সূচকগুলি নির্দেশ করে যে পুনঃসংযোগ M. bovis বংশের উপর কম প্রভাব ফেলে। পুনঃসংযোগ সংকেত কম হবে বলে আশা করা হচ্ছে, তবে পটভূমির শব্দ থেকে প্রকৃত বিবর্তন সংকেতকে আলাদা করা গুরুত্বপূর্ণ, যা একটি চ্যালেঞ্জিং কাজ। রেফারেন্স-ভিত্তিক সমাবেশ এবং অমিল সমস্যা 70, 71 দ্বারা প্রবর্তিত শব্দ সংকেত কমাতে, সম্পূর্ণ জিনোম ছাড়া বাকি সমস্ত কিছুই স্ক্র্যাচ থেকে একত্রিত করা হয়েছিল এবং QUAST পাইপলাইন বিশ্লেষণ (পরিপূরক সারণী 1) দ্বারা সমাবেশের গুণমান পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং নিশ্চিত করা হয়েছিল। এছাড়াও, সামগ্রিক জরিপের দৃঢ়তা এবং নির্ভুলতা প্রদানের জন্য একাধিক পরিপূরক বিশ্লেষণ পরিচালিত হয়েছিল। অতএব, মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস AF2122/97 এর বিপরীতে রিড ম্যাপিং দ্বারা narX এবং pks12 জিনের সিকোয়েন্সিং গুণমান মূল্যায়ন করা হয়েছিল। পদ্ধতি বিভাগে উল্লিখিত মানদণ্ড (কমপক্ষে 20টি রিডিং এবং 0.9 পরিবর্তন ফ্রিকোয়েন্সি) প্রয়োগ করে পুনর্মিলন অঞ্চলে প্রস্তাবিত SNP অবস্থান নিশ্চিত করা হয়েছিল। দুটি জিনোম (Mb1792361 এবং Mb7240415; 2.3%) এবং pks12 জিনোমের জিনোমে: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, এবং Mb12 জিনে narX জিনের পলিমরফিজম সম্পূর্ণরূপে নিশ্চিত করা হয়েছিল। তবে, Mb2043 জিনোমের জন্য, আটটি অবস্থানের মধ্যে ছয়টি পজিশন রিড ডেপথের মানদণ্ড পূরণ করে না কারণ SNP সর্বাধিক 17 টি রিড দ্বারা সমর্থিত, যা 20 এর প্রতিষ্ঠিত কাটঅফ মানের নিচে। অতএব, এই জিনোম সাইটে ছয়টি জিনোমের (8.6%) পুনর্মিলন নিশ্চিত করা যেতে পারে (চিত্র 4 এবং 5)।
মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস ডেটাসেটের পুনঃসংযোজন অঞ্চলের সারিবদ্ধকরণের বিস্তারিত ভিজ্যুয়ালাইজেশন সম্ভাব্য নাইট্রেট রিডাক্টেস এনকোডকারী narX জিনকে প্রভাবিত করে। অভ্যন্তরীণ নোডের পুনঃসংযোজন অঞ্চলে কোনও ফাঁক বা অনির্ধারিত নিউক্লিওটাইড পাওয়া যায়নি। এই বিশেষ ঘটনাটি Eu1 জিনোমে নিবন্ধিত। মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস AF2122/97 এর পাঠ প্লট করে narX জিনের সিকোয়েন্সিং গুণমান মূল্যায়ন করা হয়েছিল। পদ্ধতি বিভাগে উল্লিখিত মানদণ্ড প্রয়োগ করে (কমপক্ষে 20 টি পাঠ এবং 0.9 পরিবর্তন ফ্রিকোয়েন্সি) পুনর্সংযোজন অঞ্চলে প্রস্তাবিত SNP অবস্থান নিশ্চিত করুন। Mb1792361 এবং Mb7240415 (2.3%) এর জিনোমে narX জিনের পলিমরফিজম সম্পূর্ণরূপে নিশ্চিত করা হয়েছিল।
মাইকোপ্লাজমা বোভিস ডেটাসেটের pks12 জিনকে প্রভাবিত করে এমন পুনঃসংযোগ অঞ্চলের সারিবদ্ধকরণের বিশদ দৃশ্যায়ন। অভ্যন্তরীণ নোডের পুনঃসংযোগ অঞ্চলে কোনও ফাঁক বা অনির্ধারিত নিউক্লিওটাইড পাওয়া যায়নি। সম্ভাব্য পলিকেটাইড সিন্থেস এনকোডিং করে pks12 জিনকে প্রভাবিত করার ঘটনা সম্পর্কে, এতে কেবল Eu2 জিনোম রয়েছে। মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিস AF2122/97 এর রিড ম্যাপিং দ্বারা pks12 এর সিকোয়েন্সিং গুণমান মূল্যায়ন করা হয়েছিল। পদ্ধতি বিভাগে উল্লিখিত মানদণ্ড প্রয়োগ করে পুনঃসংযোগ অঞ্চলে প্রস্তাবিত SNP অবস্থান নিশ্চিত করুন (কমপক্ষে 20 টি রিডিং এবং 0.9 পরিবর্তন ফ্রিকোয়েন্সি)। Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 এবং Mb1960 জিনোমের পলিমরফিজম সম্পূর্ণরূপে নিশ্চিত করা হয়েছে।
PE এবং PPE জিনের পুনরাবৃত্তিমূলক অঞ্চল থাকে যা Illumina sequence এবং mismapping দ্বারা সহজেই ভুলভাবে পড়া যায়, তাই সাধারণত ম্যাপিং-টু-সিকোয়েন্স কৌশল ব্যবহার করার সময় M. tuberculosis সদস্যদের জৈব তথ্যপ্রযুক্তি কর্মপ্রবাহ থেকে এগুলি মুছে ফেলা হয়। এই কাজে প্রয়োগ করা পুনঃসংযোগ ইভেন্টগুলির অনুমান PE/PPE ফিল্টার না করেই de novo সমাবেশের উপর ভিত্তি করে। আমরা বিশ্বাস করি যে SplitsTree, Gubbins পাইপলাইন এবং RDP4 সফ্টওয়্যারের মাধ্যমে তিনটি ভিন্ন পরিপূরক পদ্ধতি এবং অ্যালগরিদম বাস্তবায়নের মাধ্যমে, প্রয়োগ করা কৌশলগুলি ত্রুটি সংকেত দ্বারা সৃষ্ট পুনর্গঠিত অঞ্চলগুলিকে প্রক্রিয়াকরণ এবং ফিল্টার করার জন্য শক্তিশালী। যাইহোক, SNP ক্লাস্টার সনাক্ত করার জন্য Gubbins এবং RDP4 সফ্টওয়্যারে PE/PPE জিনের হস্তক্ষেপ বাদ দেওয়ার জন্য, এবং সেইজন্য narX এবং pks12 জিনকে প্রভাবিত করার জন্য প্রস্তাবিত পুনঃসংযোগ অঞ্চলগুলির সনাক্তকরণ, এই জিনগুলির আশেপাশের এলাকা পরীক্ষা করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 3-5)। M. bovis AF2122/97-এ, narX জিনটি narK2 এবং Mb1764c দ্বারা পৃথক করা হয়েছে, যেখানে pks12 Mb2075c এবং Mb2073c দ্বারা বেষ্টিত (পরিপূরক চিত্র 3-5)। সম্পূর্ণ জিনোমের MAUVE সিঙ্কলাইন মানচিত্র ব্যবহার করে তৈরি করা মানচিত্রটি জিন সিকোয়েন্স সংরক্ষণ এবং পুনর্বিন্যাস সম্পর্কে তথ্য প্রদান করে, চারটি সমরৈখিক ব্লক দেখায় এবং জিনোম ট্রান্সলোকেশন বা ইনভার্সনের কোনও লক্ষণ দেখায় না। এছাড়াও, অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্সের সাথে পরিপূরক বিশ্লেষণ সমস্ত সম্পূর্ণ জিনোমের হোমোলজি প্রমাণ করে এবং narX বা pks12-এর সংলগ্ন অঞ্চলে কোনও PE/PPE পাওয়া যায়নি। narX-এর জন্য, একটি জিনোমের (Mb0030) সমার্থক স্কোর কম কারণ narX জিন দুটি খণ্ড হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল (খণ্ড 1891 এবং 1890)। pks12 এর ক্ষেত্রে, মিলের কারণে, Mb0030 এবং Mb003 কম সিঙ্কলিনিয়ারিটি স্কোর প্রদর্শন করেছে, যেখানে pks12 যথাক্রমে দুটি এবং তিনটি খণ্ডে সনাক্ত করা হয়েছে, যা প্রোটিনের বিভিন্ন ডোমেনের প্রতিনিধিত্ব করে (পরিপূরক চিত্র 3-5)। এই তথ্য বিবেচনায় নিয়ে, এবং Gubbins এবং RDP4 সফ্টওয়্যার উভয়ই বিশ্লেষণ করে, উইন্ডোতে সর্বাধিক 500 bp এর কোর মাল্টিপল অ্যালাইনমেন্ট পরীক্ষা করে, আমরা নিশ্চিত করেছি যে PE/PPE জিনটি narX এবং pks12 কে প্রভাবিত করে এমন পুনঃসংযোগ সংকেতে হস্তক্ষেপ করবে না।
যদিও এই ডেটা সেটে সনাক্ত হওয়া পুনঃসংযোগ সংকেতগুলিকে অবশিষ্ট হিসাবে বিবেচনা করা যেতে পারে, তবে এটি সত্য যে এম. বোভিসে পুনঃসংযোগের সম্ভাবনা উড়িয়ে দেওয়া যায় না, তাই এটি আরও বিশ্লেষণের বিষয় হওয়া উচিত, যেখানে বিভিন্ন মহামারী সংক্রান্ত পরিস্থিতি থেকে সম্পূর্ণ জিনোমগুলিকে গুরুত্বপূর্ণ হিসাবে ক্রমানুসারে সাজানো হয়।
পুনর্মিলন সংশোধনের আগে এবং পরে প্রাপ্ত ML ফাইলোজেনেটিক গাছের তুলনা করলে (চিত্র 2A, B) অনুমানিত ফাইলোজেনেটিক সম্পর্কের ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন আসেনি, এবং M. bovis স্ট্রেনগুলি একই গোষ্ঠীতে ক্লাস্টার করা হয়েছিল।
M. bovis AF2122/97 এর রেফারেন্স জিনোমের সাথে 42 টি নতুন সিকোয়েন্সড M. bovis রিড ম্যাপ করার পর, 1816 টি পলিমরফিক অবস্থান সম্বলিত একটি SNP অ্যালাইনমেন্ট পাওয়া গেছে। বেশিরভাগ SNP (87.1%) কোডিং অঞ্চলে অবস্থিত, এবং প্রভাবিত জিনগুলি Bovilist (চিত্র 6A, B) এ দেখানো কার্যকরী বিভাগ অনুসারে চিহ্নিত করা হয়েছে। প্রতিটি কার্যকরী বিভাগে মোট জিনের সংখ্যা বিবেচনা করে, "লিপিড বিপাক" বিভাগের জিনগুলি আরও SNP দেখিয়েছে, তারপরে "কোষ প্রাচীর এবং কোষ প্রক্রিয়া" এবং "মধ্যবর্তী বিপাক এবং শ্বসন" রয়েছে, যা প্রকাশ করে যে তারা M. bovis বিবর্তনে রয়েছে।
পর্তুগাল থেকে প্রাপ্ত এম. বোভিস ডেটাসেটের শ্রেণিবিন্যাস বিশ্লেষণ (n = 42)। প্রতিটি কার্যকরী বিভাগের (A) জন্য নিবন্ধিত SNP এবং প্রভাবিত জিনের মোট সংখ্যা। ফাংশন বিভাগ (B) দ্বারা নিবন্ধিত সমার্থক এবং অ-সমার্থক পরিবর্তনের মোট সংখ্যা।
বিশ্বব্যাপী, গড় dN/dS অনুপাত 1.5 এর চেয়ে ভালো, যা নির্দেশ করে যে বিশ্বব্যাপী বিবর্তনীয় চাপ হল পূর্বপুরুষের অবস্থা থেকে মুক্তি পাওয়ার জন্য এবং এটি একটি ইতিবাচক (বৈচিত্র্যপূর্ণ বা নির্দেশিত) এবং/অথবা শিথিল পরিশোধন পছন্দের দৃশ্যকল্পের প্রতিনিধিত্ব করে। "ভাইরুলেন্স, ডিটক্সিফিকেশন, অভিযোজন", "সন্নিবেশ ক্রম এবং ফেজ", এবং "নিয়ন্ত্রক প্রোটিন" বিভাগে, দুই-তৃতীয়াংশেরও বেশি SNP অ-সমার্থক (চিত্র 6B)।
সকল শ্রেণীতেই, একাধিক SNP সহ জিন রয়েছে, যার ফলে গড় মিউটেশন হার (অর্থাৎ, প্রতি জিনের গড় SNP) 1 এর বেশি (চিত্র 6A)। 15 SNP সহ Pks12 (Mb2074c) এবং 8 SNP সহ fas (Mb2553c) এর মিউটেশন মান বেশি। এই দুটি জিনই ফ্যাটি অ্যাসিড বিপাকের সাথে জড়িত। pks জিন পলিকেটাইড সিন্থেস (PKS) এনকোড করে, যা মাইকোব্যাকটেরিয়াল কোষ প্রাচীর লিপিড জৈব সংশ্লেষণে জড়িত একটি বহুমুখী এনজাইম74,75। এই জিনটি একটি বহুমুখী পলিপেপটাইড এনকোড করে যা মাইকোকেটাইডস74,76 এর সংশ্লেষণে জড়িত। fas জিন মাইকোলিক অ্যাসিডের সংশ্লেষণে জড়িত। এই দুটি জিনই হোস্টের সংস্পর্শে কোষ প্রাচীরের জৈব সংশ্লেষণে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে।
মাইকোব্যাকটেরিয়াম বোভিসের বিবর্তন আরও অধ্যয়ন করার জন্য, নির্দিষ্ট জিনের দুটি সেট বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। পূর্বে প্রকাশিত রচনাগুলি সিকোয়েন্স কম্পোজিশন এবং ফাইলোজেনেটিক পদ্ধতি ব্যবহার করে জিনগুলি সনাক্ত করেছে যা MTBC পূর্বপুরুষদের দ্বারা বৈচিত্র্যকরণের আগে HGT এর মাধ্যমে অর্জিত হয়েছিল37,38। এই জিনগুলি পরিপূরক সারণি 2-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। HGT-এর সাথে সম্পর্কিত হতে পারে এমন মোট 77টি জিনের SNP বিতরণ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং 26টি পলিমরফিক সাইট সনাক্ত করা হয়েছিল, যার ফলে বেশিরভাগ ক্ষেত্রে (78%) অ-সমার্থক (NS) পরিবর্তন ঘটে (পরিপূরক সারণি 2)। MTBC জিনোমে পূর্ববর্তী কাজ দেখিয়েছে যে পুনঃসংযোগকারী HGT অঞ্চলটি জিনোমের বাকি অংশের তুলনায় উচ্চতর NS SNP অনুপাত প্রদর্শন করে। যদি কেউ মনে করে যে এই পুনর্মিলন অঞ্চলগুলি MTBC পূর্বপুরুষদের দ্বারা অর্জিত হয়েছিল, এবং তাই, তারা প্রাচীন পলিমরফিজমকে বেশি প্রতিনিধিত্ব করে, তাহলে সমার্থক পরিবর্তনের অনুপাত বেশি হবে বলে আশা করা হচ্ছে, কারণ NS প্রতিস্থাপনগুলি অ্যামিনো অ্যাসিড পরিবর্তনের কারণে নেতিবাচক নির্বাচনের মাধ্যমে নির্মূল হওয়ার আশা করা হচ্ছে প্রোটিনের কার্যকারিতা পরিবর্তন করতে পারে। অতএব, আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে কার্যকরী পরিণতিগুলি HGT-সদৃশ জিনের প্রতিস্থাপনের ফলে হতে পারে, যা মূল্যবান অভিযোজিত জিনগত বৈচিত্র্যের জন্য তাদের গুরুত্ব প্রতিফলিত করে।
এই বিশ্লেষণের সমান্তরালে, 3R (DNA মেরামত, প্রতিলিপি এবং পুনর্মিলন) সিস্টেমের উপাদানগুলিকে এনকোড করা জিনগুলি ডস ভল্টোস এবং সহযোগীদের (2008) দ্বারা পূর্বে প্রকাশিত তালিকা অনুসারে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে পরীক্ষা করা হয়েছিল। অভিন্ন DNA খণ্ডগুলির বিনিময় সরাসরি পর্যবেক্ষণ করা যায় না, যদিও এটি একটি ঘন ঘন প্রক্রিয়া হতে পারে যখন ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত ব্যাকটেরিয়া জড়িত থাকে, যেমন এই ডেটা সেটের ক্ষেত্রে; উপরন্তু, এই প্রক্রিয়াটি DNA মেরামত পদ্ধতির মূল চাবিকাঠি হতে পারে72, তাই সমজাতীয় পুনর্মিলনে ভূমিকা পালন করুন। 54টি জিন দ্বারা বিতরণ করা মোট 26টি পলিমরফিক অবস্থান চিহ্নিত করা হয়েছিল (পরিপূরক সারণী 3)। জিনের এই সেটে, NS পরিবর্তনগুলি পরিণতির প্রায় 65% জন্য দায়ী, যা মাইকোব্যাকটেরিয়াম টিউবারকুলোসিস স্ট্রেন সম্পর্কিত পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।