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Il sequenziamento del genoma ha rivitalizzato il campo della ricerca sulle malattie infettive, svelandone l'epidemiologia, la patogenesi, le interazioni ospite-patogeno e il processo evolutivo imposto ai patogeni. Il complesso Mycobacterium tuberculosis (MTBC) considera Mycobacterium bovis uno dei suoi membri adattativi animali che causano la tubercolosi (TB) nei mammiferi terrestri, ed è un modello tipico dell'evoluzione batterica. Come altri membri del MTBC, si presume che Mycobacterium bovis sia un patogeno strettamente clonato e a lenta evoluzione, e non vi è ovviamente alcun segno di ricombinazione o trasferimento genico orizzontale. In questo lavoro, applichiamo la genomica comparativa a un set di dati di sequenza del genoma intero (WGS) composto da 70 M. bovini di diverse genealogie (Europa e Africa) per ottenere informazioni sulla diversità genetica del potere evolutivo di M. bovini. Tre diversi metodi vengono utilizzati per stimare i segni di riorganizzazione. A livello globale, un numero limitato di eventi di ricombinazione è stato identificato e confermato da due metodi indipendenti con solide basi. Tuttavia, rispetto alle mutazioni, la ricombinazione ha un effetto più debole sulla diversità di M. bovis (r/m complessivo = 0,037). La differenza r/m media ottenuta nel complesso clonale di Mycobacterium bovis nel nostro set di dati è coerente con il concetto generale secondo cui il grado di ricombinazione può variare notevolmente tra i lignaggi assegnati alla stessa specie tassonomica. Sulla base di questo lavoro, la ricombinazione in Mycobacterium bovis non può essere esclusa, pertanto dovrebbe essere oggetto di ulteriori studi nella futura ricerca di genomica comparativa, in cui l'analisi di dati di grandi dimensioni (WGS) da diversi scenari epidemiologici in tutto il mondo è cruciale. È stata quindi eseguita un'ulteriore analisi sul set di dati più piccolo di Mycobacterium bovis (n = 42) dalla prevalenza di TB multi-ospite, e sono stati identificati più di 1.800 loci, di cui almeno un ceppo ha mostrato un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP). La maggior parte (87,1%) si trova nella regione codificante e il rapporto globale di cambiamenti non sinonimi (dN/dS) di cambiamenti sinonimi supera 1,5, indicando che la selezione positiva è un'importante forza evolutiva esercitata su M. bovis. Una proporzione maggiore di SNP è stata rilevata in geni ricchi di categorie funzionali di "metabolismo lipidico", "parete cellulare e processi cellulari" e "metabolismo intermedio e respirazione", rivelando il loro potenziale nella biologia e nell'evoluzione di Mycobacterium bovis. Uno sguardo più attento ai geni negli antenati MTBC che sono inclini al trasferimento genico orizzontale e inclusi nel sistema 3R (riparazione, replicazione e ricombinazione del DNA) rivela il valore negativo medio globale del test D neutro di Taijima, che indica una scansione selettiva passata. Il recente collo di bottiglia dopo l'espansione della popolazione è ancora il principale fattore evolutivo trainante per il patogeno obbligatorio Mycobacterium bovis per combattere l'ospite.
Il complesso Mycobacterium tuberculosis (MTBC) è uno dei taxa di patogeni batterici di maggior successo e un tipico caso di evoluzione batterica. I suoi membri mostrano un'identità nucleotidica sorprendentemente elevata a livello genomico (> 99%)1,2. Diversi ecotipi di MTBC possono causare la tubercolosi (TB), una malattia granulomatosa infettiva, in un'ampia gamma di specie ospiti, dai micromammiferi all'uomo3,4,5. Attualmente, il complesso comprende l'uomo [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] e patogeni adattati agli animali (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" e "dassie")5,6. M. canettii (noto anche come "Nodobacter glabrata") L'identità nucleotidica media con i micobatteri sopra menzionati è del 98% e il lavoro di genomica comparativa ha dimostrato che M. canettii e il resto dell'MTBC si sono recentemente allontanati dall'antenato comune.7 Considerando questo concetto, alcuni autori chiamano M. canettii membro dell'MTBC 8.
MTBC è sistematicamente descritto come un complesso clonale stretto e la sua struttura di popolazione è chiaramente governata da ridotta diversità, colli di bottiglia, scansione selettiva e deriva genetica9,10. Presupponendo che un'evoluzione clonale stretta complessa, come la mancanza di polimorfismi, non possa essere ripristinata tramite ricombinazione. Sulla base di questa premessa, gli eventi consecutivi della delezione genomica della regione differenziale (RD) e di TbD1 (regione di delezione 1 specifica per Mtb) sono stati proposti come marcatori molecolari dell'evoluzione MTBC2,5,11. Il lavoro di genomica comparativa e di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) supporta la suddivisione dei membri adattati all'uomo in nove linee evolutive (Mycobacterium tuberculosis L1-L4, L7 e L8; e Mycobacterium africanum L5, L6 e L9), le linee evolutive da L2 a L4 condividono la regione di delezione TbD12,11,12,13. Inoltre, si propone che i membri adattati agli animali condividano un antenato comune, definito dalle delezioni specifiche dei cladi in RD7, RD8, RD9 e RD102, 5 e 14.
Gli eventi di trasferimento genico orizzontale (HGT) e di ricombinazione sono considerati rari e si verificano negli antenati del MTBC, piuttosto che nella diversa storia dell'intero membro del MTBC15,16,17. Due primi rapporti di Hughes e collaboratori (2002) e Gutacker e collaboratori (2006) hanno suggerito che gli eventi di ricombinazione possono contribuire a modellare i polimorfismi che contrassegnano loci specifici nei ceppi di M. tuberculosis18,19. Le ragioni dell'evidente mancanza di ricombinazione nel MTBC sono: (1) il processo meccanico e la perdita di capacità dell'HGT; (2) la rarità degli eventi HGT; (3) non vi è alcuna possibilità di eventi di ricombinazione nella nicchia del MTBC14,17. Di recente, alcuni studi di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) applicati al ceppo MTBC 20 e al Mycobacterium bovis 21 hanno fornito prove di ricombinazione, le prime a dimostrare che i ceppi MTBC spesso scambiano piccoli frammenti di DNA, ma a causa della limitata variazione della sequenza nucleotidica, questi eventi non vengono ancora notati.
Mycobacterium bovis è il membro MTBC più comunemente isolato dal bestiame (principalmente bovini), sebbene possa essere isolato anche da animali selvatici allevati all'aperto e in recinti4,22,23,24. M. bovis si è evoluto in cinque principali complessi clonali [Europeo 1 (Eu1), Europeo 2 (Eu2), Europeo 3 (Eu3), Africano 1 (Af1) e Africa 2 (Af2)], secondo il profilo di spoligotipizzazione, delezioni specifiche e polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 in geni specifici. Questi complessi clonali dimostrano la diversa struttura della popolazione di Mycobacterium bovis e la sua associazione con le regioni geografiche. Inoltre, il recente lavoro WGS condotto da Zimpel e collaboratori (2020) ha progettato una filogenesi basata sullo SNP di Mycobacterium bovis, con oltre 1.900 genomi, indicando che esistono almeno quattro diversi lignaggi (denominati da Lb1 a Lb1 a Lb4), non completamente coerenti con il complesso clonale precedentemente definito, sebbene possa essere confermata anche la specificità geografica30. Questi autori hanno eseguito analisi differenziali della filogenesi e datazione molecolare, ma non hanno studiato la ricombinazione30.
Precedenti lavori condotti utilizzando diverse tecniche molecolari, come lo spoligotyping, il MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) e la recente tipizzazione SNP, hanno rivelato un certo livello di diversità genetica tra i ceppi di M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. La differenziazione della variazione genetica è diventata uno strumento importante nello studio dell'epidemiologia delle malattie, utile per una comprensione approfondita della patogenesi, della virulenza e della trasmissione delle malattie. L'emergere del metodo WGS offre la possibilità di rivelare i fattori evolutivi determinanti imposti dal genoma di Mycobacterium bovis nel processo di adattamento e persistenza a diversi ospiti e scenari epidemiologici.
In questo lavoro, utilizziamo l'analisi genomica comparativa su vari set di dati di Mycoplasma bovis (n=70), inclusi isolati da diversi complessi clonali, per ottenere informazioni sul processo evolutivo di Mycoplasma bovis, in particolare per risolvere le relazioni filogenetiche e gli eventi di ricombinazione. Come supplemento a questa analisi, è stato ulteriormente esplorato un sottoinsieme di dati di isolati di M. bovis (n = 42) ottenuti da un'area tubercolare multi-ospite ben caratterizzata in Portogallo 31,36 per dedurre la non identità. L'equilibrio tra il rapporto relativo tra sostituzioni nucleotidiche senso (dN) e sinonime (dS), così come il contributo evolutivo di genomi specifici menzionati in letteratura, sono 37,38 ottenuti dagli antenati MTBC tramite HGT e codificano componenti geniche del sistema 3R (riparazione, replicazione e ricombinazione del DNA) 39. Scegliere i geni ottenuti tramite HGT perché potrebbero rappresentare polimorfismi antichi, quindi ci si aspetta che possano contenere una proporzione maggiore di cambiamenti sinonimi. I geni inclusi nel sistema 3R sono stati selezionati perché precedenti lavori su ceppi di M. tuberculosis indicavano selezioni negative/di purificazione generali che agiscono su questi geni e che potrebbero svolgere un ruolo importante nell'evoluzione 39. Un altro obiettivo di questo lavoro è dedurre l'esistenza di eventi di riorganizzazione. Per questo motivo, considerando che il nostro set di dati dal Portogallo contiene solo i genomi del complesso clone europeo 2 e i ceppi a cui non è stato assegnato il complesso clone, abbiamo deciso di includere dati genomici disponibili al pubblico per ottenere finalmente un campione rappresentativo di tutti i complessi clone e migliorare la robustezza e l'ampiezza dei risultati.
Al centro di questo lavoro vi sono 42 genomi di Mycoplasma bovis recentemente sequenziati provenienti dalla tubercolosi multiospite endemica portoghese (dettagli di seguito), precedentemente caratterizzati da una prospettiva epidemiologica36. Considerando che il set di dati portoghese include solo i rappresentanti dei complessi di cloni europei 2 e ceppi senza complessi designati, sono stati aggiunti dati di sequenziamento dell'intero genoma disponibili al pubblico per espandere il set di dati che include tutti i rappresentanti dei complessi di cloni di M. bovis. Pertanto, in questo lavoro sono state utilizzate tre fonti di dati di sequenziamento dell'intero genoma: assemblaggio completo/bozza del genoma, fino a 10 scaffold archiviati nell'NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 isolati); archiviati nell'SRA (il file Illumina fastq dell'archivio di lettura delle sequenze) che rappresenta la complessa diversità dei cloni di M. bovis (n = 12 isolati)30; e 42 genomi recentemente sequenziati dal Portogallo. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) è stato escluso dalla ricerca NCBI. M. bovis AF2122/97 viene solitamente utilizzato come genoma di riferimento da includere nel set di dati. A causa dell'indisponibilità pubblica dell'intera sequenza genomica rappresentata dal complesso di clonazione African 1 e del numero limitato di genomi provenienti da ceppi rappresentativi di Af2 ed Eu1, in questi casi sono stati utilizzati i dati di sequenziamento originali forniti da SRA. Il lavoro di Zimpel e dei suoi collaboratori (2020) ha contribuito a identificare il genoma del suddetto complesso di clonazione e a selezionare Mycobacterium bovis per l'inclusione nel set di dati. Per Eu3, è descritto un solo tipo di genoma (Branger et al., 2020), quindi il genoma che includiamo è un rappresentante separato del complesso Eu3.
A livello globale, questo set di dati include 70 ceppi bovini di M. bovis isolati da 8 specie ospiti, distribuiti in 12 paesi dal 1985 al 2016. 36 specie sono designate come Eu2, 7 specie sono Eu1, 1 specie è Eu3, 3 specie sono Af1, 4 specie sono Af2 e 19 non sono attribuibili ad alcun complesso clonale (dettagli di seguito). Le informazioni dettagliate (incluso il numero di accesso) di Mycobacterium bovis utilizzate in questo studio sono riportate nella Tabella 1 e nella Tabella supplementare 1.
Al centro di questo studio sono 42 genomi interi di Mycobacterium bovis, recentemente sequenziati, provenienti dai focolai di tubercolosi animale del Portogallo e distribuiti da oltre 12 anni, poiché i potenziali sistemi di malattie tra animali selvatici e bestiame sono stati regolarmente monitorati 31,36 (Figura 1 supplementare). Secondo procedure successive, questi ceppi sono stati isolati da bovini (n = 14), cervi (n = 16) e cinghiali (n = 12) dal 2003 al 2015: raccogliere e maneggiare gli animali in conformità con le linee guida del protocollo raccomandato. I campioni di tessuto sono presenti nel Manuale degli animali terrestri dell'OIE e vengono inoculati su terreno solido e liquido al piruvato di Stonebrink e Löwenstein-Jensen. Le colture vengono incubate a 37 °C e la crescita viene controllata una volta alla settimana per almeno 12 settimane. Le colonie vengono conservate direttamente in una soluzione di glicerolo a -80 °C. Nel terreno selettivo per Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), i campioni originali archiviati sono stati sottoposti a un singolo passaggio in vitro per ottenere il DNA del programma WGS. A tal fine, la soluzione madre di coltura congelata è stata arricchita con il 5% di piruvato di sodio e il 10% di ADS (50 g di albumina, 20 g di glucosio, 8,5 g di cloruro di sodio in 1 L di acqua) su Middlebrook 7H9 a 37 °C Retrain. Dopo 4 settimane di crescita, il terreno è stato rinnovato e la coltura è stata monitorata regolarmente fino all'osservazione della crescita. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione, il pellet è stato risospeso in 500 µL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), riscaldato a 99 °C per 30 minuti, centrifugato e il surnatante è stato conservato a -20 °C fino al WGS. Tutte le procedure vengono eseguite in strutture di biosicurezza di livello 3.
La libreria genomica paired-end WGS viene preparata utilizzando l'indice univoco di ciascun campione di DNA e utilizza la tecnologia Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 campioni) e HiSeq (2 × 150 pb) (due isolati) (Eurofins Genomics, Germania) per il sequenziamento. Secondo le istruzioni del produttore, utilizzare l'Illumina Genome Analyzer con modulo a doppia estremità per sequenziare il DNA genomico e il Nextera XT DNA Library Prep Kit di Illumina per costruire la libreria.
Considerando i dati recuperati dall'SRA (n = 12), l'identificazione del complesso clone può essere utilizzata come metadati della pubblicazione corrispondente 30, 41, 43. Considerando il genoma completo, ad eccezione di Mycobacterium bovis AF2122/97 e Mycobacterium bovis 3601, che sono membri riconosciuti del complesso clonale Eu1 ed Eu3 25, 29, rispettivamente, esso è identico al genoma completo di Mycobacterium tuberculosis H37Rv (numero di accesso NCBI NC_000962.3). L'allineamento del genoma viene eseguito utilizzando MAFFT (programma di allineamento multiplo di sequenze aminoacidiche o nucleotidiche, versione 7.458) e il parametro -addfragments48. Quindi, si ricerca l'assenza di diversi complessi clonali e/o la presenza di caratteristiche SNP.
Il Mycobacterium bovis appena sequenziato (n = 42) e le letture originali della bozza del genoma assemblato (n = 3) allineano il complesso con il genoma di riferimento Mycobacterium tuberculosis H37Rv attraverso la pipeline vSNP e la presenza di delezione e/o caratteristiche SNP di diversi cloni. È stata condotta una ricerca.
Raccogliere informazioni dall'assenza di caratteristiche e/o dalla presenza/assenza di SNP e profili di spoligotipizzazione per assegnare i dati genomici al complesso clonale corrispondente. Per i quattro assemblaggi in bozza, il profilo di spoligotipizzazione non può essere dedotto, quindi sono inclusi nel gruppo "nessuna complessità".
Il flusso di lavoro bioinformatico seguito da questo lavoro inizia dall'assemblaggio de novo e dalla mappatura secondo una strategia di riferimento, con l'obiettivo di esplorare eventi di ricombinazione e specifici polimorfismi del genoma. La Figura 1 fornisce un diagramma di flusso dei passaggi seguiti. Per l'analisi di ricombinazione, vengono utilizzati tutti i genomi per aumentare la robustezza delle inferenze e degli indicatori correlati.
Per ridurre gli errori nella generazione di sequenze consenso del genoma, abbiamo prima ottenuto l'assemblaggio de novo e poi gli allineamenti multipli principali. La pipeline Unicycler è attualmente disponibile all'indirizzo https://github.com/rrwick/Unicycler49 e viene utilizzata per eseguire l'assemblaggio de novo di 54 genomi sequenziati (42 file di nuova sequenza e 12 file fastq recuperati da SRA). In breve, prima dell'assemblaggio da zero, è stata eseguita un'analisi della qualità della lettura in FastQC versione 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) e Trimmomatic versione 0.36 (sono applicate le opzioni "tagliare gli adattatori e altre sequenze specifiche dell'illuminazione dalle letture" e "tagliare le basi dalla fine della lettura, se inferiori alla soglia di qualità di 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Quindi, è stato utilizzato SPAdes optimizer49 per l'assemblaggio del genoma e Pilon versione 1.1851 per l'ottimizzazione post-assemblaggio. È stata selezionata una modalità di bridging conservativa per evitare un assemblaggio errato e la dimensione del k-mero è stata ricercata e selezionata tra il 20% e il 95% della lunghezza della lettura. Seguire le linee guida SPAdes e considerare la dimensione della lettura, eliminare i contig più piccoli di 300 bp e stabilire un cutoff di copertura della profondità di lettura di 20 pari a 52. Nella strategia di assemblaggio de novo, le regioni genomiche come i paraloghi altamente ripetitivi prolina-glutammato (PE) e prolina-prolina glutammato (PPE) non sono state rimosse.
La qualità dell'assemblaggio de novo viene valutata tramite la pipeline QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), che facilita il rinnovo del contig e la mappatura del genoma di riferimento M. bovis AF2122/97 (numero di accesso NCBI LT708304.1) (vedere la Tabella supplementare 1 per i parametri di qualità).
Con l'ausilio della pipeline vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), il file FASTQ del genoma di M. bovis appena sequenziato tramite Illumina viene confrontato con il genoma di riferimento AF2122/97 di M. bovis (LT708304.1). In base alle raccomandazioni di best practice del Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, applicare parametri di filtro standard o punteggi di massa delle varianti per la ricalibrazione. I risultati vengono filtrati utilizzando il punteggio di massa SAMtools più basso, pari a 150, e AC = 2. È inoltre possibile utilizzare Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) per verificare le letture ed escludere contaminazioni. La pipeline vSNP utilizzata per la mappatura delle strategie di sequenziamento nel nostro lavoro esamina una serie di SNP e target definiti, escludendo anche scenari di infezione mista. La copertura del genoma letto è superiore al 99% (Tabella supplementare 1).
Per evitare errori di mappatura e SNP errati, filtrare una variante nei seguenti casi: (1) è supportata da meno di 20 letture, (2) è presente con una frequenza inferiore a 0,9, (3) è presente in almeno un ceppo, ma presenta lacune in almeno un altro ceppo. L'Integrated Genomics Viewer (IGV) versione 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 è stato utilizzato per verificare visivamente gli SNP e le posizioni con problemi di mappatura o allineamento. Poiché i geni prolina-glutammato (PE) e prolina-prolina glutammato (PPE) sono altamente duplicati e fanno parte di una famiglia multigenica, vengono facilmente fraintesi dal sequenziamento Illumina e dalla mappatura errata, quindi sono preferiti. Il flusso di lavoro bioinformatico micobatterico ha rimosso i membri del complesso tubercolare quando si utilizza la strategia di mappatura in sequenza per confermare gli SNP. Pertanto, abbiamo filtrato i geni PE/PPE e gli indel dall'analisi.
Secondo Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), tutti gli SNP sono suddivisi in categorie funzionali. La pipeline SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) viene utilizzata per dedurre le conseguenze degli SNP (cambiamenti sinonimi o non sinonimi). È stato creato un nuovo database del genoma AF2122/97 di Mycobacterium bovis (LT708304.1).
L'allineamento multiplo del genoma principale è stato eseguito utilizzando Parsnp v1.2, attualmente disponibile all'indirizzo https://github.com/marbl/parsnp57, utilizzando 69 genomi completi/assemblaggi di bozze (con opzione -c) e M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) come riferimento. Sono stati eseguiti quattro allineamenti multipli principali: solo i membri del complesso di clonazione Eu2 (n = 37), inclusi tutti i membri del complesso di clonazione europeo (n = 44), incluso il punto di giunzione del complesso di clonazione europeo e africano (n = 51), e inclusi tutti i Mycobacterium bovis in questo studio (n = 70).
L'allineamento del core generato da Parsnp viene utilizzato per dedurre l'albero filogenetico di massima verosimiglianza (ML) utilizzando CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 utilizzando RAxML ed eseguire 1000 repliche guidate.
Per verificare la presenza di eventi di ricombinazione in parallelo vengono utilizzati tre diversi algoritmi e strumenti bioinformatici: il software SplitsTree4, la pipeline Gubbins (lineage imparziale tramite ricombinazione in sequenze nucleotidiche) e il software RDP4 (programma di rilevamento della ricombinazione, versione beta 4.101).
Il metodo di decomposizione split implementato in SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 viene utilizzato per calcolare la rete filogenetica rootless, utilizzando il test Phi per la verifica statistica e la soglia di significatività è p = 0,05. L'analisi multi-allineamento core di Parsnp viene utilizzata come input e la decomposizione split come standard di rete viene implementata.
La pipeline Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 viene eseguita con parametri predefiniti come altro modo per valutare l'impatto della ricombinazione su Mycobacterium bovis. L'algoritmo implementato nella pipeline ricostruisce la linea di cloni pertinente. L'assemblaggio completo del genoma/bozza del nostro set di dati e il genoma di riferimento (bovino AF2122/97, LT708304.1) sono reciprocamente; ed esegue la scansione della posizione dell'SNP su ciascun ramo dell'albero per rilevare il cluster SNP che rappresenta l'evento di ricombinazione. Lo zero del ramo Si presuppone che non vi sia alcun evento di ricombinazione, il che significa che gli SNP che si verificano sul ramo dovrebbero essere distribuiti uniformemente. L'allineamento multiplo di base da Parsnp e l'albero ML con il punteggio migliore da RAxML vengono utilizzati come file di input.
Infine, per confermare l'evento di riorganizzazione suggerito dalla pipeline di Gubbins, i sei algoritmi implementati in RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 e SiScan66) vengono applicati all'allineamento multiplo core di Parsnp con le impostazioni predefinite. Abbiamo determinato che almeno tre degli algoritmi implementati in RDP4 devono dimostrare costantemente un segnale importante per verificare ogni evento di ricombinazione.
Considerando che sia Gubbins che il software RDP cercano segnali di ricombinazione controllando gli allineamenti multipli del core in una finestra fino a 500 bp e confermando che l'inclusione dei geni PE/PPE durante l'assemblaggio de novo non interferirà con i segnali di ricombinazione trovati, un'ulteriore analisi viene eseguita tramite il controllo di omolinearità in prossimità del gene che identifica l'evento di ricombinazione. La mappa sinlineare utilizzando il genoma completo è stata costruita utilizzando l'allineamento multi-genomico MAUVE (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) per escludere traslocazioni o inversioni genomiche locali. Inoltre, l'intero genoma è stato utilizzato per eseguire l'analisi di omolinearità sulla sequenza amminoacidica tramite il server web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Un'analisi più approfondita del set di dati genomici ottenuti dal sistema multi-ospite portoghese per la tubercolosi consiste nel verificare il polimorfismo dei geni menzionati in letteratura. Questi geni sono 37, 38 e il gene che codifica per 3R ottenuto dagli antenati MTBC attraverso i componenti del sistema HGT (riparazione, replicazione e ricombinazione del DNA) 39. Utilizzare ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) e DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) per calcolare la diversità genica e la diversità nucleotidica (π) e l'input del parametro del test D neutro di Tajima.
È stato ottenuto un albero filogenetico di massima verosimiglianza (ML) basato su 69 isolati di Mycoplasma bovis e genomi di riferimento (Figura 2A). Rispetto agli alberi basati su singoli geni o alberi basati su più locus, questa strategia consente la generazione di alberi più potenti che non catturano la variabilità dell'intero genoma e quindi mostrano una minore capacità di discriminare tra le specie 68,69. La struttura topologica dell'albero ML è solitamente coerente con la complessa classificazione dei cloni. Il genoma di Eu2 è raggruppato in un ramo e anche il genoma di Af1 è raggruppato insieme (Figura 2A). Il risultato è anche coerente con la nota relazione evolutiva di Mycobacterium bovis, ovvero esiste una grande differenza tra il membro Eu1 e il gruppo costituito da tutti gli altri complessi clonali e genomi, ma il complesso clonale 30 non è specificato. La piccola incoerenza tra il complesso clonale e la relazione osservata sull'albero filogenetico può essere spiegata dal fatto che il complesso clonale è descritto in base a regioni genomiche specifiche, mentre l'albero filogenetico si basa su allineamenti multipli di genomi principali che rappresentano l'intero genoma.
L'albero filogenetico di massima verosimiglianza (GTR) è costruito sulla base dell'allineamento del genoma centrale di Mycobacterium bovis prima (A) e dopo (B) la rimozione del sito di ricombinazione. I colori dei rami rappresentano il complesso clone di Mycobacterium bovis: Europa 1 è viola, Europa 2 è rosso, Europa 3 è blu, Africa 1 è arancione e Africa 2 è verde. L'albero è radicato e disegnato in scala, e la lunghezza dei rami è misurata come sostituzione per ciascun sito.
Il complesso Mycobacterium tuberculosis è descritto come evoluto clonalmente e la maggior parte delle prove accumulate nel corso degli anni supporta l'idea che gli eventi di HGT e di ricombinazione in corso non si verificheranno al livello rilevabile di MTBC15,17,18.
Lavori precedenti hanno dimostrato che potrebbe esserci una ricombinazione limitata tra i ceppi MTBC20,21, mentre altri non sono riusciti a identificare eventi di ricombinazione misurabili70,71. Ridiscutere questo problema concentrandosi su Mycobacterium bovis, che è diverso dal lavoro precedente che considerava solo Mycobacterium tuberculosis70,71; o considerare MTBC nel suo complesso, con quasi nessun M. bovis che rappresenta 20; o considerare solo frazioni bovine restrittive. Il set di dati sui micobatteri, in questo lavoro, comprende un totale di 70 ceppi, che rappresentano tutti i complessi clonali, utilizzati per lo screening della ricombinazione. Il set di dati è scalato secondo quattro livelli cumulativi: (1) membri Eu2, (2) tutti i membri del complesso clone europeo (ovvero Europa), (3) complesso clone europeo e africano (Eu + Af) e (4) l'intera raccolta di dati (inclusi i genomi che non sono inclusi in alcun complesso di clonazione già descritto).
Per approfondire questa ipotesi, è stata eseguita una rete di split-decomposition per valutare l'assenza di eventi di ricombinazione tra genomi, poiché questo metodo può visualizzare la relazione ancestrale tra individui e mostrare segnali filogenetici contrastanti. Tutti e quattro i set di dati nell'analisi hanno confermato l'esistenza di loop nella rete (ovvero aree che non convergono in un singolo albero), ma il test Phi non ha alcun supporto statistico (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; l'intero set di dati p = 0,2451), il che fornisce una scarsa evidenza dell'esistenza di eventi di riorganizzazione (Figure 3A-D).
In Europa 2 genomi (n = 37) (A), genomi europei (n = 44) (B), genomi europei e africani (n = 51) (C) e l'intero set di dati (n = 70) (D).
Dopo questa analisi, e tenendo conto delle osservazioni cicliche in tutte le reti, l'algoritmo di ricostruzione implementato nella pipeline Gubbins è stato applicato per ricostruire il lignaggio clonale e per integrare la stima dell'effetto della ricombinazione sul genoma di M. bovis. Si deduce il numero cumulativo di eventi di ricombinazione, la maggior parte dei quali si è verificata in rami terminali (ovvero, in un singolo genoma) (Tabella 2). Questi indicatori mostrano la coerenza dell'intero set di dati e indicano che la frequenza degli eventi di ricombinazione è da 200 a 300 volte superiore a quella delle mutazioni. Una volta che il parametro rho/theta che rappresenta i tassi relativi di ricombinazione e mutazioni puntiformi sul ramo sembra essere compreso tra 0,0037 e 0,0056 (Tabella 3). Di recente, il lavoro pubblicato sul ceppo 38 M. bovis ha dimostrato un valore rho/theta più elevato (rho/theta = 0,1) rispetto a quello ottenuto in questo set di dati, ma il lavoro di Patané e colleghi ha utilizzato l'assemblaggio basato su riferimenti per dedurre i parametri di ricombinazione. Un dettaglio procedurale, dovuto alla procedura di assemblaggio, è stato associato all'abbondanza di presunti eventi di ricombinazione nel ramo terminale.
Successivamente, il parametro r/m rappresenta il rapporto di diversità tra ricombinazione e introduzione di mutazioni, e il suo valore medio è compreso tra 0,025 e 0,037, indicando che, rispetto alle mutazioni, la ricombinazione ha un impatto complessivo inferiore sulla diversità genetica di M. bovis (Tabella 3). Per un confronto più approfondito, un metodo simile è stato utilizzato per stimare il parametro r/m per il dataset MTBC composto da 23 genomi, mostrando un valore medio di 0,48620, mentre per il dataset di 38 M. bovis di Patané e colleghi, il valore medio è risultato essere 0,98. Nel primo studio, solo due dei 23 genomi inclusi nel lavoro di M. bovis (M. bovis BCG e il ceppo di riferimento), quindi il valore ottenuto potrebbe essere distorto a causa della sovraespressione del genoma di M. tuberculosis. Nel secondo rapporto, le popolazioni di Mycobacterium bovis analizzate sono state recuperate principalmente dagli Stati Uniti e da ospiti di bestiame. Al contrario, nel nostro set di dati sono rappresentate più località geografiche e specie ospiti, e vengono utilizzati anche genomi raggruppati in diversi complessi clonali con diverse caratteristiche genetiche di popolazione, ottenendo così una conoscenza della popolazione più approfondita e ampia. Il valore medio della differenza r/m ottenuto con il nostro set di dati è coerente con il concetto che il grado di ricombinazione varia notevolmente tra i lignaggi assegnati alla stessa specie tassonomica, quindi questi risultati indicano che il complesso clone di M. bovis può presentare differenze di ricombinazione. L'impatto è anche quello suggerito da Didelot e Maiden72. Tuttavia, un'espansione significativa di questo set di dati includendo un numero maggiore di genomi di M. bovis consentirà di chiarire ulteriormente questo punto. Sia i parametri r/m che rho/theta mostrano variabilità tra i rami, e questo risultato è coerente con i rapporti su altre specie batteriche72,73.
Infine, al fine di confermare gli eventi di riorganizzazione identificati dalla pipeline di Gubbins, sono stati utilizzati sei diversi algoritmi nel software RDP4 per testare in modo indipendente diversi multi-confronti core. Globalmente, meno della metà degli eventi identificati da Gubbins sono stati confermati da RDP4 (Tabelle 4 e 5). Considerando l'intero set di dati, sono stati confermati tre eventi di ricombinazione, due dei quali coinvolgevano nodi interni e l'altro coinvolgeva un singolo genoma in un ramo terminale, per il quale non è stato possibile assegnare complessi clonali (Tabelle 4 e 5). L'identificazione di eventi nei rami terminali potrebbe indicare che la ricombinazione è ancora in corso nei ceppi contemporanei di M. bovis o che il risultato è errato70. In questa ipotetica regione di ricombinazione, circa il 20% delle posizioni presenta nucleotidi (N) indefiniti, influenzando così il segnale di ricombinazione (Figura supplementare 2). Inoltre, questa regione influenza il gene rrs, che codifica per l'RNA ribosomiale 16S che si prevede sia altamente conservato, quindi questo presunto segnale di ricombinazione potrebbe essere il risultato di errori di sequenziamento o disallineamento. È stato quindi eseguito l'allineamento dell'intero genoma tra Mb0003 e Mycobacterium bovis AF2122/97, ed è stata confermata l'esistenza di nucleotidi e SNP indefiniti, quindi i possibili problemi relativi all'allineamento errato non erano dovuti alle informazioni biologiche implementate in questo lavoro emerse dopo l'apprendimento del programma.
Non sono stati trovati gap o nucleotidi indefiniti nelle regioni di ricombinazione dei nodi interni (Figure 4 e 5). Per quanto riguarda questi eventi, uno contiene solo il genoma Eu2 e colpisce il gene pks12, che codifica una possibile polichetide sintasi; mentre l'altro è registrato nel genoma Eu1 e colpisce il gene narX che codifica una possibile nitrato reduttasi (Tabella 4). In generale, l'analisi della ricombinazione mostra che esiste un numero limitato di frammenti di ricombinazione con supporto statistico e gli indicatori dedotti indicano che la ricombinazione ha un basso impatto sul lignaggio di M. bovis. Ci si aspetta che il segnale di ricombinazione sia basso, ma è importante distinguere il vero segnale evolutivo dal rumore di fondo, il che è un compito impegnativo. Al fine di ridurre il rumore introdotto dai problemi di assemblaggio e mismatch basati su riferimenti 70, 71, tutto il resto, ad eccezione del genoma completo, è stato assemblato da zero e la qualità dell'assemblaggio è stata verificata e garantita dall'analisi della pipeline QUAST (Tabella supplementare 1). Inoltre, è stata condotta una serie di analisi supplementari per garantire la robustezza e l'accuratezza dell'indagine complessiva. Pertanto, la qualità del sequenziamento dei geni narX e pks12 è stata valutata mediante la mappatura delle letture contro Mycobacterium bovis AF2122/97. La posizione SNP raccomandata nella regione di ricombinazione è stata confermata applicando i criteri menzionati nella sezione del metodo (almeno 20 letture e 0,9 frequenza di variazione). Il polimorfismo del gene narX è stato pienamente confermato nei due genomi (Mb1792361 e Mb7240415; 2,3%) e nei genomi del genoma pks12: geni Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 e Mb12. Tuttavia, per il genoma Mb2043, sei delle otto posizioni non soddisfano il criterio di profondità di lettura poiché l'SNP è supportato da un massimo di 17 letture, che è al di sotto del valore di cutoff stabilito di 20. Pertanto, la ricombinazione di sei genomi (8,6%) in questo sito genomico può essere confermata (Figure 4 e 5).
La visualizzazione dettagliata dell'allineamento della regione di ricombinazione del dataset di Mycobacterium bovis influenza il gene narX che codifica una possibile nitrato reduttasi. Non sono state trovate lacune o nucleotidi indefiniti nella regione di ricombinazione dei nodi interni. Questo particolare evento è registrato nel genoma Eu1. La qualità del sequenziamento del gene narX è stata valutata tracciando le letture di Mycobacterium bovis AF2122/97. Confermare la posizione SNP raccomandata nell'area di ricombinazione applicando i criteri menzionati nella sezione del metodo (almeno 20 letture e frequenza di variazione pari a 0,9). Il polimorfismo del gene narX è stato pienamente confermato nei genomi di Mb1792361 e Mb7240415 (2,3%).
Visualizzazione dettagliata dell'allineamento della regione di ricombinazione del dataset di Mycoplasma bovis che interessa il gene pks12. Non sono stati trovati gap o nucleotidi indefiniti nella regione di ricombinazione dei nodi interni. Per quanto riguarda l'evento che interessa il gene pks12 che codifica per una possibile polichetide sintasi, contiene solo il genoma Eu2. La qualità del sequenziamento di pks12 è stata valutata mediante la mappatura delle letture di Mycobacterium bovis AF2122/97. Confermare la posizione SNP raccomandata nell'area di ricombinazione applicando i criteri menzionati nella sezione del metodo (almeno 20 letture e frequenza di variazione pari a 0,9). I polimorfismi dei genomi Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 e Mb1960 sono stati pienamente confermati.
I geni PE e PPE presentano regioni ripetitive che vengono facilmente interpretate in modo errato dal sequenziamento Illumina e dal mismapping, pertanto vengono solitamente eliminati dal flusso di lavoro bioinformatico dei membri di M. tuberculosis solo quando si utilizza la strategia di mappatura-sequenziamento. L'inferenza degli eventi di ricombinazione applicata in questo lavoro si basa sull'assemblaggio de novo senza filtraggio di PE/PPE. Riteniamo che implementando tre diversi metodi e algoritmi complementari tramite SplitsTree, la pipeline Gubbins e il software RDP4, le strategie applicate siano robuste nell'elaborazione e nel filtraggio delle regioni riorganizzate causate da segnali di errore. Tuttavia, al fine di escludere l'interferenza del gene PE/PPE sui software Gubbins e RDP4 per l'identificazione dei cluster SNP, e quindi l'identificazione delle regioni di ricombinazione che si ritiene influenzino i geni narX e pks12, è stato esaminato il vicinato di questi geni (Figura supplementare 3–5). In M. bovis AF2122/97, il gene narX è separato da narK2 e Mb1764c, mentre pks12 è circondato da Mb2075c e Mb2073c (Figura supplementare 3-5). La mappa generata utilizzando la mappa sinlinea MAUVE del genoma completo fornisce informazioni sulla conservazione e il riarrangiamento della sequenza genica, mostrando quattro blocchi collineari e nessun segno di traslocazione o inversione genomica. Inoltre, l'analisi di complementazione con la sequenza amminoacidica ha dimostrato l'omologia in tutti i genomi completi e non è stata trovata alcuna PE/PPE nelle regioni adiacenti di narX o pks12. Per narX, un genoma (Mb0030) ha un punteggio di sinonimia inferiore perché il gene narX è stato identificato come due frammenti (frammenti 1891 e 1890). Per pks12, a causa delle somiglianze, Mb0030 e Mb003 hanno mostrato punteggi di sinlinearità inferiori, mentre pks12 è stato identificato rispettivamente in due e tre frammenti, rappresentanti domini diversi della proteina (Figura supplementare 3-5). Tenendo conto di queste informazioni e dell'analisi eseguita dai software Gubbins e RDP4, controllando l'allineamento multiplo del core delle massime 500 bp nella finestra, abbiamo confermato che il gene PE/PPE non interferirà con il segnale di ricombinazione che interessa narX e pks12.
Sebbene i segnali di ricombinazione rilevati in questo set di dati possano essere considerati residui, è vero che la ricombinazione in M. bovis non può essere esclusa, quindi dovrebbe continuare a essere oggetto di ulteriori analisi, in cui interi genomi provenienti da diversi scenari epidemiologici vengono sequenziati in Important.
Il confronto degli alberi filogenetici ML ottenuti prima e dopo la correzione della ricombinazione (Figura 2A, B) non ha portato a cambiamenti significativi nella relazione filogenetica dedotta e i ceppi di M. bovis sono stati raggruppati nello stesso gruppo.
Dopo aver mappato 42 nuove read di M. bovis sequenziate con il genoma di riferimento di M. bovis AF2122/97, è stato ottenuto un allineamento di SNP contenente 1816 posizioni polimorfiche. La maggior parte degli SNP (87,1%) si trova nella regione codificante e i geni interessati sono caratterizzati secondo le categorie funzionali mostrate in Bovilist (Figure 6A, B). Considerando il numero totale di geni in ciascuna categoria funzionale, i geni nella categoria "metabolismo lipidico" hanno mostrato più SNP, seguiti da "parete cellulare e processi cellulari" e "metabolismo intermedio e respirazione", rivelando che rientrano nell'evoluzione di M. bovis.
Analisi gerarchica del dataset di M. bovis dal Portogallo (n = 42). Numero totale di SNP registrati e geni interessati per ciascuna categoria funzionale (A). Numero totale di cambiamenti sinonimi e non sinonimi registrati per categoria funzionale (B).
Su scala globale, il rapporto medio dN/dS è superiore a 1,5, il che indica che la pressione evolutiva globale è volta a liberarsi dello stato ancestrale e rappresenta uno scenario di scelta di purificazione positivo (diversificato o diretto) e/o rilassato. Nelle categorie di "virulenza, detossificazione, adattamento", "sequenze di inserimento e fagi" e "proteine regolatrici", oltre due terzi degli SNP sono non sinonimi (Figura 6B).
In tutte le categorie sono presenti geni con più SNP, con conseguente tasso di mutazione medio (ovvero, il numero medio di SNP per gene) superiore a 1 (Figura 6A). Pks12 (Mb2074c) con 15 SNP e fas (Mb2553c) con 8 SNP presentano valori di mutazione più elevati. Entrambi questi geni sono coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi. Il gene pks codifica per la polichetide sintasi (PKS), un enzima multifunzionale coinvolto nella biosintesi lipidica della parete cellulare micobatterica74,75. Questo gene codifica un polipeptide multifunzionale coinvolto nella sintesi dei micochetidi74,76. Il gene fas è coinvolto nella sintesi dell'acido micolico. Entrambi questi geni svolgono un ruolo importante nella biosintesi della parete cellulare a contatto con l'ospite.
Per approfondire lo studio dell'evoluzione di Mycobacterium bovis, sono stati analizzati due set di geni specifici. Lavori pubblicati in precedenza, utilizzando metodi di composizione di sequenza e filogenetici, hanno identificato geni acquisiti dagli antenati dell'MTBC attraverso l'HGT prima della diversificazione37,38. Questi geni sono elencati nella Tabella Supplementare 2. È stata analizzata la distribuzione degli SNP di un totale di 77 geni potenzialmente correlati all'HGT e sono stati identificati 26 siti polimorfici, che nella maggior parte dei casi (78%) hanno determinato cambiamenti non sinonimi (NS) (Tabella Supplementare 2). Precedenti lavori sul genoma dell'MTBC hanno dimostrato che la presunta regione HGT presenta un rapporto SNP NS più elevato rispetto al resto del genoma. Se si pensa che queste regioni di ricombinazione siano state acquisite dagli antenati MTBC e, pertanto, rappresentino in modo eccessivo i polimorfismi antichi, ci si aspetta che la proporzione di cambiamenti sinonimi sia maggiore, poiché si prevede che le sostituzioni NS vengano eliminate dalla selezione negativa a causa di cambiamenti aminoacidici che possono modificare la funzione della proteina. Pertanto, i nostri risultati indicano che le conseguenze funzionali potrebbero derivare dalla sostituzione di geni simili a HGT, il che riflette la loro importanza per una preziosa diversità genetica adattativa.
Parallelamente a questa analisi, i geni che codificano i componenti del sistema 3R (riparazione, replicazione e ricombinazione del DNA) sono stati esaminati a fondo in conformità con l'elenco precedentemente pubblicato da dos Vultos e collaboratori (2008)39. Lo scambio di frammenti di DNA identici non può essere osservato direttamente, sebbene possa essere un processo frequente quando sono coinvolti batteri strettamente correlati, come nel caso di questo set di dati; inoltre, questo processo potrebbe essere la chiave dei metodi di riparazione del DNA72, quindi svolgere un ruolo nella ricombinazione omologa. Sono state identificate un totale di 26 posizioni polimorfiche distribuite da 54 geni (Tabella supplementare 3). In questo set di geni, le modifiche NS hanno rappresentato circa il 65% delle conseguenze, il che è coerente con precedenti rapporti sui ceppi di Mycobacterium tuberculosis.
Data di pubblicazione: 21-10-2021