Дзякуй за наведванне сайта Nature. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць больш новую версію браўзера (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Адначасова, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайты без стыляў і JavaScript.
Секвенаванне геному аднавіла галіну даследаванняў інфекцыйных захворванняў, раскрыўшы эпідэміялогію хвароб, патагенез, узаемадзеянне гаспадара і патагена, а таксама эвалюцыйны працэс, які накладваецца на патагены. Комплекс Mycobacterium tuberculosis (MTBC) разглядае Mycobacterium bovis як аднаго са сваіх адаптыўных членаў, якія выклікаюць туберкулёз (ТБ) у наземных млекакормячых, і з'яўляецца тыповай мадэллю бактэрыяльнай эвалюцыі. Як і іншыя члены MTBC, Mycobacterium bovis лічыцца строга кланаваным, павольна эвалюцыянуючым патагенам, і відавочна няма прыкмет рэкамбінацыі або гарызантальнага пераносу генаў. У гэтай працы мы ўжываем параўнальную геноміку да набору дадзеных поўнай паслядоўнасці геному (WGS), які складаецца з 70 асобін буйной рагатай жывёлы M. з розных радаводаў (Еўропа і Афрыка), каб атрымаць уяўленне аб генетычнай разнастайнасці M. буйной рагатай жывёлы. Эвалюцыйная сіла. Для ацэнкі прыкмет рэарганізацыі выкарыстоўваюцца тры розныя метады. У глабальным маштабе невялікая колькасць падзей рэкамбінацыі была выяўлена і пацверджана двума незалежнымі метадамі з надзейнай падтрымкай. Тым не менш, у параўнанні з мутацыямі, рэкамбінацыя мае слабейшы ўплыў на разнастайнасць M. bovis (агульны r/m = 0,037). Сярэдняе значэнне розніцы r/m, атрыманае ў клональным комплексе Mycobacterium bovis у нашым наборы дадзеных, адпавядае агульнай канцэпцыі, што ступень рэкамбінацыі можа значна адрознівацца паміж лініямі, аднесенымі да аднаго таксанамічнага віду. Зыходзячы з гэтай працы, рэкамбінацыю ў Mycobacterium bovis нельга выключаць, таму яна павінна стаць прадметам далейшых намаганняў у будучых параўнальных геномных даследаваннях, у якіх крытычна важнае значэнне мае паўторны аналіз вялікіх набораў дадзеных з розных эпідэміялагічных сцэнарыяў па ўсім свеце. Затым быў праведзены дадатковы аналіз меншага набору дадзеных Mycobacterium bovis (n = 42) па распаўсюджанасці туберкулёзу ў розных гаспадароў, і было выяўлена больш за 1800 локусаў, з якіх прынамсі адзін штам паказаў аднануклеатыдны палімарфізм (SNP). Большасць (87,1%) размешчаны ў кадуючай вобласці, а глабальнае суадносіны несінанімічных змен (dN/dS) сінонімічных змен перавышае 1,5, што сведчыць аб тым, што станоўчы адбор з'яўляецца важнай эвалюцыйнай сілай, якая дзейнічае на M. bovis. Больш высокая доля SNP была выяўлена ў генах, багатых функцыянальнымі катэгорыямі "метабалізм ліпідаў", "клеткавая сценка і клетачныя працэсы" і "прамежкавы метабалізм і дыханне", што сведчыць аб іх патэнцыяле ў біялогіі і эвалюцыі Mycobacterium bovis. Больш уважлівы погляд на гены ў продкаў MTBC, схільных да гарызантальнага пераносу генаў і ўключаных у сістэму 3R (рэпарацыя, рэплікацыя і рэкамбінацыя ДНК), паказвае глабальнае сярэднесусветнае адмоўнае значэнне D-нейтральнага тэсту Тайдзімы, што сведчыць аб мінулым селектыўным сканаванні. Нядаўняе вузкае месца пасля пашырэння папуляцыі па-ранейшаму з'яўляецца асноўным эвалюцыйным рухаючым фактарам для абавязковага патагена Mycobacterium bovis у барацьбе з гаспадаром.
Комплекс Mycobacterium tuberculosis (MTBC) — адзін з найбольш паспяховых таксонаў бактэрыяльных патагенаў і тыповы выпадак бактэрыяльнай эвалюцыі. Яго прадстаўнікі дэманструюць дзіўна высокую нуклеатыдную ідэнтычнасць на геномным узроўні (> 99%)1,2. Розныя экатыпы MTBC могуць выклікаць туберкулёз (ТБ), які з'яўляецца інфекцыйным гранулематозным захворваннем, у шырокага дыяпазону відаў гаспадароў, ад мікрамлекакормячых да чалавека3,4,5. У цяперашні час комплекс уключае людзей [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] і адаптаваныя да жывёл патагены (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, «Bacillus chimpanzee» і «dassie»)5,6. M. canettii (таксама вядомая як «Nodobacter glabrata»). Сярэдняя нуклеатыдная ідэнтычнасць з вышэйзгаданымі мікабактэрыямі складае 98%, і параўнальныя геномныя даследаванні паказалі, што M. canettii і астатнія MTBC нядаўна адышлі ад агульнага продка.7 Улічваючы гэтую канцэпцыю, некаторыя аўтары называюць M. canettii членам MTBC 8.
МТБК сістэматычна апісваецца як строгі клональны комплекс, і яго папуляцыйная структура відавочна вызначаецца зніжанай разнастайнасцю, вузкімі месцамі, селектыўным сканаваннем і генетычным дрэйфам9,10. Калі выказаць здагадку, што складаная строгая клональная эвалюцыя, такая як адсутныя палімарфізмы, не можа быць адноўлена шляхам рэкамбінацыі. Зыходзячы з гэтай перадумовы, паслядоўныя падзеі геномнай дэлецыі дыферэнцыяльнай вобласці (RD) і TbD1 (спецыфічная для Mtb вобласць дэлецыі 1) былі прапанаваны ў якасці малекулярных маркераў эвалюцыі МТБК2,5,11. Параўнальная геноміка і секвенаванне ўсяго геному (WGS) пацвярджаюць падзел адаптаваных да чалавека членаў на дзевяць ліній (Mycobacterium tuberculosis L1-L4, L7 і L8; і Mycobacterium africanum L5, L6 і L9), лініі L2-L4 маюць агульную дэлецыю TbD1 вобласці2,11,12,13. Акрамя таго, мяркуецца, што адаптаваныя да жывёл прадстаўнікі маюць агульнага продка, які вызначаецца спецыфічнымі для кладаў дэлецыямі ў RD7, RD8, RD9 і RD102, 5 і 14.
Гарызантальны перанос генаў (ГПГ) і рэкамбінацыя лічацца рэдкімі і адбываюцца ў продкаў МТБК, а не ўлічваюць розную гісторыю ўсяго члена МТБК15,16,17. Дзве раннія працы Х'юза і яго супрацоўнікаў (2002) і Гутакера і яго супрацоўнікаў (2006) выказалі здагадку, што рэкамбінацыя можа дапамагчы сфарміраваць палімарфізмы, якія пазначаюць пэўныя локусы ў штамах M. tuberculosis18,19. Прычыны відавочнай адсутнасці рэкамбінацыі ў МТБК: (1) механічны працэс і страта здольнасці да ГПГ; (2) рэдкасць падзей ГПГ; (3) адсутнасць верагоднасці рэкамбінацыі ў нішы МТБК14,17. Нядаўна некаторыя даследаванні поўнагеномнага секвенавання (ПГС), якія прымяняліся да штама МТБК 20 і Mycobacterium bovis 21, далі доказы рэкамбінацыі, упершыню паказалі, што штамы МТБК часта абменьваюцца невялікімі фрагментамі ДНК, але з-за абмежаванай варыятыўнасці нуклеатыднай паслядоўнасці гэтыя падзеі да гэтага часу не заўважаныя.
Mycobacterium bovis з'яўляецца найбольш часта вылучаемым прадстаўніком MTBC з хатняй жывёлы (у асноўным буйной рагатай жывёлы), хоць яго таксама можна вылучыць з дзікіх жывёл на вольным выгуле і ў агароджаных дзікіх жывёл4,22,23,24. M. bovis эвалюцыянаваў у пяць асноўных клональных комплексаў [еўрапейскі 1 (Eu1), еўрапейскі 2 (Eu2), еўрапейскі 3 (Eu3), афрыканскі 1 (Af1) і афрыканскі 2 (Af2)], згодна з профілем спалігатыпавання, спецыфічнымі дэлецыямі і аднануклеатыднымі палімарфізмамі (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 у пэўных генах. Гэтыя клональныя комплексы дэманструюць разнастайную структуру папуляцыі Mycobacterium bovis і яе сувязь з геаграфічнымі рэгіёнамі. Акрамя таго, нядаўняя праца WGS, праведзеная Цымпелем і яго калегамі (2020), распрацавала філагенію на аснове SNP Mycobacterium bovis з больш чым 1900 геномамі, што сведчыць аб існаванні як мінімум чатырох розных ліній (названых ад Lb1 да Lb1 да Lb4), якія не цалкам адпавядаюць раней вызначанаму клональнаму комплексу, хоць геаграфічная спецыфічнасць таксама можа быць пацверджана30. Гэтыя аўтары правялі дыферэнцыяльны аналіз філагеніі і малекулярнае датаванне, але не вывучалі рэкамбінацыю30.
Папярэднія працы з выкарыстаннем розных малекулярных метадаў, такіх як спалігатыпаванне, MIRU-VNTR (мікабактэрыяльная перамежаная паўторная адзінка - зменная тандэмная колькасць паўтораў) і нядаўняе SNP-тыпаванне выявілі пэўны ўзровень генетычнай разнастайнасці сярод штамаў M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Дыферэнцыяцыя генетычнай зменлівасці стала важным інструментам у вывучэнні эпідэміялогіі захворванняў, што дапамагае для глыбокага разумення патагенезу, вірулентнасці і перадачы хваробы. З'яўленне метаду WGS дае магчымасць выявіць эвалюцыйныя рухаючыя фактары, накладзеныя геномам Mycobacterium bovis у працэсе адаптацыі і персістенцыі да розных гаспадароў і эпідэміялагічных сцэнарыяў.
У гэтай працы мы выкарыстоўваем параўнальны геномны аналіз розных набораў дадзеных Mycoplasma bovis (n = 70), уключаючы ізаляты з розных клональных комплексаў, каб атрымаць уяўленне аб эвалюцыйным працэсе Mycoplasma bovis, асабліва для вызначэння філагенетычных сувязяў і падзей рэкамбінацыі. У якасці дадатку да гэтага аналізу быў дадаткова даследаваны паднабор ізалятаў M. bovis (n = 42), атрыманых з добра характарызаванага шматгаспадарчага туберкулёзнага рэгіёна ў Партугаліі31,36, каб высветліць неідэнтычнасць. Баланс паміж адносным суадносінамі сэнсавых (dN) і сінонімічных (dS) нуклеатыдных замен, а таксама эвалюцыйны ўклад канкрэтных геномаў, згаданых у літаратуры,37,38 атрыманы продкамі MTBC праз HGT і кадуюць кампаненты генаў сістэмы 3R (рэпарацыя, рэплікацыя і рэкамбінацыя ДНК)39. Выбіраем гены, атрыманыя праз HGT, таму што яны могуць прадстаўляць старажытныя палімарфізмы, таму чакаецца, што яны могуць утрымліваць большую долю сінонімічных змен. Гены, уключаныя ў сістэму 3R, былі выбраны таму, што папярэднія працы са штамамі M. tuberculosis паказалі агульныя негатыўныя/ачышчальныя адборы, якія працуюць на гэтых генах, і яны могуць гуляць важную ролю ў эвалюцыі 39. Яшчэ адна мэта гэтай працы — вывесці наяўнасць падзей рэарганізацыі. Па гэтай прычыне, улічваючы, што наш набор дадзеных з Партугаліі змяшчае толькі геномы еўрапейскага клонавага комплексу 2 і штамаў, якім не прызначаны клонавы комплекс, мы вырашылі ўключыць агульнадаступныя геномныя дадзеныя, каб нарэшце атрымаць прадстаўніка ўсіх клонавых комплексаў і палепшыць надзейнасць і шырыню вынікаў.
У цэнтры гэтай працы знаходзяцца 42 нядаўна секвенаваныя геномы Mycoplasma bovis з партугальскай эндэмічнай сцэны шматгаспадарчага туберкулёзу (падрабязнасці ніжэй), раней ахарактарызаваныя з эпідэміялагічнага пункту гледжання36. Улічваючы, што набор дадзеных з Партугаліі змяшчае толькі прадстаўнікоў еўрапейскіх клонавых комплексаў 2 і штамы без пазначаных комплексаў, былі дададзены агульнадаступныя дадзеныя секвенавання ўсяго геному, каб пашырыць набор дадзеных, які ўключае ўсіх прадстаўнікоў клонавых комплексаў M. bovis. Такім чынам, у гэтай працы былі выкарыстаны тры крыніцы дадзеных секвенавання ўсяго геному: поўная/чарнавая зборка геному, да 10 скаффолдаў, якія захоўваюцца ў NCBI (Нацыянальны цэнтр біятэхналагічнай інфармацыі) (n = 15 ізалятаў); якія захоўваюцца ў SRA (файл Illumina fastq архіва прачытаных паслядоўнасцей), які прадстаўляе комплексную разнастайнасць клонаў M. bovis (n = 12 ізалятаў)30; і 42 нядаўна секвенаваныя геномы з Партугаліі. Mycobacterium bovis BCG (бацыла Кальмета-Герена) была выключана з пошуку NCBI. Звычайна ў якасці эталоннага геному для ўключэння ў набор даных выкарыстоўваецца M. bovis AF2122/97. З-за публічнай недаступнасці ўсёй паслядоўнасці геному, прадстаўленай кланіруючым комплексам African 1, і невялікай колькасці геномаў ад рэпрэзентатыўных штамаў Af2 і Eu1, у гэтых выпадках выкарыстоўваліся арыгінальныя даныя секвенавання, прадстаўленыя SRA. Праца Цымпеля і яго калег (2020) дапамагла ідэнтыфікаваць геном з вышэйзгаданага кланіруючага комплексу і дапамагла выбраць Mycobacterium bovis для ўключэння ў набор даных. Для Eu3 апісаны толькі адзін тып геному (Branger et al., 2020), таму геном, які мы ўключаем, з'яўляецца асобным прадстаўніком комплексу Eu3.
У глабальным маштабе гэты набор даных уключае 70 відаў буйной рагатай жывёлы M. bovis, вылучаных з 8 відаў гаспадароў, распаўсюджаных у 12 краінах з 1985 па 2016 год. 36 відаў пазначаны як Eu2, 7 відаў - Eu1, 1 від - Eu3, 3 віды - Af1, 4 віды - Af2, а 19 не адносяцца да якога-небудзь клональнага комплексу (падрабязнасці ніжэй). Падрабязная інфармацыя (у тым ліку нумар рэгістрацыі) пра Mycobacterium bovis, выкарыстаная ў гэтым даследаванні, паказана ў Табліцы 1 і Дадатковай Табліцы 1.
У цэнтры гэтага даследавання знаходзяцца 42 нядаўна секвенаваныя цэлыя геномы Mycobacterium bovis з гарачых кропак туберкулёзу жывёл у Партугаліі, якія распаўсюджваліся больш за 12 гадоў, паколькі патэнцыйныя сістэмы захворванняў дзікіх жывёл і жывёлы рэгулярна кантралююцца31,36 (Дадатковы мал. 1). Згодна з наступнымі працэдурамі, гэтыя штамы былі вылучаны ад буйной рагатай жывёлы (n = 14), высакароднага аленя (n = 16) і дзіка (n = 12) з 2003 па 2015 год: збіраць і апрацоўваць жывёл у адпаведнасці з рэкамендаванымі пратаколамі. Узоры тканін знаходзяцца ў Даведніку па наземных жывёлах МЭБ і высейваюцца на цвёрдае і вадкае асяроддзе з піруватам Стоўнбрынка і Лёвенштейна-Йенсена. Культуры інкубуюць пры тэмпературы 37 °C, а рост правяраюць адзін раз на тыдзень на працягу не менш за 12 тыдняў. Калоніі захоўваюць непасрэдна ў растворы гліцэрыны пры тэмпературы -80 °C. У селектыўным асяроддзі Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) арыгінальныя архіўныя ўзоры былі прапушчаны праз адзін пасаж in vitro для атрымання ДНК праграмы WGS. Для гэтага замарожаны раствор культуры быў узбагачаны 5% піруватам натрыю і 10% ADS (50 г альбуміна, 20 г глюкозы, 8,5 г хларыду натрыю ў 1 л вады) на асяроддзі Middlebrook 7H9 пры тэмпературы 37°C Retrain. Пасля 4 тыдняў росту асяроддзе абнаўлялі, і культура рэгулярна кантралявалася да назірання росту. Клеткі збіралі цэнтрыфугаваннем, асадак рэсуспендавалі ў 500 мкл фасфатна-буфернага фізраствора (PBS), награвалі пры тэмпературы 99°C на працягу 30 хвілін, цэнтрыфугавалі, а супернатант захоўвалі пры тэмпературы -20°C да WGS. Усе працэдуры праводзіліся ў памяшканнях з біялагічнай бяспекай 3-га ўзроўню.
Бібліятэка парных геномаў WGS падрыхтавана з выкарыстаннем унікальнага індэкса кожнага ўзору ДНК і выкарыстоўвае тэхналогіі секвенавання Illumina MiSeq (2 × 250 п.н.) (40 узораў) і HiSeq (2 × 150 п.н.) (два ізаляты) (Eurofins Genomics, Германія). Згодна з інструкцыямі вытворцы, выкарыстоўвайце аналізатар геному Illumina з двухбаковым модулем для секвенавання геномнай ДНК і камплект Nextera XT DNA Library Prep Kit ад Illumina для стварэння бібліятэкі.
Улічваючы дадзеныя, атрыманыя з SRA (n = 12), ідэнтыфікацыю клонавага комплексу можна выкарыстоўваць у якасці метададзеных адпаведнай публікацыі 30, 41, 43. Пры разглядзе поўнага геному, за выключэннем Mycobacterium bovis AF2122/97 і Mycobacterium bovis 3601, якія з'яўляюцца прызнанымі членамі клональнага комплексу Eu1 і Eu3 25, 29 адпаведна, ён супадае з поўным геномам Mycobacterium tuberculosis H37Rv (нумар доступу NCBI NC_000962.3). Выраўноўванне геному выконваецца з выкарыстаннем MAFFT (праграма множнага выраўноўвання амінакіслотнай або нуклеатыднай паслядоўнасці, версія 7.458) і параметра -addfragments48. Затым праводзіцца пошук адсутнасці розных клональных комплексаў і/або наяўнасці SNP-прыкмет.
Новасеквенаваны Mycobacterium bovis (n = 42) і арыгінальныя прачытанні сабранага чарнавіка геному (n = 3) супадаюць з эталонным геномам Mycobacterium tuberculosis H37Rv праз канвеер vSNP і наяўнасць дэлецый і/або SNP-прыкмет розных клонаў. Быў праведзены пошук.
Збірайце інфармацыю пра адсутнасць прыкмет і/або наяўнасць/адсутнасць SNP і профіляў спалігатыпавання, каб прысвоіць геномныя дадзеныя адпаведнаму клональнаму комплексу. Для чатырох чарнавікоў зборак профіль спалігатыпавання немагчыма вызначыць, таму яны ўключаны ў групу «без складанасці».
Біяінфарматычны працоўны працэс, які выкарыстоўваецца ў гэтай працы, пачынаецца з de novo зборкі і супастаўлення з эталоннай стратэгіяй з мэтай вывучэння падзей рэкамбінацыі і канкрэтных палімарфізмаў геному. На малюнку 1 прадстаўлена блок-схема наступных этапаў. Для аналізу рэкамбінацыі выкарыстоўваюцца ўсе геномы, каб павысіць надзейнасць высноў і звязаных з імі паказчыкаў.
Каб паменшыць памылкі пры генерацыі кансенсусных паслядоўнасцей геному, мы спачатку атрымалі de novo зборку, а затым атрымалі множныя выраўноўванні па асноўных элементах. Канвеер Unicycler у цяперашні час даступны па адрасе https://github.com/rrwick/Unicycler49 і выкарыстоўваецца для выканання de novo зборкі 54 секвенаваных геномаў (42 нядаўна секвенаваных і 12 файлаў fastq, адноўленых з SRA). Карацей кажучы, перад зборкай з нуля быў праведзены аналіз якасці чытання ў FastQC версіі 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) і Trimmomatic версіі 0.36 (ужываюцца опцыі "cutting Adapters and other lighting-specific sequences from reads" і "Cut bases from the end of the read, if lower than the threshold quality of 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic)50. Затым для зборкі геному быў выкарыстаны SPAdes optimiser49, а для аптымізацыі пасля зборкі - Pilon версіі 1.1851. Каб пазбегнуць няправільнай зборкі, быў абраны кансерватыўны рэжым масткавага ўзаемадзеяння, а памер k-мера быў знойдзены і выбраны ў межах ад 20% да 95% ад даўжыні чытання. Выконвайце рэкамендацыі SPAdes і ўлічвайце памер чытання, выдаляйце кантыгі меншыя за 300 пар асноў і ўстанаўлівайце парог пакрыцця глыбіні 20 чытанняў, роўны 52. Пры стратэгіі зборкі de novo геномныя вобласці, такія як высокапаўтаральныя паралогі пралін-глутамата (PE) і пралін-глутамата (PPE), не выдаляліся.
Якасць de novo зборкі ацэньваецца з дапамогай канвеера QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), які спрыяе абнаўленню кантыга і картаграфа эталоннага геному M. bovis AF2122/97 (нумар доступу NCBI LT708304.1) (гл. параметры якасці ў Дадатковай табліцы 1).
З дапамогай канвеера vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP) файл FASTQ нядаўна секвенаванага M. bovis з секвенавання Illumina параўноўваецца з эталонным геномам M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Згодна з рэкамендацыямі па найлепшай практыцы набору інструментаў аналізу геному (GATK) 53, 54, 55, для паўторнай каліброўкі выкарыстоўваюцца стандартныя параметры фільтра або варыянтныя балы масы. Вынікі фільтруюцца з выкарыстаннем найніжэйшага бала масы SAMtools, роўнага 150, і AC = 2. Таксама выкарыстоўвайце Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) для праверкі паказанняў, каб выключыць забруджванне. Канвеер vSNP, які выкарыстоўваецца для супастаўлення са стратэгіямі секвенавання ў нашай працы, даследуе шэраг вызначаных SNP і мішэняў, а таксама выключае сцэнарыі змешанай інфекцыі. Пакрыццё геному пры чытанні лепш за 99% (Дадатковая табліца 1).
Каб пазбегнуць памылак пры мапіраванні і няправільных SNP, адфільтруйце варыянт у наступных выпадках: (1) ён падтрымліваецца менш чым 20 вымярэннямі, (2) ён сустракаецца з частатой менш за 0,9, (3) ён ёсць хаця б у адным штаме, але хаця б у іншым штаме ёсць прабелы. Для візуальнай праверкі SNP і пазіцый з праблемамі мапіравання або выраўноўвання выкарыстоўваўся інтэграваны праглядальнік геномікі (IGV) версіі 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56. Паколькі гены пралін-глутамата (PE) і пралін-пралінглутамата (PPE) маюць высокую дублікацыю і з'яўляюцца часткай шматгеннага сямейства, іх лёгка няправільна зразумець пры секвенаванні і няправільным мапіраванні Illumina, таму яны пераважнейшыя. Працоўны працэс мікабактэрыяльнай біяінфарматыкі выдаляў члены туберкулёзнага комплексу пры выкарыстанні стратэгіі мапіравання на паслядоўнасць для пацверджання SNP. Таму мы адфільтравалі гены PE/PPE і індэлі з аналізу.
Згодна з Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), усе поліморфізмы (SNP) падзяляюцца на функцыянальныя катэгорыі. Канвеер SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) выкарыстоўваецца для вызначэння наступстваў SNP (сінонімічныя або несінонімічныя змены). Створана новая база дадзеных геному Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Множныя выраўноўванні па асноўных геномах былі выкананы з выкарыстаннем Parsnp версіі 1.2, даступнага па спасылцы https://github.com/marbl/parsnp57, з выкарыстаннем 69 поўных зборак геномаў/чарнавікоў (з опцыяй -c), прычым M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) выкарыстоўваецца ў якасці эталона. Былі выкананы чатыры множныя выраўноўванні па асноўных геномах: толькі члены кланіруючага комплексу Eu2 (n = 37), уключаючы ўсе члены еўрапейскага кланіруючага комплексу (n = 44), уключаючы кропку злучэння еўрапейскага і афрыканскага кланіруючых комплексаў (n = 51), і ўключаюць усе Mycobacterium bovis у гэтым даследаванні (n = 70).
Выраўноўванне па аснове, згенераванае Parsnp, выкарыстоўваецца для вываду філагенетычнага дрэва максімальнай праўдападобнасці (ML) з выкарыстаннем CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 з выкарыстаннем RAxML і выканання 1000 кіраваных рэплікацый.
Для паралельнай праверкі наяўнасці рэкамбінацыі выкарыстоўваюцца тры розныя алгарытмы і біяінфарматычныя інструменты: праграмнае забеспячэнне SplitsTree4, канвеер Gubbins (непрадузятае вызначэнне лініі паходжання праз рэкамбінацыю ў нуклеатыдных паслядоўнасцях) і праграмнае забеспячэнне RDP4 (праграма выяўлення рэкамбінацыі, версія бэта 4.101).
Для разліку філагенетычнай сеткі без каранёў выкарыстоўваецца метад раздзялення, рэалізаваны ў SplitsTree4 версіі 4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59, з выкарыстаннем крытэрыя Фі для статыстычнай праверкі, а парог значнасці складае p = 0,05. У якасці ўваходных дадзеных выкарыстоўваецца асноўны шматвыраўноўвальны аналіз Parsnp, і раздзяленне рэалізуецца як стандарт сеткі.
Канвеер Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) працуе з параметрамі па змаўчанні як яшчэ адзін спосаб ацаніць уплыў рэкамбінацыі на Mycobacterium bovis. Алгарытм, рэалізаваны ў канвееры, рэканструюе адпаведную лінію клонаў. Поўная зборка геному/чарнавіка нашага набору дадзеных і эталонны геном (бычынага буйволінага AF2122/97, LT708304.1) узаемна супадаюць; і скануюць пазіцыю SNP на кожнай галіны дрэва, каб выявіць кластар SNP, які прадстаўляе падзею рэкамбінацыі. Нуль галіны. Выкажам здагадку, што падзеі рэкамбінацыі няма, што азначае, што SNP, якія сустракаюцца на галіны, павінны быць раўнамерна размеркаваны. У якасці ўваходных файлаў выкарыстоўваюцца асноўнае множнае выраўноўванне з Parsnp і найлепшае дрэва ML з RAxML.
Нарэшце, каб пацвердзіць падзею рэарганізацыі, прапанаваную канвеерам Gubbins, шэсць алгарытмаў, рэалізаваных у RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 і SiScan66), былі ўжытыя да асноўнага множнага выраўноўвання Parsnp з наладамі па змаўчанні. Мы вызначылі, што прынамсі тры з алгарытмаў, рэалізаваных у RDP4, павінны паслядоўна дэманстраваць важны сігнал для праверкі кожнай падзеі рэкамбінацыі.
Улічваючы, што як праграмнае забеспячэнне Gubbins, так і праграмнае забеспячэнне RDP шукаюць сігналы рэкамбінацыі, правяраючы асноўныя множныя выраўноўванні ў акне да 500 пар асноў і пацвярджаючы, што ўключэнне генаў PE/PPE падчас de novo зборкі не будзе перашкаджаць выяўленым сігналам рэкамбінацыі, далейшы аналіз праводзіцца шляхам праверкі гамалінеарнасці паблізу гена, які ідэнтыфікуе падзею рэкамбінацыі. Сінілінейная карта з выкарыстаннем поўнага геному была пабудавана з выкарыстаннем MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) для выключэння лакальных транслакацый або інверсій геному. Акрамя таго, увесь геном быў выкарыстаны для правядзення аналізу гамалінеарнасці амінакіслотнай паслядоўнасці праз вэб-сервер SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Больш паглыблены аналіз набору дадзеных геному, атрыманых з партугальскай сістэмы шматгаспадарчага туберкулёзу, заключаецца ў праверцы палімарфізму генаў, згаданых у літаратуры. Гэта гены 37, 38 і ген, які кадуе 3R, атрыманы продкамі MTBC праз кампаненты сістэмы HGT (рэпарацыя, рэплікацыя і рэкамбінацыя ДНК) 39. Выкарыстоўвайце ClustalX версіі 2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) і DnaSP версіі 6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) для разліку геннай разнастайнасці і нуклеатыднай разнастайнасці (π) і ўваходных параметраў D-нейтральнага тэсту Таджымы.
Было атрымана філагенетычнае дрэва максімальнай праўдападобнасці (ML) на аснове 69 ізалятаў Mycoplasma bovis і эталонных геномаў (малюнак 2А). У параўнанні з дрэвамі на аснове аднаго гена або некалькіх локусаў, гэтая стратэгія дазваляе ствараць больш магутныя дрэвы, якія не ахопліваюць зменлівасць усяго геному і, такім чынам, дэманструюць меншую здольнасць адрозніваць віды 68,69. Тапалагічная структура дрэва ML звычайна адпавядае складанай класіфікацыі клонаў. Геном Eu2 кластарызуецца ў галіну, і геном Af1 таксама кластарызуецца разам (малюнак 2А). Вынік таксама адпавядае вядомай эвалюцыйнай сувязі Mycobacterium bovis, гэта значыць, існуе вялікая розніца паміж членам Eu1 і групай, якая складаецца з усіх іншых клональных комплексаў і геномаў, але клональны комплекс 30 не ўдакладняецца. Невялікую неадпаведнасць паміж клональным комплексам і ўзаемасувяззю, якая назіраецца на філагенетычным дрэве, можна растлумачыць тым, што клональны комплекс апісваецца на аснове пэўных геномных рэгіёнаў, у той час як філагенетычнае дрэва заснавана на некалькіх выраўноўваннях асноўных геномаў, якія прадстаўляюць увесь геном.
Філагенетычнае дрэва максімальнай праўдападобнасці (ФДМ) пабудавана на аснове выраўноўвання ядра геному Mycobacterium bovis да (А) і пасля (Б) выдалення сайта рэкамбінацыі. Колеры галін адлюстроўваюць комплекс клонаў Mycobacterium bovis: Еўропа 1 — фіялетавая, Еўропа 2 — чырвоная, Еўропа 3 — сіняя, Афрыка 1 — аранжавая, а Афрыка 2 — зялёная. Дрэва мае карані і намалявана ў маштабе, а даўжыня галін вымяраецца ў якасці замены для кожнага сайта.
Комплекс Mycobacterium tuberculosis апісваецца як клональна эвалюцыянаваны, і большасць доказаў, назапашаных за гады, пацвярджаюць ідэю аб тым, што бягучыя падзеі HGT і рэкамбінацыі не будуць адбывацца на выяўляльным узроўні MTBC15,17,18.
Папярэднія працы паказалі, што паміж штамамі MTBC можа быць абмежаваная рэкамбінацыя20,21, у той час як іншыя не змаглі вызначыць вымерныя падзеі рэкамбінацыі70,71. Абмяркуйце гэтае пытанне зноў з акцэнтам на Mycobacterium bovis, што адрозніваецца ад папярэдняй працы, якая разглядала толькі Mycobacterium tuberculosis70,71; або разглядайце MTBC у цэлым, практычна без M. bovis, які прадстаўляе 20; або разглядайце толькі абмежавальныя фракцыі буйной рагатай жывёлы. Набор дадзеных па мікабактэрыях у гэтай працы ўключае ў сябе ў агульнай складанасці 70 штамаў, якія прадстаўляюць усе клональныя комплексы, якія выкарыстоўваюцца для скрынінга рэкамбінацыі. Набор дадзеных маштабуецца ў адпаведнасці з чатырма кумулятыўнымі ўзроўнямі: (1) члены Eu2, (2) усе члены еўрапейскага клонавага комплексу (г.зн. Еўропа), (3) еўрапейскі і афрыканскі клонавы комплекс (Eu + Af) і (4) усе калекцыі дадзеных (у тым ліку геномы, якія не ўключаны ні ў якія з ужо апісаных клонавых комплексаў).
Для далейшага вывучэння гэтай гіпотэзы была праведзена сетка з раздзельным раскладаннем, каб ацаніць адсутнасць падзей рэкамбінацыі паміж геномамі, паколькі гэты метад можа візуалізаваць родавыя сувязі паміж асобінамі і адлюстроўваць супярэчлівыя філагенетычныя сігналы. Усе чатыры наборы дадзеных у аналізе пацвердзілі існаванне завес у сетцы (гэта значыць абласцей, якія не сыходзяцца ў адно дрэва), але тэст Phi не мае статыстычнага пацверджання (Eu2, p = 0,0956; Еўропа, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; увесь набор дадзеных p = 0,2451), што дае слабыя доказы існавання падзей рэарганізацыі (малюнак 3A-D).
У Еўропе 2 геномы (n = 37) (A), еўрапейскія геномы (n = 44) (B), еўрапейскія і афрыканскія геномы (n = 51) (C) і ўвесь набор дадзеных (n = 70) (D).
Пасля гэтага аналізу і з улікам цыклічных назіранняў ва ўсіх сетках, алгарытм рэканструкцыі, рэалізаваны ў канвееры Губінса, быў ужыты для рэканструкцыі клональнай лініі і дапаўнення ацэнкі ўплыву рэкамбінацыі на геном M. bovis. Вызначце кумулятыўную колькасць падзей рэкамбінацыі, большасць з якіх адбылася ў тэрмінальных галінах (гэта значыць у адным геноме) (табліца 2). Гэтыя паказчыкі дэманструюць узгодненасць усяго набору дадзеных і паказваюць, што частата падзей рэкамбінацыі ў 200-300 разоў перавышае частату мутацый. Пасля гэтага параметр rho/theta, які прадстаўляе адносныя хуткасці рэкамбінацыі і кропкавых мутацый на галіны, здаецца, знаходзіцца ў дыяпазоне ад 0,0037 да 0,0056 (табліца 3). Нядаўна апублікаваная праца штама 38 M. bovis прадэманстравала больш высокае значэнне rho/theta (rho/theta = 0,1), чым атрыманае ў гэтым наборы даных, але ў працы Патане і яго калег выкарыстоўвалася зборка на аснове эталонаў для вызначэння параметраў рэкамбінацыі. Працэдурная дэталь, з-за працэдуры зборкі, была звязана з вялікай колькасцю меркаваных падзей рэкамбінацыі ў тэрмінальнай галіны.
Далей, параметр r/m прадстаўляе суадносіны разнастайнасці рэкамбінацыі і ўвядзення мутацый, і яго сярэдняе значэнне знаходзіцца ў дыяпазоне ад 0,025 да 0,037, што сведчыць аб тым, што ў параўнанні з мутацыямі, рэкамбінацыя мае меншы агульны ўплыў на генетычную разнастайнасць M. bovis (табліца 3). Для падрабязнага параўнання падобны метад быў выкарыстаны для ацэнкі параметра r/m для набору дадзеных MTBC, які складаецца з 23 геномаў, паказваючы сярэдняе значэнне 0,48620, у той час як для набору дадзеных Патане і калег з 38 геномаў M. bovis сярэдняе значэнне аказалася 0,98. У першым даследаванні былі апісаны толькі два з 23 геномаў M. bovis (M. bovis BCG і эталонны штам), таму атрыманае значэнне можа быць зрушаным з-за празмернай экспрэсіі геному M. tuberculosis. У другой справаздачы аналізаваныя папуляцыі Mycobacterium bovis былі ў асноўным атрыманы са Злучаных Штатаў і ад хатніх жывёл. У адрозненне ад гэтага, у нашым наборы дадзеных прадстаўлена больш геаграфічных месцаў і відаў гаспадароў, а таксама выкарыстоўваюцца геномы, згрупаваныя ў розныя клональныя комплексы з рознымі генетычнымі характарыстыкамі папуляцыі, што дазваляе дасягнуць больш глыбокіх і шырокіх ведаў аб папуляцыі. Сярэдняе значэнне розніцы r/m, атрыманае з дапамогай нашага набору дадзеных, адпавядае канцэпцыі, што ступень рэкамбінацыі значна адрозніваецца паміж лініямі, аднесенымі да аднаго таксанамічнага віду, таму гэтыя вынікі паказваюць, што клонавы комплекс M. bovis можа праяўляць адрозненні ў рэкамбінацыі. Уплыў таксама адпавядае меркаванню Didelot & Maiden72. Тым не менш, значнае пашырэнне гэтага набору дадзеных шляхам уключэння большай колькасці геномаў M. bovis дазволіць далейшае ўдакладненне гэтага пункта. Як параметры r/m, так і rho/theta паказваюць зменлівасць паміж галінамі, і гэты вынік адпавядае паведамленням па іншых відах бактэрый72,73.
Нарэшце, каб пацвердзіць падзеі рэарганізацыі, выяўленыя канвеерам Gubbins, у праграмным забеспячэнні RDP4 было выкарыстана шэсць розных алгарытмаў для незалежнага тэставання розных асноўных мультыпараўнанняў. У глабальным маштабе менш за палову падзей, выяўленых Gubbins, былі пацверджаны RDP4 (табліцы 4 і 5). Улічваючы ўвесь набор дадзеных, былі пацверджаны тры падзеі рэкамбінацыі, дзве з якіх уключалі ўнутраныя вузлы, а другая — адзін геном у тэрмінальнай галіны, для якой не ўдалося прызначыць клональныя комплексы (табліцы 4 і 5). Ідэнтыфікацыя падзей у тэрмінальных галінах можа сведчыць аб тым, што рэкамбінацыя ўсё яшчэ працягваецца ў сучасных штамах M. bovis, або вынік няправільны70. У гэтай гіпатэтычнай вобласці рэкамбінацыі прыблізна 20% пазіцый маюць нявызначаныя нуклеатыды (N), што ўплывае на сігнал рэкамбінацыі (дадатковы малюнак 2). Акрамя таго, гэтая вобласць уплывае на ген rrs, які кадуе рыбасомную РНК 16S, якая, як чакаецца, з'яўляецца высокакансерватыўнай, таму гэты меркаваны сігнал рэкамбінацыі можа быць вынікам памылак секвенавання або няправільнага выраўноўвання. Затым было праведзена поўнае выраўноўванне геному паміж Mb0003 і Mycobacterium bovis AF2122/97, і было пацверджана існаванне неакрэсленых нуклеатыдаў і SNP, таму магчымыя праблемы, звязаныя з няправільным выраўноўваннем, не былі выкліканы біялагічнай інфармацыяй, рэалізаванай у гэтай працы. З'явіліся пасля вывучэння праграмы.
У рэкамбінацыявых абласцях унутраных вузлоў не было выяўлена прабелаў або нявызначаных нуклеатыдаў (малюнкі 4 і 5). Што тычыцца гэтых падзей, адна змяшчае толькі геном Eu2 і ўплывае на ген pks12, які кадуе магчымую полікетыдсінтазу; у той час як другая зарэгістравана ў геноме Eu1 і ўплывае на ген narX, які кадуе магчымую нітратрэдуктазу (табліца 4). У цэлым, аналіз рэкамбінацыі паказвае, што існуе абмежаваная колькасць рэкамбінацыявых фрагментаў са статыстычнай падтрымкай, і выведзеныя паказчыкі паказваюць, што рэкамбінацыя мае невялікі ўплыў на лінію M. bovis. Чакаецца, што сігнал рэкамбінацыі будзе нізкім, але важна адрозніць сапраўдны сігнал эвалюцыі ад фонавага шуму, што з'яўляецца складанай задачай. Каб паменшыць шумавы сігнал, уведзены праблемамі зборкі на аснове эталонаў і неадпаведнасці 70, 71, усе астатнія, акрамя поўнага геному, былі сабраны з нуля, а якасць зборкі была праверана і забяспечана канвеерным аналізам QUAST (дадатковая табліца 1). Акрамя таго, быў праведзены шэраг дадатковых аналізаў для забеспячэння надзейнасці і дакладнасці агульнага апытання. Такім чынам, якасць секвенавання генаў narX і pks12 была ацэненая шляхам картаграфавання счытванняў супраць Mycobacterium bovis AF2122/97. Рэкамендаваная пазіцыя SNP у вобласці рэкамбінацыі была пацверджана шляхам прымянення крытэрыяў, згаданых у раздзеле метаду (не менш за 20 счытванняў і частата змяненняў 0,9). Палімарфізм гена narX быў цалкам пацверджаны ў двух геномах (Mb1792361 і Mb7240415; 2,3%) і геномах генома pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 і Mb12. Аднак для геному Mb2043 шэсць з васьмі пазіцый не адпавядаюць крытэрыю глыбіні чытання, паколькі SNP падтрымліваецца максімум 17 чытаннямі, што ніжэй за ўстаноўленае парогавае значэнне 20. Такім чынам, рэкамбінацыя шасці геномаў (8,6%) у гэтым месцы геному можа быць пацверджана (малюнкі 4 і 5).
Падрабязная візуалізацыя выраўноўвання вобласці рэкамбінацыі набору дадзеных Mycobacterium bovis уплывае на ген narX, які кадуе магчымую нітратрэдуктазу. У вобласці рэкамбінацыі ўнутраных вузлоў не было выяўлена прабелаў або нявызначаных нуклеатыдаў. Гэтая канкрэтная падзея зарэгістравана ў геноме Eu1. Якасць секвенавання гена narX ацэньвалася шляхам пабудовы графіка чытанняў Mycobacterium bovis AF2122/97. Пацвердзіце рэкамендаванае месцазнаходжанне SNP у вобласці рэкамбінацыі, ужываючы крытэрыі, згаданыя ў раздзеле метаду (не менш за 20 чытанняў і частата змяненняў 0,9). Палімарфізм гена narX быў цалкам пацверджаны ў геномах Mb1792361 і Mb7240415 (2,3%).
Падрабязная візуалізацыя выраўноўвання вобласці рэкамбінацыі набору дадзеных Mycoplasma bovis, які ўплывае на ген pks12. У вобласці рэкамбінацыі ўнутраных вузлоў не выяўлена прабелаў або нявызначаных нуклеатыдаў. Што тычыцца падзеі, якая ўплывае на ген pks12, які кадуе магчымую полікетыдсінтазу, ён утрымлівае толькі геном Eu2. Якасць секвенавання pks12 была ацэненая шляхам картаграфавання чытання Mycobacterium bovis AF2122/97. Пацвердзіце рэкамендаванае месцазнаходжанне SNP у вобласці рэкамбінацыі, ужываючы крытэрыі, згаданыя ў раздзеле метаду (не менш за 20 чытанняў і частата змяненняў 0,9). Палімарфізмы геномаў Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 і Mb1960 былі цалкам пацверджаны.
Гены PE і PPE маюць паўтаральныя вобласці, якія лёгка няправільна чытаюцца пры секвенаванні і няправільным мапіраванні Illumina, таму яны звычайна выдаляюцца з біяінфарматычнага працоўнага працэсу членаў M. tuberculosis толькі пры выкарыстанні стратэгіі мапіравання ў паслядоўнасць. Выснова падзей рэкамбінацыі, якая выкарыстоўваецца ў гэтай працы, заснавана на de novo зборцы без фільтрацыі PE/PPE. Мы лічым, што дзякуючы рэалізацыі трох розных дадатковых метадаў і алгарытмаў праз праграмнае забеспячэнне SplitsTree, Gubbins pipeline і RDP4, ужытыя стратэгіі ўстойлівыя да апрацоўкі і фільтрацыі рэарганізаваных абласцей, выкліканых сігналамі памылак. Аднак, каб выключыць уплыў гена PE/PPE на праграмнае забеспячэнне Gubbins і RDP4 для ідэнтыфікацыі кластараў SNP, і, такім чынам, ідэнтыфікацыі абласцей рэкамбінацыі, якія, як мяркуецца, уплываюць на гены narX і pks12, было даследавана суседства гэтых генаў (Дадатковы мал. 3–5). У M. bovis AF2122/97 ген narX аддзелены ад narK2 і Mb1764c, у той час як pks12 акружаны Mb2075c і Mb2073c (Дадатковы малюнак 3-5). Карта, створаная з выкарыстаннем сінлінейнай карты MAUVE поўнага геному, дае інфармацыю аб захаванасці і перабудове паслядоўнасці генаў, паказваючы чатыры калінеарныя блокі і адсутнасць прыкмет транслакацыі або інверсіі геному. Акрамя таго, аналіз камплементацыі з амінакіслотнай паслядоўнасцю пацвердзіў гамалогію ва ўсіх поўных геномах, і ў суседніх рэгіёнах narX або pks12 не было выяўлена PE/PPE. Для narX адзін геном (Mb0030) мае больш нізкі бал сіноніміі, таму што ген narX быў ідэнтыфікаваны як два фрагменты (фрагменты 1891 і 1890). Што тычыцца pks12, з-за падабенства Mb0030 і Mb003 прадэманстравалі ніжэйшыя паказчыкі сінлінеарнасці, у той час як pks12 быў ідэнтыфікаваны ў двух і трох фрагментах адпаведна, якія прадстаўляюць розныя дамены бялку (Дадатковы малюнак 3-5). Улічваючы гэтую інфармацыю, а таксама тое, што праграмнае забеспячэнне Gubbins і RDP4 выканалі аналіз і праверылі множнае выраўноўванне па ядру максімальных 500 пар асноў у акне, мы пацвердзілі, што ген PE/PPE не будзе перашкаджаць сігналу рэкамбінацыі, які ўплывае на narX і pks12.
Нягледзячы на тое, што сігналы рэкамбінацыі, выяўленыя ў гэтым наборы дадзеных, можна лічыць рэшткавымі, праўдай з'яўляецца тое, што рэкамбінацыю ў M. bovis нельга выключаць, таму яна павінна працягвацца ў далейшым аналізе, у якім цэлыя геномы з розных эпідэміялагічных сцэнарыяў секвенуюцца да важнасці.
Параўнанне філагенетычных дрэў ML, атрыманых да і пасля карэкцыі рэкамбінацыі (малюнак 2A, B), не прывяло да істотных змен у меркаванай філагенетычнай сувязі, і штамы M. bovis былі аб'яднаны ў адну групу.
Пасля супастаўлення 42 новых секвенаваных чытанняў M. bovis з эталонным геномам M. bovis AF2122/97 было атрымана выраўноўванне SNP, якое змяшчае 1816 паліморфных пазіцый. Большасць SNP (87,1%) знаходзяцца ў кадуючай вобласці, і закранутыя гены характарызуюцца ў адпаведнасці з функцыянальнымі катэгорыямі, паказанымі ў Bovilist (Малюнак 6A, B). Улічваючы агульную колькасць генаў у кожнай функцыянальнай катэгорыі, гены ў катэгорыі «метабалізм ліпідаў» паказалі больш SNP, за імі ідуць гены «клеткавай сценкі і клеткавых працэсаў» і «прамежкавага метабалізму і дыхання», што сведчыць аб тым, што яны знаходзяцца ў эвалюцыі M. bovis.
Іерархічны аналіз набору дадзеных M. bovis з Партугаліі (n = 42). Агульная колькасць зарэгістраваных SNP і закранутых генаў для кожнай функцыянальнай катэгорыі (A). Агульная колькасць сінанімічных і несінанімічных змен, зарэгістраваных па функцыянальнай катэгорыі (B).
У глабальным маштабе сярэдняе суадносіны dN/dS лепшае за 1,5, што сведчыць аб тым, што глабальны эвалюцыйны ціск накіраваны на пазбаўленне ад авакальнага стану і прадстаўляе сабой станоўчы (дыверсіфікаваны або накіраваны) і/або паслаблены сцэнар выбару ачысткі. У катэгорыях «вірулентнасць, дэтоксікацыя, адаптацыя», «інсерцыйныя паслядоўнасці і фагі» і «рэгуляторныя бялкі» больш за дзве траціны SNP не з'яўляюцца сінонімамі (малюнак 6B).
Ва ўсіх катэгорыях ёсць гены з некалькімі SNP, што прыводзіць да сярэдняй частаты мутацый (гэта значыць сярэдняй колькасці SNP на ген) большай за 1 (малюнак 6A). Pks12 (Mb2074c) з 15 SNP і fas (Mb2553c) з 8 SNP маюць больш высокія значэнні мутацый. Абодва гэтыя гены ўдзельнічаюць у метабалізме тоўстых кіслот. Ген pks кадуе полікетыдсінтазу (PKS), якая з'яўляецца шматфункцыянальным ферментам, які ўдзельнічае ў біясінтэзе ліпідаў клеткавай сценкі мікабактэрый74,75. Гэты ген кадуе шматфункцыянальны поліпептыд, які ўдзельнічае ў сінтэзе мікакетыдаў74,76. Ген fas удзельнічае ў сінтэзе міколавай кіслаты. Абодва гэтыя гены гуляюць важную ролю ў біясінтэзе клеткавай сценкі, якая кантактуе з гаспадаром.
Для далейшага вывучэння эвалюцыі Mycobacterium bovis былі прааналізаваны два наборы спецыфічных генаў. У раней апублікаваных працах з выкарыстаннем метадаў паслядоўнасці і філагенетыкі былі выяўлены гены, якія былі набыты продкамі MTBC праз HGT да дыверсіфікацыі37,38. Гэтыя гены пералічаны ў Дадатковай табліцы 2. Было прааналізавана размеркаванне SNP у агульнай складанасці 77 генаў, якія могуць быць звязаны з HGT, і было выяўлена 26 паліморфных сайтаў, якія ў большасці выпадкаў (78%) прывялі да несінанімічных (NS) змен (Дадатковая табліца 2). Папярэдняя праца па геноме MTBC паказала, што меркаваная вобласць HGT мае больш высокае суадносіны NS SNP у параўнанні з астатняй часткай геному. Калі меркаваць, што гэтыя рэкамбінацыйныя вобласці былі набыты продкамі MTBC і, такім чынам, яны празмерна прадстаўляюць старажытныя палімарфізмы, то чакаецца, што доля сінонімічных змен будзе вышэйшай, паколькі чакаецца, што NS-замяшчэнні будуць ліквідаваны шляхам негатыўнага адбору з-за таго, што змены амінакіслот могуць змяніць функцыю бялку. Такім чынам, нашы вынікі паказваюць, што функцыянальныя наступствы могуць быць вынікам замяшчэння генаў, падобных на HGT, што адлюстроўвае іх важнасць для каштоўнай адаптыўнай генетычнай разнастайнасці.
Паралельна з гэтым аналізам гены, якія кадуюць кампаненты сістэмы 3R (рэпарацыя, рэплікацыя і рэкамбінацыя ДНК), былі старанна даследаваны ў адпаведнасці са спісам, раней апублікаваным дос Вултасам і яго супрацоўнікамі (2008)39. Абмен ідэнтычнымі фрагментамі ДНК нельга назіраць непасрэдна, хоць гэта можа быць частым працэсам, калі ўдзельнічаюць блізкароднасныя бактэрыі, як у выпадку з гэтым наборам дадзеных; акрамя таго, гэты працэс можа быць ключом да метадаў рэпарацыі ДНК72, таму яны гуляюць ролю ў гамалагічнай рэкамбінацыі. Усяго было выяўлена 26 паліморфных пазіцый, размеркаваных па 54 генах (Дадатковая табліца 3). У гэтым наборы генаў змены NS склалі каля 65% наступстваў, што адпавядае папярэднім паведамленням аб штамах Mycobacterium tuberculosis.
Час публікацыі: 21 кастрычніка 2021 г.