გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ, გამოიყენოთ ბრაუზერის უფრო ახალი ვერსია (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამავდროულად, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტებს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
გენომის სეკვენირებამ გამოაცოცხლა ინფექციური დაავადებების კვლევის სფერო, გამოავლინა დაავადების ეპიდემიოლოგია, პათოგენეზი, მასპინძელ-პათოგენის ურთიერთქმედება და პათოგენებზე დაწესებული ევოლუციური პროცესი. Mycobacterium tuberculosis კომპლექსი (MTBC) Mycobacterium bovis-ს მიიჩნევს მის ერთ-ერთ ადაპტირებულ წევრად, რომელიც იწვევს ტუბერკულოზს (TB) ხმელეთის ძუძუმწოვრებში და წარმოადგენს ბაქტერიული ევოლუციის ტიპურ მოდელს. MTBC-ის სხვა წევრების მსგავსად, Mycobacterium bovis ითვლება მკაცრად კლონირებულ, ნელა განვითარებად პათოგენად და ცხადია, არ არსებობს რეკომბინაციის ან ჰორიზონტალური გენის გადაცემის ნიშნები. ამ ნაშრომში, ჩვენ ვიყენებთ შედარებით გენომიკას მთელი გენომის თანმიმდევრობის (WGS) მონაცემთა ნაკრებზე, რომელიც შედგება სხვადასხვა გენეალოგიური წარმომავლობის (ევროპა და აფრიკა) 70 მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვისგან, რათა მივიღოთ ინფორმაცია მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვის გენეტიკური მრავალფეროვნების შესახებ. რეორგანიზაციის ნიშნების შესაფასებლად გამოიყენება სამი განსხვავებული მეთოდი. გლობალურად, რეკომბინაციის მოვლენების მცირე რაოდენობა იდენტიფიცირებული და დადასტურებულია ორი დამოუკიდებელი მეთოდით მყარი მხარდაჭერით. მიუხედავად ამისა, მუტაციებთან შედარებით, რეკომბინაციას უფრო სუსტი გავლენა აქვს M. bovis-ის მრავალფეროვნებაზე (საერთო r/m = 0.037). ჩვენს მონაცემთა ნაკრებში Mycobacterium bovis-ის კლონურ კომპლექსში მიღებული r/m საშუალო სხვაობის განსხვავება შეესაბამება ზოგად კონცეფციას, რომ რეკომბინაციის ხარისხი შეიძლება მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდეს იმავე ტაქსონომიური სახეობისთვის მინიჭებულ შტოებს შორის. ამ ნაშრომის საფუძველზე, Mycobacterium bovis-ში რეკომბინაციის გამორიცხვა შეუძლებელია, ამიტომ ის უნდა იყოს შემდგომი ძალისხმევის საგანი მომავალში შედარებითი გენომიკის კვლევაში, რომელშიც გადამწყვეტი მნიშვნელობა აქვს მსოფლიოს სხვადასხვა ეპიდემიოლოგიური სცენარიდან აღებული დიდი მონაცემთა ნაკრებების WGS-ს. შემდეგ დამატებითი ანალიზი ჩატარდა მრავალმასპინძლიანი ტუბერკულოზის გავრცელების Mycobacterium bovis-ის უფრო მცირე მონაცემთა ნაკრებზე (n = 42) და იდენტიფიცირებული იქნა 1800-ზე მეტი ლოკუსი, რომელთაგან სულ მცირე ერთ შტამს აჩვენეს ერთნუკლეოტიდური პოლიმორფიზმები (SNP). უმეტესობა (87.1%) კოდირების რეგიონშია განლაგებული და სინონიმური ცვლილებების არასინონიმური ცვლილებების გლობალური თანაფარდობა (dN/dS) 1.5-ს აღემატება, რაც მიუთითებს, რომ დადებითი სელექცია მნიშვნელოვანი ევოლუციური ძალაა, რომელიც M. bovis-ზე მოქმედებს. SNP-ების უფრო მაღალი წილი აღმოჩენილია გენებში, რომლებიც მდიდარია „ლიპიდური მეტაბოლიზმის“, „უჯრედის კედლისა და უჯრედული პროცესების“ და „შუალედური მეტაბოლიზმისა და სუნთქვის“ ფუნქციური კატეგორიებით, რაც ავლენს მათ პოტენციალს Mycobacterium bovis-ის მნიშვნელობის ბიოლოგიასა და ევოლუციაში. MTBC წინაპრების გენებზე უფრო დეტალური შესწავლა, რომლებიც მიდრეკილნი არიან ჰორიზონტალური გენის გადაცემისკენ და შედიან 3R (დნმ-ის შეკეთება, რეპლიკაცია და რეკომბინაცია) სისტემაში, ავლენს Taijima-ს D ნეიტრალური ტესტის გლობალურ საშუალო უარყოფით მნიშვნელობას, რაც მიუთითებს წარსულ სელექციურ სკანირებაზე. პოპულაციის გაფართოების შემდეგ ბოლოდროინდელი „შეფერხება“ კვლავ მთავარი ევოლუციური მამოძრავებელი ფაქტორია სავალდებულო პათოგენ Mycobacterium bovis-ისთვის მასპინძელთან საბრძოლველად.
Mycobacterium tuberculosis კომპლექსი (MTBC) ბაქტერიული პათოგენების ერთ-ერთი ყველაზე წარმატებული ტაქსონია და ბაქტერიული ევოლუციის ტიპური შემთხვევა. მისი წევრები გენომურ დონეზე გასაკვირად მაღალ ნუკლეოტიდურ იდენტურობას ავლენენ (> 99%)1,2. MTBC-ს სხვადასხვა ეკოტიპს შეუძლია გამოიწვიოს ტუბერკულოზი (TB), რომელიც ინფექციური გრანულომატოზური დაავადებაა, მასპინძელი სახეობების ფართო სპექტრში, მიკრო-ძუძუმწოვრებიდან ადამიანებამდე3,4,5. ამჟამად, კომპლექსი მოიცავს ადამიანებს [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] და ცხოველებთან ადაპტირებულ პათოგენებს (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" და "dassie")5,6. M. canettii (ასევე ცნობილი როგორც „Nodobacter glabrata“) ზემოხსენებულ მიკობაქტერიებთან ნუკლეოტიდების საშუალო იდენტურობა 98%-ია და შედარებითმა გენომიკურმა კვლევებმა აჩვენა, რომ M. canettii და MTBC-ის დანარჩენი ნაწილი ბოლო დროს განსხვავდებოდა საერთო წინაპრისგან.7 ამ კონცეფციის გათვალისწინებით, ზოგიერთი ავტორი M. canettii-ს MTBC-ის წევრს უწოდებს 8.
MTBC სისტემატურად აღწერილია, როგორც მკაცრი კლონური კომპლექსი და მისი პოპულაციის სტრუქტურა აშკარად განისაზღვრება შემცირებული მრავალფეროვნებით, შემაფერხებელი ადგილებით, შერჩევითი სკანირებით და გენეტიკური დრიფტით9,10. იმის გათვალისწინებით, რომ რთული მკაცრი კლონური ევოლუცია, როგორიცაა პოლიმორფიზმების არარსებობა, ვერ აღდგება რეკომბინაციით. ამ წინაპირობის საფუძველზე, დიფერენციალური რეგიონის (RD) და TbD1-ის (Mtb სპეციფიკური წაშლის 1 რეგიონი) გენომური წაშლის თანმიმდევრული მოვლენები შემოთავაზებულია MTBC ევოლუციის მოლეკულურ მარკერებად2,5,11. შედარებითი გენომიკისა და მთელი გენომის სეკვენირების (WGS) სამუშაოები მხარს უჭერს ადამიანისთვის ადაპტირებული წევრების დაყოფას ცხრა შტოდ (Mycobacterium tuberculosis L1-დან L4-მდე, L7-მდე და L8-მდე; და Mycobacterium africanum L5, L6-მდე და L9), შტოები L2-დან L4-მდე საერთო წაშლის TbD1 რეგიონით2,11,12,13. გარდა ამისა, ვარაუდობენ, რომ ცხოველებთან ადაპტირებულ წევრებს საერთო წინაპარი ჰყავთ, რომელიც განისაზღვრება კლად-სპეციფიკური წაშლებით RD7, RD8, RD9 და RD102, 5 და 14-ში.
ჰორიზონტალური გენის გადაცემა (HGT) და რეკომბინაციის მოვლენები იშვიათად ითვლება და MTBC-ის წინაპრებში ხდება, ვიდრე მთელი MTBC წევრის განსხვავებული ისტორია15,16,17. ჰიუზისა და მისი თანამშრომლების (2002) და გუტაკერისა და მისი თანამშრომლების (2006) ორი ადრეული ანგარიში ვარაუდობს, რომ რეკომბინაციის მოვლენებმა შეიძლება ხელი შეუწყოს პოლიმორფიზმების ჩამოყალიბებას, რომლებიც M. tuberculosis შტამებში სპეციფიკურ ლოკუსებს აღნიშნავენ18,19. MTBC-ში რეკომბინაციის აშკარა არარსებობის მიზეზებია: (1) HGT-ის მექანიკური პროცესი და უნარის დაკარგვა; (2) HGT მოვლენების იშვიათობა; (3) MTBC ნიშაში რეკომბინაციის მოვლენების შანსი არ არსებობს14,17. ბოლო დროს, MTBC შტამ 20-სა და Mycobacterium bovis 21-ზე გამოყენებული მთელი გენომის სეკვენირების (WGS) ზოგიერთმა კვლევამ რეკომბინაციის მტკიცებულება მოგვაწოდა, რაც პირველია, რაც აჩვენებს, რომ MTBC შტამები ხშირად ცვლიან დნმ-ის მცირე ფრაგმენტებს, მაგრამ ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობის შეზღუდული ვარიაციის გამო, ეს მოვლენები ჯერ კიდევ არ შეინიშნება.
Mycobacterium bovis ყველაზე ხშირად აღმოჩენილი MTBC წევრია შინაური ცხოველებიდან (ძირითადად მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვიდან), თუმცა მისი იზოლირება ასევე შესაძლებელია თავისუფლად მობინადრე და შემოღობილი გარეული ცხოველებიდან4,22,23,24. M. bovis განვითარდა ხუთ ძირითად კლონურ კომპლექსად [ევროპული 1 (Eu1), ევროპული 2 (Eu2), ევროპული 3 (Eu3), აფრიკული 1 (Af1) და აფრიკა 2 (Af2)], სპოლიგოტიპირების პროფილის, სპეციფიკური დელეციებისა და ერთნუკლეოტიდური პოლიმორფიზმების (SNPs)25, 26, 27, 28, 29 სპეციფიკურ გენებში. ეს კლონური კომპლექსები აჩვენებს Mycobacterium bovis პოპულაციის მრავალფეროვან სტრუქტურას და მის კავშირს გეოგრაფიულ რეგიონებთან. გარდა ამისა, ზიმპელისა და მისი თანამშრომლების მიერ (2020) ჩატარებულმა WGS-ის ბოლოდროინდელმა კვლევამ შეიმუშავა Mycobacterium bovis-ის SNP-ზე დაფუძნებული ფილოგენია, 1900-ზე მეტი გენომით, რაც მიუთითებს, რომ არსებობს სულ მცირე ოთხი განსხვავებული შტო (სახელწოდებით Lb1-დან Lb1-მდე და Lb4-მდე), რომლებიც სრულად არ შეესაბამება ადრე განსაზღვრულ კლონურ კომპლექსს, თუმცა გეოგრაფიული სპეციფიკურობის დადასტურებაც შესაძლებელია30. ამ ავტორებმა ჩაატარეს ფილოგენიისა და მოლეკულური დათარიღების დიფერენციალური ანალიზი, მაგრამ არ შეისწავლეს რეკომბინაცია30.
სხვადასხვა მოლეკულური ტექნიკის, როგორიცაა სპოლიგოტიპირება, MIRU-VNTR (მიკობაქტერიული ინტერსპერსული გამეორების ერთეული-ცვლადის ტანდემური გამეორების ნომერი) და SNP-ის ბოლოდროინდელი ტიპირება, გამოყენებით ჩატარებულმა წინა კვლევებმა გამოავლინა გენეტიკური მრავალფეროვნების გარკვეული დონე M. bovis შტამებს შორის 31,32,33, 34,35. გენეტიკური ვარიაციის დიფერენციაცია დაავადებათა ეპიდემიოლოგიის შესწავლის მნიშვნელოვან ინსტრუმენტად იქცა, რაც სასარგებლოა პათოგენეზის, ვირულენტობისა და დაავადების გადაცემის სიღრმისეული გაგებისთვის. WGS მეთოდის გაჩენა იძლევა შესაძლებლობას გამოვავლინოთ ევოლუციური მამოძრავებელი ფაქტორები, რომლებიც Mycobacterium bovis გენომის მიერ არის დაწესებული ადაპტაციისა და სხვადასხვა მასპინძლებთან და ეპიდემიოლოგიურ სცენარებთან მდგრადობის პროცესში.
ამ ნაშრომში, ჩვენ ვიყენებთ შედარებით გენომურ ანალიზს Mycoplasma bovis-ის სხვადასხვა მონაცემთა ნაკრებებზე (n = 70), მათ შორის სხვადასხვა კლონური კომპლექსიდან აღებულ იზოლატებზე, რათა მივიღოთ ინფორმაცია Mycoplasma bovis-ის ევოლუციური პროცესის შესახებ, განსაკუთრებით ფილოგენეტიკური ურთიერთობებისა და რეკომბინაციის მოვლენების დასადგენად. ამ ანალიზის დამატებით, პორტუგალიაში კარგად დახასიათებული მრავალმასპინძლიანი ტუბერკულოზის რეგიონიდან მიღებული M. bovis-ის იზოლატების (n = 42) ქვემონაცემთა ნაკრები 31,36 შემდგომში შესწავლილი იქნა არაიდენტურობის დასადგენად. სენს (dN) და სინონიმურ (dS) ნუკლეოტიდურ ჩანაცვლებებს შორის ბალანსი, ასევე ლიტერატურაში ნახსენები კონკრეტული გენომების ევოლუციური წვლილი, 37,38 ისინი მიღებულია MTBC წინაპრების მიერ HGT-ის მეშვეობით და კოდირებენ 3R (დნმ-ის შეკეთება, რეპლიკაცია და რეკომბინაცია) სისტემის გენის კომპონენტებს 39. აირჩიეთ HGT-ის მეშვეობით მიღებული გენები, რადგან ისინი შეიძლება წარმოადგენდნენ უძველეს პოლიმორფიზმებს, ამიტომ მოსალოდნელია, რომ ისინი შეიძლება შეიცავდეს სინონიმური ცვლილებების უფრო მაღალ პროპორციას. 3R სისტემაში შემავალი გენები შეირჩა, რადგან M. tuberculosis-ის შტამებზე წინა ნაშრომებმა აჩვენა ზოგადი უარყოფითი/გაწმენდის სელექციები, რომლებიც მოქმედებენ ამ გენებზე და მათ შეიძლება მნიშვნელოვანი როლი შეასრულონ ევოლუციაში 39. ამ ნაშრომის კიდევ ერთი მიზანია რეორგანიზაციის მოვლენების არსებობის დასკვნის გაკეთება. ამ მიზეზით, იმის გათვალისწინებით, რომ პორტუგალიიდან ჩვენი მონაცემთა ნაკრები შეიცავს მხოლოდ ევროპული კლონური კომპლექსის 2 გენომებს და იმ შტამებს, რომლებსაც არ აქვთ მინიჭებული კლონური კომპლექსი, ჩვენ გადავწყვიტეთ, ჩაგვერთვა საჯაროდ ხელმისაწვდომი გენომის მონაცემები, რათა საბოლოოდ მიგვეღო ყველა კლონური კომპლექსის წარმომადგენელი და გაგვეუმჯობესებინა შედეგების სიმტკიცე და სიგანე.
ამ ნაშრომის ცენტრშია პორტუგალიის ენდემური მრავალმასპინძლიანი ტუბერკულოზის სცენიდან 42 ახლად სეკვენცირებული Mycoplasma bovis გენომი (დეტალები ქვემოთ), რომლებიც ადრე ეპიდემიოლოგიური პერსპექტივიდან იყო დახასიათებული36. იმის გათვალისწინებით, რომ პორტუგალიიდან მონაცემთა ნაკრებში მხოლოდ ევროპული 2 კლონური კომპლექსისა და შტამების წარმომადგენლები არიან დანიშნული კომპლექსების გარეშე, დაემატა საჯაროდ ხელმისაწვდომი მთლიანი გენომის სეკვენირების მონაცემები მონაცემთა ნაკრების გასაფართოებლად, რომელიც მოიცავს M. bovis კლონური კომპლექსების ყველა წარმომადგენელს. ამიტომ, ამ ნაშრომში გამოყენებული იქნა მთლიანი გენომის სეკვენირების სამი მონაცემთა წყარო: გენომის სრული/პროექტის ასამბლეა, NCBI-ში (ბიოტექნოლოგიური ინფორმაციის ეროვნული ცენტრი) შენახული 10-მდე ხარაჩო (n = 15 იზოლატი); SRA-ში შენახული (მიმდევრობის წაკითხვის არქივის Illumina fastq ფაილი) წარმოადგენს M. bovis კლონების კომპლექსურ მრავალფეროვნებას (n = 12 იზოლატი)30; და პორტუგალიიდან 42 ახლად სეკვენცირებული გენომი. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) გამოირიცხა NCBI-ის ძიებიდან. M. bovis AF2122/97 ჩვეულებრივ გამოიყენება, როგორც საცნობარო გენომი, რომელიც მონაცემთა ნაკრებში უნდა შევიდეს. African 1 კლონირების კომპლექსით წარმოდგენილი მთელი გენომის თანმიმდევრობის საჯაროდ მიუწვდომლობისა და Af2 და Eu1-ის წარმომადგენლობითი შტამების გენომების მცირე რაოდენობის გამო, ამ შემთხვევებში გამოყენებული იქნა SRA-ს მიერ მოწოდებული ორიგინალური სეკვენირების მონაცემები. ზიმპელისა და მისი თანამშრომლების (2020) ნაშრომმა ხელი შეუწყო ზემოხსენებული კლონირების კომპლექსიდან გენომის იდენტიფიცირებას და Mycobacterium bovis-ის შერჩევას მონაცემთა ნაკრებში ჩასართავად. Eu3-ისთვის აღწერილია მხოლოდ ერთი ტიპის გენომი (Branger et al., 2020), ამიტომ ჩვენს მიერ შეტანილი გენომი Eu3 კომპლექსის ცალკე წარმომადგენელია.
გლობალურად, ეს მონაცემთა ნაკრები მოიცავს 70 მსხვილფეხა რქოსან M. bovis-ს, რომლებიც იზოლირებულია 8 მასპინძელი სახეობიდან და გავრცელებულია 12 ქვეყანაში 1985 წლიდან 2016 წლამდე. 36 სახეობა დანიშნულია, როგორც Eu2, 7 სახეობა - Eu1, 1 სახეობა - Eu3, 3 სახეობა - Af1, 4 სახეობა - Af2 და 19 არ მიეკუთვნება არცერთ კლონურ კომპლექსს (დეტალები მოცემულია ქვემოთ). ამ კვლევაში გამოყენებული Mycobacterium bovis-ის დეტალური ინფორმაცია (მათ შორის, მისადგომის ნომერი) ნაჩვენებია ცხრილში 1 და დამატებით ცხრილში 1.
ამ კვლევის ცენტრშია პორტუგალიის ცხოველთა ტუბერკულოზის ცხელი წერტილებიდან აღებული Mycobacterium bovis-ის 42 ახლად სეკვენცირებული მთლიანი გენომი, რომლებიც 12 წელზე მეტი ხნის განმავლობაში იყო გავრცელებული, რადგან პოტენციური ველური ბუნებისა და პირუტყვის დაავადებების სისტემები რეგულარულად კონტროლდებოდა 31,36 (დამატებითი სურ. 1). შემდგომი პროცედურების თანახმად, ეს შტამები იზოლირებული იქნა მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვისგან (n = 14), ირმისგან (n = 16) და გარეული ღორისგან (n = 12) 2003 წლიდან 2015 წლამდე: ცხოველების შეგროვება და დამუშავება უნდა მოხდეს რეკომენდებული პროტოკოლის მითითებების შესაბამისად. ქსოვილის ნიმუშები მოცემულია OIE-ს ხმელეთის ცხოველების სახელმძღვანელოში და ინოკულირებულია Stonebrink-ისა და Löwenstein-Jensen-ის პირუვატის მყარ და თხევად გარემოში. კულტურები ინკუბირებულია 37°C ტემპერატურაზე და ზრდა მოწმდება კვირაში ერთხელ მინიმუმ 12 კვირის განმავლობაში. კოლონიები ინახება პირდაპირ გლიცეროლის ხსნარში -80ºC ტემპერატურაზე. Mycobacterium-ის სელექციურ გარემოში (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), ორიგინალი დაარქივებული ნიმუშები გაიარა ერთჯერად in vitro პასაჟში in vitro WGS პროგრამის დნმ-ის მისაღებად. ამისათვის, გაყინული კულტურის საფონდო ხსნარი გამდიდრდა 5%-იანი ნატრიუმის პირუვატით და 10%-იანი ADS-ით (50 გ ალბუმინი, 20 გ გლუკოზა, 8.5 გ ნატრიუმის ქლორიდი 1 ლიტრ წყალში) Middlebrook 7H9-ზე 37°C Retrain ტემპერატურაზე. 4 კვირის ზრდის შემდეგ, გარემო განახლდა და კულტურა რეგულარულად კონტროლდებოდა ზრდის დაკვირვებამდე. უჯრედები შეგროვდა ცენტრიფუგირებით, ნალექი ხელახლა სუსპენზირებული იქნა 500 µლ ფოსფატ-ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში (PBS), გაცხელდა 99°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში, გაცენტრიფუგდა და ზედა ფენა შეინახეს -20°C ტემპერატურაზე WGS-მდე. ყველა პროცედურა ტარდება მე-3 დონის ბიოუსაფრთხოების დაწესებულებებში.
WGS შეწყვილებული ბოლოების გენომის ბიბლიოთეკა მზადდება თითოეული დნმ-ის ნიმუშის უნიკალური ინდექსის გამოყენებით და სეკვენირებისთვის იყენებს Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 ნიმუში) და HiSeq (2 × 150 pb) (ორი იზოლატი) ტექნოლოგიას (Eurofins Genomics, გერმანია). მწარმოებლის ინსტრუქციის თანახმად, გენომური დნმ-ის სეკვენირებისთვის გამოიყენეთ Illumina-ს გენომის ანალიზატორი ორბოლოიანი მოდულის მიმაგრებით, ხოლო ბიბლიოთეკის ასაგებად გამოიყენეთ Illumina-ს Nextera XT DNA Library Prep Kit.
SRA-დან (n = 12) აღებული მონაცემების გათვალისწინებით, კლონური კომპლექსის იდენტიფიკაცია შეიძლება გამოყენებულ იქნას შესაბამისი პუბლიკაციის 30, 41, 43 მეტამონაცემებად. სრული გენომის განხილვისას, Mycobacterium bovis AF2122/97-ისა და Mycobacterium bovis 3601-ის გარდა, რომლებიც შესაბამისად Eu1 და Eu3 კლონური კომპლექსის 25, 29 აღიარებული წევრები არიან, ის იგივეა, რაც Mycobacterium tuberculosis H37Rv-ის სრული გენომის (NCBI-ის სააბონენტო ნომერი NC_000962.3). გენომის გასწორება ხორციელდება MAFFT-ის (ამინომჟავის ან ნუკლეოტიდის თანმიმდევრობის მრავალჯერადი გასწორების პროგრამა, ვერსია 7.458) და პარამეტრის -addfragments48 გამოყენებით. შემდეგ, მოძებნეთ სხვადასხვა კლონური კომპლექსების არარსებობა და/ან SNP მახასიათებლების არსებობა.
ახლად სეკვენირებული Mycobacterium bovis (n = 42) და აწყობილი გენომის პროექტის ორიგინალური წაკითხვები (n = 3) აკავშირებს კომპლექსს Mycobacterium tuberculosis H37Rv-ის საცნობარო გენომთან vSNP მილსადენის მეშვეობით და ადგენს სხვადასხვა კლონების დელეციის და/ან SNP მახასიათებლების არსებობას. ჩატარდა ძიება.
გენომური მონაცემების შესაბამის კლონურ კომპლექსს მიკუთვნებისთვის შეაგროვეთ ინფორმაცია SNP-სა და სპოლიგოტიპირების პროფილების არარსებობის და/ან არსებობის/არარსებობის შესახებ. ოთხივე პროექტის შეკრების შემთხვევაში, სპოლიგოტიპირების პროფილის დადგენა შეუძლებელია, ამიტომ ისინი შედიან „სირთულის არარსებობის“ ჯგუფში.
ამ ნაშრომის შემდგომი ბიოინფორმატიკული სამუშაო პროცესი იწყება de novo აწყობიდან და საცნობარო სტრატეგიამდე მიბმიდან, რომლის მიზანია რეკომბინაციის მოვლენების და გენომის სპეციფიკური პოლიმორფიზმების შესწავლა. სურათი 1 წარმოადგენს შემდეგი ნაბიჯების დიაგრამას. რეკომბინაციის ანალიზისთვის, ყველა გენომი გამოიყენება დასკვნებისა და მასთან დაკავშირებული ინდიკატორების სანდოობის გასაზრდელად.
გენომის კონსენსუსური თანმიმდევრობების გენერირებისას შეცდომების შესამცირებლად, ჩვენ ჯერ მივიღეთ de novo აწყობა, შემდეგ კი ბირთვის მრავლობითი გასწორება. Unicycler-ის მილსადენი ამჟამად ხელმისაწვდომია https://github.com/rrwick/Unicycler49-ზე და გამოიყენება 54 სეკვენირებული გენომის de novo აწყობის შესასრულებლად (42 ახლად სეკვენირებული და 12 fastq ფაილი აღდგენილია SRA-დან). მოკლედ, ნულიდან აწყობამდე, წაკითხვის ხარისხის ანალიზი ჩატარდა FastQC ვერსია 0.11.7-ში (https://github.com/s-andrews/FastQC) და Trimmomatic ვერსია 0.36-ში (გამოიყენება ოფცია "ადაპტერების და სხვა განათების სპეციფიკური თანმიმდევრობების მოჭრა წაკითხვებიდან" და "ბაზების მოჭრა წაკითხვის ბოლოდან, თუ უფრო დაბალია, ვიდრე 20-ის ზღვრული ხარისხი") (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. შემდეგ, გენომის აწყობისთვის გამოყენებული იქნა SPAdes optimizer49, ხოლო აწყობის შემდგომი ოპტიმიზაციისთვის - Pilon ვერსია 1.1851. არასწორი აწყობის თავიდან ასაცილებლად შეირჩა კონსერვატიული შეერთების რეჟიმი და k-mer-ის ზომა მოიძებნა და შეირჩა წაკითხვის სიგრძის 20%-დან 95%-მდე. დაიცავით SPAdes-ის მითითებები და გაითვალისწინეთ წაკითხვის ზომა, წაშალეთ 300 bp-ზე ნაკლები კონტიგები და დაადგინეთ 20 წაკითხვის სიღრმის დაფარვის ზღვარი 52-ის ტოლი. de novo აწყობის სტრატეგიაში, გენომური რეგიონები, როგორიცაა მაღალი განმეორებადობის პროლინ-გლუტამატი (PE) და პროლინ-პროლინ გლუტამატი (PPE) პარალოგები, არ ამოიღეს.
დე ნოვო აწყობის ხარისხი ფასდება QUAST მილსადენის მეშვეობით (http://quast.sourceforge.net/quast.html), რაც ხელს უწყობს კონტიგის განახლებას და M. bovis AF2122/97 საცნობარო გენომის (NCBI-ის სააბონენტო ნომერი LT708304.1) რუკების შედგენას (ხარისხის პარამეტრებისთვის იხილეთ დამატებითი ცხრილი 1).
vSNP მილსადენის (https://github.com/USDA-VS/vSNP) დახმარებით, Illumina-ს სეკვენირების შედეგად ახლად სეკვენირებული M. bovis-ის FASTQ ფაილი შედარებულია M. bovis AF2122/97 საცნობარო გენომთან (LT708304.1)). გენომის ანალიზის ხელსაწყოების (GATK) 53, 54, 55 საუკეთესო პრაქტიკის რეკომენდაციების შესაბამისად, ხელახალი კალიბრაციისთვის გამოიყენება სტანდარტული ფილტრის პარამეტრები ან ვარიანტის მასის ქულები. შედეგები იფილტრება ყველაზე დაბალი SAMtools მასის ქულის 150-ის და AC = 2-ის გამოყენებით. ასევე, დაბინძურების გამოსარიცხად გამოიყენება Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) ჩვენებების შესამოწმებლად. ჩვენს ნაშრომში თანმიმდევრობის სტრატეგიებთან შესაბამისობისთვის გამოყენებული vSNP მილსადენი იკვლევს განსაზღვრული SNP-ებისა და სამიზნეების სერიას და ასევე გამორიცხავს შერეულ ინფექციის სცენარებს. წაკითხული გენომის დაფარვა 99%-ზე უკეთესია (დამატებითი ცხრილი 1).
რუკების შედგენის შეცდომებისა და არასწორი SNP-ების თავიდან ასაცილებლად, გაფილტრეთ ვარიანტი შემდეგ შემთხვევებში: (1) ის დასტურდება 20-ზე ნაკლები წაკითხვით, (2) ის გვხვდება 0.9-ზე ნაკლები სიხშირით, (3) ის არის სულ მცირე ერთ შტამში, მაგრამ სულ მცირე სხვა შტამში არის ხარვეზები. ინტეგრირებული გენომიკის მნახველი (IGV) ვერსია 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 გამოყენებული იქნა რუკების შედგენის ან განლაგების პრობლემების მქონე SNP-ებისა და პოზიციების ვიზუალურად დასადასტურებლად. ვინაიდან პროლინ-გლუტამატის (PE) და პროლინ-პროლინ გლუტამატის (PPE) გენები ძლიერ დუბლირებულია და მრავალგენური ოჯახის ნაწილია, ისინი ადვილად არასწორად არის გაგებული Illumina-ს სეკვენირებისა და არასწორი რუკების გამოყენებით, ამიტომ ისინი უფრო სასურველია. მიკობაქტერიული ბიოინფორმატიკის სამუშაო პროცესში ტუბერკულოზის კომპლექსის წევრები ამოღებულია რუკების შედგენის სტრატეგიის გამოყენებისას SNP-ების დასადასტურებლად. ამიტომ, ჩვენ გავფილტრეთ PE/PPE გენები და ინდელები ანალიზიდან.
Bovilist-ის (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) მიხედვით, ყველა SNP ფუნქციურ კატეგორიებად იყოფა. SNP შედეგების (სინონიმური ან არასინონიმური ცვლილებები) დასადგენად გამოიყენება SnpEff-ის მილსადენი (https://pcingola.github.io/SnpEff/). შეიქმნა Mycobacterium bovis AF2122/97 გენომის ახალი მონაცემთა ბაზა (LT708304.1).
ბირთვის გენომის მრავლობითი გასწორება განხორციელდა Parsnp v1.2-ის გამოყენებით, რომელიც ამჟამად ხელმისაწვდომია https://github.com/marbl/parsnp57-ზე, 69 სრული გენომის/პროექტის შეკრების გამოყენებით (-c ვარიანტით) და M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) გამოყენებულია როგორც საცნობარო. ჩატარდა ოთხი ბირთვის მრავლობითი გასწორება: მხოლოდ Eu2 კლონირების კომპლექსის წევრები (n = 37), მათ შორის ევროპული კლონირების კომპლექსის ყველა წევრი (n = 44), მათ შორის ევროპული და აფრიკული კლონირების კომპლექსის შეერთების წერტილი (n = 51) და მოიცავს ამ კვლევაში მონაწილე ყველა Mycobacterium bovis-ს (n = 70).
Parsnp-ის მიერ გენერირებული ბირთვის განლაგება გამოიყენება მაქსიმალური ალბათობის (ML) ფილოგენეტიკური ხის დასადგენად CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 გამოყენებით RAxML-ის გამოყენებით და 1000 მართვადი რეპლიკაციის შესასრულებლად.
რეკომბინაციის მოვლენების არსებობის პარალელურად შესამოწმებლად გამოიყენება სამი განსხვავებული ალგორითმი და ბიოინფორმატიკული ინსტრუმენტი: SplitsTree4 პროგრამული უზრუნველყოფა, Gubbins-ის (ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობების რეკომბინაციის გზით ობიექტური შტო) მილსადენი და RDP4 (რეკომბინაციის აღმოჩენის პროგრამა, ბეტა ვერსია 4.101) პროგრამული უზრუნველყოფა.
SplitsTree4 v4.15.1-ში (http://www.splitstree.org/)59 დანერგილი გაყოფილი დეკომპოზიციის მეთოდი გამოიყენება ფესვების გარეშე ფილოგენეტიკური ქსელის გამოსათვლელად, სტატისტიკური ვერიფიკაციისთვის Phi ტესტის გამოყენებით, ხოლო მნიშვნელოვნების ზღვარი არის p = 0.05. Parsnp-ის ძირითადი მრავალმხრივი გასწორების ანალიზი გამოიყენება შეყვანის სახით და ხორციელდება გაყოფილი დეკომპოზიცია, როგორც ქსელის სტანდარტი.
გაბინსის მილსადენი v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) მუშაობს ნაგულისხმევი პარამეტრებით, როგორც Mycobacterium bovis-ზე რეკომბინაციის გავლენის შეფასების კიდევ ერთი გზა. მილსადენში დანერგილი ალგორითმი ახდენს შესაბამისი კლონური შტოს რეკონსტრუქციას. ჩვენი მონაცემთა ნაკრების სრული გენომი/პროექტის ასამბლეა და საცნობარო გენომი (ძროხის ხორცი AF2122/97, LT708304.1) ურთიერთდაკავშირებულია; და სკანირებენ SNP-ის პოზიციას ხის თითოეულ ტოტზე, რათა აღმოაჩინონ SNP კლასტერი, რომელიც წარმოადგენს რეკომბინაციის მოვლენას. ტოტის ნული. ვივარაუდოთ, რომ არ არსებობს რეკომბინაციის მოვლენა, რაც ნიშნავს, რომ ტოტზე წარმოქმნილი SNP-ები თანაბრად უნდა იყოს განაწილებული. Parsnp-დან მიღებული ბირთვის მრავლობითი გასწორება და RAxML-დან მიღებული საუკეთესო შეფასების მქონე ML ხე გამოიყენება შეყვანის ფაილებად.
და ბოლოს, გაბინსის მილსადენის მიერ შემოთავაზებული რეორგანიზაციის მოვლენის დასადასტურებლად, RDP467-ში დანერგილი ექვსი ალგორითმი (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 და SiScan66) გამოიყენება Parsnp-ის ბირთვის მრავალჯერადი გასწორების ნაგულისხმევი პარამეტრებით. ჩვენ დავადგინეთ, რომ RDP4-ში დანერგილი ალგორითმებიდან სულ მცირე სამი თანმიმდევრულად უნდა აჩვენოს მნიშვნელოვანი სიგნალი თითოეული რეკომბინაციის მოვლენის დასადასტურებლად.
იმის გათვალისწინებით, რომ როგორც Gubbins-ის, ასევე RDP-ის პროგრამული უზრუნველყოფა ეძებს რეკომბინაციის სიგნალებს 500 bp-მდე ფანჯარაში ბირთვის მრავლობითი განლაგების შემოწმებით და იმის დადასტურებით, რომ de novo აწყობის დროს PE/PPE გენების ჩართვა ხელს არ შეუშლის ნაპოვნი რეკომბინაციის სიგნალებს, შემდგომი ანალიზი ტარდება ჰომოლინარულობის მეთოდით. მოწმდება რეკომბინაციის მოვლენის იდენტიფიცირების გენის სიახლოვე. სრული გენომის გამოყენებით სინლინარული რუკა აგებულია MAUVE-მრავალგენომის განლაგების გამოყენებით (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html), რათა გამოირიცხოს გენომის ლოკალური ტრანსლოკაციები ან ინვერსიები. გარდა ამისა, მთელი გენომი გამოყენებული იქნა ამინომჟავების თანმიმდევრობაზე ჰომოლინარულობის ანალიზის შესასრულებლად SyntTax ვებ სერვერის მეშვეობით (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
პორტუგალიური მრავალმასპინძლიანი ტუბერკულოზური სისტემიდან მიღებული გენომის მონაცემთა ნაკრების უფრო სიღრმისეული ანალიზი ლიტერატურაში ნახსენები გენების პოლიმორფიზმის შემოწმებას ისახავს მიზნად. ეს გენებია 37,38 და 3R-ის კოდირების გენი, რომელიც MTBC წინაპრებმა HGT (დნმ-ის შეკეთება, რეპლიკაცია და რეკომბინაცია) სისტემის კომპონენტების მეშვეობით 39 მიიღეს. გენების და ნუკლეოტიდების მრავალფეროვნების (π) და Tajima-ს D ნეიტრალური ტესტის პარამეტრის შეყვანის გამოსათვლელად გამოიყენეთ ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) და DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) ვერსია.
მაქსიმალური ალბათობის (ML) ფილოგენეტიკური ხე მიღებული იქნა 69 Mycoplasma bovis იზოლატსა და საცნობარო გენომზე დაყრდნობით (სურათი 2A). ერთ გენზე დაფუძნებულ ან მრავალ ლოკუსზე დაფუძნებულ ხეებთან შედარებით, ეს სტრატეგია საშუალებას იძლევა შეიქმნას უფრო ძლიერი ხეები, რომლებიც არ აღიქვამენ მთელი გენომის ცვალებადობას და შესაბამისად, ავლენენ სახეობების გარჩევის უფრო დაბალ უნარს 68,69. ML ხის ტოპოლოგიური სტრუქტურა, როგორც წესი, შეესაბამება კლონების კომპლექსურ კლასიფიკაციას. Eu2-ის გენომი დაჯგუფებულია ტოტად, ხოლო Af1-ის გენომი ასევე დაჯგუფებულია ერთად (სურათი 2A). შედეგი ასევე შეესაბამება Mycobacterium bovis-ის ცნობილ ევოლუციურ ურთიერთობას, ანუ დიდი განსხვავებაა Eu1 წევრსა და ყველა სხვა კლონური კომპლექსისა და გენომისგან შემდგარ ჯგუფს შორის, მაგრამ კლონური კომპლექსი 30 არ არის მითითებული. კლონურ კომპლექსსა და ფილოგენეტიკურ ხეზე დაფიქსირებულ ურთიერთობას შორის მცირე შეუსაბამობა შეიძლება აიხსნას იმით, რომ კლონური კომპლექსი აღწერილია კონკრეტული გენომური რეგიონების საფუძველზე, ხოლო ფილოგენეტიკური ხე ეფუძნება მთელი გენომის წარმომადგენლობითი ბირთვული გენომების მრავალჯერად განლაგებას.
მაქსიმალური ალბათობის ფილოგენეტიკური ხე (GTR) აგებულია Mycobacterium bovis გენომის ძირითადი გენომის განლაგების საფუძველზე რეკომბინაციის ადგილის მოცილებამდე (A) და მის შემდეგ (B). ტოტების ფერები წარმოადგენს Mycobacterium bovis კლონების კომპლექსს: ევროპა 1 არის იისფერი, ევროპა 2 - წითელი, ევროპა 3 - ლურჯი, აფრიკა 1 - ნარინჯისფერი, ხოლო აფრიკა 2 - მწვანე. ხე ფესვგადგმულია და მასშტაბურად არის დახატული, ხოლო ტოტის სიგრძე იზომება თითოეული ადგილის ჩანაცვლების სახით.
Mycobacterium tuberculosis კომპლექსი აღწერილია, როგორც კლონურად ევოლუირებული და წლების განმავლობაში დაგროვილი მტკიცებულებების უმეტესობა ადასტურებს იმ აზრს, რომ მიმდინარე HGT და რეკომბინაციის მოვლენები არ მოხდება MTBC15,17,18-ის აღმოსაჩენ დონეზე.
წინა ნაშრომებმა აჩვენა, რომ MTBC შტამებს შორის შესაძლოა შეზღუდული რეკომბინაცია იყოს20,21, ხოლო სხვა ნაშრომებმა ვერ შეძლეს გაზომვადი რეკომბინაციის მოვლენების იდენტიფიცირება70,71. ხელახლა განიხილეთ ეს საკითხი Mycobacterium bovis-ზე ფოკუსირებით, რომელიც განსხვავდება წინა ნაშრომისგან, რომელიც მხოლოდ Mycobacterium tuberculosis-ს განიხილავდა70,71; ან განიხილეთ MTBC მთლიანობაში, სადაც M. bovis თითქმის არ წარმოადგენს20; ან განიხილეთ მხოლოდ შეზღუდული მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვის ფრაქციები. ამ ნაშრომში მიკობაქტერიების მონაცემთა ნაკრები სულ 70 შტამია, რომლებიც წარმოადგენს ყველა კლონურ კომპლექსს, რომლებიც გამოიყენება რეკომბინაციის სკრინინგისთვის. მონაცემთა ნაკრები მასშტაბირებულია ოთხი კუმულაციური დონის მიხედვით: (1) Eu2 წევრი, (2) ყველა ევროპული კლონური კომპლექსის წევრი (ანუ ევროპა), (3) ევროპული და აფრიკული კლონური კომპლექსი (Eu + Af) და (4) მთელი მონაცემთა კოლექციები (მათ შორის გენომები, რომლებიც არ შედის უკვე აღწერილ არცერთ კლონირების კომპლექსში).
ამ ჰიპოთეზის შემდგომი შესწავლის მიზნით, გენომებს შორის რეკომბინაციის მოვლენების არარსებობის შესაფასებლად ჩატარდა გაყოფილი დეკომპოზიციის ქსელი, რადგან ამ მეთოდს შეუძლია ინდივიდებს შორის წინაპრების ნათესაური კავშირის ვიზუალიზაცია და ფილოგენეტიკური კონფლიქტური სიგნალების ჩვენება. ანალიზში ოთხივე მონაცემთა ნაკრებმა დაადასტურა ქსელში მარყუჟების არსებობა (ანუ ისეთი უბნები, რომლებიც ერთ ხედ არ იკრიბება), მაგრამ Phi ტესტს სტატისტიკური მხარდაჭერა არ გააჩნია (Eu2, p = 0.0956; ევროპა, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; მთელი მონაცემთა ნაკრები p = 0.2451), რაც რეორგანიზაციის მოვლენების არსებობის სუსტ მტკიცებულებას იძლევა (სურათი 3A-D).
ევროპაში 2 გენომი (n = 37) (A), ევროპული გენომები (n = 44) (B), ევროპული და აფრიკული გენომები (n = 51) (C) და მთლიანი მონაცემთა ნაკრები (n = 70) (D).
ამ ანალიზის შემდეგ და ყველა ქსელში ციკლური დაკვირვებების გათვალისწინებით, კლონური შტოს რეკონსტრუქციისა და M. bovis-ის გენომზე რეკომბინაციის ეფექტის შეფასების დასამატებლად გამოყენებული იქნა გაბინსის მილსადენში დანერგილი რეკონსტრუქციის ალგორითმი. გამოიტანეთ რეკომბინაციის მოვლენების კუმულაციური რაოდენობა, რომელთა უმეტესობა ტერმინალურ ტოტებში (ანუ ერთ გენომში) მოხდა (ცხრილი 2). ეს ინდიკატორები აჩვენებს მთელი მონაცემთა ნაკრების თანმიმდევრულობას და მიუთითებს, რომ რეკომბინაციის მოვლენების სიხშირე მუტაციების სიხშირეზე 200-დან 300-ჯერ მეტია. როგორც ჩანს, rho/theta პარამეტრი, რომელიც წარმოადგენს რეკომბინაციისა და წერტილოვანი მუტაციების ფარდობით სიჩქარეს ტოტზე, 0.0037-დან 0.0056-მდე დიაპაზონშია (ცხრილი 3). ცოტა ხნის წინ, 38 M. bovis შტამის შესახებ გამოქვეყნებულმა ნაშრომმა აჩვენა rho/theta-ს უფრო მაღალი მნიშვნელობა (rho/theta = 0.1), ვიდრე ამ მონაცემთა ნაკრებში მიღებულს, თუმცა პატანეს და მისი კოლეგების ნაშრომში გამოყენებული იქნა საცნობარო აწყობა რეკომბინაციის პარამეტრების დასადგენად. აწყობის პროცედურის გამო პროცედურული დეტალი დაკავშირებულია ტერმინალურ ტოტში სავარაუდო რეკომბინაციის მოვლენების სიმრავლესთან.
შემდეგ, r/m პარამეტრი წარმოადგენს რეკომბინაციისა და მუტაციის შეყვანის მრავალფეროვნების თანაფარდობას და მისი საშუალო მნიშვნელობა 0.025-დან 0.037-მდე მერყეობს, რაც მიუთითებს, რომ მუტაციებთან შედარებით, რეკომბინაციას უფრო დაბალი საერთო გავლენა აქვს M. bovis-ის გენეტიკურ მრავალფეროვნებაზე (ცხრილი 3). ვრცელი შედარებისთვის, მსგავსი მეთოდი გამოყენებული იქნა 23 გენომისგან შემდგარი MTBC მონაცემთა ნაკრებისთვის r/m პარამეტრის შესაფასებლად, რაც აჩვენებს საშუალო მნიშვნელობას 0.48620, ხოლო პატანეს და მისი კოლეგების 38 M. bovis მონაცემთა ნაკრებისთვის დადასტურდა, რომ საშუალო მნიშვნელობა 0.98-ია. პირველ კვლევაში, M. bovis-ის ნაშრომში შეტანილი 23 გენომიდან მხოლოდ ორი იყო (M. bovis BCG და საცნობარო შტამი), ამიტომ მიღებული მნიშვნელობა შეიძლება მიკერძოებული იყოს M. tuberculosis-ის გენომის ჭარბი ექსპრესიის გამო. მეორე ანგარიშში, გაანალიზებული Mycobacterium bovis პოპულაციები ძირითადად აღებული იყო შეერთებული შტატებიდან და შინაური ცხოველებიდან. ამის საპირისპიროდ, ჩვენს მონაცემთა ნაკრებში წარმოდგენილია მეტი გეოგრაფიული ადგილმდებარეობა და მასპინძელი სახეობა, ასევე გამოიყენება გენომები, რომლებიც დაჯგუფებულია სხვადასხვა კლონურ კომპლექსებში სხვადასხვა პოპულაციური გენეტიკური მახასიათებლებით, რითაც მიიღწევა პოპულაციის უფრო ღრმა და ფართო ცოდნა. ჩვენი მონაცემთა ნაკრებით მიღებული r/m საშუალო სხვაობის მნიშვნელობა შეესაბამება იმ კონცეფციას, რომ რეკომბინაციის ხარისხი მნიშვნელოვნად განსხვავდება ერთი და იგივე ტაქსონომიური სახეობისთვის მინიჭებულ შტოებს შორის, ამიტომ ეს შედეგები მიუთითებს, რომ M. bovis-ის კლონურ კომპლექსს შეიძლება ჰქონდეს რეკომბინაციური განსხვავებები. გავლენა ასევე შეესაბამება დიდელოტის და მეიდენის72 მიერ ვარაუდს. მიუხედავად ამისა, ამ მონაცემთა ნაკრების მნიშვნელოვნად გაფართოება M. bovis-ის გენომების უფრო დიდი რაოდენობის ჩართვით საშუალებას მოგვცემს, კიდევ უფრო განვმარტოთ ეს საკითხი. როგორც r/m, ასევე rho/theta პარამეტრები აჩვენებს ცვალებადობას ტოტებს შორის და ეს შედეგი შეესაბამება სხვა ბაქტერიული სახეობების შესახებ ცნობებს72,73.
და ბოლოს, გაბინსის მილსადენის მიერ იდენტიფიცირებული რეორგანიზაციის მოვლენების დასადასტურებლად, RDP4 პროგრამულ უზრუნველყოფაში გამოყენებული იქნა ექვსი განსხვავებული ალგორითმი, რათა დამოუკიდებლად შემოწმებულიყო სხვადასხვა ძირითადი მულტი-შედარებები. გლობალურად, გაბინსის მიერ იდენტიფიცირებული მოვლენების ნახევარზე ნაკლები დადასტურდა RDP4-ით (ცხრილები 4 და 5). მთლიანი მონაცემთა ნაკრების გათვალისწინებით, დადასტურდა სამი რეკომბინაციის მოვლენა, რომელთაგან ორი მოიცავდა შიდა კვანძებს, ხოლო მეორე მოიცავდა ერთ გენომს ტერმინალურ ტოტში, რომლის კლონური კომპლექსების მინიჭება შეუძლებელი იყო (ცხრილები 4 და 5). ტერმინალურ ტოტებში მოვლენების იდენტიფიცირება შეიძლება მიუთითებდეს, რომ რეკომბინაცია კვლავ მიმდინარეობს თანამედროვე M. bovis შტამებში ან შედეგი არასწორად არის განთავსებული70. ამ ჰიპოთეტურ რეკომბინაციის რეგიონში, პოზიციების დაახლოებით 20%-ს აქვს განუსაზღვრელი ნუკლეოტიდები (N), რაც გავლენას ახდენს რეკომბინაციის სიგნალზე (დამატებითი სურათი 2). გარდა ამისა, ეს რეგიონი გავლენას ახდენს rrs გენზე, რომელიც აკოდირებს 16S რიბოსომული რნმ-ს, რომელიც, სავარაუდოდ, მაღალკონსერვატიულია, ამიტომ ეს სავარაუდო რეკომბინაციის სიგნალი შეიძლება იყოს სეკვენირების შეცდომების ან არასწორი განლაგების შედეგი. შემდეგ ჩატარდა მთელი გენომის განლაგება Mb0003-სა და Mycobacterium bovis AF2122/97-ს შორის და დადასტურდა განუსაზღვრელი ნუკლეოტიდების და SNP-ების არსებობა, ამიტომ არასწორ განლაგებასთან დაკავშირებული შესაძლო პრობლემები არ იყო გამოწვეული ამ ნაშრომში დანერგილი ბიოლოგიური ინფორმაციით. გამოჩნდა პროგრამის შესწავლის შემდეგ.
შიდა კვანძების რეკომბინაციის რეგიონებში არ აღმოჩნდა ხარვეზები ან განუსაზღვრელი ნუკლეოტიდები (სურათი 4 და 5). ამ მოვლენებთან დაკავშირებით, ერთი შეიცავს მხოლოდ Eu2 გენომს და გავლენას ახდენს pks12 გენზე, რომელიც აკოდირებს შესაძლო პოლიკეტიდ სინთაზას; ხოლო მეორე რეგისტრირებულია Eu1 გენომში და გავლენას ახდენს narX გენზე, რომელიც აკოდირებს შესაძლო ნიტრატ რედუქტაზას (ცხრილი 4). ზოგადად, რეკომბინაციის ანალიზი აჩვენებს, რომ სტატისტიკურად დადასტურებული რეკომბინაციის ფრაგმენტების რაოდენობა შეზღუდულია და გამოტანილი ინდიკატორები მიუთითებს, რომ რეკომბინაციას დაბალი გავლენა აქვს M. bovis-ის შტოზე. რეკომბინაციის სიგნალი, სავარაუდოდ, დაბალი იქნება, მაგრამ მნიშვნელოვანია ნამდვილი ევოლუციის სიგნალის გარჩევა ფონური ხმაურისგან, რაც რთული ამოცანაა. საცნობარო აწყობისა და შეუსაბამობის პრობლემებით 70, 71 შემოტანილი ხმაურის სიგნალის შესამცირებლად, სრული გენომის გარდა ყველა დანარჩენი ნულიდან აიწყო და აწყობის ხარისხი შემოწმდა და უზრუნველყოფილი იქნა QUAST მილსადენის ანალიზით (დამატებითი ცხრილი 1). გარდა ამისა, ჩატარდა დამატებითი ანალიზების სერია საერთო კვლევის სიზუსტისა და სანდოობის უზრუნველსაყოფად. ამიტომ, narX და pks12 გენების სეკვენირების ხარისხი შეფასდა Mycobacterium bovis AF2122/97-ის მიმართ წაკითხვის რუკების შედგენით. რეკომენდებული SNP პოზიცია რეკომბინაციის რეგიონში დადასტურდა მეთოდის განყოფილებაში მითითებული კრიტერიუმების გამოყენებით (მინიმუმ 20 წაკითხვა და 0.9 ცვლილების სიხშირე). narX გენის პოლიმორფიზმი სრულად დადასტურდა ორ გენომში (Mb1792361 და Mb7240415; 2.3%) და pks12 გენომის გენომებში: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 და Mb12 გენები. თუმცა, Mb2043 გენომისთვის, რვა პოზიციიდან ექვსი არ აკმაყოფილებს წაკითხვის სიღრმის კრიტერიუმს, რადგან SNP-ს მაქსიმუმ 17 წაკითხვა ადასტურებს, რაც დადგენილ 20-იან ზღვრულ მნიშვნელობაზე ნაკლებია. ამრიგად, ამ გენომის უბანზე ექვსი გენომის (8.6%) რეკომბინაციის დადასტურება შესაძლებელია (სურათები 4 და 5).
Mycobacterium bovis მონაცემთა ნაკრების რეკომბინაციული რეგიონის განლაგების დეტალური ვიზუალიზაცია გავლენას ახდენს narX გენზე, რომელიც აკოდირებს ნიტრატ რედუქტაზას შესაძლო ვერსიას. შიდა კვანძების რეკომბინაციული რეგიონის ნახვრეტები ან განუსაზღვრელი ნუკლეოტიდები არ აღმოჩნდა. ეს კონკრეტული მოვლენა რეგისტრირებულია Eu1 გენომში. narX გენის სეკვენირების ხარისხი შეფასდა Mycobacterium bovis AF2122/97-ის წაკითხვის გრაფიკით. დაადასტურეთ რეკომენდებული SNP მდებარეობა რეკომბინაციული არეალში მეთოდის განყოფილებაში მითითებული კრიტერიუმების გამოყენებით (მინიმუმ 20 წაკითხვის და 0.9 ცვლილების სიხშირის). narX გენის პოლიმორფიზმი სრულად დადასტურდა Mb1792361 და Mb7240415 გენომებში (2.3%).
Mycoplasma bovis მონაცემთა ნაკრების pks12 გენზე მოქმედი რეკომბინაციული რეგიონის დეტალური ვიზუალიზაცია. შიდა კვანძების რეკომბინაციული რეგიონის არეში არ აღმოჩნდა ხარვეზები ან განუსაზღვრელი ნუკლეოტიდები. შესაძლო პოლიკეტიდ სინთაზას კოდირების pks12 გენზე მოქმედი მოვლენის თვალსაზრისით, ის მხოლოდ Eu2 გენომს შეიცავს. pks12-ის სეკვენირების ხარისხი შეფასდა Mycobacterium bovis AF2122/97-ის წაკითხვის რუკით. დაადასტურეთ რეკომენდებული SNP მდებარეობა რეკომბინაციის არეალში მეთოდის განყოფილებაში მითითებული კრიტერიუმების გამოყენებით (მინიმუმ 20 წაკითხვა და 0.9 ცვლილების სიხშირე). Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 და Mb1960 გენომების პოლიმორფიზმები სრულად დადასტურდა.
PE და PPE გენებს აქვთ განმეორებადი რეგიონები, რომლებიც ადვილად იკითხება არასწორად Illumina-ს სეკვენირებისა და არასწორად რუკების შექმნისას, ამიტომ ისინი, როგორც წესი, წაიშლება M. tuberculosis-ის წევრების ბიოინფორმატიკული სამუშაო პროცესიდან მხოლოდ თანმიმდევრობაზე რუკების შედგენის სტრატეგიის გამოყენებისას. ამ ნაშრომში გამოყენებული რეკომბინაციის მოვლენების დასკვნა ეფუძნება de novo აწყობას PE/PPE-ს ფილტრაციის გარეშე. ჩვენ გვჯერა, რომ SplitsTree-ს, Gubbins-ის მილსადენისა და RDP4 პროგრამული უზრუნველყოფის მეშვეობით სამი განსხვავებული დამატებითი მეთოდისა და ალგორითმის განხორციელებით, გამოყენებული სტრატეგიები მდგრადია შეცდომის სიგნალებით გამოწვეული რეორგანიზებული რეგიონების დამუშავებისა და ფილტრაციისთვის. თუმცა, იმისათვის, რომ გამოირიცხოს PE/PPE გენის ჩარევა Gubbins-ისა და RDP4 პროგრამულ უზრუნველყოფაზე SNP კლასტერების იდენტიფიცირებისთვის და, შესაბამისად, იმ რეკომბინაციის რეგიონების იდენტიფიცირებისთვის, რომლებიც სავარაუდოდ გავლენას ახდენენ narX და pks12 გენებზე, შესწავლილი იქნა ამ გენების სიახლოვე (დამატებითი სურ. 3-5). M. bovis AF2122/97-ში narX გენი გამოყოფილია narK2-ით და Mb1764c-ით, ხოლო pks12 გარშემორტყმულია Mb2075c-ით და Mb2073c-ით (დამატებითი სურათი 3-5). სრული გენომის MAUVE სინლინური რუკის გამოყენებით გენერირებული რუკა იძლევა ინფორმაციას გენის თანმიმდევრობის კონსერვაციისა და გადალაგების შესახებ, აჩვენებს ოთხ კოლინეარულ ბლოკს და გენომის ტრანსლოკაციის ან ინვერსიის ნიშნებს. გარდა ამისა, ამინომჟავების თანმიმდევრობით კომპლემენტაციის ანალიზმა დაამტკიცა ჰომოლოგია ყველა სრულ გენომში და narX-ის ან pks12-ის მიმდებარე რეგიონებში PE/PPE არ აღმოჩნდა. narX-ის შემთხვევაში, ერთ გენომს (Mb0030) აქვს უფრო დაბალი სინონიმური ქულა, რადგან narX გენი იდენტიფიცირებული იქნა როგორც ორი ფრაგმენტი (ფრაგმენტები 1891 და 1890). pks12-ის შემთხვევაში, მსგავსების გამო, Mb0030-მა და Mb003-მა აჩვენეს სინლინეარობის უფრო დაბალი ქულები, მაშინ როდესაც pks12 იდენტიფიცირებული იქნა შესაბამისად ორ და სამ ფრაგმენტში, რომლებიც წარმოადგენენ ცილის სხვადასხვა დომენებს (დამატებითი სურათი 3-5). ამ ინფორმაციის გათვალისწინებით, და გაბინსის და RDP4 პროგრამული უზრუნველყოფის მიერ ორივეს მიერ ჩატარებული ანალიზის შედეგად, ფანჯარაში მაქსიმალური 500 bp-ის ბირთვის მრავლობითი განლაგების შემოწმებით, ჩვენ დავადასტურეთ, რომ PE/PPE გენი ხელს არ შეუშლის რეკომბინაციის სიგნალს, რომელიც გავლენას ახდენს narX-სა და pks12-ზე.
მიუხედავად იმისა, რომ ამ მონაცემთა ნაკრებში აღმოჩენილი რეკომბინაციის სიგნალები შეიძლება ჩაითვალოს ნარჩენებად, მართალია, რომ M. bovis-ში რეკომბინაციის გამორიცხვა შეუძლებელია, ამიტომ ის შემდგომი ანალიზის საგანი უნდა იყოს, რომლის დროსაც სხვადასხვა ეპიდემიოლოგიური სცენარიდან მთელი გენომები სეკვენირებული იქნება მნიშვნელოვან კატეგორიამდე.
რეკომბინაციის კორექციამდე და მის შემდეგ მიღებული ML ფილოგენეტიკური ხეების შედარებამ (სურათი 2A, B) არ გამოიწვია მნიშვნელოვანი ცვლილებები დაშვებულ ფილოგენეზურ ურთიერთობაში და M. bovis-ის შტამები ერთსა და იმავე ჯგუფში იყო დაჯგუფებული.
M. bovis-ის AF2122/97-ის საცნობარო გენომთან 42 ახლად სეკვენცირებული M. bovis-ის წაკითხვის შემდეგ, მიღებულ იქნა 1816 პოლიმორფული პოზიციის შემცველი SNP განლაგება. SNP-ების უმეტესობა (87.1%) მდებარეობს კოდირების რეგიონში და დაზარალებული გენები დახასიათებულია Bovilist-ში ნაჩვენები ფუნქციური კატეგორიების მიხედვით (სურათი 6A, B). თითოეულ ფუნქციურ კატეგორიაში გენების საერთო რაოდენობის გათვალისწინებით, „ლიპიდური მეტაბოლიზმის“ კატეგორიაში გენებმა აჩვენეს მეტი SNP, შემდეგ მოდიოდა „უჯრედის კედლისა და უჯრედის პროცესები“ და „შუალედური მეტაბოლიზმი და სუნთქვა“, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ისინი M. bovis-ის ევოლუციის პროცესში არიან.
პორტუგალიიდან M. bovis-ის მონაცემთა ნაკრების იერარქიული ანალიზი (n = 42). თითოეული ფუნქციური კატეგორიის მიხედვით რეგისტრირებული SNP-ებისა და დაზარალებული გენების საერთო რაოდენობა (A). ფუნქციური კატეგორიის მიხედვით რეგისტრირებული სინონიმური და არასინონიმური ცვლილებების საერთო რაოდენობა (B).
გლობალური მასშტაბით, საშუალო dN/dS თანაფარდობა 1.5-ზე უკეთესია, რაც მიუთითებს, რომ გლობალური ევოლუციური ზეწოლა წინაპრების მდგომარეობისგან თავის დაღწევაზეა ორიენტირებული და წარმოადგენს დადებით (დივერსიფიცირებულ ან მიმართულ) და/ან მოდუნებულ გამწმენდი არჩევანის სცენარს. „ვირულენტობის, დეტოქსიკაციის, ადაპტაციის“, „ჩასმის თანმიმდევრობების და ფაგების“ და „მარეგულირებელი ცილების“ კატეგორიებში, SNP-ების ორ მესამედზე მეტი არასინონიმია (სურათი 6B).
ყველა კატეგორიაში არსებობს გენები მრავალი SNP-ით, რაც იწვევს საშუალო მუტაციის სიჩქარეს (ანუ საშუალო SNP თითო გენზე) 1-ზე მეტს (სურათი 6A). Pks12-ს (Mb2074c) 15 SNP-ით და fas-ს (Mb2553c) 8 SNP-ით უფრო მაღალი მუტაციის მნიშვნელობები აქვთ. ორივე ეს გენი მონაწილეობს ცხიმოვანი მჟავების მეტაბოლიზმში. pks გენი აკოდირებს პოლიკეტიდ სინთაზას (PKS), რომელიც არის მრავალფუნქციური ფერმენტი, რომელიც მონაწილეობს მიკობაქტერიული უჯრედის კედლის ლიპიდების ბიოსინთეზში74,75. ეს გენი აკოდირებს მრავალფუნქციურ პოლიპეპტიდს, რომელიც მონაწილეობს მიკოკეტიდების სინთეზში74,76. fas გენი მონაწილეობს მიკოლის მჟავის სინთეზში. ორივე ეს გენი მნიშვნელოვან როლს ასრულებს უჯრედის კედლის ბიოსინთეზში მასპინძელთან კონტაქტში.
Mycobacterium bovis-ის ევოლუციის შემდგომი შესწავლის მიზნით, გაანალიზდა სპეციფიკური გენების ორი ნაკრები. ადრე გამოქვეყნებულ ნაშრომებში, რომლებიც იყენებდნენ თანმიმდევრობის შემადგენლობას და ფილოგენეტიკურ მეთოდებს, გამოვლინდა გენები, რომლებიც MTBC-ის წინაპრებმა დივერსიფიკაციამდე HGT-ის მეშვეობით შეიძინეს37,38. ეს გენები ჩამოთვლილია დამატებით ცხრილში 2. გაანალიზდა HGT-სთან დაკავშირებული სულ 77 გენის SNP განაწილება და იდენტიფიცირებული იქნა 26 პოლიმორფული უბანი, რამაც უმეტეს შემთხვევაში (78%) გამოიწვია არასინონიმური (NS) ცვლილებები (დამატებითი ცხრილი 2). MTBC გენომზე წინა ნაშრომებმა აჩვენა, რომ სავარაუდო HGT რეგიონი ავლენს NS SNP-ის უფრო მაღალ თანაფარდობას გენომის დანარჩენ ნაწილთან შედარებით. თუ ვივარაუდებთ, რომ ეს რეკომბინაციის რეგიონები MTBC-ის წინაპრებმა შეიძინეს და, შესაბამისად, ისინი ჭარბად წარმოადგენენ უძველეს პოლიმორფიზმებს, მაშინ სინონიმური ცვლილებების პროპორცია, სავარაუდოდ, უფრო მაღალი იქნება, რადგან NS ჩანაცვლებები, სავარაუდოდ, აღმოიფხვრება უარყოფითი შერჩევით, რადგან ამინომჟავების ცვლილებებმა შეიძლება შეცვალოს ცილის ფუნქცია. ამრიგად, ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ ფუნქციური შედეგები შეიძლება გამოწვეული იყოს HGT-ის მსგავსი გენების ჩანაცვლებით, რაც ასახავს მათ მნიშვნელობას ღირებული ადაპტური გენეტიკური მრავალფეროვნებისთვის.
ამ ანალიზის პარალელურად, 3R (დნმ-ის შეკეთება, რეპლიკაცია და რეკომბინაცია) სისტემის კომპონენტების კოდირების გენები საფუძვლიანად იქნა შესწავლილი დოს ვულტოსისა და მისი თანამშრომლების (2008) მიერ ადრე გამოქვეყნებული სიის შესაბამისად39. იდენტური დნმ-ის ფრაგმენტების გაცვლა პირდაპირ ვერ დაფიქსირდება, თუმცა ეს შეიძლება იყოს ხშირი პროცესი, როდესაც საქმე მჭიდროდ დაკავშირებულ ბაქტერიებს ეხება, როგორც ეს ამ მონაცემთა ნაკრების შემთხვევაშია; გარდა ამისა, ეს პროცესი შეიძლება იყოს დნმ-ის შეკეთების მეთოდების გასაღები72, ამიტომ თამაშობს როლს ჰომოლოგიურ რეკომბინაციაში. იდენტიფიცირებული იქნა სულ 26 პოლიმორფული პოზიცია, რომლებიც განაწილებულია 54 გენით (დამატებითი ცხრილი 3). გენების ამ ნაკრებში, NS ცვლილებებმა შედეგების დაახლოებით 65% შეადგინა, რაც შეესაბამება Mycobacterium tuberculosis შტამების შესახებ წინა ანგარიშებს.
გამოქვეყნების დრო: 2021 წლის 21 ოქტომბერი