Dėkojame, kad apsilankėte „Nature“. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti naujesnę naršyklės versiją (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo pačiu metu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetaines rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Genomo sekoskaita atgaivino infekcinių ligų tyrimų sritį, atskleisdama ligų epidemiologiją, patogenezę, šeimininko ir patogeno sąveiką bei patogenams būdingą evoliucinį procesą. Mycobacterium tuberculosis kompleksas (MTBC) laiko Mycobacterium bovis vienu iš savo adaptacinių narių, sukeliančių tuberkuliozę (TB) sausumos žinduoliams, ir yra tipiškas bakterijų evoliucijos modelis. Kaip ir kiti MTBC nariai, Mycobacterium bovis laikoma griežtai klonuotu, lėtai evoliucionuojančiu patogenu, ir akivaizdžiai nėra jokių rekombinacijos ar horizontalaus genų perdavimo požymių. Šiame darbe taikome lyginamąją genomiką viso genomo sekos (WGS) duomenų rinkiniui, sudarytam iš 70 galvijų M. iš skirtingų kilmės šaltinių (Europos ir Afrikos), siekdami gauti įžvalgų apie galvijų M. genetinę įvairovę. Evoliucinė galia. Reorganizacijos požymiams įvertinti naudojami trys skirtingi metodai. Pasauliniu mastu buvo nustatytas nedidelis skaičius rekombinacijos įvykių ir patvirtinti dviem nepriklausomais metodais, turinčiais tvirtą pagrindą. Nepaisant to, palyginti su mutacijomis, rekombinacija turi silpnesnį poveikį M. bovis įvairovei (bendras r/m = 0,037). Mūsų duomenų rinkinyje gautas Mycobacterium bovis kloninio komplekso r/m vidurkio skirtumas atitinka bendrą koncepciją, kad rekombinacijos laipsnis gali labai skirtis tarp tai pačiai taksonominei rūšiai priskirtų linijų. Remiantis šiuo darbu, rekombinacijos Mycobacterium bovis negalima atmesti, todėl ji turėtų būti toliau tiriama būsimuose lyginamuosiuose genomikos tyrimuose, kuriuose labai svarbus didelių duomenų rinkinių iš skirtingų epidemiologinių scenarijų visame pasaulyje VGS tyrimas. Papildoma analizė buvo atlikta su mažesniu Mycobacterium bovis duomenų rinkiniu (n = 42), gautu iš daugelio šeimininkų tuberkuliozės paplitimo, ir buvo nustatyta daugiau nei 1800 lokusų, iš kurių bent viena padermė parodė vieno nukleotido polimorfizmą (SNP). Dauguma (87,1 %) yra koduojančiame regione, o bendras sinoniminių pokyčių nesinoniminių pokyčių (dN/dS) santykis viršija 1,5, o tai rodo, kad teigiama atranka yra svarbi evoliucinė jėga, veikianti M. bovis. Didesnė SNP dalis buvo aptikta genuose, kuriuose gausu funkcinių kategorijų „lipidų metabolizmas“, „ląstelės sienelė ir ląsteliniai procesai“ bei „tarpinis metabolizmas ir kvėpavimas“, o tai atskleidžia jų potencialą Mycobacterium bovis biologijoje ir evoliucijoje. Atidžiau pažvelgus į MTBC protėvių genus, kurie yra linkę į horizontalų genų perdavimą ir įtraukti į 3R (DNR reparacijos, replikacijos ir rekombinacijos) sistemą, matyti, kad Taijimos D neutralaus testo vidutinė pasaulinė vertė yra neigiama, o tai rodo praeitį atliekant selektyvų skenavimą. Pastaruoju metu susidaręs kliūtis po populiacijos padidėjimo vis dar yra pagrindinis evoliucinis veiksnys, skatinantis privalomą patogeną Mycobacterium bovis kovoti su šeimininku.
Mycobacterium tuberculosis kompleksas (MTBC) yra viena sėkmingiausių bakterinių patogenų taksonų ir tipiškas bakterijų evoliucijos atvejis. Jo nariai pasižymi stebėtinai dideliu nukleotidų tapatumu genomo lygmeniu (> 99 %)1,2. Įvairūs MTBC ekotipai gali sukelti tuberkuliozę (TB), kuri yra infekcinė granulomatozinė liga, įvairioms šeimininkų rūšims – nuo mikrožinduolių iki žmonių3,4,5. Šiuo metu kompleksą sudaro žmonės [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] ir prie gyvūnų prisitaikę patogenai (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, „Bacillus chimpanzee“ ir „dassie“)5,6. M. canettii (taip pat žinoma kaip „Nodobacter glabrata“) vidutinis nukleotidų tapatumas su minėtomis mikobakterijomis yra 98 %, o lyginamosios genomikos tyrimai parodė, kad M. canettii ir likusi MTBC dalis neseniai nutolo nuo bendro protėvio.7 Atsižvelgdami į šią koncepciją, kai kurie autoriai M. canettii vadina MTBC 8 nariu.
MTBC sistemingai apibūdinamas kaip griežtas kloninis kompleksas, o jo populiacijos struktūrą aiškiai lemia sumažėjusi įvairovė, kliūtys, selektyvus skenavimas ir genetinis dreifas9,10. Darant prielaidą, kad sudėtinga griežta kloninė evoliucija, pvz., trūkstami polimorfizmai, negali būti atkurta rekombinacijos būdu. Remiantis šia prielaida, nuoseklūs diferencinio regiono (RD) ir TbD1 (Mtb specifinis delecijos 1 regionas) genominės delecijos įvykiai buvo pasiūlyti kaip MTBC evoliucijos molekuliniai žymenys2,5,11. Lyginamosios genomikos ir viso genomo sekoskaitos (WGS) darbai patvirtina, kad prie žmogaus adaptuoti nariai yra suskirstyti į devynias linijas (Mycobacterium tuberculosis L1–L4, L7 ir L8; ir Mycobacterium africanum L5, L6 ir L9), linijos L2–L4 turi bendrą delecijos TbD1 regioną2,11,12,13. Be to, siūloma, kad prie gyvūnų adaptuoti nariai turi bendrą protėvį, kurį apibrėžia kladams būdingos delecijos RD7, RD8, RD9 ir RD102, 5 ir 14.
Horizontalusis genų perdavimas (HGT) ir rekombinacijos įvykiai laikomi retais ir pasitaiko MTBC protėviuose, o ne skirtinga viso MTBC nario istorija15,16,17. Dvi ankstyvosios Hughes ir bendradarbių (2002 m.) ir Gutacker ir bendradarbių (2006 m.) ataskaitos leido manyti, kad rekombinacijos įvykiai gali padėti formuoti polimorfizmus, kurie žymi specifinius lokusus M. tuberculosis padermėse18,19. Akivaizdaus rekombinacijos trūkumo MTBC priežastys yra šios: (1) mechaninis HGT procesas ir gebėjimo praradimas; (2) HGT įvykių retumas; (3) rekombinacijos įvykių tikimybės MTBC nišoje nėra14,17. Neseniai kai kurie viso genomo sekoskaitos (WGS) tyrimai, taikomi MTBC 20 padermei ir Mycobacterium bovis 21, pateikė rekombinacijos įrodymų, pirmieji parodydami, kad MTBC padermės dažnai apsikeičia mažais DNR fragmentais, tačiau dėl ribotos nukleotidų sekos variacijos šie įvykiai vis dar nepastebėti.
Mycobacterium bovis yra dažniausiai iš gyvulių (daugiausia galvijų) aptinkamas MTBC narys, nors jį taip pat galima išskirti iš laisvai laikomų ir aptvertų laukinių gyvūnų4,22,23,24. Pagal spoligotipų profilį, specifines delecijas ir vieno nukleotido polimorfizmus (SNP)25, 26, 27, 28, 29 specifiniuose genuose, M. bovis išsivystė į penkis pagrindinius kloninius kompleksus [europinis 1 (Eu1), europinis 2 (Eu2), europinis 3 (Eu3), afrikietiškas 1 (Af1) ir afrikietiškas 2 (Af2)]. Šie kloniniai kompleksai rodo įvairią Mycobacterium bovis populiacijos struktūrą ir jos ryšį su geografiniais regionais. Be to, neseniai Zimpelio ir bendradarbių (2020 m.) atliktame WGS darbe buvo sukurta filogenija, pagrįsta Mycobacterium bovis SNP, turinti daugiau nei 1900 genomų, o tai rodo, kad yra bent keturios skirtingos linijos (pavadintos Lb1, Lb1 ir Lb4), jos nevisiškai atitinka anksčiau apibrėžtą klonų kompleksą, nors geografinį specifiškumą taip pat galima patvirtinti30. Šie autoriai atliko diferencinę filogenijos ir molekulinio datavimo analizę, tačiau netyrė rekombinacijos30.
Ankstesni darbai, naudojant skirtingus molekulinius metodus, tokius kaip spoligotipizavimas, MIRU-VNTR (mikobakterijų tarpinių pasikartojimų vienetų ir kintamųjų tandeminių pasikartojimų skaičius) ir naujausi SNP tipizavimas, atskleidė tam tikrą genetinės įvairovės lygį tarp M. bovis padermių 31, 32, 33, 34, 35. Genetinės variacijos diferencijavimas tapo svarbia ligų epidemiologijos tyrimo priemone, kuri padeda išsamiau suprasti patogenezę, virulentiškumą ir ligų perdavimą. VGS metodo atsiradimas suteikia galimybę atskleisti evoliucinius veiksnius, kuriuos Mycobacterium bovis genomas lemia prisitaikymo ir išlikimo skirtingiems šeimininkams ir epidemiologiniams scenarijams procese.
Šiame darbe atliekame lyginamąją genominę analizę įvairiuose Mycoplasma bovis duomenų rinkiniuose (n = 70), įskaitant izoliatus iš skirtingų kloninių kompleksų, siekdami įgyti įžvalgų apie Mycoplasma bovis evoliucinį procesą, ypač siekdami išsiaiškinti filogenetinius ryšius ir rekombinacijos įvykius. Papildydami šią analizę, toliau tyrėme M. bovis izoliatų (n = 42), gautų iš gerai apibūdinto daugiašeimininko tuberkuliozės regiono Portugalijoje31,36, subduomenų rinkinį, kad nustatytume netapatumo nebuvimą. Pusiausvyra tarp santykinio sensinių (dN) ir sinoniminių (dS) nukleotidų pakeitimų santykio, taip pat literatūroje minimų specifinių genomų evoliucinis indėlis,37,38 kuriuos MTBC protėviai gavo per HGT ir koduoja 3R (DNR taisymo, replikacijos ir rekombinacijos) sistemos genų komponentus39. Pasirinkite genus, gautus naudojant HGT, nes jie gali atstovauti senovės polimorfizmams, todėl tikimasi, kad juose gali būti didesnė sinoniminių pokyčių dalis. Į 3R sistemą įtraukti genai buvo atrinkti todėl, kad ankstesni M. tuberculosis padermių tyrimai parodė bendrus neigiamus/gryninimo būdus, kurie veikia šiuos genus, ir jie gali atlikti svarbų vaidmenį evoliucijoje39. Kitas šio darbo tikslas – nustatyti reorganizacijos įvykių egzistavimą. Dėl šios priežasties, atsižvelgiant į tai, kad mūsų duomenų rinkinyje iš Portugalijos yra tik Europos klonų komplekso 2 genomai ir padermės, kurioms klonų kompleksas nepriskirtas, nusprendėme įtraukti viešai prieinamus genomo duomenis, kad galiausiai gautume visų klonų kompleksų reprezentatyvų vaizdą ir pagerintume rezultatų patikimumą bei aprėptį.
Šio darbo centre yra 42 naujai sekvenuoti Mycoplasma bovis genomai iš Portugalijos endeminės daugiašeimininkės tuberkuliozės scenos (išsamesnė informacija pateikta toliau), anksčiau apibūdinti epidemiologiniu požiūriu36. Atsižvelgiant į tai, kad duomenų rinkinyje iš Portugalijos yra tik Europos 2 klonų kompleksų ir padermių be nurodytų kompleksų atstovai, buvo pridėti viešai prieinami viso genomo sekvenavimo duomenys, siekiant išplėsti duomenų rinkinį, apimantį visus M. bovis klonų kompleksų atstovus. Todėl šiame darbe buvo naudojami trys viso genomo sekvenavimo duomenų šaltiniai: pilnas/juodraščio genomo surinkimas, iki 10 karkasų, saugomų NCBI (Nacionaliniame biotechnologijų informacijos centre) (n = 15 izoliatų); saugomi SRA (sekų skaitymo archyvo „Illumina fastq“ failas), atspindintis kompleksinę M. bovis klonų įvairovę (n = 12 izoliatų)30; ir 42 naujai sekvenuoti genomai iš Portugalijos. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) buvo pašalinta iš NCBI paieškos. M. bovis AF2122/97 paprastai naudojamas kaip etaloninis genomas, įtraukiamas į duomenų rinkinį. Kadangi viešai nėra prieinama visa Afrikos 1 klonavimo komplekso genomo seka, o reprezentatyvių Af2 ir Eu1 padermių genomų skaičius yra nedidelis, šiais atvejais buvo naudojami originalūs SRA pateikti sekoskaitos duomenys. Zimpelio ir jo bendradarbių (2020 m.) darbas padėjo identifikuoti genomą iš minėto klonavimo komplekso ir atrinkti Mycobacterium bovis įtraukimui į duomenų rinkinį. Eu3 atveju aprašytas tik vienas genomo tipas (Branger ir kt., 2020 m.), todėl mūsų įtrauktas genomas yra atskiras Eu3 komplekso atstovas.
Šiame duomenų rinkinyje yra 70 galvijų M. bovis, išskirtų iš 8 šeimininkų rūšių, paplitusių 12 šalių nuo 1985 iki 2016 m. 36 rūšys yra pažymėtos kaip Eu2, 7 rūšys – Eu1, 1 rūšis – Eu3, 3 rūšys – Af1, 4 rūšys – Af2 ir 19 nėra priskirtinos jokiam kloniniam kompleksui (išsamesnė informacija pateikta toliau). Išsami informacija (įskaitant prisijungimo numerį) apie Mycobacterium bovis, naudotą šiame tyrime, pateikta 1 lentelėje ir 1 papildomoje lentelėje.
Šio tyrimo centre yra 42 naujai sekvenuoti Mycobacterium bovis genomai iš Portugalijos gyvūnų tuberkuliozės židinių, platinami daugiau nei 12 metų, nes reguliariai stebimos potencialios laukinių gyvūnų ir gyvulių ligų sistemos31,36 (papildomas 1 pav.). Pagal vėlesnes procedūras šios padermės buvo išskirtos iš galvijų (n = 14), tauriųjų elnių (n = 16) ir šernų (n = 12) nuo 2003 iki 2015 m.: gyvūnai renkami ir tvarkomi pagal rekomenduojamas protokolo gaires. Audinių mėginiai yra OIE sausumos gyvūnų vadove ir yra inokuliuojami Stonebrink ir Löwenstein-Jensen piruvato kietoje terpėje ir skystoje terpėje. Kultūros inkubuojamos 37 °C temperatūroje, o augimas tikrinamas kartą per savaitę mažiausiai 12 savaičių. Kolonijos laikomos tiesiai glicerolio tirpale -80 °C temperatūroje. Selektyvioje „Mycobacterium“ terpėje („Middlebrook 7H9“, „BD Diagnostics“) originalūs archyvuoti mėginiai buvo praleisti per vieną in vitro pasažą, siekiant gauti WGS programos DNR. Šiuo tikslu užšaldytas kultūros tirpalas buvo praturtintas 5 % natrio piruvatu ir 10 % ADS (50 g albumino, 20 g gliukozės, 8,5 g natrio chlorido 1 l vandens) „Middlebrook 7H9“ terpėje, 37 °C temperatūroje. Po 4 savaičių auginimo terpė buvo atnaujinta, o kultūra buvo reguliariai stebima, kol buvo pastebėtas augimas. Ląstelės buvo surinktos centrifuguojant, nuosėdos buvo resuspenduotos 500 µl fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), 30 minučių kaitintos 99 °C temperatūroje, centrifuguotos, o supernatantas buvo laikomas -20 °C temperatūroje iki WGS programos. Visos procedūros atliekamos 3 lygio biologinio saugumo patalpose.
WGS porinių galų genomo biblioteka paruošiama naudojant unikalų kiekvieno DNR mėginio indeksą ir sekvenavimui naudojant „Illumina MiSeq“ (2 × 250 pb) (40 mėginių) ir „HiSeq“ (2 × 150 pb) (du izolatai) technologijas („Eurofins Genomics“, Vokietija). Vadovaujantis gamintojo instrukcijomis, genomo DNR sekvenavimui naudokite „Illumina“ genomo analizatorių su dvipusiu modulio priedu, o bibliotekai sudaryti naudokite „Illumina“ „Nextera XT DNA Library Prep Kit“.
Atsižvelgiant į iš SRA gautus duomenis (n = 12), klonų komplekso identifikacija gali būti naudojama kaip atitinkamos publikacijos 30, 41, 43 metaduomenys. Nagrinėjant visą genomą, išskyrus Mycobacterium bovis AF2122/97 ir Mycobacterium bovis 3601, kurie yra atpažįstami Eu1 ir Eu3 kloninių kompleksų 25, 29 nariai, jis sutampa su pilnu Mycobacterium tuberculosis H37Rv genomu (NCBI prieigos numeris NC_000962.3). Genomo lygiavimas atliekamas naudojant MAFFT (daugialypio aminorūgščių arba nukleotidų sekos lygiavimo programa, 7.458 versija) ir parametrą -addfragments48. Tada ieškoma skirtingų kloninių kompleksų nebuvimo ir (arba) SNP požymių buvimo.
Naujai sekvenuotas Mycobacterium bovis (n = 42) ir originalūs surinkto genomo juodraščio nuskaitymai (n = 3) suderina kompleksą su etaloniniu genomu Mycobacterium tuberculosis H37Rv per vSNP kanalą ir skirtingų klonų delecijos ir (arba) SNP ypatybių buvimą. Buvo atlikta paieška.
Surinkite informaciją apie požymių trūkumą ir (arba) SNP buvimą / nebuvimą bei spoligotipų nustatymo profilius, kad genominius duomenis priskirtumėte atitinkamam kloniniam kompleksui. Keturių juodraščių rinkinių spoligotipų nustatymo profilio negalima nustatyti, todėl jie priskiriami „nesudėtingų“ grupei.
Šio darbo bioinformatikos darbo eiga prasideda nuo de novo surinkimo ir atvaizdavimo pagal etaloninę strategiją, siekiant ištirti rekombinacijos įvykius ir specifinius genomo polimorfizmus. 1 paveiksle pateikta atliktų veiksmų schema. Rekombinacijos analizei naudojami visi genomai, siekiant padidinti išvadų ir susijusių rodiklių patikimumą.
Siekdami sumažinti genomo konsensuso sekų generavimo klaidas, pirmiausia atlikome de novo surinkimą, o tada atlikome pagrindinius daugybinius lygiavimus. „Unicycler“ konvejeris šiuo metu pasiekiamas adresu https://github.com/rrwick/Unicycler49 ir yra naudojamas 54 sekvenuotų genomų (42 naujai sekvenuotų ir 12 „fastq“ failų, atkurtų iš SRA) de novo surinkimui. Trumpai tariant, prieš pradedant surinkti nuo nulio, skaitymo kokybės analizė buvo atlikta „FastQC“ 0.11.7 versijoje (https://github.com/s-andrews/FastQC) ir „Trimmomatic“ 0.36 versijoje (taikomos parinktys „iškirpti adapterius ir kitas su apšvietimu susijusias sekas iš skaitymų“ ir „iškirpti bazes nuo skaitymo pabaigos, jei kokybė žemesnė nei 20 slenkstinė vertė“) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic)50. Tada genomo surinkimui buvo naudojamas „SPades optimizer49“, o po surinkimo optimizavimui – „Pilon“ 1.1851 versija. Siekiant išvengti neteisingo surinkimo, buvo pasirinktas konservatyvus tiltelių sudarymo būdas, o k-mer dydis buvo ieškomas ir parinktas tarp 20% ir 95% skaitymo ilgio. Vadovaukitės SPAdes gairėmis ir atsižvelkite į skaitymo dydį, ištrinkite mažesnius nei 300 bp kontigus ir nustatykite 20 skaitymo gylio aprėpties ribą – 52. De novo surinkimo strategijoje genomo regionai, tokie kaip labai pasikartojantys prolino-glutamato (PE) ir prolino-prolino glutamato (PPE) paralogai, nebuvo pašalinti.
De novo surinkimo kokybė vertinama naudojant QUAST vamzdyną (//quast.sourceforge.net/quast.html), kuris palengvina kontigo ir M. bovis AF2122/97 etaloninio genomo (NCBI prisijungimo numeris LT708304.1) žemėlapių sudarymą (kokybės parametrus žr. 1 papildomoje lentelėje).
Pasitelkus vSNP srautą (https://github.com/USDA-VS/vSNP), naujai sekvenuoto M. bovis FASTQ failas, gautas Illumina sekvenavimo metu, lyginamas su M. bovis AF2122/97 etaloniniu genomu (LT708304.1). Remiantis geriausios praktikos rekomendacijomis, pateiktomis „Genomo analizės įrankių rinkinyje“ (GATK) 53, 54, 55, pakartotiniam kalibravimui taikomi standartiniai filtro parametrai arba variantų masės balai. Rezultatai filtruojami naudojant mažiausią SAMtools masės balą – 150 ir AC = 2. Taip pat naudojamas „Kraken“ (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/), kad būtų galima patikrinti rodmenis ir atmesti užterštumą. Mūsų darbe sekvenavimo strategijoms susieti naudojamas vSNP srautas nagrinėja apibrėžtų SNP ir taikinių seriją, taip pat neįtraukiami mišrios infekcijos scenarijai. Nuskaityto genomo aprėptis yra geresnė nei 99 % (1 papildoma lentelė).
Siekiant išvengti atvaizdavimo klaidų ir neteisingų SNP, variantą reikia išfiltruoti šiais atvejais: (1) jį patvirtina mažiau nei 20 rodmenų, (2) jo dažnis yra mažesnis nei 0,9, (3) jis yra bent vienoje padermėje, bet bent kitoje padermėje yra spragų. Integruotos genomikos peržiūros programos (IGV) 2.4.19 versija (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 buvo naudojama vizualiai patikrinti SNP ir pozicijas su atvaizdavimo ar lygiavimo problemomis. Kadangi prolino-glutamato (PE) ir prolino-prolino glutamato (PPE) genai yra labai dubliuojami ir priklauso daugiageninei šeimai, „Illumina“ sekvenavimas juos lengvai nesupranta ir neteisingai atvaizduoja, todėl jiems teikiama pirmenybė. Mikobakterijų bioinformatikos darbo eiga, naudodama atvaizdavimo pagal seką strategiją SNP patvirtinimui, pašalino tuberkuliozės komplekso narius. Todėl iš analizės išfiltravome PE/PPE genus ir indelius.
Remiantis „Bovilist“ (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), visi SNP skirstomi į funkcines kategorijas. SnpEff kanalas (https://pcingola.github.io/SnpEff/) naudojamas SNP pasekmėms (sinoniminiams ar nesinomininiams pokyčiams) nustatyti. Sukurta nauja Mycobacterium bovis AF2122/97 genomo duomenų bazė (LT708304.1).
Pagrindinio genomo daugkartinis lygiavimas buvo atliktas naudojant „Parsnp v1.2“, šiuo metu prieinamą adresu https://github.com/marbl/parsnp57, naudojant 69 pilnus genomų/juodraščių rinkinius (su parinktimi -c), o kaip etalonas naudojamas „M. bovis AF2122/97“ (LT708304.1). Buvo atlikti keturi pagrindiniai daugkartiniai lygiavimai: tik Eu2 klonavimo komplekso nariai (n = 37), įskaitant visus Europos klonavimo komplekso narius (n = 44), įskaitant Europos ir Afrikos klonavimo komplekso jungties tašką (n = 51), ir visi Mycobacterium bovis šiame tyrime (n = 70).
„Parsnp“ sugeneruotas šerdies lygiavimas naudojamas didžiausios tikimybės (ML) filogenetiniam medžiui nustatyti naudojant CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58, naudojant RAxML, ir atlikti 1000 valdomų replikacijų.
Rekombinacijos įvykių buvimui lygiagrečiai tikrinti naudojami trys skirtingi algoritmai ir bioinformatikos įrankiai: „SplitsTree4“ programinė įranga, „Gubbins“ (nešališkas linijos nustatymas per rekombinaciją nukleotidų sekose) ir RDP4 (rekombinacijos aptikimo programa, 4.101 beta versija) programinė įranga.
Šaknų neturinčiam filogenetiniam tinklui apskaičiuoti naudojamas „SplitsTree4 v4.15.1“ (http://www.splitstree.org/)59 įdiegtas skaidymo metodas, statistiniam patikrinimui naudojant Phi testą, o reikšmingumo riba yra p = 0,05. Kaip įvestis naudojama Parsnp pagrindinė daugialypė analizė, o skaidymo skaidymas realizuojamas kaip tinklo standartas.
„Gubbins“ srautas v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) veikia su numatytaisiais parametrais kaip dar vienas būdas įvertinti rekombinacijos poveikį Mycobacterium bovis. Srautojuostoje įdiegtas algoritmas rekonstruoja atitinkamą klono liniją. Visas mūsų duomenų rinkinio genomo/juodraščio surinkimas ir etaloninis genomas (galvijų galvijas AF2122/97, LT708304.1) yra tarpusavyje suderinami ir nuskaito SNP poziciją kiekvienoje medžio šakoje, kad aptiktų SNP klasterį, vaizduojantį rekombinacijos įvykį. Šakos nulis Tarkime, kad rekombinacijos įvykio nėra, o tai reiškia, kad šakoje esantys SNP turėtų būti paskirstyti tolygiai. Kaip įvesties failai naudojami pagrindiniai daugybiniai lygiavimai iš Parsnp ir geriausiai įvertintas ML medis iš RAxML.
Galiausiai, siekiant patvirtinti Gubbins srauto siūlomą reorganizacijos įvykį, šeši RDP467 įdiegti algoritmai (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 ir SiScan66) buvo pritaikyti Parsnp pagrindiniam daugybiniam lygiavimui pagal numatytuosius nustatymus. Nustatėme, kad bent trys RDP4 įdiegti algoritmai turi nuosekliai parodyti svarbų signalą, kad patvirtintų kiekvieną rekombinacijos įvykį.
Atsižvelgiant į tai, kad tiek „Gubbins“, tiek RDP programinė įranga ieško rekombinacijos signalų tikrindama pagrindinius daugybinius lygiavimus iki 500 bp lange ir patvirtindama, kad PE/PPE genų įtraukimas de novo surinkimo metu netrukdys rastiems rekombinacijos signalams, tolesnė analizė atliekama homolinearumo metodu, patikrinant rekombinacijos įvykį identifikuojančio geno artumą. Sinlinearinis žemėlapis, naudojant visą genomą, buvo sudarytas naudojant MAUVE-multi-genome lygiavimą (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html), siekiant atmesti vietines genomo translokacijas ar inversijas. Be to, visas genomas buvo naudojamas aminorūgščių sekos homolinearumo analizei atlikti per „SyntTax“ žiniatinklio serverį (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Išsamesnė iš Portugalijos daugiašeimininkės tuberkuliozės sistemos gauto genomo duomenų rinkinio analizė skirta literatūroje minimų genų polimorfizmui patikrinti. Šie genai yra 37, 38, o 3R kodą koduojantis genas, gautas MTBC protėvių per HGT (DNR taisymo, replikacijos ir rekombinacijos) sistemos komponentus 39. Naudokite „ClustalX v2.1“ (http://www.clustal.org/clustal2/) ir „DnaSP v6.12.03“ (http://www.ub.edu/dnasp/), kad apskaičiuotumėte genų ir nukleotidų įvairovę (π) ir Tadžimos D neutralaus testo parametrų įvestį.
Gautas maksimalios tikimybės (ML) filogenetinis medis, pagrįstas 69 Mycoplasma bovis izolatais ir etaloniniais genomais (2A pav.). Palyginti su vieno geno arba daugelio lokusų pagrindu sukurtais medžiais, ši strategija leidžia generuoti galingesnius medžius, kurie neužfiksuoja viso genomo kintamumo ir todėl pasižymi mažesniu gebėjimu atskirti rūšis 68,69. ML medžio topologinė struktūra paprastai atitinka sudėtingą klonų klasifikaciją. Eu2 genomas yra susitelkęs į šaką, o Af1 genomas taip pat yra susitelkęs į vieną klasterį (2A pav.). Rezultatas taip pat atitinka žinomą Mycobacterium bovis evoliucinį ryšį, tai yra, yra didelis skirtumas tarp Eu1 nario ir grupės, kurią sudaro visi kiti kloniniai kompleksai ir genomai, tačiau kloninis kompleksas 30 nėra nurodytas. Nedidelis kloninio komplekso ir filogenetiniame medyje pastebėto ryšio neatitikimas gali būti paaiškintas tuo, kad kloninis kompleksas aprašomas remiantis specifiniais genomo regionais, o filogenetinis medis pagrįstas daugybiniais pagrindinių genomų, reprezentuojančių visą genomą, išsidėstymais.
Didžiausios tikimybės filogenetinis medis (GTR) sudaromas remiantis Mycobacterium bovis genomo pagrindinio genomo išsidėstymu prieš (A) ir po (B) rekombinacijos vietos pašalinimo. Šakų spalvos atitinka Mycobacterium bovis klonų kompleksą: Europa 1 yra violetinė, Europa 2 yra raudona, Europa 3 yra mėlyna, Afrika 1 yra oranžinė ir Afrika 2 yra žalia. Medis yra įsišaknijęs ir nubraižytas pagal mastelį, o šakos ilgis matuojamas kaip kiekvienos vietos pakaitalas.
Mycobacterium tuberculosis kompleksas apibūdinamas kaip kloniškai evoliucionavęs, ir dauguma per daugelį metų sukauptų įrodymų patvirtina idėją, kad vykstantys HGT ir rekombinacijos įvykiai nevyks esant aptinkamam MTBC lygiui15,17,18.
Ankstesni darbai parodė, kad tarp MTBC padermių gali būti ribota rekombinacija20,21, o kituose darbuose nepavyko nustatyti išmatuojamų rekombinacijos įvykių70,71. Iš naujo aptarkite šį klausimą, daugiausia dėmesio skirdami Mycobacterium bovis, kuris skiriasi nuo ankstesnio darbo, kuriame buvo nagrinėjama tik Mycobacterium tuberculosis70,71; arba nagrinėkite MTBC kaip visumą, beveik nereprezentuojant M. bovis20; arba atsižvelgkite tik į ribojančias galvijų frakcijas. Šiame darbe pateiktame mikobakterijų duomenų rinkinyje yra iš viso 70 padermių, reprezentuojančių visus kloninius kompleksus, naudojamus rekombinacijai tikrinti. Duomenų rinkinys suskirstytas pagal keturis kaupiamuosius lygius: (1) Eu2 nariai, (2) visi Europos klonų kompleksų nariai (t. y. Europa), (3) Europos ir Afrikos klonų kompleksas (Eu + Af) ir (4) visos duomenų kolekcijos (įskaitant genomus, kurie neįtraukti į jokius jau aprašytus klonavimo kompleksus).
Siekiant toliau tirti šią hipotezę, buvo atliktas skaidymo-skaidymo tinklas, siekiant įvertinti rekombinacijos įvykių nebuvimą tarp genomų, nes šis metodas gali vizualizuoti protėvių ryšį tarp individų ir parodyti prieštaringus filogenetinius signalus. Visi keturi analizės duomenų rinkiniai patvirtino kilpų egzistavimą tinkle (t. y. sričių, kurios nesusijungia į vieną medį), tačiau Phi testas neturi statistinės paramos (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; visas duomenų rinkinys p = 0,2451), o tai suteikia prastų įrodymų apie reorganizacijos įvykių egzistavimą (3A–D pav.).
Europoje 2 genomai (n = 37) (A), Europos genomai (n = 44) (B), Europos ir Afrikos genomai (n = 51) (C) ir visas duomenų rinkinys (n = 70) (D).
Atlikus šią analizę ir atsižvelgiant į ciklinius stebėjimus visuose tinkluose, Gubbins kanale įdiegtas rekonstrukcijos algoritmas buvo pritaikytas kloninei linijai rekonstruoti ir rekombinacijos poveikio M. bovis genomui įvertinimui papildyti. Nustatytas bendras rekombinacijos įvykių skaičius, kurių dauguma įvyko galinėse šakose (t. y. viename genome) (2 lentelė). Šie rodikliai rodo viso duomenų rinkinio nuoseklumą ir rodo, kad rekombinacijos įvykių dažnis yra 200–300 kartų didesnis nei mutacijų. Kai rho/theta parametras, rodantis santykinius rekombinacijos ir taškinių mutacijų dažnius šakoje, atrodo, yra tarp 0,0037 ir 0,0056 (3 lentelė). Neseniai paskelbtame 38 M. bovis padermės darbe nustatyta didesnė rho/theta vertė (rho/theta = 0,1) nei gauta šiame duomenų rinkinyje, tačiau Patané ir kolegų darbe rekombinacijos parametrams nustatyti buvo naudojamas etaloninis surinkimas. Procedūrinė detalė, susijusi su surinkimo procedūra, buvo siejama su tariamų rekombinacijos įvykių gausa galinėje šakoje.
Toliau, r/m parametras parodo rekombinacijos ir mutacijos įvedimo įvairovės santykį, o jo vidutinė vertė yra nuo 0,025 iki 0,037, o tai rodo, kad, palyginti su mutacijomis, rekombinacija turi mažesnį bendrą poveikį M. bovis genetinei įvairovei (3 lentelė). Išsamiam palyginimui, panašus metodas buvo naudojamas r/m parametrui įvertinti MTBC duomenų rinkiniui, sudarytam iš 23 genomų, kurio vidutinė vertė yra 0,48620, o Patané ir kolegų 38 M. bovis duomenų rinkiniui nustatyta, kad vidutinė vertė yra 0,98. Pirmajame tyrime į M. bovis darbą buvo įtraukti tik du iš 23 genomų (M. bovis BCG ir etaloninė padermė), todėl gauta vertė gali būti šališka dėl M. tuberculosis genomo perteklinės raiškos. Antrojoje ataskaitoje analizuotos Mycobacterium bovis populiacijos daugiausia buvo gautos iš Jungtinių Amerikos Valstijų ir gyvulių šeimininkų. Priešingai, mūsų duomenų rinkinyje atstovaujama daugiau geografinių vietovių ir šeimininkų rūšių, taip pat naudojami genomai, sugrupuoti į skirtingus kloninius kompleksus su skirtingomis populiacijos genetinėmis savybėmis, taip pasiekiant gilesnes ir platesnes žinias apie populiacijas. Mūsų duomenų rinkinyje gautas skirtumas tarp r/m vidutinės vertės atitinka koncepciją, kad rekombinacijos laipsnis labai skiriasi tarp linijų, priskirtų tai pačiai taksonominei rūšiai, todėl šie rezultatai rodo, kad M. bovis klonų komplekse gali būti rekombinacijos skirtumų. Šį poveikį taip pat siūlo Didelot ir Maiden72. Nepaisant to, reikšmingas šio duomenų rinkinio išplėtimas įtraukiant didesnį M. bovis genomų skaičių leis dar labiau išsiaiškinti šį klausimą. Tiek r/m, tiek rho/theta parametrai rodo kintamumą tarp šakų, ir šis rezultatas atitinka ataskaitas apie kitas bakterijų rūšis72,73.
Galiausiai, siekiant patvirtinti Gubbins srauto nustatytus reorganizacijos įvykius, RDP4 programinėje įrangoje buvo panaudoti šeši skirtingi algoritmai, skirti nepriklausomai išbandyti skirtingus pagrindinius daugiapalyginimus. Pasauliniu mastu RDP4 patvirtino mažiau nei pusę Gubbins nustatytų įvykių (4 ir 5 lentelės). Atsižvelgiant į visą duomenų rinkinį, buvo patvirtinti trys rekombinacijos įvykiai: du iš jų susiję su vidiniais mazgais, o kitas – su vienu genomu galinėje šakoje, kuriai nebuvo galima priskirti kloninių kompleksų (4 ir 5 lentelės). Įvykių identifikavimas galinėse šakose gali rodyti, kad rekombinacija vis dar vyksta šiuolaikinėse M. bovis padermėse arba rezultatas yra neteisingas70. Šiame hipotetiniame rekombinacijos regione maždaug 20 % pozicijų turi neapibrėžtus nukleotidus (N), todėl tai veikia rekombinacijos signalą (2 papildomas paveikslas). Be to, šis regionas veikia rrs geną, koduojantį 16S ribosominę RNR, kuri, kaip tikimasi, yra labai konservatyvi, todėl šis tariamas rekombinacijos signalas gali būti sekoskaitos klaidų arba nesuderinamumo rezultatas. Tuomet buvo atliktas visas genomo sulyginimas tarp Mb0003 ir Mycobacterium bovis AF2122/97, ir patvirtintas neapibrėžtų nukleotidų bei SNP egzistavimas, todėl galimos problemos, susijusios su neteisingu sulyginimu, nebuvo susijusios su šiame darbe įdiegta biologine informacija, o atsirado išmokus programą.
Vidinių mazgų rekombinacijos regionuose nerasta jokių tarpų ar neapibrėžtų nukleotidų (4 ir 5 pav.). Kalbant apie šiuos įvykius, vienas turi tik Eu2 genomą ir veikia pks12 geną, kuris koduoja galimą poliketidų sintazę; o kitas yra registruotas Eu1 genome ir veikia narX geną, kuris koduoja galimą nitratų reduktazę (4 lentelė). Apskritai rekombinacijos analizė rodo, kad yra ribotas skaičius rekombinacijos fragmentų, turinčių statistinį pagrindą, o išvesti rodikliai rodo, kad rekombinacija turi mažą poveikį M. bovis linijai. Tikimasi, kad rekombinacijos signalas bus silpnas, tačiau svarbu atskirti tikrąjį evoliucijos signalą nuo foninio triukšmo, o tai yra sudėtinga užduotis. Siekiant sumažinti triukšmo signalą, kurį sukelia etalonais pagrįstos surinkimo ir neatitikimo problemos 70, 71, visi kiti, išskyrus visą genomą, buvo surinkti nuo nulio, o surinkimo kokybė buvo patikrinta ir užtikrinta QUAST konvejerio analize (1 papildoma lentelė). Be to, buvo atlikta papildomų analizių serija, siekiant užtikrinti bendro tyrimo patikimumą ir tikslumą. Todėl narX ir pks12 genų sekvenavimo kokybė buvo įvertinta nuskaitymo žemėlapiu su Mycobacterium bovis AF2122/97. Rekomenduojama SNP pozicija rekombinacijos srityje buvo patvirtinta taikant metodo skyriuje paminėtus kriterijus (bent 20 nuskaitymų ir 0,9 kitimo dažnis). narX geno polimorfizmas buvo visiškai patvirtintas dviejuose genomuose (Mb1792361 ir Mb7240415; 2,3 %) ir pks12 genomo genomuose: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 ir Mb12 genuose. Tačiau genomo Mb2043 atveju šešios iš aštuonių pozicijų neatitinka skaitymo gylio kriterijaus, nes SNP palaiko daugiausia 17 skaitymų, o tai yra žemiau nustatytos 20 ribinės vertės. Todėl galima patvirtinti šešių genomų (8,6 %) rekombinaciją šioje genomo vietoje (4 ir 5 pav.).
Detalus „Mycobacterium bovis“ duomenų rinkinio rekombinacijos srities lygiavimo vizualizavimas paveikia „narX“ geną, kuris koduoja galimą nitratų reduktazę. Vidinių mazgų rekombinacijos srityje nerasta jokių tarpų ar neapibrėžtų nukleotidų. Šis konkretus įvykis užregistruotas Eu1 genome. „NarX“ geno sekvenavimo kokybė buvo įvertinta nubraižant „Mycobacterium bovis AF2122/97“ rodmenis. Rekomenduojamą SNP vietą rekombinacijos srityje patvirtinkite taikydami metodo skyriuje paminėtus kriterijus (bent 20 rodmenų ir 0,9 kaitos dažnis). „NarX“ geno polimorfizmas buvo visiškai patvirtintas Mb1792361 ir Mb7240415 genomuose (2,3 %).
Detalus Mycoplasma bovis duomenų rinkinio, turinčio įtakos pks12 genui, rekombinacijos srities lygiavimo vizualizavimas. Vidinių mazgų rekombinacijos srityje nerasta jokių tarpų ar neapibrėžtų nukleotidų. Kalbant apie įvykį, paveikiantį pks12 geną, koduojantį galimą poliketidų sintazę, jame yra tik Eu2 genomas. pks12 sekvenavimo kokybė buvo įvertinta naudojant Mycobacterium bovis AF2122/97 nuskaitymo žemėlapio sudarymą. Rekomenduojamą SNP vietą rekombinacijos srityje patvirtinkite taikydami metodo skyriuje paminėtus kriterijus (bent 20 nuskaitymų ir 0,9 kaitos dažnis). Genomų Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 ir Mb1960 polimorfizmai buvo visiškai patvirtinti.
PE ir PPE genai turi pasikartojančius regionus, kuriuos lengvai neteisingai nuskaito „Illumina“ sekvenavimas ir neteisingas susiejimas, todėl jie paprastai ištrinami iš M. tuberculosis narių bioinformatikos darbo eigos tik naudojant susiejimo su seka strategiją. Šiame darbe taikomas rekombinacijos įvykių nustatymas pagrįstas de novo surinkimu, nefiltruojant PE/PPE. Manome, kad įdiegę tris skirtingus vienas kitą papildančius metodus ir algoritmus per „SplitsTree“, „Gubbins“ konvejerį ir RDP4 programinę įrangą, taikomos strategijos yra patikimos apdorojant ir filtruojant reorganizuotus regionus, kuriuos sukelia klaidų signalai. Tačiau siekiant atmesti PE/PPE geno trukdymą „Gubbins“ ir RDP4 programinei įrangai, siekiant identifikuoti SNP klasterius, ir tokiu būdu identifikuoti rekombinacijos regionus, kurie, kaip manoma, turi įtakos „narX“ ir „pks12“ genams, buvo ištirtas šių genų kaimynystė (papildomas 3–5 pav.). M. bovis AF2122/97 padermėje narX geną skiria narK2 ir Mb1764c, o pks12 supa Mb2075c ir Mb2073c (papildomas 3-5 paveikslas). Naudojant viso genomo MAUVE sinlininį žemėlapį sukurtas žemėlapis pateikia informaciją apie genų sekos konservatyvumą ir pertvarkymą, rodydamas keturis kolinearinius blokus ir nerodydamas jokių genomo translokacijos ar inversijos požymių. Be to, komplementacijos analizė su aminorūgščių seka įrodė homologiją visuose pilnuose genomuose, o gretimose narX ar pks12 srityse nerasta PE/PPE. narX atveju vienas genomas (Mb0030) turi mažesnį sinonimijos balą, nes narX genas buvo identifikuotas kaip du fragmentai (fragmentai 1891 ir 1890). Dėl panašumų pks12 atveju Mb0030 ir Mb003 pasižymėjo mažesniais sinlinearumo balais, o pks12 buvo identifikuotas atitinkamai dviejuose ir trijuose fragmentuose, reprezentuojančiuose skirtingus baltymo domenus (papildomas 3-5 paveikslas). Atsižvelgdami į šią informaciją ir į tai, kad „Gubbins“ bei RDP4 programinė įranga atliko analizę, patikrino daugybinį pagrindinių 500 bp lygiavimą lange, patvirtinome, kad PE/PPE genas netrukdys rekombinacijos signalui, kuris veikia „narX“ ir pks12.
Nors šiame duomenų rinkinyje aptikti rekombinacijos signalai gali būti laikomi liekamaisiais, tiesa, kad rekombinacijos M. bovis negalima atmesti, todėl ji turėtų būti toliau analizuojama, o ištisi genomai iš skirtingų epidemiologinių scenarijų būtų sekvenuojami iki svarbių.
Lyginant ML filogenetinius medžius, gautus prieš ir po rekombinacijos korekcijos (2A, B pav.), reikšmingų pokyčių nustatytame filogenetiniame ryšyje nepastebėta, o M. bovis padermės buvo suskirstytos į tą pačią grupę.
Susiejus 42 naujai sekvenuotus M. bovis nuskaitymus su etaloniniu M. bovis AF2122/97 genomu, buvo gautas SNP lygiavimas, kuriame yra 1816 polimorfinių pozicijų. Dauguma SNP (87,1 %) yra koduojančiame regione, o paveikti genai apibūdinami pagal funkcines kategorijas, parodytas Bovilist (6A, B pav.). Atsižvelgiant į bendrą genų skaičių kiekvienoje funkcinėje kategorijoje, daugiau SNP buvo genuose „lipidų metabolizmas“ kategorijoje, po to sekė „ląstelės sienelė ir ląstelės procesai“ bei „tarpinis metabolizmas ir kvėpavimas“, o tai rodo, kad jie yra M. bovis evoliucijos dalis.
M. bovis duomenų rinkinio iš Portugalijos (n = 42) hierarchinė analizė. Bendras užregistruotų SNP ir paveiktų genų skaičius kiekvienai funkcinei kategorijai (A). Bendras užregistruotų sinoniminių ir nesinoniminių pokyčių skaičius pagal funkcijų kategoriją (B).
Pasauliniu mastu vidutinis dN/dS santykis yra geresnis nei 1,5, o tai rodo, kad pasaulinis evoliucinis spaudimas yra atsikratyti protėvių būsenos ir atspindi teigiamą (diversifikuotą arba nukreiptą) ir (arba) atsipalaidavusį apsivalymo pasirinkimo scenarijų. Kategorijose „virulentiškumas, detoksikacija, adaptacija“, „įterpimo sekos ir fagai“ ir „reguliuojantys baltymai“ daugiau nei du trečdaliai SNP yra nesinominai (6B pav.).
Visose kategorijose yra genų su keliais SNP, dėl kurių vidutinis mutacijų dažnis (t. y. vidutinis SNP vienam genui) yra didesnis nei 1 (6A pav.). Pks12 (Mb2074c) su 15 SNP ir fas (Mb2553c) su 8 SNP turi didesnes mutacijų vertes. Abu šie genai dalyvauja riebalų rūgščių metabolizme. pks genas koduoja poliketidų sintazę (PKS) – daugiafunkcį fermentą, dalyvaujantį mikobakterijų ląstelės sienelės lipidų biosintezėje74,75. Šis genas koduoja daugiafunkcį polipeptidą, kuris dalyvauja mikoketidų sintezėje74,76. Fas genas dalyvauja mikolo rūgšties sintezėje. Abu šie genai atlieka svarbų vaidmenį ląstelės sienelės, kontaktuojančios su šeimininku, biosintezėje.
Siekiant toliau tirti Mycobacterium bovis evoliuciją, buvo išanalizuoti du specifinių genų rinkiniai. Anksčiau paskelbtuose darbuose, naudojant sekos sudėties ir filogenetinius metodus, buvo nustatyti genai, kuriuos MTBC protėviai įgijo per HGT prieš diversifikaciją37,38. Šie genai išvardyti 2 papildomoje lentelėje. Buvo išanalizuotas iš viso 77 genų, kurie gali būti susiję su HGT, SNP pasiskirstymas ir nustatytos 26 polimorfinės vietos, kurios daugeliu atvejų (78 %) lėmė nesinoniminius (NS) pokyčius (2 papildoma lentelė). Ankstesni MTBC genomo tyrimai parodė, kad tariamas HGT regionas pasižymi didesniu NS SNP santykiu, palyginti su likusiu genomu. Jei manoma, kad šiuos rekombinacijos regionus įgijo MTBC protėviai ir todėl jie pernelyg reprezentuoja senovės polimorfizmus, tuomet tikimasi, kad sinoniminių pokyčių dalis bus didesnė, nes tikimasi, kad NS pakeitimai bus pašalinti neigiamos atrankos būdu dėl aminorūgščių pokyčių, kurie gali pakeisti baltymo funkciją. Todėl mūsų rezultatai rodo, kad funkcinės pasekmės gali kilti dėl HGT tipo genų pakeitimo, o tai atspindi jų svarbą vertingai adaptyviai genetinei įvairovei.
Lygiagrečiai su šia analize buvo kruopščiai ištirti genai, koduojantys 3R (DNR reparacijos, replikacijos ir rekombinacijos) sistemos komponentus, pagal anksčiau dos Vultos ir bendradarbių (2008)39 paskelbtą sąrašą. Identiškų DNR fragmentų mainų negalima tiesiogiai stebėti, nors tai gali būti dažnas procesas, kai dalyvauja glaudžiai susijusios bakterijos, kaip šio duomenų rinkinio atveju; be to, šis procesas gali būti raktas į DNR reparacijos metodus72, todėl jis vaidina svarbų vaidmenį homologinėje rekombinacijoje. Iš viso buvo nustatytos 26 polimorfinės pozicijos, paskirstytos 54 genuose (3 papildoma lentelė). Šiame genų rinkinyje NS pokyčiai sudarė apie 65 % pasekmių, o tai atitinka ankstesnes ataskaitas apie Mycobacterium tuberculosis padermes.
Įrašo laikas: 2021 m. spalio 21 d.