Ďakujeme za návštevu stránky Nature. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu pre CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať novšiu verziu prehliadača (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Zároveň, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, budeme zobrazovať stránky bez štýlov a JavaScriptu.
Sekvenovanie genómu oživilo oblasť výskumu infekčných chorôb a odhalilo epidemiológiu chorôb, patogenézu, interakcie hostiteľ-patogén a evolučný proces, ktorý je kladený patogénom. Komplex Mycobacterium tuberculosis (MTBC) považuje Mycobacterium bovis za jedného zo svojich adaptívnych členov, ktorí spôsobujú tuberkulózu (TBC) u suchozemských cicavcov, a je typickým modelom bakteriálnej evolúcie. Podobne ako ostatní členovia MTBC, aj Mycobacterium bovis sa považuje za striktne klonovaný, pomaly sa vyvíjajúci patogén a zjavne neexistujú žiadne známky rekombinácie alebo horizontálneho prenosu génov. V tejto práci aplikujeme porovnávaciu genomiku na súbor údajov o celej genómovej sekvencii (WGS) zložený zo 70 jedincov dobytka M. z rôznych rodokmeňov (Európa a Afrika), aby sme získali prehľad o genetickej diverzite jedincov dobytka M. Evolučná sila. Na odhad znakov reorganizácie sa používajú tri rôzne metódy. Celosvetovo bol identifikovaný a potvrdený malý počet rekombinačných udalostí dvoma nezávislými metódami so solídnym podkladom. Napriek tomu má rekombinácia v porovnaní s mutáciami slabší vplyv na diverzitu M. bovis (celková r/m = 0,037). Priemerný rozdiel r/m získaný v klonálnom komplexe Mycobacterium bovis v našom súbore údajov je v súlade so všeobecnou koncepciou, že stupeň rekombinácie sa môže medzi líniami priradenými k rovnakému taxonomickému druhu značne líšiť. Na základe tejto práce nemožno rekombináciu u Mycobacterium bovis vylúčiť, preto by mala byť predmetom ďalšieho úsilia v budúcom porovnávacom genomickom výskume, v ktorom je kľúčové WGS rozsiahlych súborov údajov z rôznych epidemiologických scenárov z celého sveta. Následne bola vykonaná ďalšia analýza menšieho súboru údajov Mycobacterium bovis (n = 42) z prevalencie TBC u viacerých hostiteľov a bolo identifikovaných viac ako 1 800 lokusov, z ktorých aspoň jeden kmeň vykazoval jednonukleotidový polymorfizmus (SNP). Väčšina (87,1 %) sa nachádza v kódujúcej oblasti a globálny pomer nesynonymných zmien (dN/dS) synonymných zmien presahuje 1,5, čo naznačuje, že pozitívny výber je dôležitou evolučnou silou pôsobiacou na M. bovis. Vyšší podiel SNP bol detegovaný v génoch bohatých na funkčné kategórie „metabolizmus lipidov“, „bunková stena a bunkové procesy“ a „medziľahlý metabolizmus a dýchanie“, čo odhaľuje ich potenciál v biológii a evolúcii dôležitosti Mycobacterium bovis. Bližší pohľad na gény u predkov MTBC, ktoré sú náchylné na horizontálny prenos génov a sú zahrnuté v systéme 3R (oprava, replikácia a rekombinácia DNA), odhaľuje globálnu priemernú negatívnu hodnotu Taijimaovho D neutrálneho testu, čo naznačuje minulé selektívne skenovanie. Nedávne úzke hrdlo po expanzii populácie je stále hlavným evolučným hnacím faktorom pre povinný patogén Mycobacterium bovis v boji proti hostiteľovi.
Komplex Mycobacterium tuberculosis (MTBC) je jedným z najúspešnejších taxónov bakteriálnych patogénov a typickým prípadom bakteriálnej evolúcie. Jeho členovia vykazujú prekvapivo vysokú nukleotidovú identitu na genómovej úrovni (> 99 %)1,2. Rôzne ekotypy MTBC môžu spôsobiť tuberkulózu (TBC), čo je infekčné granulomatózne ochorenie, u širokej škály hostiteľských druhov od mikrocicavcov až po ľudí3,4,5. V súčasnosti komplex zahŕňa ľudí [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] a patogény adaptované na zvieratá (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, „Bacillus chimpanzee“ a „dassie“)5,6. M. canettii (tiež známy ako „Nodobacter glabrata“) Priemerná nukleotidová identita s vyššie uvedenými mykobaktériami je 98 % a porovnávacie genomické práce ukázali, že M. canettii a zvyšok MTBC sa nedávno odchýlili od spoločného predka.7 Vzhľadom na túto koncepciu niektorí autori nazývajú M. canettii členom MTBC 8.
MTBC je systematicky opisovaný ako striktný klonálny komplex a jeho populačná štruktúra je jasne riadená zníženou diverzitou, úzkymi miestami, selektívnym skenovaním a genetickým driftom9,10. Za predpokladu, že komplexná striktná klonálna evolúcia, ako napríklad chýbajúce polymorfizmy, sa nedá obnoviť rekombináciou. Na základe tohto predpokladu boli ako molekulárne markery evolúcie MTBC navrhnuté po sebe nasledujúce udalosti genómovej delécie diferenciálnej oblasti (RD) a TbD1 (oblasť Mtb špecifickej delécie 1)2,5,11. Práca v oblasti porovnávacej genomiky a sekvenovania celého genómu (WGS) podporuje rozdelenie členov adaptovaných na človeka do deviatich línií (Mycobacterium tuberculosis L1 až L4, L7 a L8; a Mycobacterium africanum L5, L6 a L9), pričom línie L2 až L4 zdieľajú deléciu oblasti TbD12,11,12,13. Okrem toho sa predpokladá, že členovia adaptovaní na zvieratá zdieľajú spoločného predka, ktorý je definovaný deléciami špecifickými pre klad v RD7, RD8, RD9 a RD102, 5 a 14.
Horizontálny prenos génov (HGT) a rekombinačné udalosti sa považujú za zriedkavé a vyskytujú sa u predkov MTBC, a nie kvôli odlišnej histórii celého člena MTBC15,16,17. Dve skoré správy od Hughesa a spolupracovníkov (2002) a Gutackera a spolupracovníkov (2006) naznačili, že rekombinačné udalosti môžu pomôcť formovať polymorfizmy, ktoré označujú špecifické lokusy v kmeňoch M. tuberculosis18,19. Dôvody zjavného nedostatku rekombinácie v MTBC sú: (1) mechanický proces a strata schopnosti HGT; (2) zriedkavosť udalostí HGT; (3) neexistuje žiadna šanca na rekombinačné udalosti vo výklenku MTBC14,17. Nedávno niektoré štúdie sekvenovania celého genómu (WGS) aplikované na kmeň MTBC 20 a Mycobacterium bovis 21 poskytli dôkazy o rekombinácii, pričom ako prvé ukázali, že kmene MTBC si často vymieňajú malé fragmenty DNA, ale kvôli obmedzenej variácii nukleotidových sekvencií sa tieto udalosti stále nezaznamenávajú.
Mycobacterium bovis je najčastejšie získaným členom MTBC z hospodárskych zvierat (najmä z hovädzieho dobytka), hoci ho možno izolovať aj z voľne žijúcich zvierat a zvierat z oplotených chovov4,22,23,24. M. bovis sa vyvinul do piatich hlavných klonálnych komplexov [európsky 1 (Eu1), európsky 2 (Eu2), európsky 3 (Eu3), africký 1 (Af1) a africký 2 (Af2)], podľa profilu spoligotypizácie, špecifických delécií a jednonukleotidových polymorfizmov (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 v špecifických génoch. Tieto klonálne komplexy demonštrujú rozmanitú štruktúru populácie Mycobacterium bovis a jej súvislosť s geografickými oblasťami. Okrem toho, nedávna práca WGS, ktorú vykonali Zimpel a spolupracovníci (2020), navrhla fylogenézu založenú na SNP Mycobacterium bovis s viac ako 1 900 genómami, čo naznačuje, že existujú najmenej štyri rôzne línie (pomenované Lb1 až Lb1 až Lb4), ktoré nie sú úplne konzistentné s predtým definovaným klonálnym komplexom, hoci možno potvrdiť aj geografickú špecifickosť30. Títo autori vykonali diferenciálnu analýzu fylogenézy a molekulárneho datovania, ale neštudovali rekombináciu30.
Predchádzajúce práce s použitím rôznych molekulárnych techník, ako je spoligotypizácia, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number - premenlivý počet tandemových repeatov) a nedávna SNP typizácia odhalili určitú úroveň genetickej diverzity medzi kmeňmi M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Diferenciácia genetickej variácie sa stala dôležitým nástrojom v štúdiu epidemiológie chorôb, čo je užitočné pre hlbšie pochopenie patogenézy, virulencie a prenosu chorôb. Vznik metódy WGS poskytuje možnosť odhaliť evolučné hnacie faktory, ktoré ovplyvňuje genóm Mycobacterium bovis v procese adaptácie a perzistencie na rôznych hostiteľov a epidemiologické scenáre.
V tejto práci používame porovnávaciu genomickú analýzu rôznych súborov údajov o Mycoplasma bovis (n = 70), vrátane izolátov z rôznych klonálnych komplexov, aby sme získali prehľad o evolučnom procese Mycoplasma bovis, najmä na vyriešenie fylogenetických vzťahov a rekombinačných udalostí. Ako doplnok k tejto analýze bol ďalej skúmaný subsúbor izolátov M. bovis (n = 42) získaných z dobre charakterizovanej oblasti tuberkulózy s viacerými hostiteľmi v Portugalsku 31,36, aby sme odvodili neidentifikáciu. Rovnováha medzi relatívnym pomerom sense (dN) a synonymných (dS) nukleotidových substitúcií, ako aj evolučný príspevok špecifických genómov uvedených v literatúre, sú 37,38 získané predkami MTBC prostredníctvom HGT a kódujú génové komponenty systému 3R (oprava, replikácia a rekombinácia DNA) 39. Gény získané prostredníctvom HGT boli vybrané, pretože môžu predstavovať staroveké polymorfizmy, takže sa očakáva, že môžu obsahovať vyšší podiel synonymných zmien. Gény zahrnuté v systéme 3R boli vybrané, pretože predchádzajúca práca na kmeňoch M. tuberculosis naznačila všeobecné negatívne/purifikačné selekcie, ktoré pôsobia na tieto gény a môžu hrať dôležitú úlohu v evolúcii 39. Ďalším cieľom tejto práce je odvodiť existenciu reorganizačných udalostí. Z tohto dôvodu, vzhľadom na to, že náš súbor údajov z Portugalska obsahuje iba genómy európskeho klonového komplexu 2 a kmeňov, ktorým nebol priradený klonový komplex, sme sa rozhodli zahrnúť verejne dostupné genómové údaje, aby sme konečne získali reprezentatívny prehľad všetkých klonových komplexov a zlepšili robustnosť a šírku výsledkov.
Predmetom tejto práce je 42 novo sekvenovaných genómov Mycoplasma bovis z portugalskej endemickej scény multihostiteľskej tuberkulózy (podrobnosti nižšie), ktoré boli predtým charakterizované z epidemiologického hľadiska36. Vzhľadom na to, že súbor údajov z Portugalska obsahuje iba zástupcov európskych 2 klonových komplexov a kmene bez určených komplexov, boli pridané verejne dostupné údaje o sekvenovaní celého genómu, aby sa rozšíril súbor údajov, ktorý zahŕňa všetkých zástupcov klonových komplexov M. bovis. Preto boli v tejto práci použité tri zdroje údajov o sekvenovaní celého genómu: kompletná/návrhová zostava genómu, až 10 scaffoldov uložených v NCBI (Národné centrum pre biotechnologické informácie) (n = 15 izolátov); uložené v SRA (súbor Illumina fastq archívu čítania sekvencií) predstavuje komplexnú diverzitu klonov M. bovis (n = 12 izolátov)30; a 42 novo sekvenovaných genómov z Portugalska. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) bolo z vyhľadávania NCBI vylúčené. Ako referenčný genóm, ktorý sa má zahrnúť do súboru údajov, sa zvyčajne používa M. bovis AF2122/97. Vzhľadom na verejnú nedostupnosť celej sekvencie genómu reprezentovanej klonovacím komplexom African 1 a malý počet genómov z reprezentatívnych kmeňov Af2 a Eu1 boli v týchto prípadoch použité pôvodné sekvenčné údaje poskytnuté SRA. Práca Zimpela a jeho spolupracovníkov (2020) pomohla identifikovať genóm z vyššie uvedeného klonovacieho komplexu a pomohla vybrať Mycobacterium bovis na zaradenie do súboru údajov. Pre Eu3 je opísaný iba jeden typ genómu (Branger a kol., 2020), takže genóm, ktorý zahŕňame, je samostatným zástupcom komplexu Eu3.
Tento súbor údajov zahŕňa globálne 70 druhov M. bovis hovädzieho dobytka izolovaných z 8 hostiteľských druhov, rozšírených v 12 krajinách v rokoch 1985 až 2016. 36 druhov je označených ako Eu2, 7 druhov ako Eu1, 1 druh ako Eu3, 3 druhy ako Af1, 4 druhy ako Af2 a 19 nie je možné pripísať žiadnemu klonálnemu komplexu (podrobnosti nižšie). Podrobné informácie (vrátane prístupového čísla) o Mycobacterium bovis použitých v tejto štúdii sú uvedené v tabuľke 1 a doplnkovej tabuľke 1.
Predmetom tejto štúdie je 42 novo sekvenovaných celých genómov Mycobacterium bovis z ohnísk tuberkulózy zvierat v Portugalsku, ktoré sú distribuované viac ako 12 rokov, pretože potenciálne systémy chorôb medzi voľne žijúcimi zvieratami a hospodárskymi zvieratami boli pravidelne monitorované 31,36 (doplnkový obrázok 1). Podľa následných postupov boli tieto kmene izolované z hovädzieho dobytka (n = 14), jeleňa lesného (n = 16) a diviaka (n = 12) v rokoch 2003 až 2015: zvieratá treba odobrať a manipulovať s nimi v súlade s odporúčanými protokolmi. Vzorky tkaniva sú uvedené v Príručke OIE pre suchozemské zvieratá a sú naočkované na pevné a tekuté médium s pyruvátom Stonebrink a Löwenstein-Jensen. Kultúry sa inkubujú pri teplote 37 °C a rast sa kontroluje raz týždenne počas najmenej 12 týždňov. Kolónie sa skladujú priamo v roztoku glycerolu pri teplote -80 °C. V selektívnom médiu Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) boli pôvodné archivované vzorky pasážované in vitro in vitro, aby sa získala DNA programu WGS. Na tento účel bol zmrazený zásobný kultivačný roztok obohatený 5 % pyruvátom sodným a 10 % ADS (50 g albumínu, 20 g glukózy, 8,5 g chloridu sodného v 1 l vody) na médiu Middlebrook 7H9 pri teplote 37 °C (retrain). Po 4 týždňoch rastu bolo médium obnovené a kultúra bola pravidelne monitorovaná, kým nebol pozorovaný rast. Bunky boli zozbierané centrifugáciou, peleta bola resuspendovaná v 500 µl fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS), zahrievaná na 99 °C počas 30 minút, centrifugovaná a supernatant bol skladovaný pri teplote -20 °C až do WGS. Všetky postupy sa vykonávajú v zariadeniach biologickej bezpečnosti úrovne 3.
Genómová knižnica WGS s párovými koncami sa pripravuje s použitím jedinečného indexu každej vzorky DNA a na sekvenovanie sa používa technológia Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 vzoriek) a HiSeq (2 × 150 pb) (dva izoláty) (Eurofins Genomics, Nemecko). Podľa pokynov výrobcu sa na sekvenovanie genómovej DNA použije analyzátor Illumina Genome Analyzer s obojstranným modulovým pripojením a na zostavenie knižnice sa použije súprava Nextera XT DNA Library Prep Kit od spoločnosti Illumina.
Berúc do úvahy údaje získané zo SRA (n = 12), identifikácia klonového komplexu sa môže použiť ako metadáta zodpovedajúcej publikácie 30, 41, 43. Pri posudzovaní kompletného genómu, s výnimkou Mycobacterium bovis AF2122/97 a Mycobacterium bovis 3601, ktoré sú rozpoznanými členmi klonálneho komplexu Eu1 a Eu3 25, 29, je to rovnaký ako kompletný genóm Mycobacterium tuberculosis H37Rv (prístupové číslo NCBI NC_000962.3). Zarovnanie genómu sa vykonáva pomocou MAFFT (program na viacnásobné zarovnanie aminokyselinovej alebo nukleotidovej sekvencie, verzia 7.458) a parametra -addfragments48. Potom sa hľadá absencia rôznych klonálnych komplexov a/alebo prítomnosť SNP prvkov.
Novo sekvenovaný Mycobacterium bovis (n = 42) a pôvodné čítania zostaveného návrhu genómu (n = 3) zosúlaďujú komplex s referenčným genómom Mycobacterium tuberculosis H37Rv prostredníctvom vSNP pipeline a vykonalo sa vyhľadávanie prítomnosti delécií a/alebo SNP znakov rôznych klonov.
Zhromaždite informácie z nedostatku znakov a/alebo prítomnosti/neprítomnosti SNP a profilov spoligotypizácie na priradenie genomických údajov k zodpovedajúcemu klonálnemu komplexu. Pre štyri návrhy zostáv nie je možné odvodiť profil spoligotypizácie, preto sú zahrnuté do skupiny „bez zložitosti“.
Bioinformatický pracovný postup, ktorý táto práca sleduje, začína de novo zostavením a mapovaním na referenčnú stratégiu s cieľom preskúmať rekombinačné udalosti a špecifické polymorfizmy genómu. Obrázok 1 zobrazuje vývojový diagram nasledujúcich krokov. Na analýzu rekombinácie sa používajú všetky genómy na zvýšenie robustnosti inferencií a súvisiacich indikátorov.
Aby sme znížili chyby pri generovaní konsenzuálnych sekvencií genómu, najprv sme získali de novo zostavenie a potom sme získali viacnásobné zarovnania jadra. Pipeline Unicycler je momentálne dostupný na https://github.com/rrwick/Unicycler49 a používa sa na vykonanie de novo zostavenia 54 sekvenovaných genómov (42 novo sekvenovaných a 12 súborov fastq získaných zo SRA). Stručne povedané, pred zostavením od nuly bola vykonaná analýza kvality čítania v programoch FastQC verzie 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) a Trimmomatic verzie 0.36 (používa sa možnosť „vystrihnúť adaptéry a iné sekvencie špecifické pre osvetlenie z čítaní“ a „Vystrihnúť bázy z konca čítania, ak je nižšia ako prahová kvalita 20“) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic)50. Potom bol na zostavenie genómu použitý SPAdes optimiser49 a na optimalizáciu po zostavení Pilon verzie 1.1851. Aby sa predišlo nesprávnemu zostaveniu, bol zvolený konzervatívny režim premostenia a veľkosť k-méru bola vyhľadávaná a vybraná medzi 20 % a 95 % dĺžky čítania. Riaďte sa pokynmi SPAdes a zohľadnite veľkosť čítania, odstráňte kontigy menšie ako 300 bp a stanovte hraničnú hodnotu pokrytia hĺbky 20 čítaní na 52. V stratégii de novo zostavovania neboli odstránené genomické oblasti, ako sú vysoko repetitívne paralogy prolín-glutamátu (PE) a prolín-prolín-glutamátu (PPE).
Kvalita de novo zostavy sa hodnotí prostredníctvom QUAST pipeline (http://quast.sourceforge.net/quast.html), ktorý uľahčuje obnovu kontigu a mapovania referenčného genómu M. bovis AF2122/97 (prístupové číslo NCBI LT708304.1) (parametre kvality nájdete v doplnkovej tabuľke 1).
Pomocou vSNP pipeline (https://github.com/USDA-VS/vSNP) sa súbor FASTQ novo sekvenovaného M. bovis zo sekvenovania Illumina porovnáva s referenčným genómom M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Podľa odporúčaní osvedčených postupov súpravy Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55 sa na rekalibráciu použijú štandardné parametre filtra alebo variantné hmotnostné skóre. Výsledky sa filtrujú pomocou najnižšieho hmotnostného skóre SAMtools 150 a AC = 2. Na kontrolu nameraných hodnôt a vylúčenie kontaminácie sa používa aj Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/). vSNP pipeline použitý na mapovanie sekvenčných stratégií v našej práci skúma sériu definovaných SNP a cieľov a tiež vylučuje scenáre zmiešanej infekcie. Pokrytie genómu pri čítaní je lepšie ako 99 % (doplnková tabuľka 1).
Aby ste sa vyhli chybám v mapovaní a nesprávnym SNP, odfiltrujte variant v nasledujúcich prípadoch: (1) je podporený menej ako 20 údajmi, (2) nachádza sa s frekvenciou menšou ako 0,9, (3) nachádza sa aspoň v jednom kmeni, ale aspoň v inom kmeni sú medzery. Na vizuálne overenie SNP a pozícií s problémami s mapovaním alebo zarovnaním sa použil integrovaný prehliadač genomiky (IGV) verzie 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56. Keďže gény prolín-glutamátu (PE) a prolín-prolín-glutamátu (PPE) sú vysoko duplikované a sú súčasťou multigénovej rodiny, sekvenovanie a mapovanie pomocou Illuminy ich ľahko nesprávne pochopí, preto sú uprednostňované. Pracovný postup mykobakteriálnej bioinformatiky odstránil členov tuberkulózneho komplexu pri použití stratégie mapovania na sekvenciu na potvrdenie SNP. Preto sme z analýzy odfiltrovali gény PE/PPE a indely.
Podľa Bovilistu (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) sú všetky SNP rozdelené do funkčných kategórií. Na odvodenie dôsledkov SNP (synonymné alebo nesynonymné zmeny) sa používa SnpEff pipeline (https://pcingola.github.io/SnpEff/). Vytvorila sa nová databáza genómu Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Viacnásobné zarovnanie jadra genómu sa vykonalo pomocou Parsnp v1.2, ktorý je momentálne dostupný na https://github.com/marbl/parsnp57, s použitím 69 kompletných genómov/návrhov zostáv (s voľbou -c) a ako referencia sa použil M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Boli vykonané štyri viacnásobné zarovnania jadra: iba členovia klonovacieho komplexu Eu2 (n = 37), vrátane všetkých členov európskeho klonovacieho komplexu (n = 44), vrátane bodu spojenia európskeho a afrického klonovacieho komplexu (n = 51) a vrátane všetkých Mycobacterium bovis v tejto štúdii (n = 70).
Zarovnanie jadra vygenerované programom Parsnp sa používa na odvodenie fylogenetického stromu s maximálnou pravdepodobnosťou (ML) pomocou softvéru CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 s použitím RAxML a vykonanie 1000 riadených replikácií.
Na paralelnú kontrolu prítomnosti rekombinačných udalostí sa používajú tri rôzne algoritmy a bioinformatické nástroje: softvér SplitsTree4, pipeline Gubbins (nestranná línia prostredníctvom rekombinácie v nukleotidových sekvenciách) a softvér RDP4 (program na detekciu rekombinácie, verzia beta 4.101).
Na výpočet bezkoreňovej fylogenetickej siete sa používa metóda rozdelenej dekompozície implementovaná v SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 s použitím Phi testu na štatistické overenie a prah významnosti je p = 0,05. Ako vstup sa používa analýza viacerých zarovnaní jadra Parsnp a rozdelená dekompozícia sa realizuje ako sieťový štandard.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) beží s predvolenými parametrami ako ďalší spôsob na vyhodnotenie vplyvu rekombinácie na Mycobacterium bovis. Algoritmus implementovaný v pipeline rekonštruuje relevantnú klonovú líniu. Kompletná zostava genómu/návrhu našej sady údajov a referenčného genómu (hovädzí bovid AF2122/97, LT708304.1) sú vzájomne porovnané; a skenuje pozíciu SNP na každej vetve stromu, aby sa zistil klaster SNP predstavujúci rekombinačnú udalosť. Nula vetvy predpokladá, že nedošlo k žiadnej rekombinačnej udalosti, čo znamená, že SNP, ktoré sa vyskytujú na vetve, by mali byť rovnomerne rozložené. Ako vstupné súbory sa používajú jadrové viacnásobné zarovnanie z Parsnp a najlepšie skóre ML stromu z RAxML.
Nakoniec, aby sa potvrdila udalosť reorganizácie navrhnutá Gubbinsovým kanálom, šesť algoritmov implementovaných v RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 a SiScan66) sa aplikuje na viacnásobné zarovnanie jadra Parsnp v predvolených nastaveniach. Zistili sme, že aspoň tri z algoritmov implementovaných v RDP4 musia konzistentne preukazovať dôležitý signál na overenie každej udalosti rekombinácie.
Vzhľadom na to, že softvér Gubbins aj RDP hľadajú rekombinačné signály kontrolou viacnásobných zarovnaní jadra v okne až do 500 bp a potvrdením, že zahrnutie génov PE/PPE počas de novo zostavovania nebude interferovať so zistenými rekombinačnými signálmi, ďalšia analýza sa vykonáva kontrolou homolinearity v blízkosti génu identifikujúceho rekombinačnú udalosť. Synlineárna mapa s použitím kompletného genómu bola vytvorená pomocou MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) na vylúčenie lokálnych translokácií alebo inverzií genómu. Okrem toho bol celý genóm použitý na vykonanie homolinearity analýzy aminokyselinovej sekvencie prostredníctvom webového servera SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Podrobnejšia analýza súboru údajov o genóme získaných z portugalského systému multihostiteľskej tuberkulózy slúži na overenie polymorfizmu génov uvedených v literatúre. Ide o gény 37, 38 a gén kódujúci 3R, ktoré predkovia MTBC získali prostredníctvom komponentov systému HGT (oprava, replikácia a rekombinácia DNA) 39. Na výpočet génovej diverzity a nukleotidovej diverzity (π) a vstupného parametra Tajimaovho D neutrálneho testu použite ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) a DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/).
Bol získaný fylogenetický strom s maximálnou pravdepodobnosťou (ML) založený na 69 izolátoch Mycoplasma bovis a referenčných genómoch (Obrázok 2A). V porovnaní so stromami založenými na jednom géne alebo stromami založenými na viacerých lokusoch táto stratégia umožňuje generovanie výkonnejších stromov, ktoré nezachytávajú variabilitu celého genómu, a preto vykazujú nižšiu schopnosť rozlišovať medzi druhmi 68,69. Topologická štruktúra stromu ML je zvyčajne v súlade s komplexnou klasifikáciou klonov. Genóm Eu2 je zoskupený vo vetve a genóm Af1 je tiež zoskupený (Obrázok 2A). Výsledok je tiež v súlade so známym evolučným vzťahom Mycobacterium bovis, to znamená, že existuje veľký rozdiel medzi členom Eu1 a skupinou pozostávajúcou zo všetkých ostatných klonálnych komplexov a genómov, ale klonálny komplex 30 nie je špecifikovaný. Malú nekonzistentnosť medzi klonálnym komplexom a vzťahom pozorovaným na fylogenetickom strome možno vysvetliť skutočnosťou, že klonálny komplex je opísaný na základe špecifických genomických oblastí, zatiaľ čo fylogenetický strom je založený na viacerých zarovnaniach jadrových genómov reprezentujúcich celý genóm.
Fylogenetický strom s maximálnou pravdepodobnosťou (GTR) je zostrojený na základe zarovnania jadra genómu Mycobacterium bovis pred (A) a po (B) odstránení miesta rekombinácie. Farby vetiev predstavujú klonový komplex Mycobacterium bovis: Európa 1 je fialová, Európa 2 je červená, Európa 3 je modrá, Afrika 1 je oranžová a Afrika 2 je zelená. Strom je zakorenený a nakreslený v mierke a dĺžka vetiev je meraná ako náhrada pre každé miesto.
Komplex Mycobacterium tuberculosis je opísaný ako klonálne vyvinutý a väčšina dôkazov nahromadených v priebehu rokov podporuje myšlienku, že prebiehajúce udalosti HGT a rekombinácie sa nevyskytnú na detekovateľnej úrovni MTBC15,17,18.
Predchádzajúce práce ukázali, že medzi kmeňmi MTBC môže existovať obmedzená rekombinácia20,21, zatiaľ čo iné nedokázali identifikovať merateľné rekombinačné udalosti70,71. Znovu prediskutovať túto problematiku so zameraním na Mycobacterium bovis, čo sa líši od predchádzajúcej práce, ktorá brala do úvahy iba Mycobacterium tuberculosis70,71; alebo brať do úvahy MTBC ako celok, pričom takmer žiadny M. bovis nepredstavuje20; alebo brať do úvahy iba reštriktívne frakcie hovädzieho dobytka. Súbor údajov o mykobaktériách v tejto práci obsahuje celkovo 70 kmeňov, ktoré predstavujú všetky klonálne komplexy, a ktoré sa používajú na skríning rekombinácie. Súbor údajov je škálovaný podľa štyroch kumulatívnych úrovní: (1) členovia Eu2, (2) všetci členovia európskeho klonového komplexu (t. j. Európa), (3) európsky a africký klonový komplex (Eu + Af) a (4) celé zbierky údajov (vrátane genómov, ktoré nie sú zahrnuté v žiadnych už opísaných klonovacích komplexoch).
Na ďalšie štúdium tejto hypotézy bola vykonaná sieť s rozdeleným dekompozíciom na posúdenie absencie rekombinačných udalostí medzi genómami, pretože táto metóda dokáže vizualizovať vzťah medzi jedincami a zobraziť protichodné fylogenetické signály. Všetky štyri súbory údajov v analýze potvrdili existenciu slučiek v sieti (t. j. oblastí, ktoré nezbiehajú do jedného stromu), ale Phi test nemá štatistickú podporu (Eu2, p = 0,0956; Európa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; celý súbor údajov p = 0,2451), čo poskytuje slabé dôkazy o existencii reorganizačných udalostí (obrázok 3A-D).
V Európe 2 genómy (n = 37) (A), európske genómy (n = 44) (B), európske a africké genómy (n = 51) (C) a celý súbor údajov (n = 70) (D).
Po tejto analýze a s prihliadnutím na cyklické pozorovania vo všetkých sieťach bol na rekonštrukciu klonálnej línie a na doplnenie odhadu vplyvu rekombinácie na genóm M. bovis použitý rekonštrukčný algoritmus implementovaný v Gubbinsovom pipeline. Odvodte kumulatívny počet rekombinačných udalostí, z ktorých väčšina sa vyskytla v terminálnych vetvách (t. j. v jednom genóme) (Tabuľka 2). Tieto indikátory ukazujú konzistentnosť celého súboru údajov a naznačujú, že frekvencia rekombinačných udalostí je 200 až 300-krát vyššia ako frekvencia mutácií. Parameter rho/theta predstavujúci relatívne rýchlosti rekombinácie a bodových mutácií na vetve sa javí medzi 0,0037 a 0,0056 (Tabuľka 3). Nedávno publikovaná práca o kmeni 38 M. bovis preukázala vyššiu hodnotu rho/theta (rho/theta = 0,1) ako hodnota získaná v tomto súbore údajov, ale práca Pataného a kolegov použila zostavenie na základe referencií na odvodenie parametrov rekombinácie. Procedurálny detail, spôsobený postupom zostavovania, bol spojený s množstvom predpokladaných rekombinačných udalostí v terminálnej vetve.
Parameter r/m ďalej predstavuje pomer diverzity rekombinácie a zavedenia mutácií a jeho priemerná hodnota je medzi 0,025 a 0,037, čo naznačuje, že v porovnaní s mutáciami má rekombinácia nižší celkový vplyv na genetickú diverzitu M. bovis (Tabuľka 3). Pre rozsiahle porovnanie bola použitá podobná metóda na odhad parametra r/m pre súbor údajov MTBC zložený z 23 genómov, ktorá vykazuje priemernú hodnotu 0,48620, zatiaľ čo pre súbor údajov 38 M. bovis od Pataného a kolegov sa preukázala priemerná hodnota 0,98. V prvej štúdii boli zahrnuté iba dva z 23 genómov M. bovis (M. bovis BCG a referenčný kmeň), takže získaná hodnota môže byť skreslená v dôsledku nadmernej expresie genómu M. tuberculosis. V druhej správe boli analyzované populácie Mycobacterium bovis získané prevažne zo Spojených štátov a od hospodárskych zvierat. Naproti tomu v našom súbore údajov je zastúpených viac geografických lokalít a hostiteľských druhov a používajú sa aj genómy zoskupené do rôznych klonálnych komplexov s rôznymi genetickými charakteristikami populácie, čím sa dosahuje hlbšia a širšia znalosť populácie. Priemerná hodnota rozdielu r/m získaná s naším súborom údajov je v súlade s koncepciou, že stupeň rekombinácie sa medzi líniami priradenými k rovnakému taxonomickému druhu značne líši, takže tieto výsledky naznačujú, že klonový komplex M. bovis môže vykazovať rozdiely v rekombinácii. Dopad je tiež taký, aký navrhli Didelot a Maiden72. Napriek tomu výrazné rozšírenie tohto súboru údajov zahrnutím väčšieho počtu genómov M. bovis umožní ďalšie objasnenie tohto bodu. Parametre r/m aj rho/theta vykazujú variabilitu medzi vetvami a tento výsledok je v súlade so správami o iných bakteriálnych druhoch72,73.
Nakoniec, aby sa potvrdili reorganizačné udalosti identifikované Gubbinsovým kanálom, v softvéri RDP4 sa použilo šesť rôznych algoritmov na nezávislé testovanie rôznych jadrových multi-porovnaní. Celosvetovo menej ako polovica udalostí identifikovaných Gubbinsom bola potvrdená RDP4 (tabuľky 4 a 5). Z celkového súboru údajov boli potvrdené tri rekombinačné udalosti, dve zahŕňajúce interné uzly a ďalšie zahŕňajúce jeden genóm v terminálnej vetve, pre ktorú nebolo možné priradiť klonálne komplexy (tabuľky 4 a 5). Identifikácia udalostí v terminálnych vetvách môže naznačovať, že rekombinácia v súčasných kmeňoch M. bovis stále prebieha alebo je výsledok nesprávne umiestnený70. V tejto hypotetickej rekombinačnej oblasti má približne 20 % pozícií nedefinované nukleotidy (N), čo ovplyvňuje rekombinačný signál (doplnkový obrázok 2). Okrem toho táto oblasť ovplyvňuje gén rrs, kódujúci 16S ribozomálnu RNA, o ktorej sa očakáva, že je vysoko konzervovaná, takže tento predpokladaný rekombinačný signál môže byť výsledkom chýb v sekvenovaní alebo nesprávneho zarovnania. Následne sa vykonalo zarovnanie celého genómu medzi Mb0003 a Mycobacterium bovis AF2122/97 a potvrdila sa existencia nedefinovaných nukleotidov a SNP, takže možné problémy súvisiace s nesprávnym zarovnaním neboli spôsobené biologickými informáciami implementovanými v tejto práci. Objavili sa po naučení sa programu.
V rekombinačných oblastiach vnútorných uzlov sa nenašli žiadne medzery ani nedefinované nukleotidy (obrázky 4 a 5). Pokiaľ ide o tieto udalosti, jedna obsahuje iba genóm Eu2 a ovplyvňuje gén pks12, ktorý kóduje možnú polyketid syntázu; zatiaľ čo druhá je registrovaná v genóme Eu1 a ovplyvňuje gén narX, ktorý kóduje možnú nitrát reduktázu (tabuľka 4). Vo všeobecnosti analýza rekombinácie ukazuje, že existuje obmedzený počet rekombinačných fragmentov so štatistickou podporou a odvodené indikátory naznačujú, že rekombinácia má nízky vplyv na líniu M. bovis. Očakáva sa, že signál rekombinácie bude nízky, ale je dôležité rozlíšiť skutočný evolučný signál od šumu pozadia, čo je náročná úloha. Aby sa znížil šumový signál zavedený problémami s referenčným zostavením a nesúladom 70, 71, všetky ostatné okrem kompletného genómu boli zostavené od nuly a kvalita zostavenia bola skontrolovaná a zabezpečená analýzou QUAST pipeline (doplnková tabuľka 1). Okrem toho sa vykonala séria doplnkových analýz na zabezpečenie robustnosti a presnosti celkového prieskumu. Preto sa kvalita sekvenovania génov narX a pks12 vyhodnotila mapovaním čítaní proti Mycobacterium bovis AF2122/97. Odporúčaná pozícia SNP v rekombinačnej oblasti sa potvrdila použitím kritérií uvedených v časti o metóde (najmenej 20 čítaní a frekvencia zmien 0,9). Polymorfizmus génu narX sa plne potvrdil v dvoch genómoch (Mb1792361 a Mb7240415; 2,3 %) a genómoch genómu pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 a Mb12. Avšak v prípade genómu Mb2043 šesť z ôsmich pozícií nespĺňa kritérium hĺbky čítania, pretože SNP je podporený maximálne 17 čítaniami, čo je pod stanovenou hraničnou hodnotou 20. Preto možno potvrdiť rekombináciu šiestich genómov (8,6 %) na tomto mieste genómu (obrázky 4 a 5).
Detailná vizualizácia zarovnania rekombinačnej oblasti súboru údajov Mycobacterium bovis ovplyvňuje gén narX, ktorý kóduje možnú nitrátreduktázu. V rekombinačnej oblasti vnútorných uzlov sa nenašli žiadne medzery ani nedefinované nukleotidy. Táto konkrétna udalosť je zaznamenaná v genóme Eu1. Kvalita sekvenovania génu narX bola vyhodnotená vynesením údajov z Mycobacterium bovis AF2122/97. Odporúčanú polohu SNP v rekombinačnej oblasti potvrďte použitím kritérií uvedených v časti o metóde (najmenej 20 údajov a frekvencia zmien 0,9). Polymorfizmus génu narX bol plne potvrdený v genómoch Mb1792361 a Mb7240415 (2,3 %).
Detailná vizualizácia zarovnania rekombinačnej oblasti súboru údajov Mycoplasma bovis ovplyvňujúceho gén pks12. V rekombinačnej oblasti vnútorných uzlov sa nenašli žiadne medzery ani nedefinované nukleotidy. Pokiaľ ide o udalosť ovplyvňujúcu gén pks12 kódujúci možnú polyketid syntázu, obsahuje iba genóm Eu2. Kvalita sekvenovania pks12 bola hodnotená mapovaním čítania Mycobacterium bovis AF2122/97. Potvrďte odporúčané umiestnenie SNP v rekombinačnej oblasti použitím kritérií uvedených v časti o metóde (najmenej 20 čítaní a frekvencia zmien 0,9). Polymorfizmy genómov Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 a Mb1960 boli plne potvrdené.
Gény PE a PPE majú repetitívne oblasti, ktoré sa dajú ľahko nesprávne prečítať sekvenovaním a mapovaním pomocou Illumina, takže sa zvyčajne vymažú z bioinformatického pracovného postupu členov M. tuberculosis iba pri použití stratégie mapovania na sekvenciu. Inferencia rekombinačných udalostí použitá v tejto práci je založená na de novo zostavení bez filtrovania PE/PPE. Veríme, že implementáciou troch rôznych komplementárnych metód a algoritmov prostredníctvom softvéru SplitsTree, Gubbins pipeline a RDP4 sú použité stratégie robustné voči spracovaniu a filtrovaniu reorganizovaných oblastí spôsobených chybovými signálmi. Aby sa však vylúčila interferencia génu PE/PPE so softvérom Gubbins a RDP4 pri identifikácii SNP klastrov, a teda aj identifikácii rekombinačných oblastí, o ktorých sa predpokladá, že ovplyvňujú gény narX a pks12, skúmalo sa okolie týchto génov (doplnkový obrázok 3–5). V M. bovis AF2122/97 je gén narX oddelený génmi narK2 a Mb1764c, zatiaľ čo pks12 je obklopený génmi Mb2075c a Mb2073c (doplnkový obrázok 3-5). Mapa vygenerovaná pomocou synlineárnej mapy MAUVE kompletného genómu poskytuje informácie o konzervácii a preskupení génovej sekvencie, pričom zobrazuje štyri kolineárne bloky a žiadne známky translokácie alebo inverzie genómu. Okrem toho komplementačná analýza s aminokyselinovou sekvenciou preukázala homológiu vo všetkých kompletných genómoch a v susedných oblastiach narX alebo pks12 sa nenašiel žiadny PE/PPE. V prípade narX má jeden genóm (Mb0030) nižšie skóre synonymie, pretože gén narX bol identifikovaný ako dva fragmenty (fragmenty 1891 a 1890). V prípade pks12 vykazovali Mb0030 a Mb003 v dôsledku podobností nižšie skóre synlinearity, zatiaľ čo pks12 bol identifikovaný v dvoch, respektíve troch fragmentoch, ktoré predstavujú rôzne domény proteínu (doplnkový obrázok 3-5). Berúc do úvahy tieto informácie a analýzu vykonanú softvérmi Gubbins aj RDP4 a skontrolovanú viacnásobnú orientáciu jadra s maximálnymi 500 bp v danom okne, sme potvrdili, že gén PE/PPE nebude interferovať s rekombinačným signálom, ktorý ovplyvňuje narX a pks12.
Hoci rekombinačné signály detegované v tomto súbore údajov možno považovať za reziduálne, je pravda, že rekombináciu u M. bovis nemožno vylúčiť, preto by mala byť naďalej predmetom ďalšej analýzy, v ktorej sa celé genómy z rôznych epidemiologických scenárov sekvenujú na dôležité.
Porovnanie fylogenetických stromov ML získaných pred a po korekcii rekombinácie (obrázok 2A, B) neviedlo k významným zmenám v odvodenom fylogenetickom vzťahu a kmene M. bovis boli zoskupené v rovnakej skupine.
Po zmapovaní 42 novosekvenovaných čítaní M. bovis s referenčným genómom M. bovis AF2122/97 sa získalo zarovnanie SNP obsahujúce 1816 polymorfných pozícií. Väčšina SNP (87,1 %) sa nachádza v kódujúcej oblasti a postihnuté gény sú charakterizované podľa funkčných kategórií uvedených v Bovilist (obrázok 6A, B). Ak vezmeme do úvahy celkový počet génov v každej funkčnej kategórii, gény v kategórii „metabolizmus lipidov“ vykazovali viac SNP, nasledované génmi „bunková stena a bunkové procesy“ a „medziľahlý metabolizmus a dýchanie“, čo naznačuje, že sa nachádzajú v evolúcii M. bovis.
Hierarchická analýza súboru údajov M. bovis z Portugalska (n = 42). Celkový počet registrovaných SNP a postihnutých génov pre každú funkčnú kategóriu (A). Celkový počet synonymných a nesynonymných zmien registrovaných podľa funkčnej kategórie (B).
V globálnom meradle je priemerný pomer dN/dS lepší ako 1,5, čo naznačuje, že globálny evolučný tlak smeruje k zbaveniu sa predkového stavu a predstavuje pozitívny (diverzifikovaný alebo riadený) a/alebo uvoľnený scenár výberu purifikácie. V kategóriách „virulencia, detoxikácia, adaptácia“, „inzerčné sekvencie a fágy“ a „regulačné proteíny“ sú viac ako dve tretiny SNP nesynonymné (obrázok 6B).
Vo všetkých kategóriách sa nachádzajú gény s viacerými SNP, čo vedie k priemernej miere mutácií (t. j. priemernému SNP na gén) vyššej ako 1 (obrázok 6A). Pks12 (Mb2074c) s 15 SNP a fas (Mb2553c) s 8 SNP majú vyššie hodnoty mutácií. Oba tieto gény sa podieľajú na metabolizme mastných kyselín. Gén pks kóduje polyketid syntázu (PKS), čo je multifunkčný enzým zapojený do biosyntézy lipidov bunkovej steny mykobaktérií74,75. Tento gén kóduje multifunkčný polypeptid, ktorý sa podieľa na syntéze mykoketidov74,76. Gén fas sa podieľa na syntéze kyseliny mykolovej. Oba tieto gény hrajú dôležitú úlohu v biosyntéze bunkovej steny v kontakte s hostiteľom.
Pre ďalšie štúdium evolúcie Mycobacterium bovis boli analyzované dve sady špecifických génov. Predtým publikované práce využívajúce metódy sekvenčného zloženia a fylogenetických metód identifikovali gény, ktoré získali predkovia MTBC prostredníctvom HGT pred diverzifikáciou37,38. Tieto gény sú uvedené v doplnkovej tabuľke 2. Analyzovala sa distribúcia SNP celkovo 77 génov, ktoré môžu súvisieť s HGT, a identifikovalo sa 26 polymorfných miest, ktoré vo väčšine prípadov (78 %) viedli k nesynonymným (NS) zmenám (doplnková tabuľka 2). Predchádzajúce práce na genóme MTBC ukázali, že predpokladaná oblasť HGT vykazuje vyšší pomer NS SNP v porovnaní so zvyškom genómu. Ak si niekto myslí, že tieto rekombinantné oblasti získali predkovia MTBC, a preto nadmerne reprezentujú staroveké polymorfizmy, potom sa očakáva, že podiel synonymných zmien bude vyšší, pretože sa očakáva, že NS substitúcie budú eliminované negatívnou selekciou kvôli zmenám aminokyselín, ktoré môžu zmeniť funkciu proteínu. Naše výsledky preto naznačujú, že funkčné dôsledky môžu prameniť z nahradenia génov podobných HGT, čo odráža ich význam pre cennú adaptívnu genetickú diverzitu.
Súbežne s touto analýzou boli dôkladne preskúmané gény kódujúce komponenty systému 3R (oprava, replikácia a rekombinácia DNA) v súlade so zoznamom, ktorý predtým publikovali dos Vultos a spolupracovníci (2008)39. Výmenu identických fragmentov DNA nemožno priamo pozorovať, hoci môže ísť o častý proces, keď sú zapojené blízko príbuzné baktérie, ako je to v prípade tohto súboru údajov; okrem toho môže byť tento proces kľúčom k metódam opravy DNA72, takže zohrávajú úlohu v homológnej rekombinácii. Celkovo bolo identifikovaných 26 polymorfných pozícií distribuovaných 54 génmi (doplnková tabuľka 3). V tomto súbore génov predstavovali zmeny NS približne 65 % následkov, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami o kmeňoch Mycobacterium tuberculosis.
Čas uverejnenia: 21. októbra 2021