Vielen Dank für Ihren Besuch bei Nature. Ihre Browserversion bietet nur eingeschränkte CSS-Unterstützung. Für eine optimale Darstellung empfehlen wir Ihnen, eine neuere Browserversion zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren). Um die zukünftige Unterstützung zu gewährleisten, werden wir die Seiten auch ohne CSS-Stile und JavaScript anzeigen.
Die Genomsequenzierung hat die Infektionsforschung revolutioniert und Einblicke in Epidemiologie, Pathogenese, Wirt-Pathogen-Interaktionen und die evolutionären Prozesse von Krankheitserregern ermöglicht. Der Mycobacterium-tuberculosis-Komplex (MTBC) betrachtet Mycobacterium bovis als eines seiner tieradaptierten Mitglieder, das Tuberkulose (TB) bei Landsäugetieren verursacht und als typisches Modell für die bakterielle Evolution dient. Wie andere MTBC-Mitglieder gilt Mycobacterium bovis als streng klonierter, langsam evolvierender Erreger, und es gibt offensichtlich keine Anzeichen für Rekombination oder horizontalen Gentransfer. In dieser Arbeit wenden wir vergleichende Genomik auf einen Datensatz mit vollständigen Genomsequenzen (WGS) von 70 Rinder-Mycobacterium-bovis-Stämmen unterschiedlicher Abstammung (Europa und Afrika) an, um Einblicke in die genetische Diversität und das evolutionäre Potenzial von Rinder-Mycobacterium bovis zu gewinnen. Drei verschiedene Methoden werden verwendet, um Anzeichen von Reorganisation zu ermitteln. Insgesamt wurde eine geringe Anzahl von Rekombinationsereignissen identifiziert und durch zwei unabhängige Methoden mit solider Unterstützung bestätigt. Dennoch hat Rekombination im Vergleich zu Mutationen einen geringeren Einfluss auf die Diversität von M. bovis (Gesamt-r/m = 0,037). Der in unserem Datensatz ermittelte mittlere r/m-Wert des klonalen Komplexes von Mycobacterium bovis steht im Einklang mit der allgemeinen Annahme, dass der Grad der Rekombination zwischen Linien derselben taxonomischen Art stark variieren kann. Basierend auf dieser Arbeit kann Rekombination in Mycobacterium bovis nicht ausgeschlossen werden und sollte daher Gegenstand weiterer Untersuchungen in zukünftigen vergleichenden Genomstudien sein. Hierbei ist die WGS großer Datensätze aus verschiedenen epidemiologischen Szenarien weltweit von entscheidender Bedeutung. Eine zusätzliche Analyse wurde anschließend an dem kleineren Mycobacterium-bovis-Datensatz (n = 42) zur Tuberkuloseprävalenz bei mehreren Wirten durchgeführt. Dabei wurden über 1800 Loci identifiziert, von denen mindestens ein Stamm einen Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) aufwies. Die meisten (87,1 %) befinden sich in der kodierenden Region, und das globale Verhältnis von nicht-synonymen zu synonymen Veränderungen (dN/dS) übersteigt 1,5. Dies deutet darauf hin, dass positive Selektion eine wichtige evolutionäre Kraft bei M. bovis darstellt. Ein höherer Anteil an SNPs wurde in Genen mit vielen funktionellen Kategorien wie „Lipidstoffwechsel“, „Zellwand- und Zellprozesse“ sowie „Intermediärstoffwechsel und Atmung“ nachgewiesen, was deren Bedeutung für die Biologie und Evolution von Mycobacterium bovis unterstreicht. Eine genauere Betrachtung der Gene in den MTBC-Vorfahren, die anfällig für horizontalen Gentransfer sind und zum 3R-System (DNA-Reparatur, Replikation und Rekombination) gehören, zeigt einen globalen durchschnittlich negativen Wert im Taijima-D-Neutralitätstest. Dies deutet auf eine vergangene selektive Suche hin. Der jüngste Flaschenhals nach der Populationsausbreitung ist weiterhin der wichtigste evolutionäre Triebkraft für den Kampf des obligatorischen Krankheitserregers Mycobacterium bovis gegen den Wirt.
Der Mycobacterium-tuberculosis-Komplex (MTBC) zählt zu den erfolgreichsten Taxa bakterieller Krankheitserreger und ist ein typisches Beispiel bakterieller Evolution. Seine Mitglieder weisen eine überraschend hohe Nukleotididentität auf genomischer Ebene auf (> 99 %)1,2. Verschiedene MTBC-Ökotypen können Tuberkulose (TB), eine infektiöse granulomatöse Erkrankung, in einer Vielzahl von Wirtsarten, von Kleinsäugern bis hin zum Menschen, verursachen3,4,5. Derzeit umfasst der Komplex humane [M. tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] sowie an Tiere angepasste Pathogene (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, „Bacillus chimpanzee“ und „Bacillus dassie“)5,6. M. canettii (auch bekannt als "Nodobacter glabrata") weist eine durchschnittliche Nukleotididentität von 98 % mit den zuvor genannten Mykobakterien auf, und vergleichende Genomstudien haben gezeigt, dass sich M. canettii und der Rest des MTBC erst kürzlich vom gemeinsamen Vorfahren abgespalten haben.7 In Anbetracht dieses Konzepts bezeichnen einige Autoren M. canettii als Mitglied des MTBC 8.
MTBC wird systematisch als strikt klonaler Komplex beschrieben, dessen Populationsstruktur eindeutig durch reduzierte Diversität, genetische Flaschenhälse, selektives Scanning und Gendrift bestimmt wird9,10. Ausgehend von einer komplexen, strikt klonalen Evolution können fehlende Polymorphismen beispielsweise nicht durch Rekombination wiederhergestellt werden. Basierend auf dieser Prämisse wurden die aufeinanderfolgenden Ereignisse der genomischen Deletion der differentiellen Region (RD) und von TbD1 (Mtb-spezifische Deletion 1) als molekulare Marker der MTBC-Evolution vorgeschlagen2,5,11. Vergleichende Genomik und Ganzgenomsequenzierung (WGS) unterstützen die Einteilung der an den Menschen adaptierten Mitglieder in neun Linien (Mycobacterium tuberculosis L1 bis L4, L7 und L8; und Mycobacterium africanum L5, L6 und L9), wobei die Linien L2 bis L4 die Deletion der TbD1-Region gemeinsam aufweisen2,11,12,13. Darüber hinaus wird angenommen, dass die an Tiere angepassten Mitglieder einen gemeinsamen Vorfahren haben, der durch kladespezifische Deletionen in RD7, RD8, RD9 und RD102, 5 und 14 definiert ist.
Horizontaler Gentransfer (HGT) und Rekombinationsereignisse gelten als selten und treten eher in den Vorfahren des MTBC auf als in der eigenständigen Geschichte der einzelnen MTBC-Mitglieder15,16,17. Zwei frühe Berichte von Hughes et al. (2002) und Gutacker et al. (2006) legten nahe, dass Rekombinationsereignisse zur Ausprägung von Polymorphismen beitragen könnten, die spezifische Loci in M.-tuberculosis-Stämmen markieren18,19. Die Gründe für das offensichtliche Fehlen von Rekombination im MTBC sind: (1) der mechanische Prozess und der Verlust der Fähigkeit zum HGT; (2) die Seltenheit von HGT-Ereignissen; (3) die fehlende Möglichkeit für Rekombinationsereignisse in der MTBC-Nische14,17. Kürzlich durchgeführte Studien mittels Ganzgenomsequenzierung (WGS) an MTBC-Stamm 20 und Mycobacterium bovis 21 lieferten Hinweise auf Rekombinationen. Sie zeigten erstmals, dass MTBC-Stämme häufig kleine DNA-Fragmente austauschen, diese Ereignisse aber aufgrund der begrenzten Nukleotidsequenzvariation bisher nicht bemerkt wurden.
Mycobacterium bovis ist das am häufigsten aus Nutztieren (hauptsächlich Rindern) isolierte Mitglied des MTBC, kann aber auch bei freilaufenden und eingezäunten Wildtieren nachgewiesen werden4,22,23,24. M. bovis entwickelte sich gemäß dem Spoligotypisierungsprofil, spezifischen Deletionen und Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs)25,26,27,28,29 in bestimmten Genen zu fünf Hauptklonalkomplexen [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) und Africa 2 (Af2)]. Diese Klonalkomplexe verdeutlichen die vielfältige Struktur der Mycobacterium-bovis-Population und ihre Assoziation mit geografischen Regionen. Darüber hinaus erstellten Zimpel et al. (2020) mittels WGS eine Phylogenie auf Basis der SNPs von Mycobacterium bovis mit über 1.900 Genomen. Diese Phylogenie deutet auf mindestens vier verschiedene Linien (Lb1 bis Lb4) hin, die nicht vollständig mit dem zuvor definierten Klonalkomplex übereinstimmen, obwohl auch hier eine geografische Spezifität bestätigt werden konnte30. Die Autoren führten eine differentielle Phylogenie- und molekulare Datierungsanalyse durch, untersuchten jedoch keine Rekombination30.
Frühere Arbeiten mit verschiedenen molekularen Techniken wie Spoligotypisierung, MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repeat Unit – Variable Tandem Repeat Number) und der jüngsten SNP-Typisierung zeigten eine gewisse genetische Diversität zwischen M. bovis-Stämmen31,32,33,34,35. Die Differenzierung genetischer Variationen hat sich zu einem wichtigen Instrument in der Erforschung der Krankheitsepidemiologie entwickelt und trägt zu einem tieferen Verständnis von Pathogenese, Virulenz und Krankheitsübertragung bei. Die WGS-Methode ermöglicht es, die evolutionären Triebkräfte des Mycobacterium bovis-Genoms im Prozess der Anpassung und Persistenz an verschiedene Wirte und epidemiologische Szenarien aufzudecken.
In dieser Arbeit verwenden wir vergleichende Genomanalysen an verschiedenen Mycoplasma bovis-Datensätzen (n=70), darunter Isolate aus verschiedenen Klonalkomplexen, um Einblicke in den Evolutionsprozess von Mycoplasma bovis zu gewinnen, insbesondere um phylogenetische Beziehungen und Rekombinationsereignisse aufzuklären. Ergänzend zu dieser Analyse wurde ein Teildatensatz von M. bovis-Isolaten (n = 42) aus einem gut charakterisierten Tuberkulosegebiet mit mehreren Wirten in Portugal31,36 weiter untersucht, um Rückschlüsse auf die Nichtidentität zu ziehen. Das Gleichgewicht zwischen dem relativen Verhältnis von Sense- (dN) zu synonymen (dS) Nukleotidsubstitutionen sowie der evolutionäre Beitrag spezifischer Genome, die in der Literatur erwähnt werden,37,38 stammen von MTBC-Vorfahren durch horizontalen Gentransfer (HGT) und kodieren Genkomponenten des 3R-Systems (DNA-Reparatur, Replikation und Rekombination)39. Die Auswahl von durch HGT entstandenen Genen erfolgte, da diese möglicherweise alte Polymorphismen repräsentieren und daher voraussichtlich einen höheren Anteil synonymer Veränderungen aufweisen. Die im 3R-System enthaltenen Gene wurden ausgewählt, da frühere Arbeiten an M.-tuberculosis-Stämmen auf allgemeine negative/reinigende Selektionen hinwiesen, die auf diese Gene wirken und eine wichtige Rolle in der Evolution spielen könnten39. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist es, auf das Vorhandensein von Reorganisationsereignissen zu schließen. Da unser Datensatz aus Portugal nur die Genome des europäischen Klonkomplexes 2 und von Stämmen ohne Zuordnung zu einem Klonkomplex enthält, haben wir uns entschieden, öffentlich verfügbare Genomdaten einzubeziehen, um schließlich ein repräsentatives Spektrum aller Klonkomplexe zu erhalten und die Robustheit und Breite der Ergebnisse zu verbessern.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen 42 neu sequenzierte Mycoplasma-bovis-Genome aus dem endemischen, multi-host Tuberkulosegebiet Portugals (Details siehe unten), die zuvor epidemiologisch charakterisiert wurden36. Da der Datensatz aus Portugal lediglich Vertreter der europäischen Klonkomplexe 2 und Stämme ohne zugeordnete Komplexe umfasst, wurden öffentlich verfügbare Ganzgenomsequenzierungsdaten hinzugefügt, um den Datensatz um alle Vertreter der M.-bovis-Klonkomplexe zu erweitern. Daher wurden in dieser Arbeit drei Ganzgenomsequenzierungsdatenquellen verwendet: eine vollständige/vorläufige Genomassemblierung mit bis zu 10 Scaffolds, gespeichert im NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 Isolate); eine im SRA (Illumina-fastq-Datei des Sequence Read Archive) gespeicherte Sequenz, die die komplexe Diversität der M.-bovis-Klone repräsentiert (n = 12 Isolate)30; sowie 42 neu sequenzierte Genome aus Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guérin) wurde von der NCBI-Suche ausgeschlossen. M. bovis AF2122/97 wird üblicherweise als Referenzgenom für den Datensatz verwendet. Da die vollständige Genomsequenz des Klonierungskomplexes African 1 nicht öffentlich zugänglich ist und nur wenige Genome repräsentativer Stämme von Af2 und Eu1 vorliegen, wurden in diesen Fällen die von SRA bereitgestellten Originalsequenzierungsdaten verwendet. Die Arbeit von Zimpel et al. (2020) trug zur Identifizierung des Genoms des genannten Klonierungskomplexes und zur Auswahl von Mycobacterium bovis für den Datensatz bei. Für Eu3 ist nur ein Genomtyp beschrieben (Branger et al., 2020), daher handelt es sich bei dem von uns verwendeten Genom um einen separaten Vertreter des Eu3-Komplexes.
Weltweit umfasst dieser Datensatz 70 aus 8 Wirtstierarten isolierte Mycobacterium bovis-Stämme von Rindern aus 12 Ländern im Zeitraum von 1985 bis 2016. 36 Arten sind als Eu2, 7 Arten als Eu1, 1 Art als Eu3, 3 Arten als Af1, 4 Arten als Af2 klassifiziert, und 19 Arten lassen sich keinem Klonkomplex zuordnen (Details siehe unten). Die detaillierten Informationen (einschließlich der Zugangsnummer) zu den in dieser Studie verwendeten Mycobacterium bovis-Stämmen sind in Tabelle 1 und Ergänzungstabelle 1 dargestellt.
Im Mittelpunkt dieser Studie stehen 42 neu sequenzierte Vollgenome von Mycobacterium bovis aus portugiesischen Tuberkulose-Hotspots bei Tieren, die seit über 12 Jahren verbreitet sind. Potenzielle Krankheitssysteme zwischen Wild- und Nutztieren wurden regelmäßig überwacht (31,36; siehe Abb. S1 im Anhang). Die Stämme wurden gemäß den nachfolgenden Verfahren von 2003 bis 2015 aus Rindern (n = 14), Rothirschen (n = 16) und Wildschweinen (n = 12) isoliert. Die Tiere wurden gemäß den empfohlenen Protokollrichtlinien gesammelt und behandelt. Die Gewebeproben sind im OIE-Handbuch für Landtiere aufgeführt und wurden auf Stonebrink- und Löwenstein-Jensen-Pyruvat-Festmedium und -Flüssigmedium beimpft. Die Kulturen wurden bei 37 °C inkubiert und das Wachstum mindestens 12 Wochen lang wöchentlich kontrolliert. Die Kolonien wurden direkt in einer Glycerinlösung bei -80 °C gelagert. Im Mycobacterium-Selektivmedium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) wurden die archivierten Originalproben einer einzigen Passage in vitro unterzogen, um die DNA für das WGS-Programm zu gewinnen. Dazu wurde die gefrorene Kulturstammlösung mit 5 % Natriumpyruvat und 10 % ADS (50 g Albumin, 20 g Glucose, 8,5 g Natriumchlorid in 1 l Wasser) auf Middlebrook 7H9 bei 37 °C angereichert. Nach vierwöchigem Wachstum wurde das Medium erneuert und die Kultur regelmäßig bis zum Wachstum überwacht. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, das Pellet in 500 µl phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert, 30 Minuten bei 99 °C erhitzt, zentrifugiert und der Überstand bis zur WGS bei -20 °C gelagert. Alle Verfahren wurden in Laboren der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt.
Die WGS-Paired-End-Genombibliothek wird anhand des eindeutigen Index jeder DNA-Probe erstellt und mittels Illumina MiSeq (2 × 250 bp) (40 Proben) und HiSeq (2 × 150 bp) (zwei Isolate) Technologie (Eurofins Genomics, Deutschland) sequenziert. Gemäß den Herstellerangaben wird die genomische DNA mit dem Illumina Genome Analyzer und dem Double-Ended-Modul sequenziert. Die Bibliothek wird mit dem Nextera XT DNA Library Prep Kit von Illumina erstellt.
Unter Berücksichtigung der aus der SRA gewonnenen Daten (n = 12) kann die Identifizierung des Klonkomplexes als Metadaten der entsprechenden Publikationen 30, 41, 43 verwendet werden. Das vollständige Genom ist, mit Ausnahme von Mycobacterium bovis AF2122/97 und Mycobacterium bovis 3601, die als Mitglieder der Klonkomplexe Eu1 bzw. Eu3 anerkannt sind 25, 29, identisch mit dem vollständigen Genom von Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI-Zugangsnummer NC_000962.3). Die Genomsequenzierung erfolgte mit MAFFT (Multiple Alignment Program of Amino Acid or Nucleotide Sequence, Version 7.458) und dem Parameter -addfragments48. Anschließend wurde nach dem Fehlen verschiedener Klonkomplexe und/oder dem Vorhandensein von SNP-Merkmalen gesucht.
Die neu sequenzierten Mycobacterium bovis (n = 42) und die ursprünglichen Reads des assemblierten Genomentwurfs (n = 3) alignieren den Komplex mit dem Referenzgenom Mycobacterium tuberculosis H37Rv mittels der vSNP-Pipeline und der Suche nach dem Vorhandensein von Deletions- und/oder SNP-Merkmalen verschiedener Klone.
Informationen über fehlende Merkmale und/oder das Vorhandensein/Fehlen von SNP- und Spoligotypisierungsprofilen werden gesammelt, um Genomdaten dem entsprechenden Klonalkomplex zuzuordnen. Für die vier Entwurfs-Assemblierungen kann das Spoligotypisierungsprofil nicht abgeleitet werden, daher werden sie der Gruppe „keine Komplexität“ zugeordnet.
Der in dieser Arbeit angewandte bioinformatische Workflow beginnt mit der De-novo-Assemblierung und dem Mapping auf eine Referenzstrategie, um Rekombinationsereignisse und spezifische Genompolymorphismen zu untersuchen. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der einzelnen Schritte. Für die Rekombinationsanalyse werden alle Genome verwendet, um die Robustheit der Schlussfolgerungen und zugehörigen Indikatoren zu erhöhen.
Um Fehler bei der Generierung von Genom-Konsensussequenzen zu reduzieren, führten wir zunächst eine De-novo-Assemblierung durch und erstellten anschließend multiple Kernalignments. Die Unicycler-Pipeline ist derzeit unter https://github.com/rrwick/Unicycler49 verfügbar und wird zur De-novo-Assemblierung von 54 sequenzierten Genomen verwendet (42 neu sequenzierte und 12 aus SRA gewonnene FASTQ-Dateien). Kurz gesagt, wurde vor der Assemblierung von Grund auf eine Lesequalitätsanalyse mit FastQC Version 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) und Trimmomatic Version 0.36 (mit den Optionen „Adapter und andere beleuchtungsspezifische Sequenzen aus den Reads entfernen“ und „Basen vom Ende des Reads abschneiden, wenn die Qualität unter dem Schwellenwert von 20 liegt“) durchgeführt (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic)50. Anschließend wurde SPAdes Optimizer49 für die Genomassemblierung und Pilon Version 1.1851 für die Nachbearbeitungsoptimierung verwendet. Um fehlerhafte Assemblierungen zu vermeiden, wurde ein konservativer Bridging-Modus gewählt, und die k-Mer-Größe wurde zwischen 20 % und 95 % der Read-Länge ermittelt und ausgewählt. Befolgen Sie die SPAdes-Richtlinien und berücksichtigen Sie die Lesegröße, löschen Sie Contigs, die kleiner als 300 bp sind, und legen Sie einen Grenzwert für die Lesetiefe von 52 fest. Bei der De-novo-Assemblierungsstrategie wurden genomische Regionen wie die hochrepetitiven Prolin-Glutamat (PE)- und Prolin-Prolin-Glutamat (PPE)-Paraloge nicht entfernt.
Die Qualität der De-novo-Assemblierung wird mithilfe der QUAST-Pipeline (http://quast.sourceforge.net/quast.html) bewertet, welche die Aktualisierung des Contigs und des M. bovis AF2122/97 Referenzgenoms (NCBI-Zugangsnummer LT708304.1) ermöglicht (siehe Ergänzungstabelle 1 für Qualitätsparameter).
Mithilfe der vSNP-Pipeline (https://github.com/USDA-VS/vSNP) wird die FASTQ-Datei des neu sequenzierten M. bovis aus der Illumina-Sequenzierung mit dem Referenzgenom von M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) verglichen. Gemäß den Empfehlungen des Genome Analysis Toolkit (GATK)53, 54, 55 werden Standardfilterparameter oder Variantenmassenwerte zur Rekalibrierung angewendet. Die Ergebnisse werden anhand des niedrigsten SAMtools-Massenwerts von 150 und AC = 2 gefiltert. Zusätzlich werden die Reads mit Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) auf Kontaminationen überprüft. Die in dieser Arbeit verwendete vSNP-Pipeline zur Zuordnung zu Sequenzierungsstrategien untersucht eine Reihe definierter SNPs und Zielsequenzen und schließt Mischinfektionen aus. Die Genomabdeckung beträgt über 99 % (Ergänzungstabelle 1).
Um Mapping-Fehler und falsche SNPs zu vermeiden, werden Varianten in folgenden Fällen herausgefiltert: (1) Sie werden durch weniger als 20 Reads gestützt, (2) ihre Frequenz liegt unter 0,9, (3) sie kommen in mindestens einem Stamm vor, weisen aber in mindestens einem anderen Stamm Lücken auf. Der Integrated Genomics Viewer (IGV) Version 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 wurde verwendet, um SNPs und Positionen mit Mapping- oder Alignment-Problemen visuell zu überprüfen. Da die Prolin-Glutamat- (PE) und Prolin-Prolin-Glutamat- (PPE) Gene hochgradig dupliziert sind und zu einer Multigenfamilie gehören, werden sie durch Illumina-Sequenzierung leicht falsch interpretiert und falsch zugeordnet. Daher werden sie bevorzugt berücksichtigt. Im mykobakteriellen Bioinformatik-Workflow wurden Mitglieder des Tuberkulosekomplexes ausgeschlossen, wenn die Strategie des Mappings auf Sequenzen zur Bestätigung von SNPs verwendet wurde. Daher haben wir PE/PPE-Gene und Indels aus der Analyse herausgefiltert.
Laut Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) werden alle SNPs in funktionelle Kategorien eingeteilt. Die SnpEff-Pipeline (https://pcingola.github.io/SnpEff/) dient zur Ableitung der SNP-Konsequenzen (synonyme oder nicht-synonyme Veränderungen). Es wurde eine neue Datenbank des Mycobacterium bovis AF2122/97-Genoms (LT708304.1) erstellt.
Die multiple Sequenzanalyse des Kerngenoms erfolgte mit Parsnp v1.2 (verfügbar unter https://github.com/marbl/parsnp57) unter Verwendung von 69 vollständigen Genomen/Entwürfen (mit der Option -c). M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) diente als Referenz. Es wurden vier multiple Sequenzanalysen durchgeführt: eine mit den Mitgliedern des Eu2-Klonierungskomplexes (n = 37), eine mit allen Mitgliedern des europäischen Klonierungskomplexes (n = 44), eine mit dem Übergangspunkt des europäischen und afrikanischen Klonierungskomplexes (n = 51) und eine mit allen in dieser Studie untersuchten Mycobacterium bovis (n = 70).
Die von Parsnp erzeugte Kernsequenz wird verwendet, um mit Hilfe von CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 und RAxML einen phylogenetischen Baum nach der Maximum-Likelihood-Methode (ML) abzuleiten und 1000 geführte Replikationen durchzuführen.
Zur Überprüfung auf das Vorhandensein von Rekombinationsereignissen werden drei verschiedene Algorithmen und Bioinformatik-Tools parallel verwendet: die Software SplitsTree4, die Gubbins-Pipeline (unbiased lineage through recombination in nucleotide sequences) und die Software RDP4 (recombination detection program, version beta 4.101).
Die in SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 implementierte Split-Dekompositionsmethode wird zur Berechnung des wurzellosen phylogenetischen Netzwerks verwendet. Die statistische Überprüfung erfolgt mittels Phi-Test, wobei die Signifikanzschwelle bei p = 0,05 liegt. Die Kern-Multi-Alignment-Analyse von Parsnp dient als Eingabe, und die Split-Dekomposition wird als Netzwerkstandard realisiert.
Die Gubbins-Pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) wird mit Standardparametern ausgeführt und dient als weitere Methode zur Bewertung des Einflusses von Rekombination auf Mycobacterium bovis. Der in der Pipeline implementierte Algorithmus rekonstruiert die relevante Klonlinie. Das vollständige Genom/die Entwurfs-Assemblierung unseres Datensatzes und das Referenzgenom (bovines bovides AF2122/97, LT708304.1) werden einander zugeordnet. Anschließend wird die Position des SNP auf jedem Ast des Baums analysiert, um das SNP-Cluster zu identifizieren, das das Rekombinationsereignis repräsentiert. Der Nullpunkt des Astes wird als Rekombinationsereignis angenommen, was bedeutet, dass die SNPs auf dem Ast gleichmäßig verteilt sein sollten. Als Eingabedateien werden das Core Multiple Alignment von Parsnp und der beste ML-Baum von RAxML verwendet.
Um das durch die Gubbins-Pipeline vorgeschlagene Reorganisationsereignis zu bestätigen, wurden schließlich die sechs in RDP467 implementierten Algorithmen (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 und SiScan66) mit den Standardeinstellungen auf das multiple Sequenzalignment von Parsnp angewendet. Wir stellten fest, dass mindestens drei der in RDP4 implementierten Algorithmen konsistent ein wichtiges Signal liefern müssen, um jedes Rekombinationsereignis zu verifizieren.
Da sowohl Gubbins als auch die RDP-Software Rekombinationssignale durch Überprüfung der Kernsequenzen in einem Fenster von bis zu 500 bp identifizieren und sicherstellen, dass die Einbeziehung von PE/PPE-Genen während der De-novo-Assemblierung die gefundenen Rekombinationssignale nicht beeinträchtigt, erfolgt eine weitere Analyse mittels Homolinearitätsprüfung in der Umgebung des Gens, das das Rekombinationsereignis identifiziert. Die synlineare Karte des gesamten Genoms wurde mithilfe des Multi-Genom-Alignments MAUVE (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) erstellt, um lokale Genomtranslokationen oder -inversionen auszuschließen. Zusätzlich wurde das gesamte Genom für eine Homolinearitätsanalyse der Aminosäuresequenz über den SyntTax-Webserver (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) verwendet.
Eine detailliertere Analyse des aus dem portugiesischen Multi-Host-Tuberkulose-System gewonnenen Genomdatensatzes dient der Überprüfung des Polymorphismus der in der Literatur erwähnten Gene. Diese Gene sind 37, 38 und das Gen 3R, das von den MTBC-Vorfahren durch HGT-Systemkomponenten (DNA-Reparatur, Replikation und Rekombination) erworben wurde (39). Verwenden Sie ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) und DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/), um die Gendiversität und Nukleotiddiversität (π) sowie den Parameter des Tajima-D-Neutralitätstests zu berechnen.
Ein Maximum-Likelihood-(ML)-Phylogeniebaum, basierend auf 69 Mycoplasma-bovis-Isolaten und Referenzgenomen, wurde erstellt (Abbildung 2A). Im Vergleich zu Bäumen, die auf Einzelgenen oder mehreren Loci basieren, ermöglicht diese Strategie die Generierung aussagekräftigerer Bäume, die jedoch nicht die Variabilität des gesamten Genoms erfassen und daher eine geringere Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Arten aufweisen68,69. Die topologische Struktur des ML-Baums stimmt üblicherweise mit der komplexen Klassifizierung der Klone überein. Das Genom von Eu2 ist in einem eigenen Ast gruppiert, ebenso wie das Genom von Af1 (Abbildung 2A). Dieses Ergebnis deckt sich mit den bekannten evolutionären Verwandtschaftsverhältnissen von Mycobacterium bovis: Es besteht ein großer Unterschied zwischen dem Eu1-Mitglied und der Gruppe, die alle anderen Klonkomplexe und Genome umfasst; der Klonkomplex 30 wird jedoch nicht näher spezifiziert. Die geringfügige Diskrepanz zwischen dem klonalen Komplex und der im phylogenetischen Baum beobachteten Beziehung lässt sich dadurch erklären, dass der klonale Komplex anhand spezifischer genomischer Regionen beschrieben wird, während der phylogenetische Baum auf multiplen Alignments von Kerngenomen basiert, die das gesamte Genom repräsentieren.
Der Maximum-Likelihood-Phylogeniebaum (GTR) basiert auf der Sequenzierung des Kerngenoms von Mycobacterium bovis vor (A) und nach (B) der Entfernung der Rekombinationsstelle. Die Astfarben repräsentieren den Klonkomplex von Mycobacterium bovis: Europa 1 ist violett, Europa 2 rot, Europa 3 blau, Afrika 1 orange und Afrika 2 grün. Der Baum ist gewurzelt und maßstabsgetreu gezeichnet; die Astlänge entspricht der Länge jedes Rekombinationspunktes.
Der Mycobacterium tuberculosis-Komplex wird als klonal entstanden beschrieben, und die meisten der über die Jahre gesammelten Erkenntnisse stützen die Annahme, dass fortlaufende HGT- und Rekombinationsereignisse nicht auf der nachweisbaren Ebene von MTBC15,17,18 stattfinden.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass es möglicherweise zu begrenzter Rekombination zwischen MTBC-Stämmen kommt20,21, während andere keine messbaren Rekombinationsereignisse nachweisen konnten70,71. Diese Frage wird erneut diskutiert, wobei der Fokus auf Mycobacterium bovis liegt. Dies unterscheidet sich von früheren Arbeiten, die entweder nur Mycobacterium tuberculosis70,71 oder den MTBC als Ganzes betrachteten, wobei M. bovis kaum vertreten war20, oder sich ausschließlich auf restriktive Rinderfraktionen konzentrierten. Der in dieser Arbeit verwendete Mykobakterien-Datensatz umfasst insgesamt 70 Stämme, die alle klonalen Komplexe repräsentieren und zur Untersuchung auf Rekombination verwendet wurden. Der Datensatz ist in vier kumulative Ebenen unterteilt: (1) Mitglieder des Eu2-Komplexes, (2) alle Mitglieder des europäischen Klonkomplexes (d. h. Europa), (3) der europäische und afrikanische Klonkomplex (Eu + Af) und (4) die gesamte Datensammlung (einschließlich Genome, die keinem der bereits beschriebenen Klonkomplexe zugeordnet sind).
Um diese Hypothese weiter zu untersuchen, wurde ein Split-Decomposition-Netzwerk erstellt, um das Fehlen von Rekombinationsereignissen zwischen Genomen zu bewerten. Diese Methode visualisiert die Verwandtschaftsverhältnisse zwischen Individuen und kann widersprüchliche phylogenetische Signale aufzeigen. Alle vier Datensätze der Analyse bestätigten das Vorhandensein von Schleifen im Netzwerk (d. h. Bereiche, die nicht zu einem einzigen Baum konvergieren), jedoch lieferte der Phi-Test keine statistische Signifikanz (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af, p = 0,2774; Gesamtdatensatz, p = 0,2451), was nur schwache Hinweise auf das Vorliegen von Reorganisationsereignissen liefert (Abbildung 3A–D).
In Europa 2 Genome (n = 37) (A), Europäische Genome (n = 44) (B), Europäische und Afrikanische Genome (n = 51) (C) und der gesamte Datensatz (n = 70) (D).
Nach dieser Analyse und unter Berücksichtigung der zyklischen Beobachtungen in allen Netzwerken wurde der in der Gubbins-Pipeline implementierte Rekonstruktionsalgorithmus angewendet, um die klonale Abstammungslinie zu rekonstruieren und die Abschätzung des Rekombinationseffekts auf das M. bovis-Genom zu ergänzen. Die kumulative Anzahl der Rekombinationsereignisse, die größtenteils in terminalen Ästen (d. h. in einem einzelnen Genom) auftraten, wurde ermittelt (Tabelle 2). Diese Indikatoren belegen die Konsistenz des gesamten Datensatzes und zeigen, dass die Häufigkeit von Rekombinationsereignissen 200- bis 300-mal höher ist als die von Mutationen. Der Parameter ρ/θ, der die relativen Raten von Rekombination und Punktmutationen auf dem Ast repräsentiert, liegt zwischen 0,0037 und 0,0056 (Tabelle 3). Kürzlich veröffentlichte Arbeiten zum Stamm 38 von M. bovis zeigten einen höheren rho/theta-Wert (rho/theta = 0,1) als der in diesem Datensatz ermittelte. Allerdings verwendeten Patané und Kollegen in ihrer Arbeit eine referenzbasierte Assemblierung, um Rekombinationsparameter abzuleiten. Ein verfahrenstechnisches Detail, das auf das Assemblierungsverfahren zurückzuführen ist, wurde mit der Häufigkeit mutmaßlicher Rekombinationsereignisse im terminalen Zweig in Verbindung gebracht.
Der r/m-Parameter repräsentiert das Diversitätsverhältnis von Rekombination und Mutation. Sein Mittelwert liegt zwischen 0,025 und 0,037, was darauf hindeutet, dass Rekombination im Vergleich zu Mutationen einen geringeren Einfluss auf die genetische Diversität von M. bovis hat (Tabelle 3). Zum Vergleich wurde eine ähnliche Methode verwendet, um den r/m-Parameter für den MTBC-Datensatz mit 23 Genomen zu schätzen. Dieser ergab einen Mittelwert von 0,48620, während der Mittelwert für den M. bovis-Datensatz von Patané et al. mit 38 Genomen 0,98 beträgt. In der ersten Studie wurden nur zwei der 23 M. bovis-Genome (M. bovis BCG und der Referenzstamm) untersucht, sodass der Wert aufgrund der Überexpression des M. tuberculosis-Genoms verzerrt sein könnte. In der zweiten Studie stammten die analysierten Mycobacterium bovis-Populationen hauptsächlich aus den USA und von Nutztieren. Im Gegensatz dazu sind in unserem Datensatz mehr geografische Regionen und Wirtsarten vertreten, und es werden auch Genome verwendet, die verschiedenen klonalen Komplexen mit unterschiedlichen populationsgenetischen Eigenschaften zugeordnet sind. Dadurch wird ein tieferes und umfassenderes Verständnis der Population erreicht. Der mit unserem Datensatz ermittelte mittlere r/m-Wert steht im Einklang mit der Annahme, dass der Grad der Rekombination zwischen den Linien derselben taxonomischen Art stark variiert. Diese Ergebnisse deuten daher darauf hin, dass der M. bovis-Klonkomplex Unterschiede in der Rekombination aufweisen könnte. Die Auswirkungen entsprechen denen von Didelot & Maiden72. Eine signifikante Erweiterung dieses Datensatzes durch die Einbeziehung einer größeren Anzahl von M. bovis-Genomen würde jedoch eine weitere Klärung dieses Punktes ermöglichen. Sowohl der r/m- als auch der ρ/θ-Parameter zeigen Variabilität zwischen den Zweigen, und dieses Ergebnis stimmt mit Berichten über andere Bakterienarten überein72,73.
Um die mittels der Gubbins-Pipeline identifizierten Reorganisationsereignisse zu bestätigen, wurden schließlich sechs verschiedene Algorithmen der RDP4-Software eingesetzt, um unterschiedliche Kern-Multi-Vergleiche unabhängig voneinander zu testen. Insgesamt wurde weniger als die Hälfte der von Gubbins identifizierten Ereignisse durch RDP4 bestätigt (Tabellen 4 und 5). Im gesamten Datensatz wurden drei Rekombinationsereignisse bestätigt: zwei betrafen interne Knoten und das dritte ein einzelnes Genom in einem terminalen Zweig, dem keine klonalen Komplexe zugeordnet werden konnten (Tabellen 4 und 5). Die Identifizierung von Ereignissen in terminalen Zweigen könnte darauf hindeuten, dass die Rekombination in aktuellen M. bovis-Stämmen noch andauert oder dass das Ergebnis falsch zugeordnet wurde. In dieser hypothetischen Rekombinationsregion weisen etwa 20 % der Positionen undefinierte Nukleotide (N) auf, was das Rekombinationssignal beeinflusst (Ergänzende Abbildung 2). Darüber hinaus betrifft diese Region das rrs-Gen, das für die erwartungsgemäß hochkonservierte 16S ribosomale RNA kodiert. Daher könnte dieses mutmaßliche Rekombinationssignal auf Sequenzierungsfehler oder eine fehlerhafte Ausrichtung zurückzuführen sein. Anschließend wurde ein vollständiges Genom-Alignment zwischen Mb0003 und Mycobacterium bovis AF2122/97 durchgeführt, wobei das Vorhandensein undefinierter Nukleotide und SNPs bestätigt wurde. Somit waren die möglichen Probleme im Zusammenhang mit der fehlerhaften Ausrichtung nicht auf die in dieser Arbeit implementierten biologischen Informationen zurückzuführen.
In den Rekombinationsregionen der internen Knoten wurden keine Lücken oder undefinierten Nukleotide gefunden (Abbildungen 4 und 5). Eines dieser Ereignisse umfasst ausschließlich das Eu2-Genom und betrifft das pks12-Gen, das für eine mögliche Polyketidsynthase kodiert; das andere ist im Eu1-Genom registriert und betrifft das narX-Gen, das für eine mögliche Nitratreduktase kodiert (Tabelle 4). Die Rekombinationsanalyse zeigt generell, dass nur wenige Rekombinationsfragmente statistisch signifikant sind, und die abgeleiteten Indikatoren deuten darauf hin, dass die Rekombination einen geringen Einfluss auf die M. bovis-Linie hat. Das Rekombinationssignal ist erwartungsgemäß schwach, doch ist es wichtig, das tatsächliche Evolutionssignal vom Hintergrundrauschen zu unterscheiden, was eine anspruchsvolle Aufgabe darstellt. Um das durch referenzbasierte Assemblierung und Mismatch-Probleme verursachte Rauschen zu reduzieren (70, 71), wurde das gesamte Genom außer dem vollständigen Genom von Grund auf neu assembliert. Die Assemblierungsqualität wurde mittels QUAST-Pipeline-Analyse überprüft und sichergestellt (Ergänzungstabelle 1). Zusätzlich wurden weitere Analysen durchgeführt, um die Robustheit und Genauigkeit der Gesamtstudie zu gewährleisten. Die Sequenzierungsqualität der Gene narX und pks12 wurde durch Read-Mapping gegen Mycobacterium bovis AF2122/97 evaluiert. Die empfohlene SNP-Position in der Rekombinationsregion wurde anhand der im Methodenteil genannten Kriterien bestätigt (mindestens 20 Reads und eine Änderungsfrequenz von 0,9). Der Polymorphismus des narX-Gens wurde in den beiden Genomen (Mb1792361 und Mb7240415; 2,3 %) sowie in den Genomen des pks12-Genoms (Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 und Mb12) vollständig bestätigt. Im Genom Mb2043 erfüllen jedoch sechs der acht Positionen nicht das Kriterium der Lesetiefe, da der SNP maximal durch 17 Reads gestützt wird, was unter dem festgelegten Grenzwert von 20 liegt. Daher kann die Rekombination von sechs Genomen (8,6 %) an dieser Genomposition bestätigt werden (Abbildungen 4 und 5).
Die detaillierte Visualisierung der Rekombinationsregion des Mycobacterium bovis-Datensatzes betrifft das narX-Gen, das für eine mögliche Nitratreduktase kodiert. In der Rekombinationsregion der internen Knoten wurden keine Lücken oder undefinierten Nukleotide gefunden. Dieses Ereignis ist im Eu1-Genom registriert. Die Sequenzierungsqualität des narX-Gens wurde durch die Darstellung der Reads von Mycobacterium bovis AF2122/97 evaluiert. Die empfohlene SNP-Position im Rekombinationsbereich wurde anhand der im Methodenteil genannten Kriterien (mindestens 20 Reads und eine Änderungsfrequenz von 0,9) bestätigt. Der Polymorphismus des narX-Gens wurde in den Genomen von Mb1792361 und Mb7240415 (2,3 %) vollständig bestätigt.
Die detaillierte Visualisierung der Rekombinationsregion des Mycoplasma bovis-Datensatzes, die das pks12-Gen betrifft, zeigt, dass in der Rekombinationsregion der internen Knoten keine Lücken oder undefinierte Nukleotide gefunden wurden. Das Ereignis, das das für eine mögliche Polyketidsynthase kodierende pks12-Gen betrifft, umfasst ausschließlich das Eu2-Genom. Die Sequenzierungsqualität von pks12 wurde anhand des Read-Mappings von Mycobacterium bovis AF2122/97 evaluiert. Die empfohlene SNP-Position im Rekombinationsbereich wurde anhand der im Methodenteil genannten Kriterien (mindestens 20 Reads und eine Änderungsfrequenz von 0,9) bestätigt. Die Polymorphismen der Genome Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 und Mb1960 wurden vollständig bestätigt.
PE- und PPE-Gene weisen repetitive Regionen auf, die bei der Illumina-Sequenzierung leicht falsch interpretiert und zugeordnet werden können. Daher werden sie im Bioinformatik-Workflow von M. tuberculosis-Stämmen üblicherweise nur dann entfernt, wenn die Mapping-to-Sequence-Strategie angewendet wird. Die in dieser Arbeit angewandte Inferenz von Rekombinationsereignissen basiert auf der De-novo-Assemblierung ohne Herausfiltern von PE/PPE. Wir sind überzeugt, dass die angewandten Strategien durch die Implementierung dreier komplementärer Methoden und Algorithmen mittels SplitsTree, der Gubbins-Pipeline und der RDP4-Software robust gegenüber der Verarbeitung und Filterung der durch Fehlersignale verursachten reorganisierten Regionen sind. Um jedoch den Einfluss der PE/PPE-Gene auf die Gubbins- und RDP4-Software bei der Identifizierung von SNP-Clustern und damit auf die Identifizierung der Rekombinationsregionen, die die narX- und pks12-Gene betreffen könnten, auszuschließen, wurde die Umgebung dieser Gene untersucht (Ergänzende Abb. 3–5). In M. bovis AF2122/97 ist das narX-Gen durch narK2 und Mb1764c getrennt, während pks12 von Mb2075c und Mb2073c umgeben ist (Ergänzende Abbildung 3-5). Die mithilfe der MAUVE-Synline-Karte des vollständigen Genoms erstellte Karte liefert Informationen zur Konservierung und Umlagerung von Gensequenzen. Sie zeigt vier kollineare Blöcke und keine Anzeichen für Genomtranslokationen oder -inversionen. Darüber hinaus bestätigte die Komplementationsanalyse mit der Aminosäuresequenz die Homologie in allen vollständigen Genomen. In den angrenzenden Regionen von narX oder pks12 wurden keine PE/PPE gefunden. Für narX weist ein Genom (Mb0030) einen niedrigeren Synonymie-Score auf, da das narX-Gen als zwei Fragmente (Fragmente 1891 und 1890) identifiziert wurde. Aufgrund von Ähnlichkeiten wiesen Mb0030 und Mb003 für pks12 niedrigere Synlinearitätswerte auf, während pks12 in zwei bzw. drei Fragmenten identifiziert wurde, die verschiedene Domänen des Proteins repräsentieren (Ergänzende Abbildung 3-5). Unter Berücksichtigung dieser Informationen und der Analyse mit den Programmen Gubbins und RDP4, die die multiple Sequenzanalyse der maximal 500 bp im betrachteten Fenster überprüften, konnten wir bestätigen, dass das PE/PPE-Gen das Rekombinationssignal, das narX und pks12 beeinflusst, nicht beeinträchtigt.
Obwohl die in diesem Datensatz festgestellten Rekombinationssignale als residual betrachtet werden können, ist es richtig, dass eine Rekombination bei M. bovis nicht ausgeschlossen werden kann, sodass sie weiterhin Gegenstand weiterer Analysen sein sollte, bei denen ganze Genome aus verschiedenen epidemiologischen Szenarien sequenziert werden, um die Bedeutung zu verdeutlichen.
Ein Vergleich der vor und nach der Rekombinationskorrektur erhaltenen ML-Phylogeniebäume (Abbildung 2A, B) führte nicht zu signifikanten Veränderungen in der abgeleiteten phylogenetischen Verwandtschaft, und die M. bovis-Stämme wurden in der gleichen Gruppe gruppiert.
Nach dem Mapping von 42 neu sequenzierten M. bovis-Reads auf das Referenzgenom von M. bovis AF2122/97 wurde ein SNP-Alignment mit 1816 polymorphen Positionen erhalten. Die meisten SNPs (87,1 %) befinden sich in der kodierenden Region, und die betroffenen Gene wurden gemäß den in Bovilist dargestellten Funktionskategorien charakterisiert (Abbildung 6A, B). Betrachtet man die Gesamtzahl der Gene in jeder Funktionskategorie, so weisen die Gene der Kategorie „Lipidstoffwechsel“ die meisten SNPs auf, gefolgt von „Zellwand- und Zellprozessen“ sowie „Intermediärstoffwechsel und Atmung“. Dies deutet darauf hin, dass diese Gene evolutionär in M. bovis eine Rolle spielen.
Hierarchische Analyse des M. bovis-Datensatzes aus Portugal (n = 42). Gesamtzahl der registrierten SNPs und betroffenen Gene für jede Funktionskategorie (A). Gesamtzahl der registrierten synonymen und nicht-synonymen Veränderungen pro Funktionskategorie (B).
Global betrachtet liegt das durchschnittliche dN/dS-Verhältnis unter 1,5, was darauf hindeutet, dass der globale evolutionäre Druck darauf abzielt, den ursprünglichen Zustand zu eliminieren, und ein positives (diversifiziertes oder gerichtetes) und/oder entspanntes Szenario der Selektionswahl darstellt. In den Kategorien „Virulenz, Entgiftung, Anpassung“, „Insertionssequenzen und Phagen“ sowie „Regulatorische Proteine“ sind mehr als zwei Drittel der SNPs nicht-synonym (Abbildung 6B).
In allen Kategorien finden sich Gene mit mehreren SNPs, was zu einer durchschnittlichen Mutationsrate (d. h. durchschnittliche Anzahl an SNPs pro Gen) von über 1 führt (Abbildung 6A). Pks12 (Mb2074c) mit 15 SNPs und fas (Mb2553c) mit 8 SNPs weisen höhere Mutationswerte auf. Beide Gene sind am Fettsäurestoffwechsel beteiligt. Das pks-Gen kodiert für die Polyketidsynthase (PKS), ein multifunktionelles Enzym, das an der Lipidbiosynthese der mykobakteriellen Zellwand beteiligt ist74,75. Dieses Gen kodiert für ein multifunktionelles Polypeptid, das an der Synthese von Mykoketiden beteiligt ist74,76. Das fas-Gen ist an der Synthese von Mykolsäure beteiligt. Beide Gene spielen eine wichtige Rolle bei der Biosynthese der Zellwand in Kontakt mit dem Wirt.
Um die Evolution von Mycobacterium bovis weiter zu untersuchen, wurden zwei spezifische Gensätze analysiert. Frühere Studien, die Sequenzanalysen und phylogenetische Methoden nutzten, identifizierten Gene, die MTBC-Vorfahren vor ihrer Diversifizierung durch horizontalen Gentransfer (HGT) erworben hatten37,38. Diese Gene sind in Tabelle S2 (Zusatzmaterial) aufgeführt. Die SNP-Verteilung von insgesamt 77 Genen, die möglicherweise mit HGT in Zusammenhang stehen, wurde analysiert. Dabei wurden 26 polymorphe Stellen identifiziert, die in den meisten Fällen (78 %) zu nicht-synonymen (NS) Veränderungen führten (Tabelle S2). Frühere Untersuchungen des MTBC-Genoms zeigten, dass die mutmaßliche HGT-Region im Vergleich zum restlichen Genom einen höheren Anteil an NS-SNPs aufweist. Geht man davon aus, dass diese Rekombinationsregionen von MTBC-Vorfahren erworben wurden und daher alte Polymorphismen überrepräsentieren, ist ein höherer Anteil an synonymen Veränderungen zu erwarten. Denn NS-Substitutionen werden aufgrund von Aminosäureänderungen, die die Proteinfunktion verändern können, vermutlich durch negative Selektion eliminiert. Unsere Ergebnisse deuten daher darauf hin, dass die funktionellen Konsequenzen auf den Ersatz von HGT-ähnlichen Genen zurückzuführen sein könnten, was deren Bedeutung für die wertvolle adaptive genetische Vielfalt unterstreicht.
Parallel zu dieser Analyse wurden die Gene, die für die Komponenten des 3R-Systems (DNA-Reparatur, Replikation und Rekombination) kodieren, anhand der von dos Vultos et al. (2008)39 veröffentlichten Liste eingehend untersucht. Der Austausch identischer DNA-Fragmente lässt sich nicht direkt beobachten, dürfte aber bei eng verwandten Bakterien, wie in diesem Datensatz, häufig vorkommen. Zudem könnte dieser Prozess der Schlüssel zu DNA-Reparaturmechanismen72 sein und somit eine Rolle bei der homologen Rekombination spielen. Insgesamt wurden 26 polymorphe Positionen in 54 Genen identifiziert (Ergänzungstabelle 3). In diesem Gensatz machten NS-Mutationen etwa 65 % der Auswirkungen aus, was mit früheren Berichten über Mycobacterium-tuberculosis-Stämme übereinstimmt.
Veröffentlichungszeit: 21. Oktober 2021