पुनर्संयोजन, उत्परिवर्तन आणि सकारात्मक निवडीचे जीनोम-व्यापी अंदाज मायकोबॅक्टेरियम बोविसच्या विविध चालकांना प्रेरणा देतात.

नेचरला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही ब्राउझरची नवीन आवृत्ती वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड बंद करा). त्याच वेळी, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि जावास्क्रिप्टशिवाय साइट्स प्रदर्शित करू.
जीनोम सिक्वेन्सिंगने संसर्गजन्य रोग संशोधनाच्या क्षेत्राला पुनरुज्जीवित केले आहे, रोग महामारीशास्त्र, रोगजनन, यजमान-रोगजनक परस्परसंवाद आणि रोगजनकांवर लादलेल्या उत्क्रांती प्रक्रियेचा खुलासा केला आहे. मायकोबॅक्टेरियम ट्युबरक्युलोसिस कॉम्प्लेक्स (MTBC) मायकोबॅक्टेरियम बोविसला त्याच्या प्राण्यांच्या अनुकूल सदस्यांपैकी एक मानते जे स्थलीय सस्तन प्राण्यांमध्ये क्षयरोग (TB) कारणीभूत ठरते आणि हे बॅक्टेरियाच्या उत्क्रांतीचे एक विशिष्ट मॉडेल आहे. इतर MTBC सदस्यांप्रमाणे, मायकोबॅक्टेरियम बोविस हे काटेकोरपणे क्लोन केलेले, हळूहळू विकसित होणारे रोगजनक मानले जाते आणि स्पष्टपणे पुनर्संयोजन किंवा क्षैतिज जनुक हस्तांतरणाचे कोणतेही चिन्ह नाही. या कामात, आम्ही गुरांच्या अनुवांशिक विविधतेबद्दल अंतर्दृष्टी मिळविण्यासाठी वेगवेगळ्या वंशावळी (युरोप आणि आफ्रिका) मधील 70 गुरे M. पासून बनलेल्या संपूर्ण जीनोम अनुक्रम (WGS) डेटासेटवर तुलनात्मक जीनोमिक्स लागू करतो. उत्क्रांती शक्ती. पुनर्रचनाच्या चिन्हे अंदाज लावण्यासाठी तीन वेगवेगळ्या पद्धती वापरल्या जातात. जागतिक स्तरावर, ठोस समर्थनासह दोन स्वतंत्र पद्धतींद्वारे थोड्या प्रमाणात पुनर्संयोजन घटना ओळखल्या गेल्या आहेत आणि पुष्टी केल्या गेल्या आहेत. तरीसुद्धा, उत्परिवर्तनांच्या तुलनेत, पुनर्संयोजनाचा M. bovis च्या विविधतेवर कमकुवत परिणाम होतो (एकूण r/m = 0.037). आमच्या डेटा सेटमध्ये मायकोबॅक्टेरियम बोविसच्या क्लोनल कॉम्प्लेक्समध्ये मिळालेला सरासरी r/m फरक समान वर्गीकरण प्रजातींना नियुक्त केलेल्या वंशांमध्ये पुनर्संयोजनाची डिग्री मोठ्या प्रमाणात बदलू शकते या सामान्य संकल्पनेशी सुसंगत आहे. या कामाच्या आधारे, मायकोबॅक्टेरियम बोविसमधील पुनर्संयोजन नाकारता येत नाही, म्हणून भविष्यातील तुलनात्मक जीनोमिक्स संशोधनात पुढील प्रयत्नांचा विषय असावा, ज्यामध्ये जगभरातील वेगवेगळ्या महामारीविषयक परिस्थितींमधील मोठ्या डेटा सेटचे WGS महत्त्वपूर्ण आहे. त्यानंतर मल्टी-होस्ट टीबीच्या प्रसारातून लहान मायकोबॅक्टेरियम बोविस डेटा सेट (n = 42) वर अतिरिक्त विश्लेषण केले गेले आणि 1,800 पेक्षा जास्त लोकी ओळखल्या गेल्या, ज्यापैकी किमान एका स्ट्रेनने एकच न्यूक्लियोटाइड पॉलिमॉर्फिझम (SNP) दर्शविला. बहुतेक (८७.१%) कोडिंग क्षेत्रात स्थित आहेत आणि समानार्थी बदलांच्या गैर-समानार्थी बदलांचे (dN/dS) जागतिक प्रमाण १.५ पेक्षा जास्त आहे, जे दर्शविते की सकारात्मक निवड ही एम. बोविसवर लावण्यात आलेली एक महत्त्वाची उत्क्रांती शक्ती आहे. "लिपिड मेटाबोलिझम", "पेशी भिंत आणि पेशी प्रक्रिया" आणि "मध्यवर्ती चयापचय आणि श्वसन" या कार्यात्मक श्रेणींमध्ये समृद्ध जनुकांमध्ये SNP चे प्रमाण जास्त आढळले, ज्यामुळे मायकोबॅक्टेरियम बोविसच्या महत्त्वाच्या जीवशास्त्र आणि उत्क्रांतीमध्ये त्यांची क्षमता दिसून येते. क्षैतिज जनुक हस्तांतरणासाठी प्रवण असलेल्या आणि 3R (DNA दुरुस्ती, प्रतिकृती आणि पुनर्संयोजन) प्रणालीमध्ये समाविष्ट असलेल्या MTBC पूर्वजांमधील जनुकांवर बारकाईने नजर टाकल्यास तैजिमाच्या D तटस्थ चाचणीचे जागतिक सरासरी नकारात्मक मूल्य दिसून येते, जे भूतकाळातील निवडक स्कॅनिंग दर्शवते. लोकसंख्या विस्तारानंतर अलिकडच्या काळात अडथळा हा अनिवार्य रोगजनक मायकोबॅक्टेरियम बोविससाठी यजमानाशी लढण्यासाठी मुख्य उत्क्रांतीवादी प्रेरक घटक आहे.
मायकोबॅक्टेरियम ट्युबरक्युलोसिस कॉम्प्लेक्स (MTBC) हा बॅक्टेरियाच्या रोगजनकांच्या सर्वात यशस्वी टॅक्सापैकी एक आहे आणि बॅक्टेरियाच्या उत्क्रांतीचा एक सामान्य प्रकार आहे. त्याचे सदस्य जीनोमिक पातळीवर आश्चर्यकारकपणे उच्च न्यूक्लियोटाइड ओळख दर्शवतात (> 99%)1,2. वेगवेगळ्या MTBC इकोटाइपमुळे सूक्ष्म-सस्तन प्राण्यांपासून मानवांपर्यंतच्या विविध यजमान प्रजातींमध्ये क्षयरोग (TB), जो एक संसर्गजन्य ग्रॅन्युलोमॅटस रोग आहे, होऊ शकतो3,4,5. सध्या, कॉम्प्लेक्समध्ये मानवांचा समावेश आहे [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] आणि प्राण्यांशी जुळवून घेतलेले रोगजनक (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanze" आणि "dassie") 5,6. एम. कॅनेटी ("नोडोबॅक्टर ग्लॅब्राटा" म्हणूनही ओळखले जाते) वर उल्लेख केलेल्या मायकोबॅक्टेरियासह सरासरी न्यूक्लियोटाइड ओळख 98% आहे आणि तुलनात्मक जीनोमिक्सच्या कामातून असे दिसून आले आहे की एम. कॅनेटी आणि उर्वरित एमटीबीसी अलीकडेच सामान्य पूर्वजांपासून वेगळे झाले आहेत.7 ही संकल्पना लक्षात घेता, काही लेखक एम. कॅनेटीला एमटीबीसी 8 चे सदस्य म्हणतात.
MTBC ला पद्धतशीरपणे एक कठोर क्लोनल कॉम्प्लेक्स म्हणून वर्णन केले आहे आणि त्याची लोकसंख्या रचना कमी विविधता, अडथळे, निवडक स्कॅनिंग आणि अनुवांशिक प्रवाह 9,10 द्वारे स्पष्टपणे नियंत्रित केली जाते. गहाळ बहुरूपता सारख्या जटिल कठोर क्लोनल उत्क्रांती पुनर्संयोजनाद्वारे पुनर्संचयित केल्या जाऊ शकत नाहीत असे गृहीत धरले जाते. या सिद्धांतावर आधारित, विभेदक प्रदेश (RD) आणि TbD1 (Mtb विशिष्ट हटवणे 1 प्रदेश) च्या जीनोमिक हटवण्याच्या सलग घटना MTBC उत्क्रांतीचे आण्विक मार्कर म्हणून प्रस्तावित केल्या आहेत2,5,11. तुलनात्मक जीनोमिक्स आणि संपूर्ण जीनोम सिक्वेन्सिंग (WGS) कार्य मानवी-अनुकूलित सदस्यांचे नऊ वंशांमध्ये विभाजन करण्यास समर्थन देते (मायकोबॅक्टेरियम ट्यूबरक्युलोसिस L1 ते L4, L7 आणि L8; आणि मायकोबॅक्टेरियम आफ्रिकनम L5, L6 आणि L9), वंश L2 ते L4 सामायिक हटवा TbD1 प्रदेश2,11,12,13. याव्यतिरिक्त, प्राण्यांशी जुळवून घेतलेल्या सदस्यांना एक सामान्य पूर्वज सामायिक करण्याचा प्रस्ताव आहे, जो RD7, RD8, RD9 आणि RD102, 5 आणि 14 मधील क्लेड-विशिष्ट डिलीशनद्वारे परिभाषित केला आहे.
क्षैतिज जीन ट्रान्सफर (HGT) आणि पुनर्संयोजन घटना दुर्मिळ मानल्या जातात आणि संपूर्ण MTBC सदस्याच्या वेगळ्या इतिहासाऐवजी MTBC च्या पूर्वजांमध्ये घडतात15,16,17. ह्यूजेस आणि सहयोगी (2002) आणि गुटॅकर आणि सहयोगी (2006) यांच्या दोन सुरुवातीच्या अहवालांनी असे सुचवले आहे की पुनर्संयोजन घटना M. ट्यूबरक्युलोसिस स्ट्रेनमध्ये विशिष्ट स्थान चिन्हांकित करणाऱ्या बहुरूपता आकार देण्यास मदत करू शकतात18,19. MTBC मध्ये पुनर्संयोजनाच्या स्पष्ट अभावाची कारणे आहेत: (1) HGT ची यांत्रिक प्रक्रिया आणि क्षमता कमी होणे; (2) HGT घटनांची दुर्मिळता; (3) MTBC निशमध्ये पुनर्संयोजन घटनांची शक्यता नाही14,17. अलीकडे, MTBC स्ट्रेन 20 आणि मायकोबॅक्टेरियम बोविस 21 वर लागू केलेल्या काही संपूर्ण-जीनोम सिक्वेन्सिंग (WGS) अभ्यासांनी पुनर्संयोजनाचे पुरावे दिले आहेत, हे दर्शविणारे पहिले की MTBC स्ट्रेन बहुतेकदा लहान DNA तुकड्यांची देवाणघेवाण करतात, परंतु मर्यादित न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम भिन्नतेमुळे, या घटना अजूनही लक्षात येत नाहीत.
मायकोबॅक्टेरियम बोविस हा पशुधनातून (प्रामुख्याने गुरेढोरे) सर्वात सामान्यपणे आढळणारा MTBC सदस्य आहे, जरी तो मुक्त-श्रेणी आणि कुंपण असलेल्या वन्य प्राण्यांपासून देखील वेगळा केला जाऊ शकतो4,22,23,24. स्पोलिगोटाइपिंग प्रोफाइलनुसार, विशिष्ट डिलिशन आणि विशिष्ट जीन्समध्ये सिंगल न्यूक्लियोटाइड पॉलिमॉर्फिझम (SNPs) 25, 26, 27, 28, 29, एम. बोविस पाच प्रमुख क्लोनल कॉम्प्लेक्समध्ये विकसित झाला [युरोपियन 1 (Eu1), युरोपियन 2 (Eu2), युरोपियन 3 (Eu3), आफ्रिकन 1 (Af1) आणि आफ्रिका 2 (Af2)]. हे क्लोनल कॉम्प्लेक्स मायकोबॅक्टेरियम बोविस लोकसंख्येची विविध रचना आणि भौगोलिक प्रदेशांशी त्याचा संबंध दर्शवितात. याव्यतिरिक्त, झिम्पेल आणि त्यांच्या सहयोगींनी (२०२०) केलेल्या अलीकडील WGS कार्यात मायकोबॅक्टेरियम बोविसच्या SNP वर आधारित एक फायलोजेनी डिझाइन केली आहे, ज्यामध्ये १,९०० पेक्षा जास्त जीनोम आहेत, जे दर्शविते की किमान चार भिन्न वंश आहेत (Lb1 ते Lb1 ते Lb4 असे नाव), ते पूर्वी परिभाषित केलेल्या क्लोनल कॉम्प्लेक्सशी पूर्णपणे सुसंगत नाहीत, जरी भौगोलिक विशिष्टतेची देखील पुष्टी केली जाऊ शकते30. या लेखकांनी फायलोजेनी आणि आण्विक डेटिंगचे विभेदक विश्लेषण केले, परंतु पुनर्संयोजन30 चा अभ्यास केला नाही.
स्पोलिगोटाइपिंग, MIRU-VNTR (मायकोबॅक्टेरियल इंटरस्पर्स्ड रिपीट युनिट-व्हेरिएबल टँडम रिपीट नंबर) आणि अलीकडील SNP टायपिंग सारख्या वेगवेगळ्या आण्विक तंत्रांचा वापर करून केलेल्या मागील कामामुळे M. बोविस स्ट्रेन 31,32,33, 34,35 मध्ये अनुवांशिक विविधतेची एक विशिष्ट पातळी दिसून आली. रोग महामारीविज्ञानाच्या अभ्यासात अनुवांशिक भिन्नतेचे भेदभाव हे एक महत्त्वाचे साधन बनले आहे, जे रोगजनन, विषाणू आणि रोग प्रसाराच्या सखोल आकलनासाठी उपयुक्त आहे. WGS पद्धतीचा उदय वेगवेगळ्या यजमान आणि महामारीविषयक परिस्थितींमध्ये अनुकूलन आणि टिकून राहण्याच्या प्रक्रियेत मायकोबॅक्टेरियम बोविस जीनोमद्वारे लादलेल्या उत्क्रांतीवादी प्रेरक घटकांना प्रकट करण्याची शक्यता प्रदान करतो.
या कामात, आम्ही मायकोप्लाझ्मा बोविसच्या उत्क्रांती प्रक्रियेबद्दल अंतर्दृष्टी मिळविण्यासाठी, विशेषतः फायलोजेनेटिक संबंध आणि पुनर्संयोजन घटनांचे निराकरण करण्यासाठी, विविध क्लोनल कॉम्प्लेक्समधील आयसोलेट्ससह विविध मायकोप्लाझ्मा बोविस डेटासेट (n=70) वर तुलनात्मक जीनोमिक विश्लेषण वापरतो. या विश्लेषणाला पूरक म्हणून, पोर्तुगाल 31,36 मधील एका सु-वैशिष्ट्यीकृत मल्टी-होस्ट क्षयरोग क्षेत्रातून मिळवलेल्या एम. बोविस आयसोलेट्स (n = 42) चा उप-डेटा संच ओळख नसलेल्या गोष्टींचा अंदाज लावण्यासाठी अधिक शोधण्यात आला. समानार्थी (dS) न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापनांच्या इंद्रियेच्या सापेक्ष गुणोत्तर (dN) आणि साहित्यात नमूद केलेल्या विशिष्ट जीनोमच्या उत्क्रांती योगदानामधील संतुलन, ते HGT द्वारे MTBC पूर्वजांनी मिळवलेले 37,38 आहेत आणि 3R (DNA दुरुस्ती, प्रतिकृती आणि पुनर्संयोजन) प्रणाली जनुक घटक 39 एन्कोड करतात. HGT द्वारे मिळवलेले जीन्स निवडा कारण ते प्राचीन बहुरूपता दर्शवू शकतात, म्हणून अशी अपेक्षा आहे की त्यांच्यात समानार्थी बदलांचे प्रमाण जास्त असू शकते. 3R सिस्टीममध्ये समाविष्ट असलेल्या जनुके निवडण्यात आली कारण एम. ट्यूबरक्युलोसिस स्ट्रेनवरील मागील कामात या जनुकांवर काम करणाऱ्या सामान्य नकारात्मक/शुद्धीकरण निवडी दर्शविल्या गेल्या होत्या आणि ते उत्क्रांती 39 मध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावू शकतात. या कामाचे आणखी एक ध्येय म्हणजे पुनर्रचना घटनांचे अस्तित्व अनुमान काढणे. या कारणास्तव, पोर्तुगालमधील आमच्या डेटासेटमध्ये फक्त युरोपियन क्लोन कॉम्प्लेक्स 2 चे जीनोम आणि क्लोन कॉम्प्लेक्स नियुक्त न केलेल्या स्ट्रेन आहेत हे लक्षात घेऊन, आम्ही सर्व क्लोन कॉम्प्लेक्सचा प्रतिनिधी मिळविण्यासाठी सार्वजनिकरित्या उपलब्ध जीनोम डेटा समाविष्ट करण्याचा निर्णय घेतला आणि परिणामांची मजबुती आणि रुंदी सुधारली.
पोर्तुगीज स्थानिक बहु-यजमान क्षयरोगाच्या दृश्यातून (तपशील खाली दिले आहे) ४२ नवीन अनुक्रमित मायकोप्लाझ्मा बोविस जीनोम, जे पूर्वी महामारीशास्त्रीय दृष्टिकोनातून वैशिष्ट्यीकृत होते, हे या कामाचे केंद्र आहेत. पोर्तुगालमधील डेटा सेटमध्ये फक्त युरोपियन २ क्लोन कॉम्प्लेक्स आणि नियुक्त कॉम्प्लेक्सशिवाय स्ट्रेनचे प्रतिनिधी आहेत हे लक्षात घेता, सार्वजनिकरित्या उपलब्ध संपूर्ण-जीनोम सिक्वेन्सिंग डेटा जोडण्यात आला आहे ज्यामध्ये एम. बोविस क्लोन कॉम्प्लेक्सचे सर्व प्रतिनिधी समाविष्ट आहेत. म्हणून, या कामात तीन संपूर्ण-जीनोम सिक्वेन्सिंग डेटा स्रोत वापरले गेले: पूर्ण/मसुदा जीनोम असेंब्ली, NCBI (नॅशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नॉलॉजी इन्फॉर्मेशन) मध्ये संग्रहित १० पर्यंत स्कॅफोल्ड (n = १५ आयसोलेट्स); SRA मध्ये संग्रहित (द सीक्वेन्स रीड आर्काइव्हची इल्युमिना फास्टक्यू फाइल) एम. बोविस क्लोनची जटिल विविधता दर्शवते (n = १२ आयसोलेट्स) ३०; आणि पोर्तुगालमधील ४२ नवीन अनुक्रमित जीनोम. मायकोबॅक्टेरियम बोविस बीसीजी (बॅसिल कॅल्मेट-ग्युरिन) NCBI शोधातून वगळण्यात आले. डेटासेटमध्ये समाविष्ट करण्यासाठी M. bovis AF2122/97 हा सामान्यतः संदर्भ जीनोम म्हणून वापरला जातो. आफ्रिकन 1 क्लोनिंग कॉम्प्लेक्सद्वारे दर्शविलेल्या संपूर्ण जीनोम अनुक्रमाची सार्वजनिक अनुपलब्धता आणि Af2 आणि Eu1 च्या प्रतिनिधी स्ट्रेनमधील जीनोमची संख्या कमी असल्याने, SRA द्वारे प्रदान केलेला मूळ अनुक्रम डेटा या प्रकरणांमध्ये वापरला गेला. झिम्पेल आणि त्यांच्या सहयोगींच्या कामाने (२०२०) उपरोक्त क्लोनिंग कॉम्प्लेक्समधून जीनोम ओळखण्यास मदत केली आणि डेटा सेटमध्ये समाविष्ट करण्यासाठी मायकोबॅक्टेरियम बोविस निवडण्यास मदत केली. Eu3 साठी, फक्त एका प्रकारच्या जीनोमचे वर्णन केले आहे (ब्रँगर एट अल., २०२०), म्हणून आम्ही समाविष्ट केलेला जीनोम Eu3 कॉम्प्लेक्सचा वेगळा प्रतिनिधी आहे.
जागतिक स्तरावर, या डेटा सेटमध्ये १९८५ ते २०१६ पर्यंत १२ देशांमध्ये वितरित केलेल्या ८ यजमान प्रजातींमधून वेगळे केलेले ७० गुरे एम. बोविस समाविष्ट आहेत. ३६ प्रजातींना Eu2 म्हणून नियुक्त केले आहे, ७ प्रजाती Eu1 आहेत, १ प्रजाती Eu3 आहेत, ३ प्रजाती Af1 आहेत, ४ प्रजाती Af2 आहेत आणि १९ कोणत्याही क्लोनल कॉम्प्लेक्सशी संबंधित नाहीत (तपशील खाली दिले आहे). या अभ्यासात वापरल्या जाणाऱ्या मायकोबॅक्टेरियम बोविसची तपशीलवार माहिती (अ‍ॅक्सेशन नंबरसह) तक्ता १ आणि पूरक तक्ता १ मध्ये दर्शविली आहे.
पोर्तुगालच्या प्राण्यांच्या क्षयरोगाच्या हॉटस्पॉट्समधून १२ वर्षांहून अधिक काळ वितरित केलेले मायकोबॅक्टेरियम बोविसचे ४२ नवीन अनुक्रमित संपूर्ण जीनोम हे या अभ्यासाचे केंद्र आहेत, कारण संभाव्य वन्यजीव-पशुधन रोग प्रणालींचे नियमितपणे निरीक्षण केले जात आहे ३१,३६ (पूरक आकृती १). त्यानंतरच्या प्रक्रियांनुसार, २००३ ते २०१५ पर्यंत हे स्ट्रेन गुरेढोरे (n = १४), लाल हरण (n = १६) आणि रानडुक्कर (n = १२) पासून वेगळे केले गेले: शिफारस केलेल्या प्रोटोकॉल मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार प्राणी गोळा करा आणि हाताळा ऊतींचे नमुने OIE टेरेस्ट्रियल अ‍ॅनिमल हँडबुकमध्ये आहेत आणि स्टोनब्रिंक आणि लोवेनस्टाईन-जेन्सेन पायरुवेट सॉलिड मीडियम आणि लिक्विड मीडियमवर लसीकरण केले जातात. कल्चर्स ३७ डिग्री सेल्सिअस तापमानावर इनक्युबेट केले जातात आणि आठवड्यातून एकदा किमान १२ आठवड्यांसाठी वाढ तपासली जाते. वसाहती थेट -८० डिग्री सेल्सिअस तापमानावर ग्लिसरॉल द्रावणात साठवल्या जातात. मायकोबॅक्टेरियम निवडक माध्यमात (मिडलब्रुक ७एच९, बीडी डायग्नोस्टिक्स) WGS प्रोग्रामचा डीएनए मिळविण्यासाठी मूळ संग्रहित नमुने एकाच इन विट्रो पॅसेज इन विट्रोमधून पास केले गेले. यासाठी, फ्रोझन कल्चर स्टॉक सोल्यूशनला मिडलब्रुक ७एच९ वर ३७°C रीट्रेनवर ५% सोडियम पायरुवेट आणि १०% ADS (५० ग्रॅम अल्ब्युमिन, २० ग्रॅम ग्लुकोज, १ लिटर पाण्यात ८.५ ग्रॅम सोडियम क्लोराईड) ने समृद्ध केले गेले. ४ आठवड्यांच्या वाढीनंतर, माध्यमाचे नूतनीकरण केले गेले आणि वाढ दिसून येईपर्यंत कल्चरचे नियमितपणे निरीक्षण केले गेले. पेशी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे कापल्या गेल्या, गोळी ५०० µL फॉस्फेट बफर सलाईन (PBS) मध्ये पुन्हा सस्पेंड केली गेली, ९९°C वर ३० मिनिटे गरम केली गेली, सेंट्रीफ्यूज केली गेली आणि सुपरनॅटंट -२०°C वर WGS पर्यंत साठवले गेले. सर्व प्रक्रिया लेव्हल ३ बायोसेफ्टी सुविधांमध्ये केल्या जातात.
WGS पेअर-एंड जीनोम लायब्ररी प्रत्येक DNA नमुन्याच्या अद्वितीय निर्देशांकाचा वापर करून तयार केली जाते आणि अनुक्रमणासाठी Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 नमुने) आणि HiSeq (2 × 150 pb) (दोन आयसोलेट्स) तंत्रज्ञान (युरोफिन्स जीनोमिक्स, जर्मनी) वापरते. उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, जीनोमिक DNA अनुक्रमित करण्यासाठी डबल-एंडेड मॉड्यूल संलग्नकासह Illumina Genome Analyzer वापरा आणि लायब्ररी तयार करण्यासाठी Illumina कडून Nextera XT DNA लायब्ररी प्रेप किट वापरा.
SRA (n = 12) मधून मिळवलेला डेटा विचारात घेऊन, क्लोन कॉम्प्लेक्सची ओळख संबंधित प्रकाशन 30, 41, 43 च्या मेटाडेटा म्हणून वापरली जाऊ शकते. संपूर्ण जीनोमचा विचार करताना, मायकोबॅक्टेरियम बोविस AF2122/97 आणि मायकोबॅक्टेरियम बोविस 3601 वगळता, जे अनुक्रमे Eu1 आणि Eu3 क्लोनल कॉम्प्लेक्स 25, 29 चे मान्यताप्राप्त सदस्य आहेत, ते मायकोबॅक्टेरियम ट्यूबरक्युलोसिस H37Rv (NCBI अॅक्सेसियन नंबर NC_000962.3) च्या संपूर्ण जीनोमसारखेच आहे. जीनोम अलाइनमेंट MAFFT (अमीनो अॅसिड किंवा न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमाचा मल्टीपल अलाइनमेंट प्रोग्राम, आवृत्ती 7.458) आणि पॅरामीटर -addfragments48 वापरून केले जाते. नंतर, वेगवेगळ्या क्लोनल कॉम्प्लेक्सची अनुपस्थिती आणि/किंवा SNP वैशिष्ट्यांची उपस्थिती शोधा.
नवीन अनुक्रमित मायकोबॅक्टेरियम बोविस (n = 42) आणि एकत्रित जीनोम ड्राफ्टचे मूळ वाचन (n = 3) vSNP पाइपलाइनद्वारे संदर्भ जीनोम मायकोबॅक्टेरियम ट्यूबरक्युलोसिस H37Rv सह कॉम्प्लेक्स संरेखित करतात आणि वेगवेगळ्या क्लोनच्या डिलीशन आणि/किंवा SNP वैशिष्ट्यांची उपस्थिती शोधण्यात आली.
संबंधित क्लोनल कॉम्प्लेक्सला जीनोमिक डेटा नियुक्त करण्यासाठी वैशिष्ट्यांचा अभाव आणि/किंवा SNP आणि स्पोलिगोटाइपिंग प्रोफाइलची उपस्थिती/अनुपस्थिती यावरून माहिती गोळा करा. चार ड्राफ्ट असेंब्लीसाठी, स्पोलिगोटाइपिंग प्रोफाइलचा अंदाज लावता येत नाही, म्हणून ते "कोणतीही जटिलता नाही" गटात समाविष्ट केले आहेत.
या कामानंतर येणारा बायोइन्फॉरमॅटिक्स वर्कफ्लो डी नोव्हो असेंब्ली आणि मॅपिंगपासून संदर्भ धोरणापर्यंत सुरू होतो, ज्याचे उद्दिष्ट पुनर्संयोजन घटना आणि विशिष्ट जीनोम बहुरूपता एक्सप्लोर करणे आहे. आकृती १ मध्ये अनुसरण केलेल्या चरणांचा फ्लोचार्ट प्रदान केला आहे. पुनर्संयोजन विश्लेषणासाठी, सर्व जीनोमचा वापर अनुमान आणि संबंधित निर्देशकांची मजबूती वाढवण्यासाठी केला जातो.
जीनोम कॉन्सेन्सस सीक्वेन्सच्या निर्मितीमध्ये त्रुटी कमी करण्यासाठी, आम्ही प्रथम डी नोव्हो असेंब्ली मिळवली आणि नंतर कोर मल्टिपल अलाइनमेंट मिळवले. युनिसायक्लर पाइपलाइन सध्या https://github.com/rrwick/Unicycler49 वर उपलब्ध आहे आणि 54 सीक्वेन्स्ड जीनोमची डी नोव्हो असेंब्ली करण्यासाठी वापरली जाते (42 नवीन सीक्वेन्स्ड आणि SRA मधून पुनर्प्राप्त केलेल्या 12 फास्टक्यू फाइल्स). थोडक्यात, सुरवातीपासून असेंबल करण्यापूर्वी, FastQC आवृत्ती 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) आणि Trimmomatic आवृत्ती 0.36 ("रीड्समधून अ‍ॅडॉप्टर्स आणि इतर प्रकाश-विशिष्ट अनुक्रम कापून टाकणे" आणि "रीडच्या शेवटीून बेस कट करा, जर 20 च्या थ्रेशोल्ड गुणवत्तेपेक्षा कमी असेल" हा पर्याय लागू केला असेल) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50 मध्ये वाचन गुणवत्ता विश्लेषण केले गेले. त्यानंतर, जीनोम असेंबलीसाठी SPAdes ऑप्टिमायझर49 वापरण्यात आला आणि पोस्ट-एसेम्बली ऑप्टिमायझेशनसाठी Pilon आवृत्ती 1.1851 वापरण्यात आली. चुकीची असेंबली टाळण्यासाठी एक रूढीवादी ब्रिजिंग मोड निवडण्यात आला आणि k-mer आकार वाचन लांबीच्या 20% आणि 95% दरम्यान शोधला गेला आणि निवडला गेला. SPAdes मार्गदर्शक तत्त्वांचे पालन करा आणि वाचन आकार विचारात घ्या, 300 bp पेक्षा लहान कॉन्टिग्स हटवा आणि 52 चा 20 वाचन खोली कव्हरेज कटऑफ स्थापित करा. डी नोवो असेंब्ली स्ट्रॅटेजीमध्ये, अत्यंत पुनरावृत्ती होणारे प्रोलाइन-ग्लूटामेट (PE) आणि प्रोलाइन-प्रोलाइन ग्लूटामेट (PPE) पॅरालॉग्स सारखे जीनोमिक क्षेत्र काढले गेले नाहीत.
डी नोव्हो असेंब्लीची गुणवत्ता QUAST पाइपलाइन (http://quast.sourceforge.net/quast.html) द्वारे मूल्यांकन केली जाते, जी कॉन्टिग आणि एम. बोविस AF2122/97 संदर्भ जीनोम (NCBI प्रवेश क्रमांक LT708304.1) मॅपिंगचे नूतनीकरण सुलभ करते (गुणवत्ता पॅरामीटर्ससाठी पूरक तक्ता 1 पहा).
vSNP पाइपलाइन (https://github.com/USDA-VS/vSNP) च्या मदतीने, इल्युमिना सिक्वेन्सिंगमधील नवीन अनुक्रमित M. bovis च्या FASTQ फाइलची तुलना M. bovis AF2122/97 संदर्भ जीनोम (LT708304.1)) शी केली जाते. जीनोम अॅनालिसिस टूलकिट (GATK) 53, 54, 55 च्या सर्वोत्तम सराव शिफारसींनुसार रिकॅलिब्रेशनसाठी मानक फिल्टर पॅरामीटर्स किंवा व्हेरिएंट मास स्कोअर लागू करा. निकाल सर्वात कमी SAMtools मास स्कोअर 150 आणि AC = 2 वापरून फिल्टर केले जातात. दूषितता नाकारण्यासाठी रीडिंग तपासण्यासाठी Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) देखील वापरा. ​​आमच्या कामात मॅप टू सीक्वेन्स स्ट्रॅटेजीजसाठी वापरलेली vSNP पाइपलाइन परिभाषित SNPs आणि लक्ष्यांच्या मालिकेचे परीक्षण करते आणि मिश्र संसर्ग परिस्थिती देखील वगळते. रीड जीनोम कव्हरेज 99% पेक्षा चांगले आहे (पूरक तक्ता 1).
मॅपिंग त्रुटी आणि चुकीचे SNP टाळण्यासाठी, खालील प्रकरणांमध्ये एक प्रकार फिल्टर करा: (१) ते २० पेक्षा कमी वाचनांनी समर्थित आहे, (२) ते ०.९ पेक्षा कमी वारंवारतेसह आढळते, (३) ते किमान एका स्ट्रेनमध्ये आहे, परंतु किमान दुसऱ्या स्ट्रेनमध्ये अंतर आहे. एकात्मिक जीनोमिक्स व्ह्यूअर (IGV) आवृत्ती २.४.१९ (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)५६ चा वापर मॅपिंग किंवा अलाइनमेंट समस्यांसह SNP आणि पोझिशन्स दृश्यमानपणे सत्यापित करण्यासाठी केला गेला. प्रोलाइन-ग्लूटामेट (PE) आणि प्रोलाइन-प्रोलाइन ग्लूटामेट (PPE) जीन्स अत्यंत डुप्लिकेट असल्याने आणि बहु-जीन कुटुंबाचा भाग असल्याने, इल्युमिना सिक्वेन्सिंग आणि मिसमॅपिंगद्वारे त्यांचा सहज गैरसमज होतो, म्हणून त्यांना प्राधान्य दिले जाते. SNPs ची पुष्टी करण्यासाठी मॅपिंग टू सीक्वेन्सची रणनीती वापरताना मायकोबॅक्टेरियल बायोइन्फॉरमॅटिक्स वर्कफ्लोने क्षयरोग कॉम्प्लेक्सचे सदस्य काढून टाकले. म्हणून, आम्ही विश्लेषणातून PE/PPE जीन्स आणि इंडेल फिल्टर केले.
बोविलिस्ट (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) नुसार, सर्व SNPs कार्यात्मक श्रेणींमध्ये विभागले गेले आहेत. SnpEff पाइपलाइन (https://pcingola.github.io/SnpEff/) चा वापर SNP परिणाम (समानार्थी किंवा समानार्थी बदल) अनुमान काढण्यासाठी केला जातो. मायकोबॅक्टेरियम बोविस AF2122/97 जीनोम (LT708304.1) चा एक नवीन डेटाबेस तयार केला.
कोर जीनोम मल्टिपल अलाइनमेंट हे Parsnp v1.2 वापरून केले गेले, जे सध्या https://github.com/marbl/parsnp57 वर उपलब्ध आहे, ज्यामध्ये 69 पूर्ण जीनोम/ड्राफ्ट असेंब्ली (पर्याय -c सह) वापरल्या गेल्या आणि M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) संदर्भ म्हणून वापरला गेला. चार कोर मल्टिपल अलाइनमेंट केले गेले: फक्त Eu2 क्लोनिंग कॉम्प्लेक्सचे सदस्य (n = 37), ज्यामध्ये युरोपियन क्लोनिंग कॉम्प्लेक्सचे सर्व सदस्य (n = 44), युरोपियन आणि आफ्रिकन क्लोनिंग कॉम्प्लेक्सच्या जंक्शन पॉइंटसह (n = 51), आणि या अभ्यासात सर्व मायकोबॅक्टेरियम बोविस समाविष्ट आहेत (n = 70).
Parsnp द्वारे व्युत्पन्न केलेले कोर अलाइनमेंट RAxML वापरून CIPRES सायन्स गेटवे v3.3 (http://www.phylo.org/)58 वापरून जास्तीत जास्त शक्यता (ML) फायलोजेनेटिक ट्री अनुमानित करण्यासाठी आणि 1000 मार्गदर्शित प्रतिकृती करण्यासाठी वापरले जाते.
समांतरपणे पुनर्संयोजन घटनांची उपस्थिती तपासण्यासाठी तीन वेगवेगळे अल्गोरिदम आणि बायोइन्फॉरमॅटिक्स टूल्स वापरले जातात: स्प्लिट्सट्री४ सॉफ्टवेअर, गुबिन्स (न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमांमध्ये पुनर्संयोजनाद्वारे निष्पक्ष वंश) पाइपलाइन आणि आरडीपी४ (पुनसंयोजन शोध कार्यक्रम, आवृत्ती बीटा ४.१०१) सॉफ्टवेअर.
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 मध्ये अंमलात आणलेली स्प्लिट डिकॉम्पोझिशन पद्धत रूटलेस फायलोजेनेटिक नेटवर्कची गणना करण्यासाठी वापरली जाते, सांख्यिकीय पडताळणीसाठी Phi चाचणी वापरून, आणि महत्त्व थ्रेशोल्ड p = 0.05 आहे. Parsnp चे कोर मल्टी-अलाइनमेंट विश्लेषण इनपुट म्हणून वापरले जाते आणि नेटवर्क मानक म्हणून स्प्लिट डिकॉम्पोझिशन साकार केले जाते.
गुबिन्स पाइपलाइन v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) ही मायकोबॅक्टेरियम बोविसवरील पुनर्संयोजनाच्या प्रभावाचे मूल्यांकन करण्याचा आणखी एक मार्ग म्हणून डिफॉल्ट पॅरामीटर्ससह चालते. पाइपलाइनमध्ये लागू केलेला अल्गोरिथम संबंधित क्लोन वंशाची पुनर्रचना करतो. आमच्या डेटा सेटची संपूर्ण जीनोम/ड्राफ्ट असेंब्ली आणि संदर्भ जीनोम (बोवाइन बोविड AF2122/97, LT708304.1) परस्पर आहेत; आणि पुनर्संयोजन घटनेचे प्रतिनिधित्व करणारा SNP क्लस्टर शोधण्यासाठी झाडाच्या प्रत्येक शाखेवरील SNP ची स्थिती स्कॅन करा. शाखेचा शून्य गृहीत धरा की कोणतीही पुनर्संयोजन घटना नाही, याचा अर्थ असा की शाखेवर होणारे SNP समान रीतीने वितरित केले पाहिजेत. Parsnp मधील कोर मल्टिपल अलाइनमेंट आणि RAxML मधील सर्वोत्तम स्कोअर केलेले ML ट्री इनपुट फाइल्स म्हणून वापरले जातात.
शेवटी, गुबिन्स पाइपलाइनने सुचवलेल्या पुनर्रचना कार्यक्रमाची पुष्टी करण्यासाठी, RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 आणि SiScan66) मध्ये लागू केलेले सहा अल्गोरिदम डीफॉल्ट सेटिंग्ज अंतर्गत Parsnp च्या कोर मल्टिपल अलाइनमेंटवर लागू केले जातात. आम्ही असे निर्धारित केले आहे की RDP4 मध्ये लागू केलेल्या किमान तीन अल्गोरिदमने प्रत्येक पुनर्संयोजन घटनेची पडताळणी करण्यासाठी सातत्याने एक महत्त्वाचा सिग्नल प्रदर्शित केला पाहिजे.
गब्बिन्स आणि आरडीपी सॉफ्टवेअर दोघेही ५०० बीपी पर्यंतच्या विंडोमध्ये कोर मल्टिपल अलाइनमेंट्स तपासून पुनर्संयोजन सिग्नल शोधतात आणि डी नोव्हो असेंब्ली दरम्यान पीई/पीपीई जीन्सचा समावेश आढळलेल्या पुनर्संयोजन सिग्नलमध्ये व्यत्यय आणणार नाही याची पुष्टी करतात हे लक्षात घेता, पुढील विश्लेषण होमोलाइनियरिटीद्वारे केले जाते. पुनर्संयोजन घटनेची ओळख पटवणाऱ्या जीनच्या आसपासची तपासणी करा. स्थानिक जीनोम ट्रान्सलोकेशन किंवा इनव्हर्जन वगळण्यासाठी MAUVE-मल्टी-जीनोम अलाइनमेंट (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) वापरून संपूर्ण जीनोमचा वापर करून सिंटलाइनियर नकाशा तयार करण्यात आला. याव्यतिरिक्त, सिंटटॅक्स वेब सर्व्हर (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) द्वारे अमीनो अॅसिड अनुक्रमावर समलाइनियरिटी विश्लेषण करण्यासाठी संपूर्ण जीनोमचा वापर करण्यात आला.
पोर्तुगीज मल्टी-होस्ट ट्यूबरक्युलोसिस सिस्टममधून मिळवलेल्या जीनोम डेटा सेटचे अधिक सखोल विश्लेषण म्हणजे साहित्यात नमूद केलेल्या जनुकांच्या बहुरूपता तपासणे. हे जनुके 37,38 आहेत आणि HGT (DNA दुरुस्ती, प्रतिकृती आणि पुनर्संयोजन) प्रणाली घटक 39 द्वारे MTBC पूर्वजांनी मिळवलेले जीन एन्कोडिंग 3R आहेत. जनुक विविधता आणि न्यूक्लियोटाइड विविधता (π) आणि ताजिमाच्या D न्यूट्रल चाचणी पॅरामीटर इनपुटची गणना करण्यासाठी ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) वापरा आणि DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) वापरा.
६९ मायकोप्लाझ्मा बोविस आयसोलेट्स आणि रेफरन्स जीनोमवर आधारित जास्तीत जास्त शक्यता (एमएल) फायलोजेनेटिक वृक्ष प्राप्त झाला (आकृती २अ). एकल-जीन-आधारित झाडे किंवा बहु-लोकस-आधारित झाडांच्या तुलनेत, ही रणनीती अधिक शक्तिशाली झाडे निर्माण करण्यास अनुमती देते जी संपूर्ण जीनोमची परिवर्तनशीलता कॅप्चर करत नाहीत आणि म्हणून प्रजाती ६८,६९ मध्ये भेद करण्याची कमी क्षमता प्रदर्शित करतात. एमएल झाडाची टोपोलॉजिकल रचना सहसा क्लोनच्या जटिल वर्गीकरणाशी सुसंगत असते. Eu2 चा जीनोम एका शाखेत क्लस्टर केलेला असतो आणि Af1 चा जीनोम देखील एकत्र क्लस्टर केलेला असतो (आकृती २अ). परिणाम मायकोबॅक्टेरियम बोविसच्या ज्ञात उत्क्रांती संबंधांशी देखील सुसंगत आहे, म्हणजेच, Eu1 सदस्य आणि इतर सर्व क्लोनल कॉम्प्लेक्स आणि जीनोम असलेल्या गटामध्ये मोठा फरक आहे, परंतु क्लोनल कॉम्प्लेक्स ३० निर्दिष्ट केलेला नाही. क्लोनल कॉम्प्लेक्स आणि फायलोजेनेटिक ट्रीवरील संबंधांमधील लहान विसंगती या वस्तुस्थितीद्वारे स्पष्ट केली जाऊ शकते की क्लोनल कॉम्प्लेक्सचे वर्णन विशिष्ट जीनोमिक प्रदेशांवर आधारित आहे, तर फायलोजेनेटिक ट्री संपूर्ण जीनोमचे प्रतिनिधित्व करणाऱ्या कोर जीनोमच्या अनेक संरेखनांवर आधारित आहे.
जास्तीत जास्त संभाव्यता फायलोजेनेटिक ट्री (GTR) ही मायकोबॅक्टेरियम बोविस जीनोमच्या (A) आधी आणि (B) पुनर्संयोजन साइट काढून टाकल्यानंतरच्या कोर जीनोम संरेखनावर आधारित तयार केली जाते. फांद्याचे रंग मायकोबॅक्टेरियम बोविस क्लोन कॉम्प्लेक्सचे प्रतिनिधित्व करतात: युरोप 1 जांभळा आहे, युरोप 2 लाल आहे, युरोप 3 निळा आहे, आफ्रिका 1 नारंगी आहे आणि आफ्रिका 2 हिरवा आहे. झाडाला मुळं बसवलेले आहे आणि ते स्केलवर काढलेले आहे आणि प्रत्येक साइटसाठी बदल म्हणून फांद्याची लांबी मोजली जाते.
मायकोबॅक्टेरियम ट्युबरक्युलोसिस कॉम्प्लेक्सचे वर्णन क्लोनलली इव्होल्यूशन म्हणून केले जाते आणि गेल्या काही वर्षांत जमा झालेले बहुतेक पुरावे या कल्पनेला समर्थन देतात की चालू एचजीटी आणि पुनर्संयोजन घटना एमटीबीसी१५,१७,१८ च्या शोधण्यायोग्य पातळीवर होणार नाहीत.
मागील कामातून असे दिसून आले आहे की MTBC स्ट्रेनमध्ये मर्यादित पुनर्संयोजन असू शकते20,21, तर इतर मोजता येण्याजोग्या पुनर्संयोजन घटना ओळखण्यात अयशस्वी झाले आहेत70,71. मायकोबॅक्टेरियम बोविसवर लक्ष केंद्रित करून या समस्येवर पुन्हा चर्चा करा, जे मागील कामापेक्षा वेगळे आहे ज्यामध्ये फक्त मायकोबॅक्टेरियम ट्यूबरक्युलोसिस 70,71 मानले गेले होते; किंवा संपूर्ण MTBC चा विचार करा, जवळजवळ कोणतेही M. बोविस 20 चे प्रतिनिधित्व करत नाहीत; किंवा फक्त प्रतिबंधात्मक गुरांच्या अंशांचा विचार करा. मायकोबॅक्टेरिया डेटासेट, या कामात, सर्व क्लोनल कॉम्प्लेक्सचे प्रतिनिधित्व करणारे एकूण 70 स्ट्रेन आहेत, जे पुनर्संयोजनासाठी स्क्रीन करण्यासाठी वापरले जातात. डेटा सेट चार संचयी स्तरांनुसार मोजला जातो: (1) Eu2 सदस्य, (2) सर्व युरोपियन क्लोन कॉम्प्लेक्स सदस्य (म्हणजे युरोप), (3) युरोपियन आणि आफ्रिकन क्लोन कॉम्प्लेक्स (Eu + Af) आणि (4) संपूर्ण डेटा संग्रह (आधीच वर्णन केलेल्या कोणत्याही क्लोनिंग कॉम्प्लेक्समध्ये समाविष्ट नसलेल्या जीनोमसह).
या गृहीतकाचा अधिक अभ्यास करण्यासाठी, जीनोममधील पुनर्संयोजन घटनांच्या अनुपस्थितीचे मूल्यांकन करण्यासाठी एक विभाजित-विघटन नेटवर्क केले गेले, कारण ही पद्धत व्यक्तींमधील पूर्वजांच्या संबंधांची कल्पना करू शकते आणि परस्परविरोधी फायलोजेनेटिक सिग्नल प्रदर्शित करू शकते. विश्लेषणातील सर्व चार डेटा सेटने नेटवर्कमध्ये लूपच्या अस्तित्वाची पुष्टी केली (म्हणजेच, असे क्षेत्र जे एकाच झाडात एकत्र येत नाहीत), परंतु फाय चाचणीला कोणताही सांख्यिकीय आधार नाही (Eu2, p = 0.0956; युरोप, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; संपूर्ण डेटा सेट p = 0.2451), जे पुनर्रचना घटनांच्या अस्तित्वासाठी खराब पुरावे प्रदान करते (आकृती 3A-D).
युरोपमध्ये २ जीनोम (n = ३७) (A), युरोपियन जीनोम (n = ४४) (B), युरोपियन आणि आफ्रिकन जीनोम (n = ५१) (C) आणि संपूर्ण डेटा सेट (n = ७०) (D).
या विश्लेषणानंतर, आणि सर्व नेटवर्कमधील चक्रीय निरीक्षणे लक्षात घेऊन, गुबिन्स पाइपलाइनमध्ये लागू केलेला पुनर्रचना अल्गोरिथम क्लोनल वंशाची पुनर्रचना करण्यासाठी आणि एम. बोविस जीनोमवरील पुनर्संयोजनाच्या परिणामाचा अंदाज पूरक करण्यासाठी लागू केला गेला. पुनर्संयोजन घटनांची संचयी संख्या काढा, ज्यापैकी बहुतेक टर्मिनल शाखांमध्ये (म्हणजेच, एकाच जीनोममध्ये) घडल्या (तक्ता 2). हे निर्देशक संपूर्ण डेटा सेटची सुसंगतता दर्शवतात आणि सूचित करतात की पुनर्संयोजन घटनांची वारंवारता उत्परिवर्तनांपेक्षा 200 ते 300 पट आहे. एकदा शाखेवरील पुनर्संयोजन आणि बिंदू उत्परिवर्तनांच्या सापेक्ष दरांचे प्रतिनिधित्व करणारा rho/theta पॅरामीटर 0.0037 आणि 0.0056 दरम्यान असल्याचे दिसून आले (तक्ता 3). अलिकडेच, ३८ एम. बोविस स्ट्रेनच्या प्रकाशित कामात या डेटासेटमध्ये मिळालेल्यापेक्षा जास्त rho/theta मूल्य (rho/theta = ०.१) दिसून आले, परंतु पटाने आणि त्यांच्या सहकाऱ्यांच्या कामात पुनर्संयोजन पॅरामीटर्सचे अनुमान काढण्यासाठी संदर्भ-आधारित असेंब्लीचा वापर करण्यात आला. असेंब्ली प्रक्रियेमुळे प्रक्रियात्मक तपशील टर्मिनल शाखेत पुटेटिव्ह पुनर्संयोजन घटनांच्या विपुलतेशी संबंधित आहे.
पुढे, r/m पॅरामीटर पुनर्संयोजन आणि उत्परिवर्तन परिचयाचे विविधता गुणोत्तर दर्शवितो आणि त्याचे सरासरी मूल्य 0.025 आणि 0.037 दरम्यान आहे, जे दर्शविते की उत्परिवर्तनांच्या तुलनेत, पुनर्संयोजनाचा M. bovis च्या अनुवांशिक विविधतेवर कमी एकूण प्रभाव पडतो (तक्ता 3)). विस्तृत तुलनेसाठी, 23 जीनोम असलेल्या MTBC डेटासेटसाठी r/m पॅरामीटरचा अंदाज घेण्यासाठी समान पद्धत वापरली गेली, ज्याचे सरासरी मूल्य 0.48620 दर्शविले गेले, तर Patané आणि सहकाऱ्यांच्या 38 M. bovis डेटासेटसाठी, सरासरी मूल्य 0.98 असल्याचे सिद्ध झाले. पहिल्या अभ्यासात, M. bovis (M. bovis BCG आणि संदर्भ स्ट्रेन) च्या कामात समाविष्ट असलेल्या 23 जीनोमपैकी फक्त दोनच जीनोम होते, त्यामुळे M. tuberculosis जीनोमच्या अतिप्रदर्शनामुळे प्राप्त मूल्य पक्षपाती असू शकते. दुसऱ्या अहवालात, विश्लेषण केलेली मायकोबॅक्टेरियम बोविस लोकसंख्या प्रामुख्याने युनायटेड स्टेट्स आणि पशुधन यजमानांकडून पुनर्प्राप्त केली गेली. याउलट, आमच्या डेटा सेटमध्ये, अधिक भौगोलिक स्थाने आणि यजमान प्रजाती दर्शविल्या जातात आणि वेगवेगळ्या लोकसंख्या अनुवांशिक वैशिष्ट्यांसह वेगवेगळ्या क्लोनल कॉम्प्लेक्समध्ये गटबद्ध केलेले जीनोम देखील वापरले जातात, अशा प्रकारे सखोल आणि व्यापक लोकसंख्या ज्ञान प्राप्त होते. आमच्या डेटा सेटसह प्राप्त होणारा फरक r/m सरासरी मूल्य या संकल्पनेशी सुसंगत आहे की पुनर्संयोजनाची डिग्री समान वर्गीकरण प्रजातींना नियुक्त केलेल्या वंशांमध्ये मोठ्या प्रमाणात बदलते, म्हणून हे परिणाम सूचित करतात की M. bovis क्लोन कॉम्प्लेक्स पुनर्संयोजन फरक प्रदर्शित करू शकते. प्रभाव देखील Didelot आणि Maiden72 ने सुचविल्याप्रमाणे आहे. तरीही, मोठ्या संख्येने M. bovis जीनोम समाविष्ट करून या डेटा सेटचा लक्षणीय विस्तार केल्याने या मुद्द्याचे अधिक स्पष्टीकरण मिळू शकेल. r/m आणि rho/theta दोन्ही पॅरामीटर्स शाखांमधील परिवर्तनशीलता दर्शवितात आणि हा निकाल इतर जीवाणू प्रजातींवरील अहवालांशी सुसंगत आहे72,73.
शेवटी, गुबिन्स पाइपलाइनद्वारे ओळखल्या गेलेल्या पुनर्रचना घटनांची पुष्टी करण्यासाठी, RDP4 सॉफ्टवेअरमध्ये सहा वेगवेगळ्या अल्गोरिदमचा वापर करून स्वतंत्रपणे वेगवेगळ्या कोर मल्टी-तुलना तपासल्या गेल्या. जागतिक स्तरावर, गुबिन्सने ओळखल्या गेलेल्या अर्ध्याहून कमी घटनांची पुष्टी RDP4 द्वारे झाली (तक्ते 4 आणि 5). संपूर्ण डेटा सेटचा विचार करता, तीन पुनर्संयोजन घटनांची पुष्टी झाली, दोन अंतर्गत नोड्सशी संबंधित आणि दुसरी टर्मिनल शाखेतील एकच जीनोमशी संबंधित, ज्यासाठी क्लोनल कॉम्प्लेक्स नियुक्त केले जाऊ शकत नव्हते (तक्ते 4 आणि 5). टर्मिनल शाखांमधील घटनांची ओळख पटवल्याने असे दिसून येते की समकालीन एम. बोविस स्ट्रेनमध्ये पुनर्संयोजन अजूनही प्रगतीपथावर आहे किंवा परिणाम चुकीचा आहे70. या काल्पनिक पुनर्संयोजन क्षेत्रात, अंदाजे 20% पोझिशन्समध्ये अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड्स (N) आहेत, ज्यामुळे पुनर्संयोजन सिग्नलवर परिणाम होतो (पूरक आकृती 2). याव्यतिरिक्त, हा प्रदेश rrs जनुकावर परिणाम करतो, 16S राइबोसोमल RNA एन्कोड करतो जो अत्यंत संरक्षित असण्याची अपेक्षा आहे, म्हणून हे पुटेटिव्ह रीकॉम्बिनेशन सिग्नल अनुक्रम त्रुटी किंवा चुकीच्या संरेखनाचा परिणाम असू शकतो. नंतर Mb0003 आणि मायकोबॅक्टेरियम बोविस AF2122/97 मधील संपूर्ण जीनोम संरेखन केले गेले आणि अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड्स आणि SNPs च्या अस्तित्वाची पुष्टी झाली, म्हणून चुकीच्या संरेखनाशी संबंधित संभाव्य समस्या या कामात अंमलात आणलेल्या जैविक माहितीमुळे नव्हत्या. कार्यक्रम शिकल्यानंतर दिसून आले.
अंतर्गत नोड्सच्या पुनर्संयोजन क्षेत्रांमध्ये कोणतेही अंतर किंवा अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड आढळले नाहीत (आकृती 4 आणि 5). या घटनांबद्दल, एकामध्ये फक्त Eu2 जीनोम आहे आणि तो pks12 जीनवर परिणाम करतो, जो संभाव्य पॉलीकेटाइड सिंथेस एन्कोड करतो; तर दुसरा Eu1 जीनोममध्ये नोंदणीकृत आहे आणि संभाव्य नायट्रेट रिडक्टेस एन्कोड करणाऱ्या narX जीनवर परिणाम करतो (तक्ता 4). सर्वसाधारणपणे, पुनर्संयोजन विश्लेषण दर्शविते की सांख्यिकीय समर्थनासह मर्यादित संख्येने पुनर्संयोजन तुकड्या आहेत आणि अनुमानित निर्देशक सूचित करतात की पुनर्संयोजनाचा M. bovis वंशावर कमी प्रभाव पडतो. पुनर्संयोजन सिग्नल कमी असण्याची अपेक्षा आहे, परंतु खऱ्या उत्क्रांती सिग्नलला पार्श्वभूमी आवाजापासून वेगळे करणे महत्वाचे आहे, जे एक आव्हानात्मक काम आहे. संदर्भ-आधारित असेंब्ली आणि जुळत नसलेल्या समस्या 70, 71 द्वारे सादर केलेला आवाज सिग्नल कमी करण्यासाठी, संपूर्ण जीनोम वगळता उर्वरित सर्व सुरवातीपासून एकत्र केले गेले आणि QUAST पाइपलाइन विश्लेषणाद्वारे असेंब्लीची गुणवत्ता तपासली गेली आणि खात्री केली गेली (पूरक तक्ता 1). याव्यतिरिक्त, एकूण सर्वेक्षणाची मजबूती आणि अचूकता प्रदान करण्यासाठी पूरक विश्लेषणांची मालिका आयोजित करण्यात आली. म्हणून, मायकोबॅक्टेरियम बोविस AF2122/97 विरुद्ध वाचन मॅपिंगद्वारे narX आणि pks12 जनुकांच्या अनुक्रम गुणवत्तेचे मूल्यांकन केले गेले. पद्धत विभागात नमूद केलेल्या निकषांचा वापर करून पुनर्संयोजन प्रदेशात शिफारसित SNP स्थितीची पुष्टी केली गेली (किमान 20 वाचन आणि 0.9 बदल वारंवारता). दोन जीनोममध्ये (Mb1792361 आणि Mb7240415; 2.3%) आणि pks12 जीनोमच्या जीनोममध्ये: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 आणि Mb12 जनुकांमध्ये narX जनुकाचे बहुरूपता पूर्णपणे पुष्टी झाली. तथापि, Mb2043 जीनोमसाठी, आठपैकी सहा पोझिशन्स रीड डेप्थ निकष पूर्ण करत नाहीत कारण SNP ला जास्तीत जास्त 17 रीड्सचा आधार आहे, जो 20 च्या स्थापित कटऑफ मूल्यापेक्षा कमी आहे. म्हणून, या जीनोम साइटवर सहा जीनोम (8.6%) च्या पुनर्संयोजनाची पुष्टी केली जाऊ शकते (आकृती 4 आणि 5).
मायकोबॅक्टेरियम बोविस डेटासेटच्या पुनर्संयोजन क्षेत्र संरेखनाचे तपशीलवार दृश्यमानीकरण संभाव्य नायट्रेट रिडक्टेस एन्कोड करणाऱ्या narX जनुकावर परिणाम करते. अंतर्गत नोड्सच्या पुनर्संयोजन क्षेत्रात कोणतेही अंतर किंवा अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड आढळले नाहीत. ही विशिष्ट घटना Eu1 जीनोममध्ये नोंदवली गेली आहे. मायकोबॅक्टेरियम बोविस AF2122/97 च्या वाचनांचे प्लॉटिंग करून narX जनुकाच्या अनुक्रम गुणवत्तेचे मूल्यांकन केले गेले. पद्धत विभागात नमूद केलेल्या निकषांचा वापर करून पुनर्संयोजन क्षेत्रात शिफारस केलेले SNP स्थान निश्चित करा (किमान 20 वाचन आणि 0.9 बदल वारंवारता). Mb1792361 आणि Mb7240415 (2.3%) च्या जीनोममध्ये narX जनुकाचे बहुरूपता पूर्णपणे पुष्टी झाली.
pks12 जनुकावर परिणाम करणाऱ्या मायकोप्लाझ्मा बोविस डेटासेटच्या पुनर्संयोजन क्षेत्र संरेखनाचे तपशीलवार दृश्यमानीकरण. अंतर्गत नोड्सच्या पुनर्संयोजन क्षेत्रात कोणतेही अंतर किंवा अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड आढळले नाहीत. संभाव्य पॉलीकेटाइड सिंथेस एन्कोडिंग करणाऱ्या pks12 जनुकावर परिणाम करणाऱ्या घटनेबाबत, त्यात फक्त Eu2 जीनोम आहे. pks12 च्या अनुक्रम गुणवत्तेचे मूल्यांकन मायकोबॅक्टेरियम बोविस AF2122/97 च्या वाचन मॅपिंगद्वारे केले गेले. पद्धत विभागात नमूद केलेले निकष लागू करून पुनर्संयोजन क्षेत्रातील शिफारस केलेले SNP स्थान पुष्टी करा (किमान 20 वाचन आणि 0.9 बदल वारंवारता). Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 आणि Mb1960 जीनोमचे बहुरूपता पूर्णपणे पुष्टी केली गेली आहे.
PE आणि PPE जनुकांमध्ये पुनरावृत्ती होणारे क्षेत्र असतात जे इल्युमिना सिक्वेन्सिंग आणि मिसमॅपिंगद्वारे सहजपणे चुकीचे वाचले जातात, म्हणून ते सहसा मॅपिंग-टू-सिक्वेन्स स्ट्रॅटेजी वापरतानाच M. tuberculosis सदस्यांच्या बायोइन्फॉरमॅटिक्स वर्कफ्लोमधून हटवले जातात. या कामात लागू केलेल्या पुनर्संयोजन घटनांचा निष्कर्ष PE/PPE फिल्टर न करता डी नोव्हो असेंब्लीवर आधारित आहे. आमचा असा विश्वास आहे की SplitsTree, Gubbins पाइपलाइन आणि RDP4 सॉफ्टवेअरद्वारे तीन वेगवेगळ्या पूरक पद्धती आणि अल्गोरिदम लागू करून, लागू केलेल्या धोरणे त्रुटी सिग्नलमुळे होणाऱ्या पुनर्गठित प्रदेशांवर प्रक्रिया आणि फिल्टर करण्यासाठी मजबूत आहेत. तथापि, SNP क्लस्टर्स ओळखण्यासाठी Gubbins आणि RDP4 सॉफ्टवेअरवरील PE/PPE जनुकाचा हस्तक्षेप वगळण्यासाठी आणि म्हणूनच narX आणि pks12 जनुकांवर परिणाम करण्यासाठी प्रस्तावित पुनर्संयोजन क्षेत्रांची ओळख पटविण्यासाठी, या जनुकांच्या परिसराची तपासणी करण्यात आली (पूरक आकृती 3-5). M. bovis AF2122/97 मध्ये, narX जनुक narK2 आणि Mb1764c ने वेगळे केले आहे, तर pks12 हे Mb2075c आणि Mb2073c ने वेढलेले आहे (पूरक आकृती 3-5). संपूर्ण जीनोमच्या MAUVE सिंकलाइन नकाशाचा वापर करून तयार केलेला नकाशा जीन अनुक्रम संवर्धन आणि पुनर्रचना बद्दल माहिती प्रदान करतो, ज्यामध्ये चार समरेखीय ब्लॉक्स दर्शविले आहेत आणि जीनोम ट्रान्सलोकेशन किंवा इनव्हर्जनची कोणतीही चिन्हे नाहीत. याव्यतिरिक्त, अमीनो आम्ल अनुक्रमासह पूरक विश्लेषणाने सर्व पूर्ण जीनोममध्ये समरूपता सिद्ध केली आणि narX किंवा pks12 च्या लगतच्या प्रदेशांमध्ये कोणताही PE/PPE आढळला नाही. narX साठी, एका जीनोम (Mb0030) चा समानार्थी गुण कमी आहे कारण narX जनुक दोन तुकड्यांमध्ये ओळखला गेला होता (खंड 1891 आणि 1890). pks12 साठी, समानतेमुळे, Mb0030 आणि Mb003 ने कमी समरेखीयता गुण प्रदर्शित केले, तर pks12 अनुक्रमे दोन आणि तीन तुकड्यांमध्ये ओळखले गेले, जे प्रथिनांच्या वेगवेगळ्या डोमेनचे प्रतिनिधित्व करतात (पूरक आकृती 3-5). ही माहिती लक्षात घेऊन, आणि गुबिन्स आणि RDP4 सॉफ्टवेअर दोघेही विश्लेषण करतात, विंडोमध्ये जास्तीत जास्त 500 bp चे कोर मल्टिपल अलाइनमेंट तपासतात, आम्ही पुष्टी केली की PE/PPE जनुक narX आणि pks12 ला प्रभावित करणाऱ्या पुनर्संयोजन सिग्नलमध्ये व्यत्यय आणणार नाही.
जरी या डेटा सेटमध्ये आढळलेले पुनर्संयोजन सिग्नल अवशिष्ट मानले जाऊ शकतात, परंतु हे खरे आहे की एम. बोविसमध्ये पुनर्संयोजन होण्याची शक्यता नाकारता येत नाही, म्हणून तो पुढील विश्लेषणाचा विषय राहिला पाहिजे, ज्यामध्ये वेगवेगळ्या महामारीविषयक परिस्थितींमधील संपूर्ण जीनोम महत्त्वाचे म्हणून क्रमबद्ध केले जातात.
पुनर्संयोजन सुधारणापूर्वी आणि नंतर मिळवलेल्या ML फायलोजेनेटिक झाडांची तुलना केल्याने (आकृती 2A, B) अनुमानित फायलोजेनेटिक संबंधात लक्षणीय बदल झाले नाहीत आणि M. bovis strains एकाच गटात एकत्रित केले गेले.
एम. बोविस AF2122/97 च्या संदर्भ जीनोमसह ४२ नवीन अनुक्रमित एम. बोविस वाचनांचे मॅपिंग केल्यानंतर, १८१६ बहुरूपी स्थाने असलेले एक एसएनपी संरेखन प्राप्त झाले. बहुतेक एसएनपी (८७.१%) कोडिंग प्रदेशात स्थित आहेत आणि प्रभावित जीन्स बोविलिस्टमध्ये दर्शविलेल्या कार्यात्मक श्रेणींनुसार वैशिष्ट्यीकृत आहेत (आकृती ६अ, बी). प्रत्येक कार्यात्मक श्रेणीतील जीन्सची एकूण संख्या लक्षात घेता, "लिपिड मेटाबोलिझम" श्रेणीतील जीन्सने अधिक एसएनपी दर्शविले, त्यानंतर "पेशी भिंत आणि पेशी प्रक्रिया" आणि "मध्यवर्ती चयापचय आणि श्वसन", जे ते एम. बोविस उत्क्रांतीमध्ये असल्याचे दर्शविते.
पोर्तुगालमधील एम. बोविस डेटासेटचे पदानुक्रमिक विश्लेषण (n = 42). प्रत्येक कार्यात्मक श्रेणी (A) साठी नोंदणीकृत SNPs आणि प्रभावित जनुकांची एकूण संख्या. कार्य श्रेणी (B) द्वारे नोंदणीकृत समानार्थी आणि समानार्थी नसलेल्या बदलांची एकूण संख्या.
जागतिक स्तरावर, सरासरी dN/dS गुणोत्तर 1.5 पेक्षा चांगले आहे, जे दर्शवते की जागतिक उत्क्रांतीचा दबाव पूर्वजांच्या अवस्थेपासून मुक्त होण्यासाठी आहे आणि सकारात्मक (विविध किंवा निर्देशित) आणि/किंवा आरामदायी शुद्धीकरण निवड परिस्थिती दर्शवते. "विषाणू, विषारीपणा, अनुकूलन", "प्रवेश अनुक्रम आणि फेजेस" आणि "नियामक प्रथिने" या श्रेणींमध्ये, दोन तृतीयांश पेक्षा जास्त SNP समानार्थी नाहीत (आकृती 6B).
सर्व श्रेणींमध्ये, अनेक SNPs असलेले जनुके आहेत, ज्यामुळे सरासरी उत्परिवर्तन दर (म्हणजेच, प्रति जनुक सरासरी SNP) 1 पेक्षा जास्त आहे (आकृती 6A). 15 SNPs असलेले Pks12 (Mb2074c) आणि 8 SNPs असलेले fas (Mb2553c) मध्ये उत्परिवर्तन मूल्ये जास्त आहेत. ही दोन्ही जनुके फॅटी अॅसिड चयापचयात सहभागी आहेत. pks जनुके पॉलीकेटाइड सिंथेस (PKS) एन्कोड करते, जे मायकोबॅक्टेरियल सेल वॉल लिपिड बायोसिंथेसिसमध्ये सामील असलेले एक बहु-कार्यात्मक एंजाइम आहे74,75. हे जनुके मायकोकेटाइड्स74,76 च्या संश्लेषणात सहभागी असलेल्या एक बहु-कार्यात्मक पॉलीपेप्टाइड एन्कोड करते. फास जनुके मायकोलिक अॅसिडच्या संश्लेषणात सहभागी आहे. हे दोन्ही जनुके यजमानाच्या संपर्कात असलेल्या पेशी भिंतीच्या जैवसंश्लेषणात महत्त्वाची भूमिका बजावतात.
मायकोबॅक्टेरियम बोविसच्या उत्क्रांतीचा अधिक अभ्यास करण्यासाठी, विशिष्ट जनुकांच्या दोन संचांचे विश्लेषण करण्यात आले. अनुक्रम रचना आणि फायलोजेनेटिक पद्धती वापरून पूर्वी प्रकाशित झालेल्या कामांमध्ये विविधीकरणापूर्वी HGT द्वारे MTBC पूर्वजांनी मिळवलेले जीन्स ओळखले गेले होते37,38. हे जीन्स पूरक तक्ता 2 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. HGT शी संबंधित असू शकणाऱ्या एकूण 77 जनुकांच्या SNP वितरणाचे विश्लेषण करण्यात आले आणि 26 बहुरूपी स्थळे ओळखली गेली, ज्यामुळे बहुतेक प्रकरणांमध्ये (78%) समानार्थी नसलेले (NS) बदल झाले (पूरक तक्ता 2). MTBC जीनोमवरील मागील कामातून असे दिसून आले की पुटेटिव्ह HGT प्रदेश उर्वरित जीनोमच्या तुलनेत उच्च NS SNP गुणोत्तर प्रदर्शित करतो. जर एखाद्याला असे वाटत असेल की हे पुनर्संयोजन क्षेत्र MTBC पूर्वजांनी मिळवले होते आणि म्हणूनच, ते प्राचीन बहुरूपता जास्त दर्शवतात, तर समानार्थी बदलांचे प्रमाण जास्त असण्याची अपेक्षा आहे, कारण NS प्रतिस्थापन नकारात्मक निवडीद्वारे काढून टाकले जाण्याची अपेक्षा आहे कारण अमीनो आम्ल बदलांमुळे प्रथिनांचे कार्य बदलू शकते. म्हणूनच, आमचे निकाल असे दर्शवतात की कार्यात्मक परिणाम HGT-सारख्या जनुकांच्या बदलीमुळे उद्भवू शकतात, जे मौल्यवान अनुकूली अनुवांशिक विविधतेसाठी त्यांचे महत्त्व प्रतिबिंबित करते.
या विश्लेषणाच्या समांतर, 3R (DNA दुरुस्ती, प्रतिकृती आणि पुनर्संयोजन) प्रणालीच्या घटकांना एन्कोड करणाऱ्या जनुकांची तपासणी डॉस व्हल्टोस आणि सहयोगी (2008)39 यांनी पूर्वी प्रकाशित केलेल्या यादीनुसार केली गेली. समान DNA तुकड्यांचे देवाणघेवाण थेट पाहता येत नाही, जरी जवळून संबंधित जीवाणूंचा सहभाग असताना ही वारंवार प्रक्रिया असू शकते, जसे की या डेटा सेटच्या बाबतीत; याव्यतिरिक्त, ही प्रक्रिया DNA दुरुस्ती पद्धतींची गुरुकिल्ली असू शकते72, म्हणून समरूप पुनर्संयोजनात भूमिका बजावा. 54 जनुकांद्वारे वितरित केलेल्या एकूण 26 बहुरूपी स्थिती ओळखल्या गेल्या (पूरक तक्ता 3). जनुकांच्या या संचामध्ये, NS बदल परिणामांपैकी सुमारे 65% होते, जे मायकोबॅक्टेरियम ट्यूबरक्युलोसिस स्ट्रेनवरील मागील अहवालांशी सुसंगत आहे.