Байгальд зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-ийг хязгаарлагдмал дэмждэг. Хамгийн сайн ашиглахын тулд хөтчийн шинэ хувилбарыг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг унтраа). Үүний зэрэгцээ, тасралтгүй дэмжлэг үзүүлэхийн тулд бид загвар, JavaScript-гүй сайтуудыг харуулах болно.
Геномын дараалал нь халдварт өвчний судалгааны талбарыг сэргээж, өвчний тархвар судлал, эмгэг жам, эзэн ба эмгэг төрүүлэгчийн харилцан үйлчлэл, эмгэг төрүүлэгчид ногдуулсан хувьслын үйл явцыг илрүүлсэн. Mycobacterium tuberculosis цогцолбор (MTBC) нь Mycobacterium bovis-ийг хуурай газрын хөхтөн амьтдад сүрьеэ (сүрьеэ) үүсгэдэг амьтны дасан зохицох чадвартай гишүүдийн нэг гэж үздэг бөгөөд бактерийн хувьслын ердийн загвар юм. MTBC-ийн бусад гишүүдийн нэгэн адил Mycobacterium bovis нь хатуу хувилсан, аажмаар хөгжиж буй эмгэг төрөгч гэж үздэг бөгөөд рекомбинаци эсвэл хэвтээ ген шилжүүлгийн шинж тэмдэг илрээгүй нь ойлгомжтой. Энэ ажилд бид үхрийн генетикийн олон янз байдлын талаарх ойлголтыг олж авахын тулд өөр өөр удмын (Европ, Африк) 70 үхэр M.-аас бүрдсэн геномын бүхэл бүтэн дараалал (WGS) мэдээллийн багцад харьцуулсан геномикийг ашигласан. Дахин зохион байгуулалтын шинж тэмдгийг тооцоолохын тулд гурван өөр аргыг ашигладаг. Дэлхий даяар цөөн тооны рекомбинацийн үйл явдлыг тодорхойлж, бат бөх дэмжлэгтэйгээр бие даасан хоёр аргаар баталгаажуулсан. Гэсэн хэдий ч мутацитай харьцуулахад рекомбинаци нь M. bovis-ийн олон янз байдалд сул нөлөө үзүүлдэг (нийт r/m = 0.037). Манай өгөгдлийн багц дахь Mycobacterium bovis-ийн клональ цогцолбороос олж авсан дундаж r/m-ийн зөрүү нь ижил ангилал зүйн зүйлүүдэд хуваарилагдсан удамшлын хооронд рекомбинацын зэрэг ихээхэн ялгаатай байж болно гэсэн ерөнхий ойлголттой нийцэж байна. Энэхүү ажилд үндэслэн Mycobacterium bovis-ийн рекомбинацийг үгүйсгэх аргагүй тул энэ нь дэлхийн өнцөг булан бүрт тархвар судлалын янз бүрийн хувилбаруудын том мэдээллийн багцын WGS чухал ач холбогдолтой ирээдүйн харьцуулсан геномикийн судалгааны цаашдын хүчин чармайлтын сэдэв байх ёстой. Дараа нь олон төрлийн сүрьеэгийн тархалтаас жижиг Mycobacterium bovis өгөгдлийн багц (n = 42) дээр нэмэлт шинжилгээ хийж, 1800 гаруй локусыг тодорхойлсон бөгөөд үүнээс дор хаяж нэг омог нь нэг нуклеотидын полиморфизм (SNP) харуулсан байна. Ихэнх (87.1%) нь кодлох бүсэд байрладаг бөгөөд ижил утгатай өөрчлөлтүүдийн ижил утгатай бус өөрчлөлтүүдийн дэлхийн харьцаа (dN/dS) 1.5-аас давсан нь эерэг сонголт нь M. bovis-д үйлчилдэг чухал хувьслын хүч гэдгийг харуулж байна. SNP-ийн өндөр хувь нь "липидийн солилцоо", "эсийн хана ба эсийн үйл явц", "завсрын бодисын солилцоо ба амьсгал" гэсэн функциональ категориудаар баялаг генүүдэд илэрсэн нь микобактерийн биологи, хувьслын ач холбогдлыг харуулсан. 3R (ДНХ-ийн засвар, репликаци, рекомбинаци) системд багтсан MTBC-ийн өвөг дээдсийн генийн хэвтээ шилжүүлэгт өртөмтгий генийг нарийвчлан авч үзвэл Тайжимагийн D саармаг тестийн дэлхийн дундаж сөрөг утгыг харуулсан бөгөөд энэ нь өнгөрсөн сонгомол сканнерыг харуулж байна. эзэнтэй тулалдана.
Сүрьеэгийн микобактерийн цогцолбор (MTBC) нь бактерийн эмгэг төрүүлэгчдийн хамгийн амжилттай таксуудын нэг бөгөөд бактерийн хувьслын ердийн тохиолдол юм. Түүний гишүүд геномын түвшинд (> 99%)1,2 нуклеотидын гайхалтай өндөр үзүүлэлттэй байдаг. MTBC-ийн өөр өөр экотипүүд нь бичил хөхтөн амьтдаас хүн хүртэлх өргөн хүрээний эзэн зүйлийн халдварт мөхлөгт өвчин болох сүрьеэ (сүрьеэ) үүсгэдэг. Одоогийн байдлаар уг цогцолборт хүмүүс багтдаг [М. Сүрьеэ (Mtb), Mycobacterium africanum] болон амьтны дасан зохицсон эмгэг төрүүлэгчид (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium "Mycobacterium, mycobacterium, miyercillus". шимпанзе" ба "дэсси") 5,6. M. canettii (мөн "Nodobacter glabrata" гэж нэрлэдэг) Дээр дурдсан микобактерийн нуклеотидын ижил төстэй байдал нь дунджаар 98% байдаг бөгөөд харьцуулсан геномикийн судалгаагаар M. canettii болон MTBC-ийн бусад хэсэг нь нийтлэг өвөг дээдсээс саяхан салсан болохыг харуулж байна.7 Энэ үзэл баримтлалыг MBC гишүүн гэж нэрлэдэг.
MTBC-ийг хатуу клоны цогцолбор гэж системчилсэн байдлаар тодорхойлсон бөгөөд түүний популяцийн бүтцийг олон янз байдал, саад тотгор, сонгомол хайлт, генетикийн шилжилтээр тодорхой зохицуулдаг9,10. Алга болсон полиморфизм гэх мэт нарийн төвөгтэй клоны хувьслыг дахин нэгтгэх замаар сэргээх боломжгүй гэж үзвэл. Энэ үндэслэлд үндэслэн дифференциал бүс (RD) ба TbD1 (Mtb тусгай устгалын 1 бүс) геномын устгалын дараалсан үйл явдлуудыг MTBC хувьслын молекулын маркер болгон санал болгосон байна2,5,11. Харьцуулсан геномик ба бүхэл геномын дараалал тогтоох (WGS) ажил нь хүний дасан зохицсон гишүүдийг есөн удамд хуваахыг дэмждэг (Mycobacterium tuberculosis L1-L4, L7, L8; and Mycobacterium africanum L5, L6, and L9), L2-оос L4-ийн удамшлыг хуваалцсан T2,11b. Нэмж дурдахад, амьтдын дасан зохицсон гишүүдийг RD7, RD8, RD9 болон RD102, 5, 14-т ангиллын тусгай устгалаар тодорхойлсон нийтлэг өвөг дээдсийг хуваалцахыг санал болгож байна.
Хэвтээ генийн шилжүүлэг (HGT) болон рекомбинацын үйл явдлууд нь ховор гэж тооцогддог бөгөөд МТБК-ийн бүхэл бүтэн гишүүний өөр өөр түүхээс илүүтэй MTBC-ийн өвөг дээдэст тохиолддог15,16,17. Хьюз ба хамтран ажиллагсад (2002) болон Гутакер ба хамтран ажиллагсдын (2006) хийсэн хоёр анхны тайланд рекомбинацын үйл явдал нь M. tuberculosis омгийн өвөрмөц байрлалыг тэмдэглэдэг полиморфизмыг бий болгоход тусална гэж санал болгосон18,19. MTBC-д рекомбинаци илт дутагдаж байгаа шалтгаанууд нь: (1) механик процесс ба HGT-ийн чадвар алдагдах; (2) HGT үйл явдлын ховор тохиолдол; (3) MTBC niche14,17-д рекомбинацын үйл явдлууд үүсэх боломж байхгүй. Саяхан MTBC омог 20 ба Mycobacterium bovis 21-д хэрэглэсэн зарим бүхэл геномын дарааллын (WGS) судалгаанууд нь рекомбинацын нотолгоог өгсөн бөгөөд энэ нь MTBC омгууд нь ихэвчлэн жижиг ДНХ-ийн хэлтэрхий солилцдог болохыг харуулсан боловч нуклеотидын дарааллын хэлбэлзэл хязгаарлагдмал тул эдгээр үйл явдал хараахан анзаарагдаагүй байна.
Mycobacterium bovis нь малаас (голчлон үхэр) ялгардаг МТБХ-ны хамгийн түгээмэл гишүүн боловч түүнийг чөлөөтэй тархаж, хашаатай зэрлэг амьтдаас тусгаарлаж болно4,22,23,24. M. bovis нь сполиготипийн профайл, тодорхой устгал, дан нуклеотидын полиморфизм (SNPs) 256,2, 282, 282, удамшлын дагуу өвөрмөц таван том клон цогцолборт [Европ 1 (Eu1), Европын 2 (Eu2), Европын 3 (Eu3), Африк 1 (Af1) болон Африк 2 (Af2)] болон хувирав. Эдгээр клон цогцолборууд нь Mycobacterium bovis популяцийн олон янзын бүтэц, түүний газарзүйн бүс нутагтай холбоотой болохыг харуулдаг. Нэмж дурдахад, Zimpel болон хамтран ажиллагсдын (2020) хийсэн WGS-ийн сүүлийн үеийн ажил нь 1900 гаруй геном бүхий Mycobacterium bovis-ийн SNP-д суурилсан филогенезийг зохион бүтээсэн нь дор хаяж дөрвөн өөр удам (Lb1-ээс Lb1-Lb4 гэж нэрлэдэг) байгааг харуулж байна. батлагдсан30. Эдгээр зохиогчид филогений болон молекулын болзоонд дифференциал шинжилгээ хийсэн боловч рекомбинацийг судлаагүй30.
Сполиготип, MIRU-VNTR (микобактерийн давтагдсан давталтын нэгж хувьсагчийн тандемын давталтын тоо) болон сүүлийн үеийн SNP бичих зэрэг янз бүрийн молекулын техникийг ашигласан өмнөх ажил нь M. bovis омгийн 31,32,33, 34,35 генетикийн олон янз байдлыг тодорхой түвшинд илрүүлсэн. Удамшлын өөрчлөлтийг ялгах нь өвчний тархвар судлалын судалгааны чухал хэрэгсэл болсон бөгөөд энэ нь эмгэг жам, хоруу чанар, халдвар дамжих чадварыг гүнзгий ойлгоход тустай юм. WGS арга бий болсноор Mycobacterium bovis геномын дасан зохицох үйл явц, тархвар судлалын янз бүрийн хувилбаруудад дасан зохицох хувьслын хөдөлгөгч хүчин зүйлсийг илрүүлэх боломжийг олгож байна.
Энэ ажилд бид Mycoplasma bovis-ийн хувьслын үйл явцын талаар ойлголттой болох, ялангуяа филогенетик харилцаа, рекомбинацын үйл явдлыг шийдвэрлэхийн тулд төрөл бүрийн Mycoplasma bovis өгөгдлийн багц (n=70) дээр харьцуулсан геномын шинжилгээг ашигладаг. Энэхүү шинжилгээний нэмэлт болгон Португалийн 31,36-ийн сайн шинж чанартай олон төрлийн сүрьеэгийн бүс нутгаас олж авсан M. bovis тусгаарлалтуудын (n = 42) дэд өгөгдлийн багцыг мөн адил бус дүгнэлт гаргахын тулд цаашид судалсан болно. Мэдрэмжийн (dN) ижил утгатай (dS) нуклеотидын харьцангуй харьцаа, мөн генийн орлуулах хувь нэмрийг дурьдсан. уран зохиол, тэдгээр нь HGT-ээр дамжуулан MTBC өвөг дээдсээс олж авсан 37,38 бөгөөд 3R (ДНХ-ийн засвар, репликаци, рекомбинаци) системийн генийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг кодлодог 39. HGT-ээр олж авсан генүүдийг сонго, учир нь тэдгээр нь эртний полиморфизмыг төлөөлж болох тул тэдгээр нь ижил утгатай өөрчлөлтүүдийн илүү хувийг агуулж болзошгүй гэж үзэж байна. 3R системд багтсан генүүдийг сонгосон учир нь M. tuberculosis омог дээр хийсэн өмнөх ажил нь эдгээр генүүд дээр ажилладаг ерөнхий сөрөг/цэвэршүүлэх сонголтуудыг зааж өгсөн бөгөөд тэдгээр нь хувьсалд чухал үүрэг гүйцэтгэж магадгүй юм 39. Энэхүү ажлын өөр нэг зорилго нь өөрчлөн байгуулалтын үйл явдлууд байгаа эсэхийг дүгнэх явдал юм. Ийм учраас Португалиас авсан манай мэдээллийн багцад зөвхөн Европын клоны цогцолбор 2-ын геномууд болон клоны цогцолборыг хуваарилаагүй омгууд агуулагдаж байгааг харгалзан бид бүх клоны цогцолборуудын төлөөлөгчийг олж авах, үр дүнгийн бат бөх байдал, өргөн цар хүрээг сайжруулахын тулд олон нийтэд нээлттэй геномын өгөгдлийг оруулахаар шийдсэн.
Өмнө нь тархвар судлалын үүднээс36 тодорхойлогдсон Португалийн эндемик олон эзэнт сүрьеэгийн 42 шинэ дараалсан Mycoplasma bovis геномууд (доорх дэлгэрэнгүй мэдээлэл) нь энэхүү ажлын гол төв юм. Португалийн өгөгдлийн багцад зөвхөн Европын 2 клоны цогцолборын төлөөлөл, зориулалтын цогцолборгүй омгууд байгааг харгалзан M. bovis клон цогцолборын бүх төлөөлөгчийг багтаасан мэдээллийн багцыг өргөжүүлэхийн тулд нийтэд нээлттэй геномын дарааллын өгөгдлийг нэмсэн. Тиймээс, энэ ажилд гурван бүтэн геномын дарааллын мэдээллийн эх сурвалжийг ашигласан: геномын иж бүрэн / төсөл, NCBI (Биотехнологийн мэдээллийн үндэсний төв) -д хадгалагдсан 10 хүртэлх шат (n = 15 тусгаарлалт); SRA-д хадгалагдсан ( Уншсан дарааллын архивын Illumina fastq файл) нь M. bovis клонуудын (n = 12 тусгаарлалт) нийлмэл олон янз байдлыг илэрхийлдэг30; Португалиас шинээр дараалсан 42 геном. NCBI-ийн хайлтаас Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) хасагдсан. M. bovis AF2122/97-г ихэвчлэн мэдээллийн багцад оруулах лавлагаа геном болгон ашигладаг. Африкийн 1 клончлолын цогцолбороор төлөөлүүлсэн геномын бүхэл бүтэн дараалал олон нийтэд боломжгүй, мөн Af2 ба Eu1-ийн төлөөлөгч омгийн цөөн тооны геномын улмаас эдгээр тохиолдлуудад SRA-аас өгсөн анхны дарааллын өгөгдлийг ашигласан. Зимпел болон түүний хамтран ажиллагсдын хийсэн ажил (2020) нь дээр дурдсан клончлолын цогцолбороос геномыг тодорхойлоход тусалсан бөгөөд өгөгдлийн багцад оруулахаар Mycobacterium bovis-ийг сонгоход тусалсан. Eu3-ийн хувьд зөвхөн нэг төрлийн геномыг тодорхойлсон байдаг (Брангер нар, 2020), тиймээс бидний оруулсан геном нь Eu3 цогцолборын тусдаа төлөөлөгч юм.
Дэлхий даяар энэ мэдээллийн багцад 1985-2016 он хүртэл 12 улсад тархсан 8 зүйлээс тусгаарлагдсан 70 үхэр M. bovis багтсан болно. 36 зүйл Eu2, 7 зүйл Eu1, 1 зүйл Eu3, 3 зүйл Af1, 4 зүйл Af2, 19 зүйл нь ямар ч сүүлний цогцолбор биш (хүснэгтэд хамаарахгүй). Энэхүү судалгаанд ашигласан Mycobacterium bovis-ийн нарийвчилсан мэдээллийг (нээлтийн дугаарыг оруулаад) Хүснэгт 1 ба Нэмэлт Хүснэгт 1-д үзүүлэв.
Португалийн малын сүрьеэгийн голомтоос 12 гаруй жилийн турш тархсан Mycobacterium bovis-ийн шинээр дараалсан бүхэл бүтэн 42 геном нь энэхүү судалгааны төв болж байгаа тул зэрлэг амьтан, малын өвчлөлийн системд тогтмол хяналт тавьж байсан 31,36 (Нэмэлт зураг 1). Дараачийн журмын дагуу эдгээр омгуудыг үхэр (n = 14), халиун буга (n = 16), зэрлэг гахай (n = 12) -аас 2003-2015 он хүртэл тусгаарласан: зөвлөмж болгосон протоколын удирдамжийн дагуу амьтдыг цуглуулж, харьцах Эдийн дээжүүд нь ДЭМБ-ын хуурай газрын амьтдын гарын авлагад байгаа бөгөөд Stonebrensen-Jen-Jen-Jen-Wein-Jen- пируват хатуу орчин ба шингэн орчин. Өсгөвөрийг 37 ° C-д өсгөвөрлөж, ургалтыг долоо хоногт нэг удаа дор хаяж 12 долоо хоног шалгана. Колониудыг -80ºC температурт глицерин уусмалд шууд хадгална. Mycobacterium сонгомол орчинд (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) архивлагдсан дээжийг нэг in vitro дамжуулалтаар дамжуулж, WGS хөтөлбөрийн ДНХ-ийг олж авсан. Үүний тулд хөлдөөсөн өсгөвөрийн нөөцийн уусмалыг 5% натрийн пируват, 10% ADS (50 г альбумин, 20 г глюкоз, 1 л усанд 8.5 г натрийн хлорид) -аар Middlebrook 7H9 дээр 37°C Retrain дээр баяжуулсан. 4 долоо хоногийн өсөлтийн дараа тэжээлийг шинэчилж, өсөлт ажиглагдах хүртэл өсгөвөрийг тогтмол хянаж байв. Центрифуг хийх замаар эсүүдийг цуглуулж, үрэлийг 500 мкл фосфатын буферт давсны уусмалд (PBS) дахин түдгэлзүүлж, 99 ° C-т 30 минут халааж, центрифуг хийж, дээд давхаргыг -20 ° C-т WGS хүртэл хадгалав. Бүх процедурыг биоаюулгүй байдлын 3-р түвшний байгууламжид гүйцэтгэдэг.
WGS хосолсон геномын санг ДНХ-ийн дээж бүрийн өвөрмөц индексийг ашиглан бэлтгэсэн бөгөөд дараалал тогтоохдоо Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 дээж) болон HiSeq (2 × 150 pb) (хоёр тусгаарлалт) технологийг (Eurofins Genomics, Герман) ашигладаг. Үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу геномын ДНХ-ийн дарааллыг тогтоохын тулд хоёр талт модулийн хавсралт бүхий Illumina геномын анализаторыг ашиглаж, номын санг барихдаа Illumina-аас Nextera XT DNA Library Prep Kit ашиглана уу.
SRA-аас олж авсан өгөгдлийг (n = 12) харгалзан үзэхэд клоны цогцолборыг тодорхойлохыг холбогдох хэвлэлд өгсөн мета өгөгдөл болгон ашиглаж болно 30, 41, 43. Бүрэн геномыг авч үзэхэд Mycobacterium bovis AF2122/97 ба Mycobacterium bovis-ээс бусад нь E clonal 360, 361u, 25, 29, тус тус нь Mycobacterium tuberculosis H37Rv-ийн бүрэн геномтой ижил байна (NCBI элсэлтийн дугаар NC_000962.3). Геномын зэрэгцүүлэлтийг MAFFT (амин хүчил эсвэл нуклеотидын дарааллын олон тэгшитгэх програм, хувилбар 7.458) болон -addfragments48 параметрийг ашиглан гүйцэтгэнэ. Дараа нь өөр өөр клонын цогцолбор байхгүй ба/эсвэл SNP-ийн шинж чанарууд байгаа эсэхийг хайж олох хэрэгтэй.
Шинээр дараалалд орсон Mycobacterium bovis (n = 42) болон угсарсан геномын ноорог (n = 3) нь цогцолборыг vSNP дамжуулах хоолойгоор дамжуулан Mycobacterium tuberculosis H37Rv лавлагаа геномтой уялдуулж, өөр өөр клонуудын устгал болон/эсвэл SNP шинж чанарууд байгаа эсэхийг хайлт хийсэн.
Харгалзах клонын цогцолборт геномын өгөгдлийг хуваарилахын тулд SNP болон spoligotyping профайлын дутагдал ба/эсвэл байгаа/байгаа эсэхээс мэдээлэл цуглуулна. Дөрвөн төслийн ассамблейн хувьд сполиготипийн профайлыг дүгнэх боломжгүй тул тэдгээрийг "ямар ч төвөгтэй" бүлэгт оруулсан болно.
Энэхүү ажлын дараагаар биоинформатикийн ажлын урсгал нь шинэ угсралт, зураглалаас эхлээд рекомбинацын үйл явдал болон геномын тодорхой полиморфизмыг судлах зорилготой лавлах стратеги хүртэл эхэлдэг. Зураг 1-д дараалсан алхмуудын схемийг үзүүлэв. Рекомбинацын шинжилгээнд бүх геномыг ашиглан дүгнэлт болон холбогдох үзүүлэлтүүдийн бат бөх байдлыг нэмэгдүүлдэг.
Геномын зөвшилцлийн дарааллыг бий болгоход гарсан алдааг багасгахын тулд бид эхлээд de novo угсралтыг олж авсан бөгөөд дараа нь үндсэн олон тохируулгыг олж авсан. Unicycler дамжуулах хоолойг одоогоор https://github.com/rrwick/Unicycler49 дээрээс авах боломжтой бөгөөд дараалсан 54 геномыг (SRA-аас сэргээсэн 42 шинээр дараалсан, 12 fastq файл) шинэ угсралт хийхэд ашигладаг. Товчхондоо, эхнээс нь угсрахаасаа өмнө FastQC хувилбар 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) болон Trimmomatic хувилбар 0.36 ("Адаптерууд болон бусад гэрэлтүүлгийн тусгай дарааллыг уншсанаас хайчлах" сонголт, "Унших чанар 2-оос доогуур байвал сууриудыг таслах") дээр унших чанарын шинжилгээг хийсэн. (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Дараа нь геномын угсралтад SPAdes optimiser49, угсралтын дараах оновчлолд Pilon 1.1851 хувилбарыг ашигласан. Буруу угсрахаас зайлсхийхийн тулд консерватив гүүрний горимыг сонгосон бөгөөд k-mer хэмжээг хайж, унших уртын 20% -аас 95% -ийн хооронд сонгосон. SPAdes-ийн удирдамжийг дагаж, унших хэмжээг анхаарч үзээрэй, 300 bp-ээс бага контигуудыг устгаж, 20 унших гүнийн хамрах хүрээний хязгаарыг 52-оор тогтооно. Де ново угсралтын стратегид өндөр давтагдах пролин-глутамат (PE) болон пролин-пролин глутамат (PPE) зэрэг геномын бүсүүдийг арилгаагүй.
Де ново угсралтын чанарыг QUAST дамжуулах хоолойгоор (http://quast.sourceforge.net/quast.html) үнэлдэг бөгөөд энэ нь контиг болон M. bovis AF2122/97 лавлагаа геномыг (NCBI элсэлтийн дугаар LT708304.1) зураглалыг шинэчлэхэд тусалдаг (чанарын нэмэлт параметрүүдийг 1-ээс үзнэ үү).
vSNP дамжуулах хоолойн (https://github.com/USDA-VS/vSNP) тусламжтайгаар Illumina дараалалаас шинээр дараалсан M. bovis-ийн FASTQ файлыг M. bovis AF2122/97 лавлагаа геномтой (LT708304.1) харьцуулсан. Геномын шинжилгээний хэрэглүүрийн (GATK) 53, 54, 55-ын шилдэг туршлагын зөвлөмжийн дагуу стандарт шүүлтүүрийн параметрүүд эсвэл дахин тохируулгын массын хувилбарын оноог ашиглана. Үр дүнг SAMtools массын хамгийн бага оноо болох 150 ба AC = 2 ашиглан шүүнэ. Мөн Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) ашиглан бохирдлыг үгүйсгэхийн тулд уншилтыг шалгана уу. Бидний ажилд стратегийн дэс дарааллыг тодорхойлоход ашигладаг vSNP дамжуулах хоолой нь хэд хэдэн тодорхойлогдсон SNP болон зорилтуудыг судалж, халдварын холимог хувилбаруудыг оруулаагүй болно. Уншсан геномын хамрах хүрээ 99% -иас илүү байна (Нэмэлт хүснэгт 1).
Газрын зургийн алдаа болон буруу SNP-ээс зайлсхийхийн тулд дараах тохиолдолд хувилбарыг шүүнэ үү: (1) 20-иос бага уншилтаар дэмжигддэг, (2) 0.9-аас бага давтамжтай байдаг, (3) энэ нь дор хаяж нэг омогт байгаа боловч ядаж өөр омогт цоорхой байгаа. Нэгдсэн геномик үзэгч (IGV) хувилбар 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 нь SNP болон байрлалыг зураглал эсвэл зэрэгцүүлэх асуудалтай нүдээр шалгахад ашигласан. Пролин-глутамат (PE) болон пролин-пролин глутамат (PPE) генүүд нь маш их давхардалтай бөгөөд олон генийн гэр бүлийн нэг хэсэг байдаг тул тэдгээрийг Illumina дараалал, буруу зураглалаар амархан ойлгодог тул тэдгээрийг илүүд үздэг. Тиймээс бид шинжилгээнээс PE/PPE ген, инделийг шүүсэн.
Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) дагуу бүх SNP нь функциональ ангилалд хуваагддаг. SnpEff дамжуулах хоолой (https://pcingola.github.io/SnpEff/) нь SNP-ийн үр дагаврыг (ижил утгатай эсвэл ижил утгатай бус өөрчлөлт) гаргахад ашиглагддаг. Mycobacterium bovis AF2122/97 геномын шинэ мэдээллийн санг (LT708304.1) үүсгэсэн.
Үндсэн геномын олон тэгшитгэлийг Parsnp v1.2-г ашиглан гүйцэтгэсэн бөгөөд одоогоор https://github.com/marbl/parsnp57 сайтаас авах боломжтой бөгөөд 69 бүрэн геном/ноорог угсралт (-c сонголттой) болон M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)-ийг лавлагаа болгон ашигласан. Дөрвөн үндсэн олон тохируулга хийгдсэн: зөвхөн Eu2 клончлолын цогцолборын гишүүд (n = 37), Европын клончлолын цогцолборын бүх гишүүд (n = 44), Европ, Африкийн клончлолын цогцолборын уулзвар цэг (n = 51) багтсан бөгөөд энэ судалгаанд бүх Mycobacterium bovis (n = 70) багтсан болно.
Parsnp-ийн үүсгэсэн үндсэн шугамыг RAxML ашиглан CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 ашиглан хамгийн их магадлалтай (ML) филогенетикийн модыг гаргаж, 1000 удирдамжтай хуулбарыг хийдэг.
Гурван өөр алгоритм ба биоинформатикийн хэрэглүүр нь рекомбинацийн үйл явдал байгаа эсэхийг шалгахад хэрэглэгддэг: SplitsTree4 програм хангамж, Губбинс (нуклеотидын дараалал дахь рекомбинацийн шугаман шугам) болон RDP4 (рекомбинацийг илрүүлэх програм, хувилбар бета 4.101) программ хангамж.
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59-д хэрэгжсэн хуваагдлын задралын аргыг статистикийн баталгаажуулалтад Phi тест ашиглан үндэсгүй филогенетик сүлжээг тооцоолоход ашигладаг бөгөөд ач холбогдлын босго нь p = 0.05 байна. Parsnp-ийн үндсэн олон талт шинжилгээг оролт болгон ашиглаж, сүлжээний стандарт болгон хуваах задралыг хэрэгжүүлдэг.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 нь Mycobacterium bovis-д рекомбинацын нөлөөллийг үнэлэх өөр нэг арга болох өгөгдмөл параметрүүдтэй ажилладаг. Дамжуулах хоолойд хэрэгжүүлсэн алгоритм нь холбогдох клоны удамшлыг сэргээдэг. AF2122/97, LT708304.1) нь харилцан уялдаатай байх ба рекомбинацийн үйл явдлыг илэрхийлэх SNP кластерийг илрүүлэхийн тулд модны мөчир тус бүр дээр SNP-ийн байрлалыг сканнердах RAxML-ийн ML модыг оролтын файл болгон ашигладаг.
Эцэст нь, Gubbins дамжуулах хоолойн санал болгож буй өөрчлөн зохион байгуулалтын үйл явдлыг баталгаажуулахын тулд RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 болон SiScan66) дээр хэрэгжсэн зургаан алгоритмыг Parsnp-ийн үндсэн олон тохируулгад анхдагч тохиргоонд ашигласан болно. Бид RDP4-д хэрэгжүүлсэн алгоритмын гурваас доошгүй нь рекомбинацын үйл явдал бүрийг баталгаажуулахын тулд чухал дохиог байнга харуулах ёстойг тодорхойлсон.
Gubbins болон RDP программ хангамж хоёулаа 500 bp хүртэлх цонхон дахь үндсэн олон тохируулгыг шалгах замаар рекомбинацийн дохиог хайж, шинэ угсралтын явцад PE/PPE генийг оруулах нь олдсон рекомбинацын дохионд саад болохгүйг баталгаажуулж байгааг харгалзан, цаашдын шинжилгээг гомолинеар байдлаар хийдэг. Бүрэн геномыг ашигласан синлинар зураглалыг MAUVE-олон геномын тэгшитгэх (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ашиглан орон нутгийн геномын шилжилт, урвуу өөрчлөлтийг оруулахгүйн тулд бүтээсэн. Түүнчлэн геномыг бүхэлд нь SyntTax вэб серверээр (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) дамжуулан амин хүчлийн дараалалд ижил шугаман байдлын шинжилгээ хийхэд ашигласан.
Португалийн олон эзэнт сүрьеэгийн системээс олж авсан геномын мэдээллийн багцад илүү гүнзгий дүн шинжилгээ хийх нь уран зохиолд дурдсан генүүдийн полиморфизмыг шалгах явдал юм. Эдгээр генүүд нь 37,38 бөгөөд HGT (ДНХ-ийн засвар, хуулбар ба рекомбинац) системийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдээр дамжуулан MTBC өвөг дээдсийн олж авсан 3R кодчилол бүхий ген юм. нуклеотидын олон янз байдал (π) болон Тажимагийн D саармаг тестийн параметрийн оролт.
Mycoplasma bovis-ийн 69 тусгаарлалт болон лавлагаа геном дээр үндэслэсэн хамгийн их магадлалтай (ML) филогенетик модыг олж авсан (Зураг 2А). Нэг генд суурилсан мод эсвэл олон цэгт суурилсан модтой харьцуулахад энэ стратеги нь геномын хувьсах чадварыг бүхэлд нь шингээдэггүй, улмаар 68,69 зүйлийн хооронд ялгах чадвар багатай илүү хүчирхэг модыг бий болгох боломжийг олгодог. ML модны топологийн бүтэц нь ихэвчлэн клонуудын нарийн төвөгтэй ангилалд нийцдэг. Eu2-ийн геном нь салаагаар бөөгнөрсөн ба Af1-ийн геном нь мөн хамт бөөгнөрсөн байдаг (Зураг 2А). Үүний үр дүн нь Mycobacterium bovis-ийн мэдэгдэж буй хувьслын хамааралтай нийцэж байгаа бөгөөд өөрөөр хэлбэл, Eu1 гишүүн болон бусад бүх клонын цогцолбор, геномуудаас бүрдэх бүлгийн хооронд том ялгаа байгаа боловч клонын цогцолбор 30-ыг тодорхой заагаагүй байна. Клонын цогцолбор болон филогенетик мод дээр ажиглагдсан харилцааны хоорондын бага зэргийн зөрчил нь клонын цогцолборыг тодорхой геномын бүс нутгуудад тулгуурлан тодорхойлсон байдаг бол филогенетик мод нь геномыг бүхэлд нь төлөөлж буй үндсэн геномуудын олон дараалал дээр суурилдагтай холбон тайлбарлаж болно.
Хамгийн их магадлалтай филогенетик мод (GTR) нь Mycobacterium bovis геномын үндсэн геномын уялдааг үндэслэн (A) ба дараа (B) рекомбинацын талбайг арилгасны дараа бүтээгдсэн. Салбарын өнгө нь Mycobacterium bovis клон цогцолборыг төлөөлдөг: Европ 1 нь нил ягаан, Европ 2 улаан, Европ 3 цэнхэр, Африк 1 улбар шар, Африк 2 ногоон өнгөтэй. Модыг үндсээр нь салгаж, масштабаар нь зурж, салбар бүрийн уртыг солих байдлаар хэмждэг.
Mycobacterium tuberculosis цогцолборыг клоноор хувьссан гэж тодорхойлсон бөгөөд олон жилийн турш хуримтлагдсан ихэнх нотлох баримтууд нь үргэлжилж буй HGT болон рекомбинацийн үйл явдлууд MTBC15,17,18-ын илрүүлж болох түвшинд үүсэхгүй гэсэн санааг баталж байна.
Өмнөх ажил нь MTBC омгийн хооронд хязгаарлагдмал рекомбинац байж болохыг харуулсан20,21 байхад бусад нь хэмжигдэхүйц рекомбинацын үйл явдлыг тодорхойлж чадаагүй байна70,71. Зөвхөн Mycobacterium tuberculosis гэж үзсэн өмнөх ажлаас ялгаатай Mycobacterium bovis-д анхаарлаа хандуулж энэ асуудлыг дахин хэлэлцэх 70,71; эсвэл 20-ийг төлөөлж буй M. bovis бараг байхгүй, MTBC-ийг бүхэлд нь авч үзэх; эсвэл зөвхөн хязгаарлагдмал үхрийн фракцуудыг авч үзэх. Микобактерийн өгөгдлийн багц, энэ ажилд бүх клонын цогцолборыг төлөөлсөн нийт 70 омог рекомбинацийг илрүүлэхэд ашигладаг. Мэдээллийн багцыг дөрвөн хуримтлагдсан түвшний дагуу хуваадаг: (1) Eu2 гишүүд, (2) Европын бүх клон цогцолборын гишүүд (жишээ нь Европ), (3) Европ ба Африкийн клон цогцолбор (Eu + Af) болон (4) бүх мэдээллийн цуглуулгууд (түүний өмнө тайлбарласан клонжуулалтын цогцолборт ороогүй геномуудыг оруулаад).
Энэхүү таамаглалыг цаашид судлахын тулд геномуудын хооронд рекомбинацийн үйл явдлууд байхгүй эсэхийг үнэлэхийн тулд хуваагдмал задралын сүлжээг хийсэн, учир нь энэ арга нь хувь хүмүүсийн хоорондын өвөг дээдсийн харилцааг төсөөлж, филогенетикийн зөрчилтэй дохиог харуулах боломжтой юм. Шинжилгээнд дурдсан бүх дөрвөн өгөгдлийн багц нь сүлжээнд гогцоо байгааг (өөрөөр хэлбэл нэг мод руу нийлдэггүй хэсгүүд) баталгаажуулсан боловч Phi тест нь статистикийн дэмжлэггүй (Eu2, p = 0.0956; Европ, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; өгөгдлийн багц нь бүхэлдээ муу байгааг нотлох баримт p45) харуулж байна. үйл явдал (Зураг 3A-D).
Европт 2 геном (n = 37) (A), Европын геном (n = 44) (B), Европ, Африкийн геном (n = 51) (C) болон бүх мэдээллийн багц (n = 70) (D).
Энэхүү шинжилгээний дараа бүх сүлжээн дэх мөчлөгийн ажиглалтыг харгалзан үзсэний үндсэн дээр Gubbins дамжуулах хоолойд хэрэгжүүлсэн сэргээн босголтын алгоритмыг клональ удамшлыг сэргээн босгох, M. bovis геномд рекомбинацийн нөлөөллийн үнэлгээг нэмэх зорилгоор ашигласан. Ихэнх нь төгсгөлийн мөчрүүдэд (өөрөөр хэлбэл нэг геномд) тохиолдсон рекомбинацийн үйл явдлын хуримтлагдсан тоог гарга (Хүснэгт 2). Эдгээр үзүүлэлтүүд нь бүх өгөгдлийн багцын нийцтэй байдлыг харуулж, рекомбинацын үйл явдлын давтамж нь мутацийн давтамжаас 200-300 дахин их байгааг харуулж байна. Салбар дээрх рекомбинацын болон цэгийн мутацийн харьцангуй хурдыг илэрхийлдэг rho/theta параметр нь 0.0037-0.0056 хооронд байх шиг байна (Хүснэгт 3). Саяхан 38 M. bovis омгийн хэвлэгдсэн ажил нь энэ өгөгдлийн багцаас олж авсан rho/theta утгыг (rho/theta = 0.1) харуулсан боловч Патанэ болон хамтран ажиллагсдын хийсэн ажил нь рекомбинацын параметрүүдийг гаргахын тулд лавлагаанд суурилсан угсралтыг ашигласан. терминалын салбар.
Дараа нь r/m параметр нь рекомбинаци ба мутацын нэвтрүүлэх олон янз байдлын харьцааг илэрхийлдэг бөгөөд дундаж утга нь 0.025-аас 0.037 хооронд байгаа нь мутацитай харьцуулахад рекомбинаци нь M. bovis-ийн генетикийн олон янз байдалд ерөнхий нөлөөлөл багатай байгааг харуулж байна (Хүснэгт 3)). Өргөн цар хүрээтэй харьцуулахын тулд ижил төстэй аргыг 23 геномоос бүрдсэн MTBC мэдээллийн багцын r/m параметрийг тооцоолоход ашигласан бөгөөд дундаж утгыг 0.48620 харуулсан бол Патанэ болон түүний хамтран ажиллагсдын 38 M. bovis мэдээллийн багцын хувьд дундаж утга нь 0.98 байна. Эхний судалгаагаар M. bovis-ийн ажилд орсон 23 геномын зөвхөн хоёр нь (M. bovis BCG ба лавлагаа омог) тул M. сүрьеэгийн геномын хэт их илэрхийлэлээс болж авсан үнэ цэнэ нь хазайсан байж магадгүй юм. Хоёрдахь тайланд шинжилгээнд хамрагдсан Mycobacterium bovis популяцийг гол төлөв АНУ болон малын тэжээвэр амьтдаас гаргаж авсан. Үүний эсрэгээр, манай мэдээллийн багцад илүү олон газарзүйн байршил, эзэн төрлийг төлөөлж, өөр өөр популяцийн генетик шинж чанартай өөр өөр клоны цогцолборт бүлэглэсэн геномуудыг ашигладаг бөгөөд ингэснээр Популяцийн илүү гүнзгий, өргөн хүрээний мэдлэгийг олж авдаг. Бидний өгөгдлийн багцаас олж авсан ялгаа r/m дундаж утга нь ижил ангилал зүйн зүйлүүдэд хуваарилагдсан удамшлын хооронд рекомбинацын зэрэг ихээхэн ялгаатай байдаг гэсэн ойлголттой нийцэж байгаа тул эдгээр үр дүн нь M. bovis клоны цогцолбор нь рекомбинацын ялгааг үзүүлж болохыг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч илүү олон тооны M. bovis геномыг оруулах замаар энэхүү өгөгдлийн багцыг мэдэгдэхүйц өргөжүүлэх нь энэ асуудлыг илүү тодорхой болгох боломжийг олгоно. r/m болон rho/theta параметрүүдийн аль аль нь салбар хоорондын харилцан адилгүй байдлыг харуулдаг бөгөөд энэ үр дүн нь бусад бактерийн зүйлийн тайлантай нийцэж байна72,73.
Эцэст нь Губбинсын шугамаар тодорхойлсон өөрчлөн зохион байгуулалтын үйл явдлуудыг баталгаажуулахын тулд RDP4 програм хангамжид зургаан өөр алгоритмыг ашиглан өөр өөр үндсэн олон харьцуулалтыг бие даан туршиж үзсэн. Дэлхий даяар Губбинсийн тодорхойлсон үйл явдлын талаас бага хувийг RDP4 баталсан (Хүснэгт 4 ба 5). Өгөгдлийн багцыг бүхэлд нь авч үзвэл хоёр нь дотоод зангилаа, нөгөө нь терминалын салбар дахь нэг геномыг хамарсан гурван рекомбинацын үйл явдлыг баталгаажуулсан бөгөөд үүнд клональ цогцолборыг хуваарилах боломжгүй байсан (Хүснэгт 4, 5). Төгсгөлийн мөчрүүдэд тохиолдсон үйл явдлыг тодорхойлох нь орчин үеийн M. bovis омгийн рекомбинацийг үргэлжлүүлж байгаа эсвэл үр дүн нь буруу байгааг илтгэж болно70. Энэхүү таамагласан рекомбинацын бүсэд байрлалын 20 орчим хувь нь тодорхойлогдоогүй нуклеотид (N)тэй байдаг нь рекомбинацын дохионд нөлөөлдөг (Нэмэлт Зураг 2). Нэмж дурдахад, энэ бүс нь rrs генд нөлөөлж, өндөр хадгалагдах төлөвтэй байгаа 16S рибосомын РНХ-ийг кодлодог тул энэхүү таамагласан рекомбинацийн дохио нь дарааллын алдаа эсвэл буруу тохируулгын үр дүн байж болно. Дараа нь Mb0003 болон Mycobacterium bovis AF2122/97 хоёрын хооронд геномын уялдааг бүхэлд нь хийж, тодорхойлогдоогүй нуклеотид болон SNP-ууд байгаа нь батлагдсан тул буруу тохируулгатай холбоотой асуудал нь энэ ажилд хэрэгжсэн биологийн мэдээллээс шалтгаалаагүй болно.
Дотоод зангилааны рекомбинацын бүсэд цоорхой, тодорхойлогдоогүй нуклеотид олдсонгүй (Зураг 4, 5). Эдгээр үйл явдлуудын тухайд нэг нь зөвхөн Eu2 геномыг агуулдаг бөгөөд боломжит поликетид синтазыг кодлодог pks12 генд нөлөөлдөг; нөгөө нь Eu1 геномд бүртгэгдсэн бөгөөд боломжит нитратын редуктазыг кодлодог narX генд нөлөөлдөг (Хүснэгт 4). Ерөнхийдөө рекомбинацын шинжилгээ нь статистикийн дэмжлэг бүхий рекомбинацын фрагментуудын тоо хязгаарлагдмал байгааг харуулж байгаа бөгөөд дүгнэлтийн үзүүлэлтүүд нь рекомбинац нь M. bovis удамд бага нөлөө үзүүлж байгааг харуулж байна. Рекомбинацын дохио бага байх төлөвтэй байгаа ч жинхэнэ хувьслын дохиог арын чимээ шуугианаас ялгах нь чухал бөгөөд энэ нь хэцүү ажил юм. Лавлагаа дээр суурилсан угсралт болон үл нийцэх асуудлууд 70, 71-ээс үүдэлтэй дуу чимээний дохиог багасгахын тулд геномоос бусад бүх зүйлийг эхнээс нь цуглуулж, угсралтын чанарыг QUAST дамжуулах хоолойн шинжилгээгээр шалгаж, баталгаажуулсан (Нэмэлт Хүснэгт 1). Үүнээс гадна ерөнхий судалгааны найдвартай, үнэн зөв байдлыг хангахын тулд хэд хэдэн нэмэлт шинжилгээ хийсэн. Тиймээс narX болон pks12 генийн дарааллын чанарыг Mycobacterium bovis AF2122/97-ийн эсрэг уншсан зураглалаар үнэлэв. Аргын хэсэгт дурдсан шалгуурыг (хамгийн багадаа 20 уншилт, 0.9 өөрчлөлтийн давтамж) ашиглан дахин нэгтгэх бүс нутагт санал болгож буй SNP байрлалыг баталгаажуулсан. NarX генийн полиморфизм нь хоёр геном (Mb1792361 ба Mb7240415; 2.3%) болон pks12 геномын геномууд: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17176es, Mb1716es, Mb1716es, геномуудад бүрэн батлагдсан. Гэсэн хэдий ч Mb2043 геномын хувьд SNP нь дээд тал нь 17 уншилтаар дэмжигддэг тул 8 байрлалын зургаа нь унших гүнийн шалгуурыг хангахгүй байна. Энэ нь тогтоосон хязгаарын утгаас доогуур буюу 20. Тиймээс энэ геномын талбайд зургаан геномын рекомбинацийг (8.6%) баталж болно (Зураг 45).
Mycobacterium bovis өгөгдлийн багцын рекомбинацын бүсийн уялдааг нарийвчлан дүрсэлсэн нь нитрат редуктазыг кодлодог narX генд нөлөөлдөг. Дотоод зангилааны рекомбинацын бүсэд цоорхой эсвэл тодорхойгүй нуклеотид олдсонгүй. Энэ онцгой үйл явдал Eu1 геномд бүртгэгдсэн. NarX генийн дарааллын чанарыг Mycobacterium bovis AF2122/97-ийн уншилтыг графикаар үнэлэв. Аргын хэсэгт дурдсан шалгуурыг (хамгийн багадаа 20 уншилт, 0.9 өөрчлөлтийн давтамж) ашиглан дахин нэгтгэх хэсэгт санал болгож буй SNP байршлыг баталгаажуулна уу. Mb1792361 ба Mb7240415 (2.3%) геномуудад narX генийн полиморфизм бүрэн батлагдсан.
pks12 генд нөлөөлж буй Mycoplasma bovis өгөгдлийн багцын рекомбинацын бүсийн зохицуулалтын нарийвчилсан дүрслэл. Дотоод зангилааны рекомбинацын бүсэд цоорхой эсвэл тодорхойгүй нуклеотид олдсонгүй. Боломжит поликетид синтазын кодчилол бүхий pks12 генд нөлөөлөх үйл явдлын тухайд энэ нь зөвхөн Eu2 геномыг агуулдаг. Pks12-ийн дарааллын чанарыг Mycobacterium bovis AF2122/97-ийн уншсан зураглалаар үнэлэв. Аргын хэсэгт дурдсан шалгуурыг (хамгийн багадаа 20 уншилт, 0.9 өөрчлөлтийн давтамж) ашиглан дахин нэгтгэх хэсэгт санал болгож буй SNP байршлыг баталгаажуулна уу. Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, Mb1960 геномуудын полиморфизм бүрэн батлагдсан.
PE болон PPE генүүд нь Illumina-ийн дараалал, буруу зураглалаар амархан ойлгогддог давтагдах бүсүүдтэй байдаг тул M. tuberculosis-ийн гишүүдийн биоинформатикийн ажлын урсгалаас зөвхөн дарааллын зураглалыг ашиглах үед л устгадаг. Энэ ажилд ашигласан рекомбинацын үйл явдлын дүгнэлт нь PE/PPE-ийг шүүхгүйгээр шинэ угсралтад үндэслэсэн болно. SplitsTree, Gubbins дамжуулах хоолой болон RDP4 программ хангамжаар дамжуулан гурван өөр нэмэлт арга, алгоритмыг хэрэгжүүлснээр ашигласан стратеги нь алдааны дохионоос үүдэлтэй дахин зохион байгуулагдсан бүс нутгийг боловсруулж, шүүх боломжтой гэж бид үзэж байна. Гэсэн хэдий ч SNP кластеруудыг тодорхойлохын тулд Gubbins болон RDP4 программ хангамжид PE/PPE генийн хөндлөнгийн оролцоог үгүйсгэхийн тулд narX болон pks12 генүүдэд нөлөөлөхийг санал болгож буй рекомбинацын бүс нутгийг тодорхойлохын тулд эдгээр генүүдийн ойр орчмын байдлыг шалгасан (Нэмэлт зураг 3-5). M. bovis AF2122/97-д narX генийг narK2 ба Mb1764c-ээр тусгаарладаг бол pks12 нь Mb2075c e Mb2073c-ээр хүрээлэгдсэн байдаг (Нэмэлт зураг 3-5). Бүрэн геномын MAUVE синлайн зураглалыг ашиглан үүсгэсэн зураг нь генийн дарааллыг хадгалах, дахин зохион байгуулах тухай мэдээллийг өгдөг бөгөөд дөрвөн коллинеар блокыг харуулсан бөгөөд геномын шилжилт, урвуу шинж тэмдэг илрээгүй. Нэмж дурдахад, амин хүчлийн дараалал бүхий комплементийн шинжилгээ нь бүх геномын ижил төстэй байдлыг нотолсон бөгөөд narX эсвэл pks12-ийн зэргэлдээ бүс нутгуудад PE/PPE илрээгүй. NarX-ийн хувьд нэг геном (Mb0030) нь бага синонимын оноотой байна, учир нь narX генийг хоёр фрагмент (1891 ба 1890 оны фрагмент) гэж тодорхойлсон. Pks12-ын хувьд ижил төстэй байдлаас шалтгаалан Mb0030 ба Mb003 нь синлинеар байдлын бага оноог харуулсан бол pks12 нь уургийн өөр өөр домэйныг төлөөлсөн хоёр ба гурван фрагментээр тодорхойлогдсон (Нэмэлт Зураг 3-5). Энэ мэдээллийг харгалзан Gubbins болон RDP4 программ хангамж хоёулаа дүн шинжилгээ хийж, цонхон дээрх хамгийн ихдээ 500 bp-ийн үндсэн олон тэгш байдлыг шалгаснаар PE/PPE ген нь narX болон pks12-д нөлөөлдөг рекомбинацын дохионд саад болохгүйг бид баталж байна.
Хэдийгээр энэ өгөгдлийн багцад илэрсэн рекомбинацын дохиог үлдэгдэл гэж үзэж болох ч M. bovis-ийн рекомбинацийг үгүйсгэх аргагүй нь үнэн, тиймээс энэ нь эпидемиологийн янз бүрийн хувилбаруудын бүхэл геномыг Чухал гэж дарааллаар нь дараалсан цаашдын шинжилгээний сэдэв хэвээр байх ёстой.
Рекомбинацын залруулга хийхээс өмнө болон дараа олж авсан ML филогенетик модыг харьцуулах нь (Зураг 2A, B) филогенетикийн таамаглалд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт оруулаагүй бөгөөд M. bovis омог нэг бүлэгт бөөгнөрсөн.
M. bovis AF2122/97-ийн лавлагаа геномын хамт шинээр дараалсан 42 M. bovis уншлагад зураглал хийсний дараа 1816 полиморф байрлалыг агуулсан SNP шугамыг олж авсан. Ихэнх SNP (87.1%) нь кодлох бүсэд байрладаг бөгөөд нөлөөлөлд өртсөн генүүд нь Bovilist-д үзүүлсэн функциональ ангиллын дагуу тодорхойлогддог (Зураг 6A, B). Функциональ ангилал тус бүрийн генийн нийт тоог харгалзан үзэхэд "липидийн солилцоо" ангилалд багтсан генүүд нь илүү олон SNP-ийг харуулсан ба дараа нь "эсийн хана ба эсийн үйл явц", "завсрын бодисын солилцоо ба амьсгал" нь M. bovis хувьсалд байгааг илрүүлсэн.
Португалийн M. bovis мэдээллийн багцын шаталсан шинжилгээ (n = 42). Функциональ ангилал (A) тус бүрийн бүртгэгдсэн SNP болон нөлөөлөлд өртсөн генийн нийт тоо. Функцийн ангилалд (B) бүртгэгдсэн ижил утгатай болон ижил утгатай бус өөрчлөлтүүдийн нийт тоо.
Дэлхийн хэмжээнд дундаж dN/dS харьцаа нь 1.5-аас илүү байгаа нь дэлхийн хувьслын дарамт нь өвөг дээдсийнхээ төлөв байдлаас ангижрахад чиглэж байгааг харуулж байгаа бөгөөд эерэг (төрөлжүүлсэн эсвэл чиглэсэн) ба/эсвэл цэвэршүүлэх сонголтын тайвширсан хувилбарыг илэрхийлж байна. "Хоруу чанар, хоргүйжүүлэх, дасан зохицох", "оруулах дараалал ба фагууд", "зохицуулах уураг" гэсэн ангилалд SNP-ийн гуравны хоёроос илүү нь ижил утгатай биш юм (Зураг 6B).
Бүх ангилалд олон SNP-тэй генүүд байдаг бөгөөд үүний үр дүнд мутацийн дундаж хувь (өөрөөр хэлбэл нэг генийн дундаж SNP) 1-ээс их байдаг (Зураг 6А). 15 SNP-тэй Pks12 (Mb2074c) ба 8 SNP-тэй fas (Mb2553c) нь мутацийн өндөр утгатай байдаг. Эдгээр хоёр ген нь өөх тосны хүчлийн солилцоонд оролцдог. Pks ген нь микобактерийн эсийн хананы липидийн биосинтезд оролцдог олон үйлдэлт фермент болох поликетид синтазыг (PKS) кодлодог74,75. Энэ ген нь микокетидын нийлэгжилтэнд оролцдог олон үйлдэлт полипептидийг кодлодог74,76. Fas ген нь миколийн хүчлийн нийлэгжилтэнд оролцдог. Эдгээр генүүд хоёулаа эзэнтэй харьцах эсийн хананы биосинтезд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.
Mycobacterium bovis-ийн хувьслыг цаашид судлахын тулд хоёр багц тусгай генийг шинжилсэн. Өмнө нь хэвлэгдсэн бүтээлүүд нь дарааллын найрлага, филогенетик аргуудыг ашиглан төрөлжүүлэхээс өмнө HGT-ээр дамжуулан MTBC-ийн өвөг дээдсээс олж авсан генүүдийг тодорхойлсон байдаг37,38. Эдгээр генүүдийг Нэмэлт Хүснэгт 2-т жагсаасан болно. HGT-тэй холбоотой байж болох нийт 77 генийн SNP тархалтыг шинжилж, 26 полиморф цэгийг тодорхойлсон бөгөөд ихэнх тохиолдолд (78%) ижил утгатай (NS) өөрчлөлт гарсан (Нэмэлт Хүснэгт 2). MTBC геномын өмнөх ажил нь HGT-ийн таамагласан бүс нь бусад геномтой харьцуулахад илүү өндөр NS SNP харьцаатай болохыг харуулсан. Хэрэв эдгээр рекомбинацын бүсүүдийг MTBC-ийн өвөг дээдэс олж авсан гэж үзвэл тэдгээр нь эртний полиморфизмыг хэт их илэрхийлдэг гэж үзвэл амин хүчлийн өөрчлөлтөөс болж NS орлуулалт нь сөрөг сонголтоор арилдаг тул ижил утгатай өөрчлөлтүүдийн эзлэх хувь өндөр байх болно. Уургийн үйл ажиллагааг өөрчилж болно. Тиймээс бидний үр дүнгээс харахад функциональ үр дагавар нь HGT-тэй төстэй генийг орлуулахаас үүдэлтэй байж болох бөгөөд энэ нь үнэ цэнэтэй дасан зохицох генетикийн олон янз байдалд чухал ач холбогдолтой болохыг харуулж байна.
Энэхүү шинжилгээтэй зэрэгцэн 3R (ДНХ-ийн засвар, репликаци, рекомбинац) системийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг кодлодог генүүдийг өмнө нь дос Вултос болон хамтран ажиллагсад (2008)39 нийтэлсэн жагсаалтын дагуу сайтар шалгасан. ДНХ-ийн ижил хэсгүүдийн солилцоог шууд ажиглах боломжгүй, гэхдээ энэ нь өгөгдлийн багц гэх мэт хоорондоо нягт холбоотой нянгийн оролцоотой үед байнга тохиолддог процесс байж болно; Үүнээс гадна, энэ үйл явц нь ДНХ-ийн засварын аргуудын гол түлхүүр байж болох юм72, тиймээс гомолог рекомбинацад үүрэг гүйцэтгэнэ. 54 генээр тархсан нийт 26 полиморф байрлалыг тодорхойлсон (Нэмэлт хүснэгт 3). Энэхүү генийн багцад NS өөрчлөлт нь үр дагаврын 65 орчим хувийг эзэлж байгаа нь сүрьеэгийн микобактерийн омгийн талаарх өмнөх тайлантай нийцэж байна.
Шуудангийн цаг: 2021 оны 10-р сарын 21