جینوم کے وسیع تخمینے سے دوبارہ ملاپ، اتپریورتن، اور مثبت انتخاب مائکوبیکٹیریم بووس کے متنوع ڈرائیوروں کو متاثر کرتے ہیں۔

فطرت کا دورہ کرنے کے لئے آپ کا شکریہ. آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں وہ سی ایس ایس کے لیے محدود حمایت رکھتا ہے۔ بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ براؤزر کا نیا ورژن استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو بند کر دیں)۔ اسی وقت، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے بغیر سائٹس کو ڈسپلے کریں گے۔
جینوم کی ترتیب نے متعدی بیماری کی تحقیق کے میدان کو زندہ کر دیا ہے، بیماری کی وبائی امراض، روگجنن، میزبان پیتھوجین کے تعاملات، اور پیتھوجینز پر مسلط ارتقائی عمل کا انکشاف کیا ہے۔ مائکوبیکٹیریم تپ دق کمپلیکس (ایم ٹی بی سی) مائکوبیکٹیریم بووس کو اپنے جانوروں کے موافق ممبروں میں سے ایک مانتا ہے جو زمینی ممالیہ میں تپ دق (ٹی بی) کا سبب بنتا ہے، اور یہ بیکٹیریل ارتقاء کا ایک عام نمونہ ہے۔ ایم ٹی بی سی کے دیگر ارکان کی طرح، مائکوبیکٹیریم بووس کو سختی سے کلون کیا گیا، آہستہ آہستہ تیار ہونے والا پیتھوجین سمجھا جاتا ہے، اور ظاہر ہے کہ دوبارہ ملاپ یا افقی جین کی منتقلی کا کوئی نشان نہیں ہے۔ اس کام میں، ہم مویشیوں کے جینیاتی تنوع کے بارے میں بصیرت حاصل کرنے کے لیے مختلف نسلوں (یورپ اور افریقہ) کے 70 مویشی M. پر مشتمل پورے جینوم سیکوینس (WGS) ڈیٹاسیٹ پر تقابلی جینومکس کا اطلاق کرتے ہیں۔ تنظیم نو کی علامات کا اندازہ لگانے کے لیے تین مختلف طریقے استعمال کیے جاتے ہیں۔ عالمی سطح پر، بہت کم تعداد میں دوبارہ ملاپ کے واقعات کی شناخت اور ٹھوس تعاون کے ساتھ دو آزاد طریقوں سے تصدیق کی گئی ہے۔ بہر حال، اتپریورتنوں کے مقابلے میں، M. bovis (مجموعی طور پر r/m = 0.037) کے تنوع پر دوبارہ ملاپ کا کمزور اثر پڑتا ہے۔ ہمارے ڈیٹا سیٹ میں مائکوبیکٹیریم بووس کے کلونل کمپلیکس میں حاصل کردہ r/m اوسط کا فرق اس عمومی تصور سے مطابقت رکھتا ہے کہ ایک ہی ٹیکونومک پرجاتیوں کو تفویض کردہ نسبوں کے درمیان دوبارہ ملاپ کی ڈگری بہت زیادہ مختلف ہو سکتی ہے۔ اس کام کی بنیاد پر، مائکوبیکٹیریم بووس میں دوبارہ ملاپ کو مسترد نہیں کیا جا سکتا، اس لیے یہ مستقبل کی تقابلی جینومکس تحقیق میں مزید کوششوں کا موضوع ہونا چاہیے، جس میں دنیا بھر کے مختلف وبائی حالات سے بڑے ڈیٹا سیٹس کا WGS اہم ہے۔ اس کے بعد چھوٹے مائکوبیکٹیریم بووس ڈیٹا سیٹ (n = 42) پر کثیر میزبان ٹی بی کے پھیلاؤ سے ایک اضافی تجزیہ کیا گیا، اور 1,800 سے زیادہ لوکی کی نشاندہی کی گئی، جن میں سے کم از کم ایک تناؤ نے ایک واحد نیوکلیوٹائڈ پولیمورفزم (SNP) دکھایا۔ زیادہ تر (87.1%) کوڈنگ کے علاقے میں واقع ہیں، اور مترادف تبدیلیوں کی غیر مترادف تبدیلیوں (dN/dS) کا عالمی تناسب 1.5 سے زیادہ ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ مثبت انتخاب ایک اہم ارتقائی قوت ہے جو M. bovis پر استعمال کی گئی ہے۔ SNPs کا ایک اعلی تناسب "لپڈ میٹابولزم"، "خلیہ کی دیوار اور سیلولر عمل"، اور "انٹرمیڈیٹ میٹابولزم اور تنفس" کے فنکشنل زمروں سے مالا مال جینوں میں پایا گیا، جو مائکوبیکٹیریم بووس کی اہمیت کی حیاتیات اور ارتقا میں ان کی صلاحیت کو ظاہر کرتا ہے۔ MTBC کے آباؤ اجداد میں جینز پر گہری نظر جو افقی جین کی منتقلی کا شکار ہیں اور 3R (DNA مرمت، نقل، اور دوبارہ ملاپ) کے نظام میں شامل ہیں، Taijima کے D نیوٹرل ٹیسٹ کی عالمی اوسط منفی قدر کو ظاہر کرتی ہے، جو ماضی کی سلیکٹیو اسکیننگ کی نشاندہی کرتی ہے، آبادی میں توسیع کے بعد حالیہ رکاوٹ اب بھی بنیادی ارتقاء کے لیے بنیادی حقیقت ہے۔ پیتھوجین مائکوبیکٹیریم بووس میزبان سے لڑنے کے لیے۔
مائکوبیکٹیریم تپ دق کمپلیکس (MTBC) بیکٹیریل پیتھوجینز کے سب سے کامیاب ٹیکا میں سے ایک ہے اور بیکٹیریل ارتقاء کا ایک عام معاملہ ہے۔ اس کے ارکان جینومک سطح (> 99%)1,2 پر حیرت انگیز طور پر اعلیٰ نیوکلیوٹائیڈ شناخت ظاہر کرتے ہیں۔ مختلف MTBC ایکوٹائپس تپ دق (TB) کا سبب بن سکتی ہیں، جو کہ ایک متعدی گرینولومیٹس بیماری ہے، مائیکرو ممالیہ سے لے کر انسانوں تک میزبان پرجاتیوں کی ایک وسیع رینج میں 3,4,5۔ فی الحال، کمپلیکس میں انسان شامل ہیں [M. تپ دق (Mtb)، Mycobacterium africanum] اور جانوروں کے موافق پیتھوجینز (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysterium, surycobacterium, مائکوبیکٹیریم مائیکرو ٹوبیکٹر اور "ڈیسی") 5,6۔ M. canettii (جسے "Nodobacter glabrata" بھی کہا جاتا ہے) مذکورہ مائکوبیکٹیریا کے ساتھ اوسطا نیوکلیوٹائڈ کی شناخت 98% ہے، اور تقابلی جینومکس کے کام سے معلوم ہوا ہے کہ M. canettii اور باقی MTBC حال ہی میں مشترکہ آباؤ اجداد سے ہٹ گئے ہیں۔
ایم ٹی بی سی کو منظم طور پر ایک سخت کلونل کمپلیکس کے طور پر بیان کیا گیا ہے، اور اس کی آبادی کا ڈھانچہ واضح طور پر کم تنوع، رکاوٹوں، سلیکٹیو اسکیننگ، اور جینیاتی بڑھے 9,10 کے زیر انتظام ہے۔ پیچیدہ سخت کلونل ارتقاء کو فرض کرتے ہوئے، جیسے لاپتہ پولیمورفزم کو دوبارہ ملاپ کے ذریعے بحال نہیں کیا جا سکتا۔ اس بنیاد کی بنیاد پر، ڈیفرینشل ریجن (RD) اور TbD1 (Mtb مخصوص ڈیلیٹیشن 1 ریجن) کے جینومک ڈیلیٹیشن کے لگاتار واقعات کو MTBC ارتقاء2,5,11 کے مالیکیولر مارکر کے طور پر تجویز کیا گیا ہے۔ تقابلی جینومکس اور پورے جینوم کی ترتیب (WGS) کا کام نو نسبوں (مائکوبیکٹیریم تپ دق L1 سے L4، L7، اور L8؛ اور مائکوبیکٹیریم افریکانم L5، L6، اور L9)، نسب L2 سے L4، Tb112 مشترکہ خطہ، Tb113، D113، مائکوبیکٹیریم افریکانم L5 میں تقسیم کرنے میں معاون ہے۔ اس کے علاوہ، جانوروں سے موافقت پذیر اراکین کو ایک مشترکہ آباؤ اجداد کا اشتراک کرنے کی تجویز دی گئی ہے، جس کی تعریف RD7، RD8، RD9 اور RD102، 5، اور 14 میں کلیڈ سے متعلق مخصوص حذف کے ذریعے کی گئی ہے۔
افقی جین کی منتقلی (HGT) اور دوبارہ ملاپ کے واقعات کو نایاب سمجھا جاتا ہے اور یہ MTBC کے آباؤ اجداد میں رونما ہوتے ہیں، بجائے اس کے کہ پورے MTBC ممبران کی مختلف تاریخوں میں 15,16,17۔ Hughes and collaborators (2002) اور Gutacker and collaborators (2006) کی دو ابتدائی رپورٹوں نے تجویز کیا کہ دوبارہ ملاپ کے واقعات سے پولیمورفزم کو تشکیل دینے میں مدد مل سکتی ہے جو M. تپ دق کے تناؤ میں مخصوص لوکی کو نشان زد کرتے ہیں 18,19۔ MTBC میں دوبارہ ملاپ کی واضح کمی کی وجوہات یہ ہیں: (1) مکینیکل عمل اور HGT کی صلاحیت کا نقصان؛ (2) HGT واقعات کی نایابیت؛ (3) MTBC طاق 14,17 میں دوبارہ ملاپ کے واقعات کا کوئی امکان نہیں ہے۔ حال ہی میں، MTBC سٹرین 20 اور مائکوبیکٹیریم بووس 21 پر لاگو کچھ مکمل جینوم سیکوینسنگ (WGS) مطالعات نے دوبارہ ملاپ کا ثبوت فراہم کیا ہے، جو پہلی بار یہ ظاہر کرتا ہے کہ MTBC کے تناؤ اکثر چھوٹے DNA کے ٹکڑوں کا تبادلہ کرتے ہیں، لیکن محدود نیوکلیوٹائڈ تسلسل کی تبدیلی کی وجہ سے، ان واقعات کا ابھی تک نوٹس نہیں لیا گیا ہے۔
مائکوبیکٹیریم بووس سب سے زیادہ عام طور پر مویشیوں (بنیادی طور پر مویشیوں) سے برآمد ہونے والا MTBC رکن ہے، حالانکہ اسے فری رینج اور باڑ والے جنگلی جانوروں سے بھی الگ کیا جا سکتا ہے 4,22,23,24۔ ایم بووس پانچ بڑے کلونل کمپلیکس میں تیار ہوئے [یورپی 1 (Eu1)، یورپی 2 (Eu2)، یورپی 3 (Eu3)، افریقی 1 (Af1) اور افریقہ 2 (Af2)]، اسپولیگوٹائپنگ پروفائل کے مطابق، مخصوص حذف اور واحد نیوکلیوٹائڈ پولیمورفیزم (SNPs، 229، 26 میں مخصوص) جینز یہ کلونل کمپلیکس مائکوبیکٹیریم بووس کی آبادی کی متنوع ساخت اور جغرافیائی علاقوں کے ساتھ اس کی وابستگی کو ظاہر کرتے ہیں۔ اس کے علاوہ، زیمپل اور ساتھیوں (2020) کے ذریعہ کئے گئے حالیہ WGS کام نے مائکوبیکٹیریم بووس کے SNP پر مبنی ایک فائیلوجنی ڈیزائن کی ہے، جس میں 1,900 سے زیادہ جینوم ہیں، جو اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ کم از کم چار مختلف نسب ہیں (جس کا نام Lb1 سے Lb1 سے Lb4 ہے)، وہ مکمل طور پر سابقہ ​​پیچیدہ نہیں ہیں۔ جغرافیائی مخصوصیت کی بھی تصدیق کی جا سکتی ہے۔ ان مصنفین نے phylogeny اور مالیکیولر ڈیٹنگ کا امتیازی تجزیہ کیا، لیکن recombination30 کا مطالعہ نہیں کیا۔
مختلف مالیکیولر تکنیکوں کا استعمال کرتے ہوئے پچھلے کام، جیسے اسپولیگوٹائپنگ، MIRU-VNTR (مائکوبیکٹیریل انٹرسپرسڈ ریپیٹ یونٹ متغیر ٹینڈم ریپیٹ نمبر)، اور حالیہ SNP ٹائپنگ نے M. bovis strains 31,32,33, 34,35 کے درمیان جینیاتی تنوع کی ایک خاص سطح کا انکشاف کیا۔ جینیاتی تغیرات کی تفریق بیماری کے وبائی امراض کے مطالعہ میں ایک اہم ذریعہ بن گیا ہے، جو روگجنن، وائرس اور بیماری کی منتقلی کے بارے میں گہرائی سے سمجھنے میں مددگار ہے۔ WGS طریقہ کار کا ظہور مائکوبیکٹیریم بوویس جینوم کی طرف سے مختلف میزبانوں اور وبائی امراض کے منظرناموں میں موافقت اور استقامت کے عمل میں ارتقائی محرک عوامل کو ظاہر کرنے کا امکان فراہم کرتا ہے۔
اس کام میں، ہم مختلف مائکوپلاسما بووس ڈیٹاسیٹس (n=70) پر تقابلی جینومک تجزیہ کا استعمال کرتے ہیں، بشمول مختلف کلونل کمپلیکس سے الگ تھلگ، مائکوپلاسما بووس کے ارتقائی عمل کے بارے میں بصیرت حاصل کرنے کے لیے، خاص طور پر فائیلوجنیٹک رشتوں اور بحالی کے واقعات کو حل کرنے کے لیے۔ اس تجزیے کے ضمیمہ کے طور پر، پرتگال 31,36 میں ایک اچھی خصوصیات والے کثیر میزبان تپ دق کے علاقے سے حاصل کردہ M. bovis کے ایک ذیلی ڈیٹا سیٹ (n = 42) کو غیر شناخت کا اندازہ لگانے کے لیے مزید دریافت کیا گیا، حس کے رشتہ دار تناسب (dN) سے مترادف (dS) کے طور پر توازن ادب میں ذکر کردہ مخصوص جینوموں کی شراکت، وہ MTBC آباؤ اجداد نے HGT کے ذریعے حاصل کیے 37,38 ہیں، اور انکوڈ 3R (DNA مرمت، نقل، اور recombination) سسٹم کے جین کے اجزاء 39. HGT کے ذریعے حاصل کیے گئے جینز کا انتخاب کریں کیونکہ وہ قدیم پولیمورفزم کی نمائندگی کر سکتے ہیں جس کی توقع کی جاتی ہے کہ ان میں تبدیلیاں ہو سکتی ہیں۔ 3R سسٹم میں شامل جینز کا انتخاب اس لیے کیا گیا تھا کیونکہ M. تپ دق کے تناؤ پر پچھلے کام نے ان جینز پر کام کرنے والے عمومی منفی/پاکیزگی کے انتخاب کی نشاندہی کی تھی، اور یہ ارتقاء 39 میں اہم کردار ادا کر سکتے ہیں۔ اس کام کا ایک اور مقصد تنظیم نو کے واقعات کے وجود کا اندازہ لگانا ہے۔ اس وجہ سے، اس بات پر غور کرتے ہوئے کہ پرتگال سے ہمارے ڈیٹاسیٹ میں صرف یورپی کلون کمپلیکس 2 کے جینومز ہیں اور وہ تناؤ جنہوں نے کلون کمپلیکس کو تفویض نہیں کیا ہے، ہم نے فیصلہ کیا کہ آخر کار تمام کلون کمپلیکس کا نمائندہ حاصل کرنے کے لیے عوامی طور پر دستیاب جینوم ڈیٹا کو شامل کیا جائے، اور مضبوطی اور نتائج کی وسعت کو بہتر بنایا جائے۔
پرتگالی مقامی کثیر میزبان تپ دق کے منظر سے 42 نئے ترتیب والے مائکوپلاسما بووس جینوم (تفصیلات ذیل میں)، جو پہلے وبائی امراض کے نقطہ نظر سے خصوصیت رکھتے تھے، اس کام کا مرکز ہیں۔ اس بات پر غور کرتے ہوئے کہ پرتگال کے ڈیٹا سیٹ میں صرف یورپی 2 کلون کمپلیکس کے نمائندے ہیں اور نامزد کمپلیکس کے بغیر تناؤ، عوامی طور پر دستیاب مکمل جینوم سیکوینسنگ ڈیٹا کو ڈیٹا سیٹ کو بڑھانے کے لیے شامل کیا گیا ہے جس میں M. bovis کلون کمپلیکس کے تمام نمائندے شامل ہیں۔ لہذا، اس کام میں تین مکمل جینوم کی ترتیب والے ڈیٹا کے ذرائع استعمال کیے گئے: مکمل/ڈرافٹ جینوم اسمبلی، NCBI (نیشنل سینٹر فار بائیوٹیکنالوجی انفارمیشن) میں 10 تک کے اسکافولڈز (n = 15 الگ تھلگ)؛ ایس آر اے میں ذخیرہ (دی سیکوینس ریڈ آرکائیو کی ایلومینا فاسٹق فائل) ایم بووس کلون کے پیچیدہ تنوع کی نمائندگی کرتی ہے (n = 12 الگ تھلگ)30؛ اور پرتگال سے 42 نئے ترتیب والے جینوم۔ مائکوبیکٹیریم بووس BCG (Bacille Calmette-Guerin) کو NCBI کی تلاش سے خارج کر دیا گیا تھا۔ M. bovis AF2122/97 عام طور پر ڈیٹاسیٹ میں شامل کرنے کے لیے حوالہ جینوم کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔ افریقی 1 کلوننگ کمپلیکس کے ذریعہ پیش کردہ پورے جینوم ترتیب کی عوامی عدم دستیابی کی وجہ سے، اور Af2 اور Eu1 کے نمائندہ تناؤ سے جینوم کی کم تعداد، SRA کے ذریعہ فراہم کردہ اصل ترتیب کے اعداد و شمار کو ان معاملات میں استعمال کیا گیا تھا۔ زیمپل اور اس کے ساتھیوں (2020) کے کام نے مذکورہ کلوننگ کمپلیکس سے جینوم کی شناخت کرنے میں مدد کی اور ڈیٹا سیٹ میں شامل کرنے کے لیے مائکوبیکٹیریم بووس کو منتخب کرنے میں مدد کی۔ Eu3 کے لیے، جینوم کی صرف ایک قسم بیان کی گئی ہے (Branger et al., 2020)، اس لیے ہم جس جینوم کو شامل کرتے ہیں وہ Eu3 کمپلیکس کا الگ نمائندہ ہے۔
عالمی سطح پر، اس ڈیٹا سیٹ میں 8 میزبان پرجاتیوں سے الگ تھلگ 70 مویشی M. bovis شامل ہیں، جو 1985 سے 2016 تک 12 ممالک میں تقسیم کیے گئے ہیں۔ 36 پرجاتیوں کو Eu2 کے طور پر نامزد کیا گیا ہے، 7 پرجاتیوں کو Eu1، 1 پرجاتیوں کو Eu3، 3 پرجاتیوں کو Af1، Af1 پر Af1، 49 پرجاتیوں کو 1985 سے 2016 تک تقسیم کیا گیا ہے۔ پیچیدہ (تفصیلات ذیل میں)۔ اس مطالعہ میں استعمال ہونے والے مائکوبیکٹیریم بووس کی تفصیلی معلومات (بشمول الحاق نمبر) جدول 1 اور ضمنی جدول 1 میں دکھائی گئی ہیں۔
پرتگال کے جانوروں کے تپ دق کے ہاٹ سپاٹ سے مائکوبیکٹیریم بووس کے 42 نئے ترتیب والے مکمل جینوم اور 12 سال سے زیادہ عرصے سے تقسیم کیے گئے اس مطالعے کا مرکز ہیں، کیونکہ ممکنہ جنگلی حیات اور مویشیوں کی بیماری کے نظام کی باقاعدگی سے نگرانی کی گئی ہے 31,36 (ضمنی شکل 1)۔ بعد کے طریقہ کار کے مطابق، ان تناؤ کو مویشیوں (n = 14)، سرخ ہرن (n = 16) اور جنگلی سؤر (n = 12) سے 2003 سے 2015 تک الگ تھلگ کیا گیا تھا: تجویز کردہ پروٹوکول رہنما خطوط کے مطابق جانوروں کو جمع اور ہینڈل کریں اور ٹشو کے نمونے OIE پر ہیں Löwenstein-Jensen pyruvate ٹھوس میڈیم اور مائع میڈیم۔ ثقافتوں کو 37 ° C پر انکیوبیٹ کیا جاتا ہے اور ہفتے میں ایک بار کم از کم 12 ہفتوں تک ترقی کی جانچ کی جاتی ہے۔ کالونیوں کو -80ºC پر گلیسرول کے محلول میں براہ راست ذخیرہ کیا جاتا ہے۔ مائکوبیکٹیریم سلیکٹیو میڈیم (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) میں، اصل محفوظ شدہ نمونے WGS پروگرام کے DNA حاصل کرنے کے لیے وٹرو میں ایک سنگل ان وٹرو پاسیج سے گزرے تھے۔ اس کے لیے، منجمد کلچر اسٹاک سلوشن کو 5% سوڈیم پائروویٹ اور 10% ADS (50 جی البومین، 20 جی گلوکوز، 1 لیٹر پانی میں 8.5 جی سوڈیم کلورائیڈ) کے ساتھ مڈل بروک 7H9 پر 37 ° C ریٹرین پر افزودہ کیا گیا۔ ترقی کے 4 ہفتوں کے بعد، درمیانے درجے کی تجدید کی گئی اور ثقافت کی باقاعدگی سے نگرانی کی جاتی رہی جب تک کہ ترقی کا مشاہدہ نہ کیا جائے۔ خلیوں کی کٹائی سینٹرفیوگریشن کے ذریعے کی گئی تھی، گولی کو 500 µL فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) میں دوبارہ معطل کیا گیا تھا، 30 منٹ کے لیے 99 ° C پر گرم کیا گیا تھا، سینٹرفیوج کیا گیا تھا، اور سپرنٹنٹ کو WGS تک -20 ° C پر محفوظ کیا گیا تھا۔ تمام طریقہ کار لیول 3 بائیو سیفٹی سہولیات میں انجام پاتے ہیں۔
WGS پیئر اینڈ جینوم لائبریری ہر DNA نمونے کے منفرد انڈیکس کا استعمال کرتے ہوئے تیار کی گئی ہے، اور ترتیب کے لیے Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 نمونے) اور HiSeq (2 × 150 pb) (دو الگ تھلگ) ٹیکنالوجی (یوروفنز جینومکس، جرمنی) کا استعمال کرتی ہے۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق، جینومک ڈی این اے کو ترتیب دینے کے لیے Illumina Genome Analyzer کو ڈبل اینڈڈ ماڈیول اٹیچمنٹ کے ساتھ استعمال کریں، اور لائبریری کی تعمیر کے لیے Illumina سے Nextera XT DNA Library Prep Kit کا استعمال کریں۔
SRA (n = 12) سے برآمد ہونے والے ڈیٹا کو مدنظر رکھتے ہوئے، کلون کمپلیکس کی شناخت کو متعلقہ اشاعت 30, 41, 43 کے میٹا ڈیٹا کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ مکمل جینوم پر غور کرتے وقت، ماسوائے مائکوبیکٹیریم بووس AF2122/97 اور مائکوبیکٹیریم بووس کے E36 اور ممبران کو تسلیم کیا جاتا ہے۔ کلونل کمپلیکس 25، 29 بالترتیب، یہ مائکوبیکٹیریم تپ دق H37Rv (NCBI الحاق نمبر NC_000962.3) کے مکمل جینوم جیسا ہی ہے۔ جینوم الائنمنٹ ایم اے ایف ایف ٹی (امائنو ایسڈ یا نیوکلیوٹائڈ ترتیب کے ایک سے زیادہ سیدھ پروگرام، ورژن 7.458) اور پیرامیٹر -addfragments48 کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا جاتا ہے۔ پھر، مختلف کلونل کمپلیکس کی غیر موجودگی اور/یا SNP خصوصیات کی موجودگی کو تلاش کریں۔
نئے ترتیب شدہ مائکوبیکٹیریم بوویس (n = 42) اور اسمبل شدہ جینوم ڈرافٹ (n = 3) کے اصل ریڈز vSNP پائپ لائن کے ذریعے حوالہ جینوم مائکوبیکٹیریم تپ دق H37Rv کے ساتھ کمپلیکس کو سیدھ میں لاتے ہیں اور حذف ہونے اور/یا SNP کی تلاش کی مختلف خصوصیات تھیں۔
متعلقہ کلونل کمپلیکس کو جینومک ڈیٹا تفویض کرنے کے لیے خصوصیات کی کمی اور/یا SNP اور spoligotyping پروفائلز کی موجودگی/غیر موجودگی سے معلومات اکٹھی کریں۔ چار مسودہ اسمبلیوں کے لیے، اسپولیگو ٹائپنگ پروفائل کا اندازہ نہیں لگایا جا سکتا، اس لیے وہ "کوئی پیچیدگی نہیں" گروپ میں شامل ہیں۔
اس کام کے بعد بائیو انفارمیٹکس ورک فلو ڈی نوو اسمبلی اور نقشہ سازی سے ایک حوالہ حکمت عملی تک شروع ہوتا ہے، جس کا مقصد بحالی کے واقعات اور مخصوص جینوم پولیمورفزم کو تلاش کرنا ہے۔ شکل 1 اس کے بعد کے اقدامات کا فلو چارٹ فراہم کرتا ہے۔ دوبارہ ملاپ کے تجزیے کے لیے، تمام جینوم کا استعمال انفرنسز اور متعلقہ اشارے کی مضبوطی کو بڑھانے کے لیے کیا جاتا ہے۔
جینوم اتفاق رائے کے سلسلے کی نسل میں غلطیوں کو کم کرنے کے لیے، ہم نے پہلے ڈی نوو اسمبلی حاصل کی، اور پھر بنیادی متعدد صف بندی حاصل کی۔ یونیسیکلر پائپ لائن فی الحال https://github.com/rrwick/Unicycler49 پر دستیاب ہے اور اسے 54 ترتیب والے جینومز (SRA سے 42 نئی ترتیب شدہ اور 12 فاسٹ کیو فائلیں برآمد) کی ڈی نوو اسمبلی انجام دینے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ مختصراً، شروع سے جمع ہونے سے پہلے، FastQC ورژن 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) اور ٹرمومیٹک ورژن 0.36 میں پڑھنے کے معیار کا تجزیہ کیا گیا تھا (آپشن "پڑھنے سے اڈاپٹر اور دیگر لائٹنگ کے لیے مخصوص ترتیب کو کاٹنا"، اگر پڑھے جانے والے کوالٹی کے اختتام سے کم درجے کی طرف سے کوالٹی کو کم کیا جائے تو 20" لاگو ہوتے ہیں) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. پھر، SPAdes optimiser49 کو جینوم اسمبلی کے لیے استعمال کیا گیا، اور Pilon ورژن 1.1851 کو اسمبلی کے بعد کی اصلاح کے لیے استعمال کیا گیا۔ غلط اسمبلی سے بچنے کے لیے ایک قدامت پسند برجنگ موڈ کا انتخاب کیا گیا تھا، اور k-mer سائز کو تلاش کیا گیا تھا اور پڑھنے کی لمبائی کے 20% اور 95% کے درمیان منتخب کیا گیا تھا۔ SPAdes کے رہنما خطوط پر عمل کریں اور پڑھنے کے سائز پر غور کریں، 300 bp سے چھوٹے کانٹیگز کو حذف کریں، اور 52 کا 20 پڑھنے کی گہرائی کی کوریج کٹ آف قائم کریں۔ ڈی نوو اسمبلی کی حکمت عملی میں، جینومک ریجنز جیسے کہ انتہائی دہرائے جانے والے پرولین-گلوٹامیٹ (PE) اور proline-proline glutamate (PPE) پیرالاگس کو نہیں ہٹایا گیا تھا۔
ڈی نوو اسمبلی کے معیار کا اندازہ QUAST پائپ لائن (http://quast.sourceforge.net/quast.html) کے ذریعے کیا جاتا ہے، جو کونٹیگ اور M. بووس AF2122/97 حوالہ جینوم (NCBI الحاق نمبر LT708304.1) میپنگ کی تجدید میں سہولت فراہم کرتا ہے (Taryable parameter Supple کے لیے دیکھیں)۔
vSNP پائپ لائن (https://github.com/USDA-VS/vSNP) کی مدد سے، Illumina کی ترتیب سے نئی ترتیب شدہ M. bovis کی FASTQ فائل کا موازنہ M. bovis AF2122/97 حوالہ جینوم (LT708304.1)) سے کیا جاتا ہے۔ جینوم اینالیسس ٹول کٹ (GATK) 53، 54، 55 کی بہترین پریکٹس کی سفارشات کے مطابق ری کیلیبریشن کے لیے معیاری فلٹر پیرامیٹرز یا ویرینٹ ماس اسکورز کا اطلاق ہوتا ہے۔ نتائج کو سب سے کم SAMtools ماس اسکور 150 اور AC = 2 کا استعمال کرتے ہوئے فلٹر کیا جاتا ہے۔ آلودگی کو مسترد کرنے کے لیے ریڈنگ چیک کرنے کے لیے کریکن (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) کا بھی استعمال کریں۔ ہمارے کام میں ترتیب کی حکمت عملیوں کا نقشہ بنانے کے لیے استعمال ہونے والی vSNP پائپ لائن متعین SNPs اور اہداف کی ایک سیریز کی جانچ کرتی ہے، اور مخلوط انفیکشن کے منظرناموں کو بھی خارج کرتی ہے۔ پڑھنے والے جینوم کی کوریج 99٪ سے بہتر ہے (ضمنی جدول 1)۔
نقشہ سازی کی غلطیوں اور غلط SNPs سے بچنے کے لیے، مندرجہ ذیل صورتوں میں ایک قسم کو فلٹر کریں: (1) اسے 20 سے کم ریڈنگز سے سپورٹ کیا جاتا ہے، (2) یہ 0.9 سے کم فریکوئنسی کے ساتھ پایا جاتا ہے، (3) یہ کم از کم ایک سٹرین میں ہے، لیکن کم از کم کسی اور سٹرین میں خلا موجود ہے۔ انٹیگریٹڈ جینومکس ویور (IGV) ورژن 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 کو نقشہ سازی یا صف بندی کے مسائل کے ساتھ SNPs اور پوزیشنوں کی بصری طور پر تصدیق کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ چونکہ proline-glutamate (PE) اور proline-proline glutamate (PPE) جین بہت زیادہ نقل کیے گئے ہیں اور ایک ملٹی جین فیملی کا حصہ ہیں، انہیں Illumina کی ترتیب اور غلط نقشہ سازی کے ذریعے آسانی سے غلط فہمی میں ڈال دیا جاتا ہے، اس لیے انہیں ترجیح دی جاتی ہے کہ مائکوبیکٹیریل بائیو انفارمیٹکس ورک فلو کے ذریعے ہٹائے گئے ارکان کو تپ دق کی حکمت عملی کی تصدیق کے لیے استعمال کرتے ہوئے ایس پی این پی کے پیچیدہ عمل کی تصدیق کرتے ہیں۔ لہذا، ہم نے تجزیہ سے PE/PPE جینز اور انڈیلز کو فلٹر کیا۔
Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) کے مطابق، تمام SNPs کو فنکشنل کیٹیگریز میں تقسیم کیا گیا ہے۔ SnpEff پائپ لائن (https://pcingola.github.io/SnpEff/) کا استعمال SNP کے نتائج (مترادف یا غیر مترادف تبدیلیوں) کا اندازہ لگانے کے لیے کیا جاتا ہے۔ Mycobacterium bovis AF2122/97 جینوم (LT708304.1) کا ایک نیا ڈیٹا بیس بنایا۔
بنیادی جینوم ایک سے زیادہ الائنمنٹ Parsnp v1.2 کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا، جو فی الحال https://github.com/marbl/parsnp57 پر دستیاب ہے، 69 مکمل جینوم/ڈرافٹ اسمبلیز (آپشن -c کے ساتھ) اور M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) کو بطور حوالہ استعمال کیا جاتا ہے۔ چار بنیادی متعدد صف بندی کی گئی: صرف Eu2 کلوننگ کمپلیکس کے ممبران (n = 37)، بشمول یورپی کلوننگ کمپلیکس کے تمام ممبران (n = 44)، بشمول یورپی اور افریقی کلوننگ کمپلیکس کے جنکشن پوائنٹ (n = 51)، اور اس مطالعہ میں تمام مائکوبیکٹیریم بووس کو شامل کیا گیا (n = 70)۔
Parsnp کی طرف سے تیار کردہ بنیادی الائنمنٹ کا استعمال CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 کا استعمال کرتے ہوئے RAxML کا استعمال کرتے ہوئے زیادہ سے زیادہ امکان (ML) فائیلوجنیٹک درخت کا اندازہ لگانے کے لیے کیا جاتا ہے، اور 1000 گائیڈڈ ریپلیکیشنز انجام دیتے ہیں۔
تین مختلف الگورتھم اور بائیو انفارمیٹکس ٹولز متوازی طور پر دوبارہ گنتی کے واقعات کی موجودگی کو جانچنے کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں: SplitsTree4 سافٹ ویئر، Gubbins (نیوکلیوٹائڈ سیکوینسز میں دوبارہ ملاپ کے ذریعے غیر جانبدارانہ نسب) پائپ لائن، اور RDP4 (دوبارہ ملاپ کا پتہ لگانے کا پروگرام، ورژن بیٹا 4.101) سافٹ ویئر۔
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 میں لاگو سپلٹ سڑنے کا طریقہ شماریاتی تصدیق کے لیے Phi ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے، جڑ کے بغیر فائیلوجنیٹک نیٹ ورک کا حساب لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، اور اہمیت کی حد p = 0.05 ہے۔ Parsnp کا بنیادی کثیر الائنمنٹ تجزیہ ان پٹ کے طور پر استعمال ہوتا ہے، اور نیٹ ورک کے معیار کے طور پر تقسیم ہونے والی سڑن کو محسوس کیا جاتا ہے۔
گبنز پائپ لائن v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 ڈیفالٹ پیرامیٹرز کے ساتھ مائکوبیکٹیریم بووس پر دوبارہ جمع ہونے کے اثرات کا جائزہ لینے کے ایک اور طریقے کے طور پر چلتی ہے۔ پائپ لائن میں لاگو کیا گیا الگورتھم متعلقہ کلون نسب کی تشکیل نو کرتا ہے جو ہمارے جینوم کے مکمل ڈیٹا اور ڈیٹا بیس کی تشکیل نو کرتا ہے۔ AF2122/97, LT708304.1) آپس میں ہیں؛ اور SNP کلسٹر کا پتہ لگانے کے لیے اسکین کریں جو کہ برانچ کا کوئی ری کنبینیشن ایونٹ نہیں ہے، جس کا مطلب ہے کہ SNPs جو کہ ایک سے زیادہ اسکور کو تقسیم کیا گیا ہے۔ RAxML سے ML ٹری ان پٹ فائلوں کے طور پر استعمال ہوتے ہیں۔
آخر میں، Gubbins پائپ لائن کی طرف سے تجویز کردہ تنظیم نو کے ایونٹ کی تصدیق کرنے کے لیے، RDP467 (RDP61، GENECONV62، Bootscan63، Maxchi64، Chimaera65 اور SiScan66) میں لاگو کیے گئے چھ الگورتھم پہلے سے طے شدہ ترتیبات کے تحت Parsnp کی بنیادی کثیر الائنمنٹ پر لاگو ہوتے ہیں۔ ہم نے طے کیا ہے کہ RDP4 میں لاگو کیے گئے الگورتھم میں سے کم از کم تین کو مستقل طور پر ایک اہم سگنل کا مظاہرہ کرنا چاہیے تاکہ ہر دوبارہ ملاپ کے واقعے کی تصدیق کی جا سکے۔
اس بات پر غور کرتے ہوئے کہ گبنز اور آر ڈی پی سافٹ ویئر دونوں 500 بی پی تک کی ونڈو میں بنیادی متعدد الائنمنٹس کو چیک کرکے دوبارہ ملاپ کے سگنلز تلاش کرتے ہیں، اور اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ ڈی نوو اسمبلی کے دوران PE/PPE جینز کی شمولیت سے ملنے والے دوبارہ ملاپ کے سگنلز میں کوئی رکاوٹ نہیں آئے گی، مزید تجزیہ homolinearity کی طرف سے کیا جاتا ہے۔ مکمل جینوم کا استعمال کرتے ہوئے ہم آہنگی کا نقشہ MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) کا استعمال کرتے ہوئے مقامی جینوم ٹرانسلوکیشن یا الٹ کو خارج کرنے کے لیے بنایا گیا تھا۔ اس کے علاوہ، پورے جینوم کو SyntTax ویب سرور (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) کے ذریعے امینو ایسڈ کی ترتیب پر ہم آہنگی کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔
پرتگالی کثیر میزبان تپ دق کے نظام سے حاصل کردہ جینوم ڈیٹا سیٹ کا مزید گہرائی سے تجزیہ ادب میں مذکور جینز کی پولیمورفزم کو جانچنا ہے۔ یہ جینز 37,38 ہیں اور MTBC آباؤ اجداد کے ذریعہ HGT (DNA مرمت، نقل اور دوبارہ ملاپ) نظام کے اجزاء کے ذریعے حاصل کردہ جین انکوڈنگ 3R۔ جینی تنوع اور نیوکلیوٹائڈ تنوع (π) اور تاجیما کے ڈی نیوٹرل ٹیسٹ پیرامیٹر ان پٹ کا حساب لگائیں۔
69 مائکوپلاسما بووس الگ تھلگ اور حوالہ جینوم پر مبنی زیادہ سے زیادہ امکان (ML) فائیلوجنیٹک درخت حاصل کیا گیا تھا (شکل 2A)۔ سنگل جین پر مبنی درختوں یا ملٹی لوکس پر مبنی درختوں کے مقابلے میں، یہ حکمت عملی زیادہ طاقتور درختوں کی نسل کی اجازت دیتی ہے جو پورے جینوم کے تغیر کو نہیں پکڑتے اور اس لیے 68,69 پرجاتیوں کے درمیان امتیاز کرنے کی کم صلاحیت کا مظاہرہ کرتے ہیں۔ ML درخت کا ٹاپولوجیکل ڈھانچہ عام طور پر کلون کی پیچیدہ درجہ بندی کے مطابق ہوتا ہے۔ Eu2 کا جینوم ایک شاخ میں کلسٹرڈ ہے، اور Af1 کا جینوم بھی ایک ساتھ کلسٹرڈ ہے (شکل 2A)۔ نتیجہ Mycobacterium bovis کے معلوم ارتقائی تعلق سے بھی مطابقت رکھتا ہے، یعنی Eu1 ممبر اور دیگر تمام کلونل کمپلیکس اور جینوم پر مشتمل گروپ کے درمیان بڑا فرق ہے، لیکن کلونل کمپلیکس 30 کی وضاحت نہیں کی گئی ہے۔ کلونل کمپلیکس اور فائیلوجنیٹک درخت پر مشاہدہ کیے جانے والے تعلق کے درمیان چھوٹی سی عدم مطابقت کی وضاحت اس حقیقت سے کی جا سکتی ہے کہ کلونل کمپلیکس مخصوص جینومک خطوں کی بنیاد پر بیان کیا گیا ہے، جبکہ فائیلوجنیٹک درخت بنیادی جینوم کی متعدد سیدھوں پر مبنی ہے جو پورے جینوم کی نمائندگی کرتا ہے۔
زیادہ سے زیادہ امکان فائیلوجینیٹک ٹری (GTR) کی تعمیر مائکوبیکٹیریم بووس جینوم کے بنیادی جینوم کی سیدھ کی بنیاد پر کی جاتی ہے (A) سے پہلے اور (B) دوبارہ جمع کرنے کی جگہ کو ہٹانے کے بعد۔ شاخوں کے رنگ مائکوبیکٹیریم بووس کلون کمپلیکس کی نمائندگی کرتے ہیں: یورپ 1 جامنی ہے، یورپ 2 سرخ ہے، یورپ 3 نیلا ہے، افریقہ 1 نارنجی ہے، اور افریقہ 2 سبز ہے۔ درخت جڑوں سے جڑا ہوا ہے اور پیمانے پر کھینچا گیا ہے، اور شاخ کی لمبائی ہر سائٹ کے متبادل کے طور پر ماپا جاتا ہے۔
مائکوبیکٹیریم تپ دق کمپلیکس کو کلونلی طور پر تیار کیا گیا ہے، اور کئی سالوں میں جمع ہونے والے زیادہ تر شواہد اس خیال کی تائید کرتے ہیں کہ جاری HGT اور دوبارہ ملاپ کے واقعات MTBC15,17,18 کی قابل شناخت سطح پر رونما نہیں ہوں گے۔
پچھلے کام سے یہ ظاہر ہوا ہے کہ MTBC تناؤ 20,21 کے درمیان محدود دوبارہ ملاپ ہو سکتا ہے، جبکہ دیگر پیمائش کے قابل دوبارہ ملاپ کے واقعات 70,71 کی شناخت کرنے میں ناکام رہے ہیں۔ مائکوبیکٹیریم بووس پر توجہ مرکوز کرتے ہوئے اس مسئلے پر دوبارہ بحث کریں، جو پچھلے کام سے مختلف ہے جس میں صرف مائکوبیکٹیریم تپ دق کو 70,71 سمجھا جاتا ہے۔ یا مجموعی طور پر MTBC پر غور کریں، تقریباً کوئی M. bovis 20 کی نمائندگی نہیں کرتا ہے۔ یا صرف مویشیوں کے محدود حصوں پر غور کریں۔ مائکوبیکٹیریا ڈیٹاسیٹ، اس کام میں، کل 70 تناؤ ہیں، جو تمام کلونل کمپلیکسز کی نمائندگی کرتے ہیں، جو دوبارہ ملاپ کے لیے اسکرین کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ ڈیٹا سیٹ کو چار مجموعی سطحوں کے مطابق پیمانہ کیا جاتا ہے: (1) Eu2 ممبران، (2) تمام یورپی کلون کمپلیکس ممبران (یعنی یورپ)، (3) یورپی اور افریقی کلون کمپلیکس (Eu + Af) اور (4) پورے ڈیٹا کے مجموعے (بشمول جینوم جو پہلے سے بیان کیے گئے کلوننگ کمپلیکس میں شامل نہیں ہیں)۔
اس مفروضے کا مزید مطالعہ کرنے کے لیے، جینوموں کے درمیان دوبارہ ملاپ کے واقعات کی عدم موجودگی کا اندازہ لگانے کے لیے ایک تقسیم سڑن والے نیٹ ورک کو انجام دیا گیا، کیونکہ یہ طریقہ افراد کے درمیان آبائی تعلق کا تصور کر سکتا ہے اور متضاد فائیلوجنیٹک سگنلز کو ظاہر کر سکتا ہے۔ تجزیہ میں موجود چاروں ڈیٹا سیٹس نے نیٹ ورک میں لوپس کے وجود کی تصدیق کی ہے (یعنی وہ علاقے جو ایک درخت میں تبدیل نہیں ہوتے ہیں)، لیکن Phi ٹیسٹ میں کوئی شماریاتی معاونت نہیں ہے (Eu2, p = 0.0956; Europe, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774؛ Eu + Af p = 0.2774؛ جو کہ پورا ڈیٹا فراہم کرتا ہے ناقص ڈیٹا = 455 کے لیے موجود ہے)۔ تنظیم نو کے واقعات کی (شکل 3A-D)۔
یورپ میں 2 جینوم (n = 37) (A)، یورپی جینوم (n = 44) (B)، یورپی اور افریقی جینوم (n = 51) (C) اور پورا ڈیٹا سیٹ (n = 70) (D)۔
اس تجزیے کے بعد، اور تمام نیٹ ورکس میں چکراتی مشاہدات کو مدنظر رکھتے ہوئے، گبنز پائپ لائن میں لاگو کیا گیا تعمیر نو کا الگورتھم کلونل نسب کی تعمیر نو اور M. بووس جینوم پر دوبارہ ملاپ کے اثر کے تخمینے کو پورا کرنے کے لیے لاگو کیا گیا۔ دوبارہ ملاپ کے واقعات کی مجموعی تعداد کا اندازہ لگائیں، جن میں سے زیادہ تر ٹرمینل برانچوں میں (یعنی ایک جینوم میں) ہوا (ٹیبل 2)۔ یہ اشارے پورے ڈیٹا سیٹ کی مستقل مزاجی کو ظاہر کرتے ہیں اور یہ بتاتے ہیں کہ دوبارہ ملاپ کے واقعات کی تعدد اتپریورتنوں سے 200 سے 300 گنا زیادہ ہے۔ ایک بار برانچ پر ری کنبینیشن اور پوائنٹ میوٹیشن کی نسبتہ شرحوں کی نمائندگی کرنے والا rho/theta پیرامیٹر 0.0037 اور 0.0056 (ٹیبل 3) کے درمیان ظاہر ہوتا ہے۔ حال ہی میں، 38 M. bovis سٹرین کے شائع شدہ کام نے اس ڈیٹاسیٹ میں حاصل کردہ سے زیادہ rho/theta قدر (rho/theta = 0.1) کا مظاہرہ کیا، لیکن Patané اور ساتھیوں کے کام نے recombination پیرامیٹرز کا اندازہ لگانے کے لیے حوالہ پر مبنی اسمبلی کا استعمال کیا، ایک طریقہ کار کی تفصیل، جو کہ اسمبلی کے طریقہ کار کے ساتھ منسلک ہونے کی وجہ سے ہے ٹرمینل شاخ.
اس کے بعد، r/m پیرامیٹر دوبارہ ملاپ اور اتپریورتن کے تعارف کے تنوع کے تناسب کی نمائندگی کرتا ہے، اور اس کی اوسط قدر 0.025 اور 0.037 کے درمیان ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ اتپریورتنوں کے مقابلے میں، بحالی کا مجموعی طور پر M. bovis کے جینیاتی تنوع پر کم اثر پڑتا ہے (ٹیبل 3)۔ وسیع موازنہ کے لیے، 23 جینومز پر مشتمل MTBC ڈیٹاسیٹ کے لیے r/m پیرامیٹر کا تخمینہ لگانے کے لیے اسی طرح کا طریقہ استعمال کیا گیا، جس کی اوسط قدر 0.48620 ہے، جب کہ Patané اور ساتھیوں کے 38 M. bovis ڈیٹاسیٹ کے لیے، اس نے ثابت کیا کہ اوسط قدر 0.98 ہے۔ پہلی تحقیق میں، M. bovis (M. bovis BCG اور reference strain) کے کام میں شامل 23 جینوموں میں سے صرف دو، اس لیے حاصل کردہ قدر M. تپ دق کے جینوم کے زیادہ اظہار کی وجہ سے متعصب ہو سکتی ہے۔ دوسری رپورٹ میں، تجزیہ کردہ مائکوبیکٹیریم بووس کی آبادی بنیادی طور پر ریاستہائے متحدہ اور مویشیوں کے میزبانوں سے برآمد ہوئی تھی۔ اس کے برعکس، ہمارے ڈیٹا سیٹ میں، زیادہ جغرافیائی مقامات اور میزبان پرجاتیوں کی نمائندگی کی جاتی ہے، اور مختلف آبادی کی جینیاتی خصوصیات کے ساتھ مختلف کلونل کمپلیکس میں گروپ کیے گئے جینوم بھی استعمال کیے جاتے ہیں، اس طرح آبادی کا گہرا اور وسیع علم حاصل ہوتا ہے۔ ہمارے ڈیٹا سیٹ کے ساتھ حاصل کردہ r/m اوسط قدر کا فرق اس تصور سے مطابقت رکھتا ہے کہ ایک ہی ٹیکنومک پرجاتیوں کو تفویض کردہ نسبوں کے درمیان دوبارہ ملاپ کی ڈگری بہت زیادہ مختلف ہوتی ہے، لہذا یہ نتائج بتاتے ہیں کہ M. bovis کلون کمپلیکس دوبارہ ملاپ کے فرق کو ظاہر کر سکتا ہے اثر بھی وہی ہے جیسا کہ Didelot & Maiden72 نے تجویز کیا ہے۔ بہر حال، M. bovis جینوم کی ایک بڑی تعداد کو شامل کرکے اس ڈیٹا سیٹ کو نمایاں طور پر پھیلانا اس نکتے کی مزید وضاحت کی اجازت دے گا۔ r/m اور rho/theta دونوں پیرامیٹرز شاخوں کے درمیان تغیر کو ظاہر کرتے ہیں، اور یہ نتیجہ دیگر بیکٹیریل انواع 72,73 کی رپورٹوں سے مطابقت رکھتا ہے۔
آخر میں، گبنز پائپ لائن کے ذریعے شناخت شدہ تنظیم نو کے واقعات کی تصدیق کرنے کے لیے، RDP4 سافٹ ویئر میں چھ مختلف الگورتھم استعمال کیے گئے تاکہ مختلف بنیادی کثیر موازنہ کو آزادانہ طور پر جانچ سکیں۔ عالمی سطح پر، گبنز کے ذریعے شناخت کیے گئے واقعات میں سے نصف سے بھی کم کی تصدیق RDP4 (ٹیبلز 4 اور 5) سے ہوئی۔ پورے ڈیٹا سیٹ پر غور کرتے ہوئے، تین دوبارہ ملاپ کے واقعات کی تصدیق کی گئی، دو میں اندرونی نوڈس شامل ہیں اور دوسرے میں ایک ٹرمینل برانچ میں ایک جینوم شامل ہے، جس کے لیے کلونل کمپلیکس تفویض نہیں کیے جا سکے (ٹیبلز 4 اور 5)۔ ٹرمینل شاخوں میں واقعات کی شناخت اس بات کی نشاندہی کر سکتی ہے کہ ہم عصر ایم بووس سٹرین میں دوبارہ ملاپ ابھی بھی جاری ہے یا نتیجہ غلط ہے70۔ اس فرضی دوبارہ ملاپ والے خطے میں، تقریباً 20% پوزیشنوں میں غیر متعینہ نیوکلیوٹائڈس (N) ہیں، اس طرح دوبارہ ملاپ کے سگنل کو متاثر کرتے ہیں (ضمنی شکل 2)۔ اس کے علاوہ، یہ خطہ rrs جین کو متاثر کرتا ہے، 16S رائبوسومل RNA کو انکوڈنگ کرتا ہے جس کے انتہائی محفوظ ہونے کی امید ہے، اس لیے یہ پوٹیوٹیو ریکومبنیشن سگنل تسلسل کی غلطیوں یا غلط ترتیب کا نتیجہ ہو سکتا ہے۔ پھر Mb0003 اور Mycobacterium bovis AF2122/97 کے درمیان جینوم کی مکمل سیدھ کی گئی، اور غیر متعینہ نیوکلیوٹائڈز اور SNPs کے وجود کی تصدیق کی گئی، لہذا غلط سیدھ سے متعلق ممکنہ مسائل اس کام میں لاگو کی گئی حیاتیاتی معلومات کی وجہ سے نہیں تھے، پروگرام سیکھنے کے بعد ظاہر ہوئے۔
اندرونی نوڈس (اعداد و شمار 4 اور 5) کے دوبارہ ملاپ والے علاقوں میں کوئی خلا یا غیر متعینہ نیوکلیوٹائڈس نہیں ملے۔ ان واقعات کے بارے میں، ایک میں صرف Eu2 جینوم ہوتا ہے اور pks12 جین کو متاثر کرتا ہے، جو ممکنہ پولی کیٹائیڈ ترکیب کو انکوڈ کرتا ہے۔ جبکہ دوسرا Eu1 جینوم میں رجسٹرڈ ہے اور narX جین کو متاثر کرتا ہے جو ممکنہ نائٹریٹ ریڈکٹیس کو انکوڈ کرتا ہے (ٹیبل 4)۔ عام طور پر، دوبارہ ملاپ کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ اعدادوشمار کی مدد کے ساتھ دوبارہ ملاپ کے ٹکڑے کی ایک محدود تعداد ہے، اور تخمینہ شدہ اشارے اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ دوبارہ ملاپ کا M. bovis نسب پر کم اثر پڑتا ہے۔ بحالی سگنل کم ہونے کی توقع ہے، لیکن یہ ضروری ہے کہ حقیقی ارتقاء کے سگنل کو پس منظر کے شور سے الگ کیا جائے، جو کہ ایک مشکل کام ہے۔ حوالہ پر مبنی اسمبلی کے ذریعہ متعارف کرائے گئے شور سگنل کو کم کرنے اور مماثلت کے مسائل 70, 71، مکمل جینوم کے علاوہ باقی تمام کو شروع سے جمع کیا گیا تھا، اور QUAST پائپ لائن تجزیہ (ضمنی جدول 1) کے ذریعہ اسمبلی کے معیار کی جانچ اور یقینی بنائی گئی تھی۔ اس کے علاوہ، مجموعی سروے کی مضبوطی اور درستگی فراہم کرنے کے لیے ضمنی تجزیوں کا ایک سلسلہ منعقد کیا گیا۔ لہذا، narX اور pks12 جین کی ترتیب کے معیار کا اندازہ مائکوبیکٹیریم بووس AF2122/97 کے خلاف ریڈ میپنگ کے ذریعے کیا گیا۔ ری کمبینیشن ریجن میں تجویز کردہ SNP پوزیشن کی تصدیق طریقہ کار کے سیکشن (کم از کم 20 ریڈنگز اور 0.9 تبدیلی کی فریکوئنسی) میں بیان کردہ معیار کو لاگو کرکے کی گئی۔ narX جین کے پولیمورفزم کی مکمل تصدیق دو جینوم (Mb1792361 اور Mb7240415؛ 2.3%) اور pks12 جینوم کے جینومز: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb170, Mb16415, Mb1789 جینز تاہم، جینوم Mb2043 کے لیے، آٹھ پوزیشنوں میں سے چھ پڑھنے کی گہرائی کے معیار پر پورا نہیں اترتے ہیں کیونکہ SNP کو زیادہ سے زیادہ 17 ریڈز کی حمایت حاصل ہے، جو کہ 20 کی قائم کردہ کٹ آف ویلیو سے کم ہے۔ اس لیے، اس جینوم سائٹ پر چھ جینوم (8.6%) کے دوبارہ ملاپ کی تصدیق کی جا سکتی ہے اور (اعداد و شمار 5)۔
مائکوبیکٹیریم بوویس ڈیٹاسیٹ کے ری کمبینیشن ریجن الائنمنٹ کا تفصیلی تصور narX جین کو متاثر کرتا ہے جو ممکنہ نائٹریٹ ریڈکٹیس کو انکوڈ کرتا ہے۔ اندرونی نوڈس کے دوبارہ ملاپ والے علاقے میں کوئی خلا یا غیر متعینہ نیوکلیوٹائڈس نہیں ملے۔ یہ خاص واقعہ Eu1 جینوم میں رجسٹرڈ ہے۔ narX جین کی ترتیب کے معیار کا اندازہ مائکوبیکٹیریم بووس AF2122/97 کے ریڈز کو ترتیب دے کر کیا گیا۔ طریقہ کار کے سیکشن میں بیان کردہ معیارات (کم از کم 20 ریڈنگز اور 0.9 تبدیلی کی فریکوئنسی) کو لاگو کر کے دوبارہ ملاپ کے علاقے میں تجویز کردہ SNP مقام کی تصدیق کریں۔ Mb1792361 اور Mb7240415 (2.3%) کے جینوم میں narX جین کی پولیمورفزم کی مکمل تصدیق ہوگئی۔
Pks12 جین کو متاثر کرنے والے Mycoplasma bovis ڈیٹاسیٹ کی دوبارہ گنتی کے علاقے کی سیدھ کا تفصیلی تصور۔ اندرونی نوڈس کے دوبارہ ملاپ والے علاقے میں کوئی خلا یا غیر متعینہ نیوکلیوٹائڈس نہیں ملے۔ pks12 جین کو ممکنہ پولی کیٹائڈ سنتھیس کو انکوڈنگ کرنے والے واقعہ کے بارے میں، اس میں صرف Eu2 جینوم ہوتا ہے۔ pks12 کی ترتیب کے معیار کا اندازہ مائکوبیکٹیریم بووس AF2122/97 کی ریڈ میپنگ سے کیا گیا۔ طریقہ کار کے سیکشن میں بیان کردہ معیارات (کم از کم 20 ریڈنگز اور 0.9 تبدیلی کی فریکوئنسی) کو لاگو کر کے دوبارہ ملاپ کے علاقے میں تجویز کردہ SNP مقام کی تصدیق کریں۔ جینومز Mb0891، Mb1711، Mb1789، Mb1870، Mb1758، Mb2043، اور Mb1960 کی پولیمورفزم کی مکمل تصدیق ہو چکی ہے۔
پی ای اور پی پی ای جینز میں دہرائے جانے والے خطے ہوتے ہیں جنہیں ایلومینا سیکوینسنگ اور غلط نقشہ سازی کے ذریعے آسانی سے غلط پڑھا جاتا ہے، اس لیے وہ عام طور پر M. تپ دق کے اراکین کے بائیو انفارمیٹکس ورک فلو سے صرف اس وقت حذف کیے جاتے ہیں جب میپنگ ٹو سیکوینس حکمت عملی استعمال کی جاتی ہے۔ اس کام میں لاگو ہونے والے دوبارہ ملاپ کے واقعات کا تخمینہ PE/PPE کو فلٹر کیے بغیر ڈی نوو اسمبلی پر مبنی ہے۔ ہم سمجھتے ہیں کہ SplitsTree، Gubbins پائپ لائن اور RDP4 سافٹ ویئر کے ذریعے تین مختلف تکمیلی طریقوں اور الگورتھم کو لاگو کر کے، لاگو کی گئی حکمت عملی غلطی کے اشاروں کی وجہ سے دوبارہ منظم خطوں کی پروسیسنگ اور فلٹرنگ کے لیے مضبوط ہے۔ تاہم، SNP کلسٹرز کی شناخت کے لیے Gubbins اور RDP4 سافٹ ویئر پر PE/PPE جین کی مداخلت کو خارج کرنے کے لیے، اور اسی لیے narX اور pks12 جینوں کو متاثر کرنے کے لیے تجویز کردہ بحالی والے خطوں کی شناخت، ان جینوں کے پڑوس کی جانچ کی گئی (ضمیمہ تصویر 5–3)۔ M. bovis AF2122/97 میں، narX جین کو narK2 اور Mb1764c سے الگ کیا گیا ہے، جبکہ pks12 Mb2075c e Mb2073c (ضمنی شکل 3-5) سے گھرا ہوا ہے۔ مکمل جینوم کے MAUVE synline نقشے کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا نقشہ جین کی ترتیب کے تحفظ اور دوبارہ ترتیب کے بارے میں معلومات فراہم کرتا ہے، جس میں چار کولینیئر بلاکس دکھائے جاتے ہیں، اور جینوم ٹرانسلوکیشن یا الٹ جانے کی کوئی علامت نہیں ہوتی ہے۔ مزید برآں، امینو ایسڈ کی ترتیب کے ساتھ تکمیلی تجزیے نے تمام مکمل جینوم میں ہومولوجی کو ثابت کیا، اور narX یا pks12 کے ملحقہ علاقوں میں کوئی PE/PPE نہیں ملا۔ narX کے لیے، ایک جینوم (Mb0030) کا مترادف اسکور کم ہے کیونکہ narX جین کی شناخت دو ٹکڑوں (ٹکڑوں 1891 اور 1890) کے طور پر کی گئی تھی۔ pks12 کے لیے، مماثلت کی وجہ سے، Mb0030 اور Mb003 نے کم ہم آہنگی کے اسکور کی نمائش کی، جبکہ pks12 کی شناخت بالترتیب دو اور تین ٹکڑوں میں ہوئی، جو پروٹین کے مختلف ڈومینز کی نمائندگی کرتے ہیں (ضمنی شکل 3-5)۔ اس معلومات کو مدنظر رکھتے ہوئے، اور Gubbins اور RDP4 سافٹ ویئر دونوں تجزیہ کرتے ہیں، ونڈو میں زیادہ سے زیادہ 500 bp کی کور ملٹیپل الائنمنٹ کو چیک کرتے ہیں، ہم نے تصدیق کی کہ PE/PPE جین narX اور pks12 کو متاثر کرنے والے ری کنبینیشن سگنل میں مداخلت نہیں کرے گا۔
اگرچہ اس ڈیٹا سیٹ میں پائے جانے والے دوبارہ امتزاج کے سگنلز کو بقایا سمجھا جا سکتا ہے، لیکن یہ سچ ہے کہ M. bovis میں دوبارہ ملاپ کو مسترد نہیں کیا جا سکتا، اس لیے اسے مزید تجزیہ کا موضوع بننا چاہیے، جس میں مختلف وبائی منظرناموں کے پورے جینوم کو ترتیب سے ترتیب دیا گیا ہے۔
دوبارہ ملاپ کی اصلاح (شکل 2A، B) سے پہلے اور بعد میں حاصل کیے گئے ایم ایل فائیلوجنیٹک درختوں کا موازنہ کرنے سے قیاس شدہ فائیلوجنیٹک تعلقات میں اہم تبدیلیاں نہیں آئیں، اور ایم بووس کے تناؤ کو ایک ہی گروپ میں کلسٹر کیا گیا تھا۔
M. bovis AF2122/97 کے حوالہ جینوم کے ساتھ 42 نئے ترتیب والے M. bovis کی نقشہ سازی کے بعد، 1816 پولیمورفک پوزیشنوں پر مشتمل SNP سیدھ حاصل کی گئی۔ زیادہ تر SNPs (87.1%) کوڈنگ کے علاقے میں واقع ہیں، اور متاثرہ جینز بوویلسٹ (شکل 6A، B) میں دکھائے گئے فنکشنل زمروں کے مطابق نمایاں ہیں۔ ہر فنکشنل زمرے میں جینز کی کل تعداد کو مدنظر رکھتے ہوئے، "لپڈ میٹابولزم" کے زمرے میں موجود جینز نے زیادہ SNP دکھائے، جس کے بعد "خلیہ کی دیوار اور خلیے کے عمل" اور "انٹرمیڈیٹ میٹابولزم اور سانس"، یہ ظاہر کرتے ہیں کہ وہ M. bovis ارتقاء میں ہیں۔
پرتگال سے M. bovis ڈیٹاسیٹ کا درجہ بندی کا تجزیہ (n = 42)۔ ہر فنکشنل زمرہ (A) کے لیے رجسٹرڈ SNPs اور متاثرہ جینوں کی کل تعداد۔ فنکشن کیٹیگری (B) کے ذریعے رجسٹرڈ مترادف اور غیر مترادف تبدیلیوں کی کل تعداد۔
عالمی سطح پر، اوسط dN/dS تناسب 1.5 سے بہتر ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ عالمی ارتقائی دباؤ آبائی حالت سے چھٹکارا پانے کے لیے ہے اور مثبت (متنوع یا ہدایت یافتہ) اور/یا صاف صاف کرنے کے انتخاب کے منظر نامے کی نمائندگی کرتا ہے۔ "وائرولنس، سم ربائی، موافقت"، "انسرشن سیکوینسز اور فیجز"، اور "ریگولیٹری پروٹینز" کے زمرے میں، دو تہائی سے زیادہ SNPs غیر مترادف ہیں (شکل 6B)۔
تمام زمروں میں، ایک سے زیادہ SNPs کے ساتھ جین موجود ہیں، جس کے نتیجے میں اوسط تبدیلی کی شرح (یعنی اوسط SNP فی جین) 1 (شکل 6A) سے زیادہ ہے۔ 15 SNPs کے ساتھ Pks12 (Mb2074c) اور 8 SNPs کے ساتھ fas (Mb2553c) میں تبدیلی کی قدریں زیادہ ہیں۔ یہ دونوں جین فیٹی ایسڈ میٹابولزم میں شامل ہیں۔ pks جین پولی کیٹائڈ سنتھیس (PKS) کو انکوڈ کرتا ہے، جو کہ مائکوبیکٹیریل سیل وال لپڈ بائیو سنتھیس74,75 میں شامل ایک ملٹی فنکشنل انزائم ہے۔ یہ جین ایک ملٹی فنکشنل پولی پیپٹائڈ کو انکوڈ کرتا ہے جو مائکوکیٹائڈس74,76 کی ترکیب میں شامل ہے۔ فاس جین مائکولک ایسڈ کی ترکیب میں شامل ہے۔ یہ دونوں جین میزبان کے ساتھ رابطے میں خلیے کی دیوار کے بائیو سنتھیسز میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔
مائکوبیکٹیریم بووس کے ارتقاء کا مزید مطالعہ کرنے کے لیے، مخصوص جینز کے دو سیٹوں کا تجزیہ کیا گیا۔ ترتیب کی ساخت اور فائیلوجنیٹک طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے پہلے شائع شدہ کاموں نے جینوں کی نشاندہی کی جو MTBC آباؤ اجداد نے HGT کے ذریعے تنوع 37,38 سے پہلے حاصل کیے تھے۔ یہ جین ضمنی جدول 2 میں درج ہیں۔ کل 77 جینوں کی SNP تقسیم کا جو HGT سے متعلق ہو سکتا ہے تجزیہ کیا گیا، اور 26 پولیمورفک سائٹس کی نشاندہی کی گئی، جن کے نتیجے میں زیادہ تر معاملات میں (78%) غیر مترادف (NS) تبدیلیاں ہوئیں (ضمنی جدول 2)۔ MTBC جینوم پر پچھلے کام نے یہ ظاہر کیا کہ پوٹیٹیو HGT خطہ باقی جینوم کے مقابلے میں زیادہ NS SNP تناسب کی نمائش کرتا ہے۔ اگر کوئی یہ سمجھتا ہے کہ یہ ری کنبینیشن ریجنز MTBC آباؤ اجداد نے حاصل کیے تھے، اور اس وجہ سے وہ قدیم پولیمورفزم کو زیادہ پیش کرتے ہیں، تو مترادف تبدیلیوں کا تناسب زیادہ ہونے کی توقع ہے، کیونکہ NS کے متبادل کے منفی انتخاب کے ذریعے ختم ہونے کی امید کی جاتی ہے کیونکہ امینو ایسڈ کی تبدیلیوں کی وجہ سے پروٹین کا کام بدل سکتا ہے۔ لہذا، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ عملی نتائج HGT جیسے جینوں کی تبدیلی سے پیدا ہو سکتے ہیں، جو قیمتی انکولی جینیاتی تنوع کے لیے ان کی اہمیت کو ظاہر کرتا ہے۔
اس تجزیے کے متوازی طور پر، 3R (DNA مرمت، نقل، اور recombination) نظام کے اجزاء کو انکوڈ کرنے والے جینوں کی اس فہرست کے مطابق اچھی طرح سے جانچ پڑتال کی گئی جو اس سے پہلے dos Vultos اور collaborators (2008)39 کے ذریعہ شائع کی گئی تھی۔ ایک جیسے ڈی این اے کے ٹکڑوں کے تبادلے کا براہ راست مشاہدہ نہیں کیا جا سکتا، حالانکہ یہ ایک متواتر عمل ہو سکتا ہے جب قریب سے متعلقہ بیکٹیریا شامل ہوں، جیسے کہ اس ڈیٹا سیٹ کی صورت میں؛ اس کے علاوہ، یہ عمل ڈی این اے کی مرمت کے طریقوں کی کلید ہو سکتا ہے72، اس لیے ہوموولوس ری کمبینیشن میں اپنا کردار ادا کریں۔ 54 جینوں کے ذریعہ تقسیم کردہ کل 26 پولیمورفک پوزیشنوں کی نشاندہی کی گئی تھی (ضمنی جدول 3)۔ جینز کے اس مجموعے میں، NS کی تبدیلیاں تقریباً 65% نتائج کا سبب بنتی ہیں، جو کہ مائکوبیکٹیریم تپ دق کے تناؤ سے متعلق پچھلی رپورٹوں سے مطابقت رکھتی ہے۔