Spas ji bo serdana Nature. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgiriya CSS-ê bi sînor e. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn guhertoyek nûtir a gerokê bikar bînin (an jî moda lihevhatinê di Internet Explorer-ê de vemirînin). Di heman demê de, ji bo ku piştgiriya berdewam misoger bikin, em ê malperan bêyî şêwaz û JavaScript nîşan bidin.
Rêzkirina genomê qada lêkolîna nexweşiyên vegirtî vejandiye, epidemiolojiya nexweşiyê, patogeneza nexweşiyê, têkiliyên mêvandar-patojen, û pêvajoya pêşveçûnê ya li ser patojenan ferzkirî eşkere kiriye. Kompleksa Mycobacterium tuberculosis (MTBC) Mycobacterium bovis wekî yek ji endamên xwe yên adapteyî yên heywanan dibîne ku dibin sedema tuberkulozê (TB) di memikên bejayî de, û modelek tîpîk a pêşkeftina bakteriyan e. Mîna endamên din ên MTBC, Mycobacterium bovis wekî patojenek bi hişkî klonkirî, hêdî hêdî pêşve diçe tê hesibandin, û eşkere ye ku ti nîşanek ji nû ve kombînasyonê an veguhastina gena horizontal tune. Di vê xebatê de, em genomîkên berawirdî li ser komek daneya rêza tevahî ya genomê (WGS) ya ji 70 dewaran M. ji nijadên cûda (Ewropa û Afrîka) pêk tê bicîh tînin da ku têgihîştinê li ser cihêrengiya genetîkî ya dewaran M. Hêza pêşveçûnê bi dest bixin. Sê rêbazên cûda têne bikar anîn da ku nîşanên ji nû ve rêxistinkirinê texmîn bikin. Li seranserê cîhanê, hejmareke piçûk ji bûyerên ji nû ve kombînasyonê bi du rêbazên serbixwe yên bi piştgiriyek zexm hatine destnîşankirin û piştrast kirin. Lêbelê, li gorî mutasyonan, rekombînasyon bandorek qelstir li ser cûrbecûrîya M. bovis dike (bi tevahî r/m = 0.037). Cûdahiya navînî ya r/m ya ku di kompleksa klonal a Mycobacterium bovis de di koma daneyên me de hatî bidestxistin, bi têgeha giştî re lihevhatî ye ku pileya rekombînasyonê dikare di navbera rêzikên ku ji heman cureyê taksonomîk re hatine veqetandin de pir cûda bibe. Li gorî vê xebatê, rekombînasyona di Mycobacterium bovis de nayê redkirin, ji ber vê yekê divê ew bibe mijara hewildanên din di lêkolînên genomîk ên berawirdî yên pêşerojê de, ku tê de WGS-ya komên daneyên mezin ji senaryoyên epidemiolojîk ên cûda li çaraliyê cîhanê girîng e. Dûv re analîzek din li ser koma daneyên Mycobacterium bovis a piçûktir (n = 42) ji belavbûna TB-ya pir-mêvandar hate kirin, û zêdetirî 1,800 lokusî hatin nas kirin, ku ji wan herî kêm yek celeb polîmorfîzma yek nukleotîd (SNP) nîşan da. Piraniya wan (87.1%) di herêma kodkirinê de ne, û rêjeya gerdûnî ya guhertinên ne-hevwate (dN/dS) ya guhertinên hevwate ji 1.5 derbas dibe, ku nîşan dide ku hilbijartina erênî hêzek girîng a pêşveçûnê ye ku li ser M. bovis tê sepandin. Rêjeyek bilindtir a SNP-yan di genên dewlemend ên di kategoriyên fonksiyonel ên "metabolîzma lîpîd", "dîwarê şaneyê û pêvajoyên şaneyê", û "metabolîzma navîn û nefesgirtinê" de hatin tespît kirin, ku potansiyela wan di biyolojî û pêşkeftina girîngiya Mycobacterium bovis de eşkere dike. Nirxandinek ji nêz ve li genên di bav û kalên MTBC de ku meyldarê veguhastina gena horizontî ne û di pergala 3R (tamîrkirina DNA, dubarekirin û ji nû ve kombînasyon) de ne, nirxa navînî ya neyînî ya gerdûnî ya testa D-ya bêalî ya Taijima eşkere dike, ku nîşan dide ku skankirina bijartî ya berê heye. Tengbûna dawî piştî berfirehbûna nifûsê hîn jî faktora sereke ya ajotina pêşveçûnê ye ji bo patojena mecbûrî Mycobacterium bovis ku bi mêvandar re şer bike.
Kompleksa Mycobacterium tuberculosis (MTBC) yek ji taksonên herî serketî yên patojenên bakterî ye û mînakek tîpîk a pêşveçûna bakterî ye. Endamên wê di asta genomîk de nasnameya nukleotîdê ya ecêb bilind nîşan didin (> 99%)1,2. Ekotipên cûda yên MTBC dikarin bibin sedema tuberkulozê (TB), ku nexweşiyeke granulomatoz a enfeksiyonê ye, di rêzek fireh ji cureyên mêvandar de ji mîkro-memikan bigire heya mirovan3,4,5. Niha, kompleks mirovan [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] û patojenên adapteyî yên heywanan (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" û "dassie") vedihewîne 5,6. M. canettii (wekî "Nodobacter glabrata" jî tê zanîn) Nasnameya nukleotîdê ya navînî bi mîkobakteriyên ku li jor hatine behs kirin re %98 e, û xebata genomîkê ya berawirdî nîşan daye ku M. canettii û yên mayî yên MTBC vê dawiyê ji bav û kalê hevpar cuda bûne.7 Bihesibînin vê têgehê, hin nivîskar M. canettii wekî Endamê MTBC 8 bi nav dikin.
MTBC bi awayekî sîstematîk wekî kompleksek klonal a hişk tê binavkirin, û avahiya nifûsê wê bi awayekî zelal ji hêla cihêrengiya kêmkirî, tengasiyan, şopandina bijartî, û dûrketina genetîkî ve tê rêvebirin9,10. Bi texmîna ku pêşveçûna klonal a hişk a tevlihev, wekî polîmorfîzmên winda, nikare bi rekombînasyonê were sererast kirin. Li ser bingeha vê pêşgotinê, bûyerên li pey hev ên jêbirina genomîk a herêma cûda (RD) û TbD1 (herêma jêbirina taybetî ya Mtb 1) wekî nîşankerên molekulî yên pêşveçûna MTBC hatine pêşniyar kirin2,5,11. Xebata genomîk a berawirdî û rêzkirina tevahiya genomê (WGS) piştgirî dide dabeşkirina endamên adapteyî yên mirovan di nav neh rêzikan de (Mycobacterium tuberculosis L1 heta L4, L7, û L8; û Mycobacterium africanum L5, L6, û L9), rêzikên L2 heta L4 herêma TbD1 ya jêbirina hevpar2,11,12,13. Herwiha, tê pêşniyarkirin ku endamên adapteyî heywanan bav û kalek hevpar parve dikin, ku bi jêbirinên taybetî yên kladê di RD7, RD8, RD9 û RD102, 5, û 14 de tê destnîşankirin.
Veguhestina gena horizontal (HGT) û bûyerên ji nû ve kombînasyonê kêm têne hesibandin û di bav û kalên MTBC de çêdibin, ne ku dîroka cûda ya tevahiya endamê MTBC15,16,17. Du raporên destpêkê yên Hughes û hevkarên wî (2002) û Gutacker û hevkarên wî (2006) pêşniyar kirin ku bûyerên ji nû ve kombînasyonê dikarin bibin alîkar ku polîmorfîzmên ku cihên taybetî di şaneyên M. tuberculosis de nîşan didin şekil bidin18,19. Sedemên nebûna eşkere ya ji nû ve kombînasyonê di MTBC de ev in: (1) pêvajoya mekanîkî û windakirina şiyana HGT; (2) kêmbûna bûyerên HGT; (3) di nîşa MTBC de şansê bûyerên ji nû ve kombînasyonê tune ye14,17. Di demên dawî de, hin lêkolînên rêzkirina tevahî-genomê (WGS) yên ku li ser şaneya MTBC 20 û Mycobacterium bovis 21 hatine sepandin, delîlên ji nû ve kombînasyonê peyda kirine, yekem ku nîşan dide ku şaneyên MTBC pir caran perçeyên piçûk ên DNA diguhezînin, lê ji ber guherîna rêza nukleotîdê ya sînorkirî, ev bûyer hîn jî nayên dîtin.
Mycobacterium bovis endamê MTBC-yê ye ku herî zêde ji ajalan (bi piranî dewaran) tê dîtin, her çend ew dikare ji ajalên kovî yên azad û dorpêçkirî jî were veqetandin4,22,23,24. M. bovis li gorî profîla spoligotîpkirinê, jêbirinên taybetî û polîmorfîzmên nukleotîdên yekane (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 di genên taybetî de pêşketiye û bûye pênc kompleksên klonal ên sereke [Ewropî 1 (Eu1), Ewropî 2 (Eu2), Ewropî 3 (Eu3), Afrîkî 1 (Af1) û Afrîka 2 (Af2)]. Ev kompleksên klonal avahiya cihêreng a nifûsa Mycobacterium bovis û têkiliya wê bi herêmên erdnîgarî re nîşan didin. Herwiha, xebata WGS ya dawî ya ku ji hêla Zimpel û hevkarên wî ve (2020) hatiye kirin, fîlojenyeyek li ser bingeha SNP ya Mycobacterium bovis sêwirand, bi zêdetirî 1,900 genom, ku nîşan dide ku herî kêm çar rêzikên cûda hene (bi navê Lb1 heta Lb1 heta Lb4), ew bi tevahî bi kompleksa klonal a berê ve hatî destnîşankirin re lihevhatî nînin, her çend taybetmendiya erdnîgarî jî dikare were piştrast kirin30. Van nivîskaran analîzek cûda ya fîlojeny û dîroka molekulî pêk anîn, lê li ser rekombînasyonê lêkolîn nekirine30.
Xebatên berê yên bi karanîna teknîkên molekulî yên cûda, wekî spoligotîpkirin, MIRU-VNTR (hejmara dubarekirina yekîneya dubare ya guherbar a mîkobakteriyal a navberhev), û tîpkirina SNP ya dawî, di navbera şaneyên M. bovis de astek diyarkirî ya cihêrengiya genetîkî eşkere kir 31,32,33, 34,35. Cûdahiya guhertoya genetîkî di lêkolîna epidemiolojiya nexweşiyan de bûye amûrek girîng, ku ji bo têgihîştina kûr a patogenez, virulans û veguhestina nexweşiyê alîkar e. Derketina holê ya rêbaza WGS derfetê peyda dike ku faktorên ajotinê yên pêşveçûnê yên ku ji hêla genoma Mycobacterium bovis ve di pêvajoya adapteyî û domdariyê de li hember mêvandar û senaryoyên epidemiolojîk ên cûda têne ferz kirin eşkere bikin.
Di vê xebatê de, em analîza genomîk a berawirdî li ser setên daneyên cûrbecûr ên Mycoplasma bovis (n = 70) bikar tînin, di nav de îzolekirinên ji kompleksên klonal ên cûda, da ku têgihîştinê li ser pêvajoya pêşveçûnê ya Mycoplasma bovis bi dest bixin, nemaze ji bo çareserkirina têkiliyên fîlojenetîk û bûyerên rekombînasyonê. Wekî pêvekek vê analîzê, komek daneyên bin-data yên îzolekirinên M. bovis (n = 42) ku ji herêmeke baş-taybetmendiya tuberkuloza pir-mêvandar li Portekîzê hatine wergirtin 31,36 bêtir hate lêkolîn kirin da ku ne-nasname were destnîşankirin. Hevsengiya di navbera rêjeya nisbî ya guheztinên nukleotîd ên wateyî (dN) û hevwate (dS), û her weha beşdariya pêşveçûnê ya genomên taybetî yên ku di wêjeyê de hatine behs kirin, ew 37,38 ji hêla bav û kalên MTBC ve bi rêya HGT têne wergirtin, û pêkhateyên genên pergala 3R (tamîrkirina DNA, dubarekirin û rekombînasyon) kod dikin 39. Genên ku bi rêya HGT hatine wergirtin hilbijêrin ji ber ku ew dikarin polîmorfîzmên kevnar temsîl bikin, ji ber vê yekê tê hêvî kirin ku ew dikarin rêjeyek bilindtir a guhertinên hevwate hebin. Genên ku di sîstema 3R de cih digirin hatine hilbijartin ji ber ku xebatên berê yên li ser şaneyên M. tuberculosis hilbijartinên neyînî/paqijkirinê yên giştî nîşan dane ku li ser van genan dixebitin, û ew dikarin di pêşveçûnê de rolek girîng bilîzin 39. Armancek din a vê xebatê ew e ku hebûna bûyerên ji nû ve rêxistinkirinê were texmînkirin. Ji ber vê sedemê, ji ber ku daneyên me yên ji Portekîzê tenê genomên kompleksa klona Ewropî 2 û şaneyên ku kompleksa klona wan nehatiye destnîşankirin dihewîne, me biryar da ku daneyên genomê yên giştî yên berdest têxin nav xwe da ku di dawiyê de nûnerek ji hemî kompleksên klona bi dest bixin, û xurtbûn û firehiya encaman baştir bikin.
42 genomên Mycoplasma bovis ên nû rêzkirî ji dîmena tuberkuloza pir-mêvandar a endemîk a Portekîzî (hûrguliyên li jêr), ku berê ji perspektîfek epidemiolojîk ve hatine destnîşankirin36, navenda vê xebatê ne. Ji ber ku koma daneyên ji Portekîzê tenê nûnerên 2 kompleksên klon û şaneyên Ewropî bêyî kompleksên diyarkirî hene, daneyên rêzkirina tevahiya genomê yên ku ji bo raya giştî hene hatine zêdekirin da ku koma daneyên ku hemî nûnerên kompleksên klonên M. bovis vedihewîne berfireh bikin. Ji ber vê yekê, di vê xebatê de sê çavkaniyên daneyên rêzkirina tevahiya genomê hatin bikar anîn: komkirina genoma temam/reşnivîs, heta 10 scaffoldên ku di NCBI (Navenda Neteweyî ya Agahdariya Biyoteknolojiyê) de hatine hilanîn (n = 15 îzole); ku di SRA (pelê Illumina fastq ya arşîva xwendina rêzê) de hatine hilanîn, cihêrengiya tevlihev a klonên M. bovis (n = 12 îzole)30 temsîl dike; û 42 genomên nû rêzkirî ji Portekîzê. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ji lêgerîna NCBI hate derxistin. M. bovis AF2122/97 bi gelemperî wekî genoma referansê tê bikar anîn da ku di daneyan de were zêdekirin. Ji ber nebûna raya giştî ya tevahiya rêza genoma ku ji hêla kompleksa klonkirina Afrîkî 1 ve tê temsîlkirin, û jimara hindik a genomên ji şaneyên nûner ên Af2 û Eu1, daneyên rêzkirina orîjînal ên ku ji hêla SRA ve hatine peyda kirin di van rewşan de hatin bikar anîn. Xebata Zimpel û hevkarên wî (2020) alîkarî kir ku genoma ji kompleksa klonkirina jorîn were destnîşankirin û alîkarî kir ku Mycobacterium bovis ji bo tevlêkirina di daneyan de were hilbijartin. Ji bo Eu3, tenê yek celeb genoma tê vegotin (Branger et al., 2020), ji ber vê yekê genoma ku em tê de ne nûnerek cuda ya kompleksa Eu3 ye.
Li seranserê cîhanê, ev koma daneyan 70 dewarên M. bovis dihewîne ku ji 8 cureyên mêvandar hatine veqetandin, ku ji 1985 heta 2016 li 12 welatan belav bûne. 36 cure wekî Eu2, 7 cure Eu1, 1 cure Eu3, 3 cure Af1, 4 cure Af2 û 19 jî ne girêdayî ti kompleksek klonî ne (hûrgilî li jêr). Agahiyên berfireh (tevî hejmara gihîştinê) yên Mycobacterium bovis ên ku di vê lêkolînê de hatine bikar anîn di Tabloya 1 û Tabloya Pêvek 1 de têne nîşandan.
42 genomên tevahî yên Mycobacterium bovis ên nû hatine rêzkirin ji navendên germ ên tuberkuloza ajalan ên Portekîzê û ji 12 salan zêdetir hatine belavkirin, navenda vê lêkolînê ne, ji ber ku pergalên nexweşiyên potansiyel ên jiyana kovî-ajalan bi rêkûpêk hatine şopandin 31,36 (Wêneya Pêvek 1). Li gorî prosedurên paşê, ev şane ji 2003 heta 2015 ji dewaran (n = 14), geyikên sor (n = 16) û berazê kovî (n = 12) hatine veqetandin: heywanan li gorî rêbernameyên protokolê yên pêşniyarkirî berhev bikin û bi wan re mijûl bibin. Nimûneyên tevnê di Destûra Heywanên Bejayî ya OIE de ne û li ser navgîniya hişk û navgîniya şile ya pîruvatê ya Stonebrink û Löwenstein-Jensen têne derzîkirin. Kultur di 37 °C de têne înkubasyon kirin û mezinbûn heftê carekê ji bo herî kêm 12 hefteyan tê kontrol kirin. Kolonî rasterast di çareseriya glîserolê de di -80ºC de têne hilanîn. Di navgîna bijartî ya Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) de, nimûneyên arşîvkirî yên orîjînal ji bo bidestxistina DNAya bernameya WGS di rêgehek yekane ya in vitro de derbas bûn. Ji bo vê yekê, çareseriya stoka çanda cemidî bi 5% sodyûm pîruvat û 10% ADS (50 g albûmîn, 20 g glukoz, 8.5 g sodyûm klorîd di 1 L avê de) li ser Middlebrook 7H9 di 37°C Retrain de dewlemend bû. Piştî 4 hefteyan mezinbûnê, navgîn hate nûkirin û çand bi rêkûpêk hate şopandin heya ku mezinbûn hate dîtin. Hucre bi santrifujkirinê hatin berhevkirin, pelet di 500 µL salona tamponkirî ya fosfatê (PBS) de ji nû ve hate rawestandin, di 99°C de ji bo 30 hûrdeman hate germ kirin, santrifuj kirin, û supernatant heta WGS di -20°C de hate hilanîn. Hemî prosedur di tesîsên ewlehiya biyolojîk ên asta 3-an de têne kirin.
Pirtûkxaneya genoma cot-dawî ya WGS bi karanîna îndeksa bêhempa ya her nimûneya DNA-yê tê amadekirin, û ji bo rêzkirina rêzkirinê teknolojiya Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 nimûne) û HiSeq (2 × 150 pb) (du îzole) (Eurofins Genomics, Almanya) bikar tîne. Li gorî rêwerzên çêker, ji bo rêzkirina DNA-ya genomîk Illumina Genome Analyzer bi girêdana modula du-dawî bikar bînin, û ji bo avakirina pirtûkxaneyê Nextera XT DNA Library Prep Kit ji Illumina bikar bînin.
Bi berçavgirtina daneyên ji SRA (n = 12) hatine wergirtin, nasnameya kompleksa klona dikare wekî metadataya weşana têkildar 30, 41, 43 were bikar anîn. Dema ku genoma tevahî tê hesibandin, ji bilî Mycobacterium bovis AF2122/97 û Mycobacterium bovis 3601, ku bi rêzê ve endamên kompleksa klonal a Eu1 û Eu3 25, 29 têne nas kirin, ew wekî genoma tevahî ya Mycobacterium tuberculosis H37Rv (hejmara gihîştina NCBI NC_000962.3) ye. Hevrêzkirina genoma bi karanîna MAFFT (bernameya hevrêzkirina pirjimar a rêza asîda amînî an nukleotîdê, guhertoya 7.458) û parametreya -addfragments48 tê kirin. Dûv re, li nebûna kompleksên klonal ên cûda û/an hebûna taybetmendiyên SNP bigerin.
Mycobacterium bovis a nû rêzkirî (n = 42) û xwendinên orîjînal ên pêşnûmeya genoma komkirî (n = 3) kompleksê bi genoma referansê Mycobacterium tuberculosis H37Rv re bi rêya lûleya vSNP û hebûna taybetmendiyên jêbirin û/an SNP yên klonên cûda li hev dikin. Lêgerînek hate kirin.
Ji bo destnîşankirina daneyên genomîk li kompleksa klonal a têkildar, ji nebûna taybetmendiyan û/an hebûn/nebûna profîlên SNP û spoligotîpkirinê agahî berhev bikin. Ji bo çar kombûnên pêşnûmeyê, profîla spoligotîpkirinê nayê texmînkirin, ji ber vê yekê ew di koma "bê tevlihevî" de têne hesibandin.
Herikîna karê biyoenformatîkê ya ku ji hêla vê xebatê ve tê şopandin, ji komkirin û nexşekirina de novo ber bi stratejiyeke referansê ve dest pê dike, bi armanca lêkolîna bûyerên rekombînasyonê û polîmorfîzmên genomê yên taybetî. Wêne 1 nexşeyek herikînê ya gavên ku têne şopandin peyda dike. Ji bo analîza rekombînasyonê, hemî genom têne bikar anîn da ku berxwedana texmînan û nîşaneyên têkildar zêde bikin.
Ji bo kêmkirina xeletiyên di çêkirina rêzikên lihevhatina genomê de, me pêşî komkirina de novo bi dest xist, û dûv re jî hevrêzkirinên piralî yên bingehîn bi dest xistin. Xeta Unicycler niha li https://github.com/rrwick/Unicycler49 heye û ji bo pêkanîna komkirina de novo ya 54 genomên rêzkirî (42 pelên nû rêzkirî û 12 pelên fastq ên ji SRA hatine wergirtin) tê bikar anîn. Bi kurtasî, berî ku ji sifirê were komkirin, analîza kalîteya xwendinê di guhertoya 0.11.7 ya FastQC (https://github.com/s-andrews/FastQC), û guhertoya 0.36 ya Trimmomatic (vebijarka "birîna Adaptoran û rêzikên din ên taybetî yên ronahiyê ji xwendinê" û "Birîna bingehan ji dawiya xwendinê, heke ji kalîteya threshold 20 kêmtir be" têne sepandin) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50 de hate kirin. Dûv re, SPAdes optimiser49 ji bo komkirina genomê hate bikar anîn, û guhertoya 1.1851 ya Pilon ji bo çêtirkirina piştî komkirinê hate bikar anîn. Ji bo dûrketina ji komkirina xelet, moda pira muhafezekar hate hilbijartin, û mezinahiya k-mer di navbera 20% û 95% ji dirêjahiya xwendinê de hate lêgerîn û hilbijartin. Rêbernameyên SPAdes bişopînin û mezinahiya xwendinê li ber çavan bigirin, kontîgên ji 300 bp piçûktir jê bibin, û sînorek berfirehiya kûrahiya xwendinê ya 20-an a 52-an saz bikin. Di stratejiya komkirina de novo de, herêmên genomîk ên wekî paralogên prolîn-glutamate (PE) û prolîn-prolîn glutamate (PPE) yên pir dubarekirî nehatin rakirin.
Kalîteya kombûna de novo bi rêya xeta QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html) tê nirxandin, ku nûjenkirina kontig û nexşeya genoma referansê ya M. bovis AF2122/97 (hejmara gihîştina NCBI LT708304.1) hêsan dike (ji bo parametreyên kalîteyê li Tabloya Pêvek 1 binêre).
Bi alîkariya xeta vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), pelê FASTQ ya M. bovis a nû rêzkirî ji rêzkirina Illumina bi genoma referansê ya M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)) re tê berhev kirin. Li gorî pêşniyarên pratîkê yên çêtirîn ên Amûrên Analîza Genome (GATK) 53, 54, 55, parametreyên fîlterê yên standard an puanên girseya varyant ji bo ji nû ve kalibrasyonê têne bikar anîn. Encam bi karanîna xala girseya SAMtools a herî nizm a 150 û AC = 2 têne fîltrekirin. Her weha Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) bikar bînin da ku xwendinê kontrol bikin da ku kontaminasyonê ji holê rakin. Xeta vSNP ya ku ji bo nexşekirina stratejiyên rêzkirinê di xebata me de tê bikar anîn, rêzek SNP û hedefên diyarkirî vedikole, û her weha senaryoyên enfeksiyonê yên tevlihev jî derdixe. Berfirehiya genoma xwendî ji %99 çêtir e (Tabloya Pêvek 1).
Ji bo dûrketina ji şaşiyên nexşekirinê û SNP-yên xelet, di rewşên jêrîn de guhertoyek parzûn bikin: (1) ew ji hêla kêmtir ji 20 xwendinê ve tê piştgirî kirin, (2) ew bi frekansek kêmtir ji 0.9 tê dîtin, (3) ew di herî kêm yek Strain de ye, lê herî kêm di strainek din de valahî hene. Temaşevana genomîkê ya yekbûyî (IGV) guhertoya 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 ji bo verastkirina dîtbarî ya SNP û pozîsyonan bi pirsgirêkên nexşekirin an hevrêzkirinê hate bikar anîn. Ji ber ku genên prolîn-glutamate (PE) û prolîn-prolîn glutamate (PPE) pir dubare dibin û beşek ji malbatek pir-genî ne, ew bi hêsanî ji hêla rêzkirina Illumina û nexşekirina xelet ve têne fam kirin, ji ber vê yekê ew têne tercîh kirin. Herikîna xebatê ya biyoenformatîkê ya mîkobakterî endamên kompleksa tuberkulozê derxist dema ku stratejiya nexşekirinê ji bo rêzkirina ji bo piştrastkirina SNP-an bikar anîn. Ji ber vê yekê, me gen û indelên PE/PPE ji analîzê parzûn kirin.
Li gorî Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), hemû SNP li gorî kategoriyên fonksiyonel têne dabeş kirin. Lûleya SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) ji bo texmînkirina encamên SNP (guhertinên hevwate an ne-hevwate) tê bikar anîn. Databaseke nû ya genoma Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1) hate afirandin.
Hevrêzkirina piralî ya genoma bingehîn bi karanîna Parsnp v1.2, ku niha li https://github.com/marbl/parsnp57 peyda dibe, bi karanîna 69 genom/kombûnên pêşnûmeyê yên temam (bi vebijarka -c) û M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) wekî referans tê bikar anîn, hate kirin. Çar hevrêzkirinên piralî yên bingehîn hatin kirin: tenê endamên kompleksa klona Eu2 (n = 37), tevî hemî endamên kompleksa klona Ewropî (n = 44), tevî xala girêdana kompleksa klona Ewropî û Afrîkayê (n = 51), û hemî Mycobacterium bovis di vê lêkolînê de vedihewîne (n = 70).
Hevrêzkirina bingehîn a ku ji hêla Parsnp ve hatî çêkirin ji bo texmînkirina dara fîlojenetîk a îhtîmala herî zêde (ML) bi karanîna CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 bi karanîna RAxML tê bikar anîn, û 1000 dubarekirinên rêberkirî têne kirin.
Ji bo kontrolkirina hebûna bûyerên rekombînasyonê bi paralel sê algorîtma û amûrên biyoenformatîkê yên cuda têne bikar anîn: nermalava SplitsTree4, lûleya Gubbins (rêza bêalî bi rêya rekombînasyonê di rêzikên nukleotîdê de), û nermalava RDP4 (bernameya tespîtkirina rekombînasyonê, guhertoya beta 4.101).
Rêbaza dabeşkirina parçekirinê ya ku di SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 de hatiye bicîhkirin, ji bo hesabkirina tora fîlojenetîk a bêkok, bi karanîna testa Phi ji bo verastkirina îstatîstîkî, tê bikar anîn, û asta girîngiyê p = 0.05 e. Analîza pir-hevrêziya bingehîn a Parsnp wekî têketin tê bikar anîn, û dabeşkirina parçekirinê wekî standardek torê tê pêkanîn.
Gubbins borieline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) bi parametreyên xwerû wekî rêyek din ji bo nirxandina bandora rekombînasyonê li ser Mycobacterium bovis dixebite. Algorîtmaya ku di borieyê de hatî bicîh kirin rêza klona têkildar ji nû ve ava dike. Kombûna tevahî ya genom/reşnivîsa koma daneyên me û genomê referansê (bovine bovid AF2122/97, LT708304.1) bi hev re ne; û pozîsyona SNP-ê li ser her şaxek darê dişopîne da ku koma SNP-ê ya ku bûyera rekombînasyonê temsîl dike tespît bike. Sifira şaxê Bifikirin ku bûyerek rekombînasyonê tune ye, ku tê vê wateyê ku SNP-yên ku li ser şaxê çêdibin divê bi rengek wekhev werin belav kirin. Hevrêzkirina pirjimar a bingehîn ji Parsnp û dara ML-ê ya herî baş-pûankirî ji RAxML wekî pelên têketinê têne bikar anîn.
Di dawiyê de, ji bo piştrastkirina bûyera ji nû ve rêxistinkirinê ya ku ji hêla boriya Gubbins ve hatî pêşniyar kirin, şeş algorîtmayên ku di RDP467 de hatine bicîh kirin (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 û SiScan66) di bin mîhengên xwerû de li ser hevrêzkirina pirjimar a bingehîn a Parsnp têne sepandin. Me diyar kir ku herî kêm sê ji algorîtmayên ku di RDP4 de hatine bicîh kirin divê bi domdarî sînyalek girîng nîşan bidin da ku her bûyera ji nû ve kombînasyonê verast bikin.
Ji ber ku hem nermalava Gubbins û hem jî RDP bi kontrolkirina hevrêzkirinên pirjimar ên bingehîn di pencereyek heta 500 bp de li sînyalên ji nû ve kombînasyonê digerin, û piştrast dikin ku tevlêbûna genên PE/PPE di dema kombûna de novo de dê destwerdanê li sînyalên ji nû ve kombînasyonê yên hatine dîtin neke, analîza bêtir bi homolinearîteyê tê kirin. Nêzîkbûna gena ku bûyera ji nû ve kombînasyonê nas dike kontrol bikin. Nexşeya sînlîar bi karanîna genoma tevahî bi karanîna hevrêzkirina MAUVE-pir-genom (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) hate çêkirin da ku veguheztin an berevajîkirinên genoma herêmî werin derxistin. Wekî din, tevahiya genoma ji bo pêkanîna analîza homolinearîteyê li ser rêza asîda amînî bi rêya servera webê ya SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) hate bikar anîn.
Analîzek kûrtir a daneyên genomê yên ji sîstema tüberkuloza pir-mêvandar a Portekîzî hatine bidestxistin, kontrolkirina polîmorfîzma genên ku di wêjeyê de hatine behs kirin e. Ev gen 37,38 û gena ku koda 3R dike ji hêla bav û kalên MTBC ve bi rêya pêkhateyên sîstema HGT (tamîrkirina DNA, dubarekirin û rekombînasyon) 39 hatine bidestxistin. Ji bo hesabkirina cihêrengiya genan û cihêrengiya nukleotîd (π) û têketina parametreya testa D ya bêalî ya Tajima, ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) û DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) bikar bînin.
Dareke fîlojenetîk a îhtîmala herî zêde (ML) li ser bingeha 69 îzolekirin û genomên referansê yên Mycoplasma bovis hate bidestxistin (Wêne 2A). Li gorî darên yek-genî an darên pir-cihî, ev stratejî rê dide çêkirina darên bihêztir ku guherbariya tevahiya genomê nagirin û ji ber vê yekê şiyana cûdakirina di navbera cureyan de kêmtir nîşan didin 68,69. Avahiya topolojîk a dara ML bi gelemperî bi dabeşkirina tevlihev a klonan re lihevhatî ye. Genoma Eu2 di şaxekê de kom bûye, û genoma Af1 jî bi hev re kom bûye (Wêne 2A). Encam her weha bi têkiliya pêşketinî ya naskirî ya Mycobacterium bovis re lihevhatî ye, ango, ferqek mezin di navbera endamê Eu1 û koma ku ji hemî kompleks û genomên klonal ên din pêk tê de heye, lê kompleksa klonal 30 nehatiye destnîşankirin. Nakokiya piçûk a di navbera kompleksa klonal û têkiliya ku li ser dara fîlojenetîk de tê dîtin, dikare bi vê rastiyê were ravekirin ku kompleksa klonal li ser bingeha herêmên genomîk ên taybetî tê vegotin, lê dara fîlojenetîk li ser bingeha gelek hevrêziyên genomên bingehîn ên ku tevahiya genomê temsîl dikin e.
Dara fîlojenetîk a îhtîmala herî zêde (GTR) li ser bingeha hevrêziya genoma bingehîn a genoma Mycobacterium bovis berî (A) û piştî (B) rakirina cihê rekombînasyonê tê çêkirin. Rengên şaxan kompleksa klona Mycobacterium bovis temsîl dikin: Ewropa 1 binefşî ye, Ewropa 2 sor e, Ewropa 3 şîn e, Afrîka 1 porteqalî ye, û Afrîka 2 kesk e. Dar kok lê hatiye danîn û li gorî pîvanê hatiye xêzkirin, û dirêjahiya şaxê wekî şûna her cihî tê pîvandin.
Kompleksa Mycobacterium tuberculosis wekî ku bi awayekî klonî pêşketiye tê wesifandin, û piraniya delîlên ku di salan de hatine berhevkirin piştgirî didin wê ramanê ku bûyerên HGT û rekombînasyonê yên berdewam dê di asta tespîtkirinê ya MTBC15,17,18 de çênebin.
Xebatên berê nîşan dane ku dibe ku di navbera cureyên MTBC de rekombînasyonek sînordar hebe20,21, lê yên din nekarîne bûyerên rekombînasyona pîvandî destnîşan bikin70,71. Vê mijarê bi balkişandina ser Mycobacterium bovis ji nû ve nîqaş bikin, ku ji xebata berê ku tenê Mycobacterium tuberculosis dinirxand cuda ye70,71; an MTBC wekî tevahî bifikirin, hema hema bêyî M. bovis temsîl bike20; an jî tenê perçeyên dewarên sînorker bifikirin. Di vê xebatê de, di seta daneyên mîkobakteriyan de, bi tevahî 70 cure hene, ku hemî kompleksên klonal temsîl dikin, ku ji bo lêkolîna rekombînasyonê têne bikar anîn. Seta daneyan li gorî çar astên berhevkirî tê pîvandin: (1) endamên Eu2, (2) hemî endamên kompleksa klona Ewropî (ango Ewropa), (3) kompleksa klona Ewropî û Afrîkî (Eu + Af) û (4) tevahiya Berhevokên Daneyan (tevî genomên ku di nav ti kompleksên klonkirinê yên ku berê hatine vegotin de nehatine nav kirin).
Ji bo lêkolîna bêtir a vê hîpotezê, toreke dabeş-dekompozîsyonê hate pêkanîn da ku nebûna bûyerên ji nû ve kombînasyonê di navbera genomên de were nirxandin, ji ber ku ev rêbaz dikare têkiliya bav û kalan di navbera kesan de bibîne û sînyalên fîlojenetîk ên nakok nîşan bide. Her çar setên daneyan di analîzê de hebûna xelekan di torê de piştrast kirin (ango, deverên ku di nav darekê de nacivin), lê testa Phi piştgiriya statîstîkî tune (Eu2, p = 0.0956; Ewropa, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; tevahiya seta daneyan p = 0.2451), ku delîlên qels ji bo hebûna bûyerên ji nû ve rêxistinkirinê peyda dike (Wêne 3A-D).
Li Ewropayê 2 genom (n = 37) (A), genomên Ewropî (n = 44) (B), genomên Ewropî û Afrîkayê (n = 51) (C) û tevahiya seta daneyan (n = 70) (D).
Piştî vê analîzê, û bi berçavgirtina çavdêriyên çerxî yên di hemî toran de, algorîtmaya ji nû ve avakirinê ya ku di lûleya Gubbins de hatî bicîh kirin ji bo ji nû ve avakirina rêza klonal û temamkirina texmîna bandora ji nû ve kombînasyonê li ser genoma M. bovis hate sepandin. Hejmara berhevkirî ya bûyerên ji nû ve kombînasyonê texmîn bikin, ku piraniya wan di şaxên termînal de (ango, di yek genomê de) çêbûne (Tabloya 2). Ev nîşane lihevhatina tevahiya seta daneyan nîşan didin û destnîşan dikin ku pirbûna bûyerên ji nû ve kombînasyonê 200 heta 300 carî ji mutasyonan e. Carekê parametreya rho/theta ya ku rêjeyên têkildar ên ji nû ve kombînasyon û mutasyonên xalî li ser şaxê temsîl dike, di navbera 0.0037 û 0.0056 de xuya dike (Tabloya 3). Di demên dawî de, xebata weşandî ya li ser cureya 38 M. bovis nirxek rho/theta (rho/theta = 0.1) ji ya ku di vê daneyê de hatî bidestxistin bilindtir nîşan da, lê xebata Patané û hevkarên wî ji bo texmînkirina parametreyên rekombînasyonê, civandina li ser bingeha referansê bikar anîn. Hûrguliyek prosedurî, ji ber prosedurên civandinê, bi pirbûna bûyerên rekombînasyona texmînî di şaxa termînal de ve girêdayî ye.
Piştre, parametreya r/m rêjeya cihêrengiya ji nû ve kombînasyon û danasîna mutasyonê temsîl dike, û nirxa wê ya navînî di navbera 0.025 û 0.037 de ye, ku nîşan dide ku li gorî mutasyonan, ji nû ve kombînasyon bandorek giştî ya kêmtir li ser cihêrengiya genetîkî ya M. bovis dike (Tabloya 3). Ji bo berhevdana berfireh, rêbazek wekhev ji bo texmînkirina parametreya r/m ji bo daneya MTBC ya ji 23 genom pêk tê hate bikar anîn, ku nirxek navînî ya 0.48620 nîşan dide, lê ji bo daneya 38 M. bovis a Patané û hevkarên wî, wê îspat kir ku nirxa navînî 0.98 e. Di lêkolîna yekem de, tenê du ji 23 genomên ku di xebata M. bovis de cih girtine (M. bovis BCG û şaneya referansê), ji ber vê yekê nirxa ku hatî bidestxistin dibe ku ji ber zêde îfadeya genoma M. tuberculosis xelet be. Di rapora duyemîn de, nifûsa Mycobacterium bovis a analîzkirî bi piranî ji Dewletên Yekbûyî û heywanên mêvandar hatine wergirtin. Berevajî vê, di koma daneyên me de, bêtir cihên erdnîgarî û cureyên mêvandar têne temsîl kirin, û genomên ku di kompleksên klonal ên cûda de bi taybetmendiyên genetîkî yên nifûsê yên cûda kom bûne jî têne bikar anîn, bi vî rengî zanînek kûrtir û berfirehtir a nifûsê tê bidestxistin. Nirxa navînî ya cudahiya r/m ku bi koma daneyên me ve hatî bidestxistin lihevhatî ye bi têgeha ku pileya ji nû ve kombûnê di navbera rêzikên ku ji heman cureyê taksonomîk re hatine veqetandin de pir diguhere, ji ber vê yekê ev encam nîşan didin ku kompleksa klona M. bovis dibe ku cûdahiyên ji nû ve kombûnê nîşan bide. Bandor jî wekî ku ji hêla Didelot & Maiden ve hatî pêşniyar kirin e72. Lêbelê, berfirehkirina girîng a vê koma daneyan bi zêdekirina hejmareke mezintir a genomên M. bovis dê rê bide zelalkirina bêtir vê xalê. Hem parametreyên r/m û hem jî rho/theta guherbariya di navbera şaxan de nîşan didin, û ev encam lihevhatî ye bi raporên li ser cureyên din ên bakteriyan72,73.
Di dawiyê de, ji bo piştrastkirina bûyerên ji nû ve rêxistinkirinê yên ku ji hêla boriya Gubbins ve hatine destnîşankirin, şeş algorîtmayên cûda di nermalava RDP4 de hatin bikar anîn da ku bi serbixwe pir-berawirdkirinên bingehîn ên cûda biceribînin. Li seranserê cîhanê, kêmtir ji nîvê bûyerên ku ji hêla Gubbins ve hatine destnîşankirin ji hêla RDP4 ve hatine piştrast kirin (Tabloyên 4 û 5). Bi berçavgirtina tevahiya daneyan, sê bûyerên ji nû ve kombînasyonê hatin piştrast kirin, du ji wan girêkên navxweyî û ya din jî genomek yekane di şaxek termînal de vedihewîne, ku ji bo wan kompleksên klonal nehatine destnîşankirin (Tabloyên 4 û 5). Nasîna bûyerên di şaxên termînal de dibe ku nîşan bide ku ji nû ve kombînasyon hîn jî di şaneyên M. bovis ên hemdem de berdewam dike an jî encam di cîhê xwe de ye70. Di vê herêma ji nû ve kombînasyona hîpotetîk de, bi qasî 20% ji pozîsyonan nukleotîdên nediyar (N) hene, bi vî rengî bandorê li sînyala ji nû ve kombînasyonê dikin (Wêneya Pêvek 2). Herwiha, ev herêm bandorê li gena rrs dike, ku RNAya rîbozomal a 16S kod dike ku tê payîn ku pir parastî be, ji ber vê yekê ev sînyala rekombînasyona texmînî dibe ku encama xeletiyên rêzkirinê an jî nelihevhatinê be. Dûv re hevrêzkirina tevahiya genomê di navbera Mb0003 û Mycobacterium bovis AF2122/97 de hate kirin, û hebûna nukleotîd û SNP-yên nediyar hate piştrast kirin, ji ber vê yekê pirsgirêkên gengaz ên têkildarî hevrêzkirina xelet ne ji ber agahdariya biyolojîkî ya ku di vê xebatê de hatî bicîh kirin bûn. Piştî fêrbûna bernameyê xuya bû.
Di herêmên ji nû ve kombînasyonê yên girêkên navxweyî de ti valahî an jî nukleotîdên nediyar nehatin dîtin (Wêne 4 û 5). Di derbarê van bûyeran de, yek tenê genoma Eu2 dihewîne û bandorê li gena pks12 dike, ku sîntaza polîketîd a muhtemel kod dike; lê ya din di genoma Eu1 de qeydkirî ye û bandorê li gena narX dike ku kêmdana nîtratê ya muhtemel kod dike (Tabloya 4). Bi gelemperî, analîza ji nû ve kombînasyonê nîşan dide ku hejmareke sînorkirî ya perçeyên ji nû ve kombînasyonê bi piştgiriya îstatîstîkî heye, û nîşaneyên hatine texmînkirin nîşan didin ku ji nû ve kombînasyon bandorek kêm li ser rêza M. bovis dike. Tê payîn ku sînyala ji nû ve kombînasyonê kêm be, lê girîng e ku sînyala pêşveçûna rastîn ji dengê paşxaneyê were cudakirin, ku ev karekî dijwar e. Ji bo kêmkirina sînyala dengê ku ji hêla pirsgirêkên civandin û nelihevhatinê yên li ser bingeha referansê ve hatî destnîşan kirin 70, 71, hemî yên mayî ji bilî genoma tevahî ji sifirê hatin kom kirin, û kalîteya komkirinê bi analîza boriyê ya QUAST (Tabloya Pêvek 1) hate kontrol kirin û misoger kirin. Herwiha, rêze analîzên zêde hatin kirin da ku xurtbûn û rastbûna anketa giştî were misogerkirin. Ji ber vê yekê, kalîteya rêzkirina genên narX û pks12 bi nexşeya xwendinê li dijî Mycobacterium bovis AF2122/97 hate nirxandin. Cihê SNP-ya pêşniyarkirî di herêma rekombînasyonê de bi sepandina pîvanên ku di beşa rêbazê de hatine behs kirin (bi kêmî ve 20 xwendin û frekansa guhertinê 0.9) hate piştrast kirin. Polîmorfîzma gena narX di her du genomên (Mb1792361 û Mb7240415; 2.3%) û genomên genoma pks12: genên Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, û Mb12 de bi tevahî hate piştrast kirin. Lêbelê, ji bo genoma Mb2043, şeş ji heşt pozîsyonan pîvana kûrahiya xwendinê bicîh naynin ji ber ku SNP ji hêla herî zêde 17 xwendinê ve tê piştgirî kirin, ku ji nirxa qutkirina diyarkirî ya 20-an kêmtir e. Ji ber vê yekê, ji nû ve kombînasyona şeş genom (8.6%) li vê cîhê genomê dikare were piştrast kirin (Wêne 4 û 5).
Dîtbarîkirina berfireh a hevrêziya herêma rekombînasyonê ya daneya Mycobacterium bovis bandorê li gena narX dike ku gena nîtratê ya muhtemel kod dike. Di herêma rekombînasyonê ya girêkên navxweyî de ti valahî an jî nukleotîdên nediyar nehatin dîtin. Ev bûyera taybetî di genoma Eu1 de hatiye tomar kirin. Kalîteya rêzkirina gena narX bi xêzkirina xwendinên Mycobacterium bovis AF2122/97 hate nirxandin. Cihê SNP-ya pêşniyarkirî di herêma rekombînasyonê de bi sepandina pîvanên ku di beşa rêbazê de hatine behs kirin (bi kêmanî 20 xwendin û frekansa guhertinê 0.9) piştrast bikin. Polîmorfîzma gena narX di genomên Mb1792361 û Mb7240415 (2.3%) de bi tevahî hate piştrast kirin.
Dîtbarîkirina berfireh a hevrêziya herêma rekombînasyonê ya daneyên Mycoplasma bovis ku bandorê li gena pks12 dike. Di herêma rekombînasyonê ya girêkên navxweyî de ti valahî an jî nukleotîdên nediyar nehatin dîtin. Di derbarê bûyera ku bandorê li gena pks12 dike ku polîketîd sîntaza gengaz kod dike de, ew tenê genoma Eu2 dihewîne. Kalîteya rêzkirina pks12 bi nexşeya xwendinê ya Mycobacterium bovis AF2122/97 hate nirxandin. Cihê SNP-ya pêşniyarkirî di herêma rekombînasyonê de bi sepandina pîvanên ku di beşa rêbazê de hatine behs kirin (bi kêmî ve 20 xwendin û frekansa guhertinê 0.9) piştrast bikin. Polimorfîzmên genomên Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, û Mb1960 bi tevahî hatine piştrast kirin.
Genên PE û PPE herêmên dubarekirî hene ku bi hêsanî ji hêla rêzkirin û nexşekirina xelet a Illumina ve têne xwendin, ji ber vê yekê ew bi gelemperî ji herikîna xebata biyoenformatîkê ya endamên M. tuberculosis tenê dema ku stratejiya nexşe-bi-rêzikê tê bikar anîn têne jêbirin. Encama bûyerên rekombînasyonê yên ku di vê xebatê de têne sepandin li ser bingeha kombûna de novo bêyî fîlterkirina PE/PPE ye. Em bawer dikin ku bi bicîhanîna sê rêbaz û algorîtmayên temamker ên cûda bi rêya SplitsTree, lûleya Gubbins û nermalava RDP4, stratejiyên ku têne sepandin ji bo pêvajoykirin û fîlterkirina herêmên ji nû ve organîzekirî yên ku ji ber sînyalên xeletiyê çêdibin xurt in. Lêbelê, ji bo ku destwerdana gena PE/PPE li ser nermalava Gubbins û RDP4 ji bo destnîşankirina komên SNP, û ji ber vê yekê destnîşankirina herêmên rekombînasyonê yên ku têne pêşniyar kirin ku bandorê li genên narX û pks12 bikin, cîrantiya van genan hate lêkolîn kirin (Wêneya Pêvek 3-5). Di M. bovis AF2122/97 de, gena narX ji hêla narK2 û Mb1764c ve tê veqetandin, di heman demê de pks12 ji hêla Mb2075c û Mb2073c ve tê dorpêç kirin (Wêneya Pêvek 3-5). Nexşeya ku bi karanîna nexşeya sînlîn a MAUVE ya genoma tevahî hatî çêkirin agahdarî li ser parastin û ji nû ve rêzkirina rêza genê peyda dike, çar blokên hevrêz nîşan dide, û ti nîşanên veguheztin an berevajîkirina genoma nîşan nade. Wekî din, analîza temamkirinê bi rêza asîda amînî homologî di hemî genomên tevahî de îspat kir, û di herêmên cîran ên narX an pks12 de PE/PPE nehat dîtin. Ji bo narX, yek genom (Mb0030) xwedî puana hevwateyê ya nizmtir e ji ber ku gena narX wekî du perçe (perçeyên 1891 û 1890) hate nas kirin. Ji bo pks12, ji ber wekheviyan, Mb0030 û Mb003 puanên sînlînerîtiyê yên nizmtir nîşan dan, di heman demê de pks12 bi rêzê ve di du û sê perçeyan de hat nas kirin, ku deverên cûda yên proteînê temsîl dikin (Wêneya Pêvek 3-5). Bi berçavgirtina vê agahiyê, û nermalava Gubbins û RDP4 her du jî analîzê pêk tînin, hevrêziya pirjimar a bingehîn a herî zêde 500 bp di pencereyê de kontrol dikin, me piştrast kir ku gena PE/PPE dê destwerdanê neke bi sînyala rekombînasyonê ku bandorê li narX û pks12 dike.
Her çend sînyalên ji nû ve kombînasyonê yên ku di vê koma daneyan de hatine tespîtkirin dikarin wekî mayînde werin hesibandin jî, rast e ku ji nû ve kombînasyon di M. bovis de nayê redkirin, ji ber vê yekê divê ew mijara analîzek din be, ku tê de tevahiya genomên ji senaryoyên epidemiolojîk ên cûda li gorî Girîng têne rêzkirin.
Berawirdkirina darên fîlojenetîk ên ML-ê yên berî û piştî rastkirina rekombînasyonê hatine bidestxistin (Wêne 2A, B) di têkiliya fîlojenetîk a texmînkirî de guhertinên girîng çênekir, û şaneyên M. bovis di heman komê de kom bûn.
Piştî nexşekirina 42 xwendinên M. bovis ên nû rêzkirî bi genoma referansê ya M. bovis AF2122/97 re, hevrêziyek SNP-ê ku 1816 pozîsyonên polîmorfîk dihewîne hate bidestxistin. Piraniya SNP-an (87.1%) di herêma kodkirinê de ne, û genên bandorkirî li gorî kategoriyên fonksiyonel ên ku di Bovilist de têne nîşandan têne taybetmendî kirin (Wêne 6A, B). Dema ku hejmara giştî ya genan di her kategoriya fonksiyonel de tê hesibandin, genên di kategoriya "metabolîzma lîpîdan" de bêtir SNP nîşan dan, dûv re "dîwarê şaneyê û pêvajoyên şaneyê" û "metabolîzma û nefesgirtina navîn" hatin, ku eşkere kir ku ew di pêşveçûna M. bovis de ne.
Analîza hiyerarşîk a daneyên M. bovis ji Portekîzê (n = 42). Hejmara giştî ya SNP-yên qeydkirî û genên bandorkirî ji bo her kategoriya fonksiyonel (A). Hejmara giştî ya guhertinên hevwate û ne-hevwate yên ku li gorî kategoriya fonksiyonê hatine tomar kirin (B).
Li ser asta gerdûnî, rêjeya navînî ya dN/dS ji 1.5 çêtir e, ku nîşan dide ku zexta evolusyonî ya gerdûnî ji holê rakirina rewşa bav û kalan e û senaryoyek hilbijartina paqijkirinê ya erênî (cûrbecûr an arastekirî) û/an rehet temsîl dike. Di kategoriyên "vîrulens, detoksîfîkasyon, adaptasyon", "rêzikên danînê û faj", û "proteînên rêkûpêk", ji du ji sêyan zêdetir SNP ne-hevwate ne (Wêne 6B).
Di hemû kategoriyan de, genên bi gelek SNP hene, ku di encamê de rêjeya mutasyonê ya navînî (ango, SNP-ya navînî ya her genê) ji 1 mezintir e (Wêne 6A). Pks12 (Mb2074c) bi 15 SNP û fas (Mb2553c) bi 8 SNP nirxên mutasyonê yên bilindtir hene. Her du gen di metabolîzma asîdên rûn de beşdar in. Gena pks polîketîd sîntaz (PKS) kod dike, ku enzîmek pirfonksiyonel e ku di bîyosenteza lîpîdên dîwarê şaneya mîkobakteriyal de beşdar e74,75. Ev gen polîpeptîdek pirfonksiyonel kod dike ku di senteza mîkoketîdan de beşdar e74,76. Gena fas di senteza asîda mîkolîk de beşdar e. Her du gen di bîyosenteza dîwarê şaneyê de di têkiliyê de bi mêvandar re rolek girîng dilîzin.
Ji bo lêkolîna pêşveçûna Mycobacterium bovis, du setên genên taybetî hatin analîzkirin. Xebatên berê yên ku bi karanîna rêbazên pêkhatina rêzê û fîlojenetîk hatine weşandin, genên ku ji hêla bav û kalên MTBC ve berî cihêrengkirinê bi rêya HGT hatine bidestxistin destnîşan kirin37,38. Ev gen di Tabloya Pêvek 2 de hatine navnîş kirin. Belavbûna SNP ya bi tevahî 77 genên ku dibe ku bi HGT ve girêdayî bin hate analîzkirin, û 26 cihên polîmorfîk hatin destnîşankirin, ku di pir rewşan de (78%) bûn sedema guhertinên ne-hevwate (NS) (Tabloya Pêvek 2). Xebatên berê yên li ser genoma MTBC nîşan dan ku herêma HGT ya texmînkirî rêjeyek SNP ya NS ya bilindtir nîşan dide li gorî mayî ya genoma. Ger meriv bifikire ku ev herêmên ji nû ve kombînasyonê ji hêla bav û kalên MTBC ve hatine bidestxistin, û ji ber vê yekê, ew polîmorfîzmên kevnar zêde temsîl dikin, wê hingê tê payîn ku rêjeya guhertinên hevwate bilindtir be, ji ber ku tê payîn ku guheztinên NS bi hilbijartina neyînî werin rakirin ji ber ku guhertinên asîda amînî dikarin fonksiyona proteînê biguherînin. Ji ber vê yekê, encamên me nîşan didin ku encamên fonksiyonel dikarin ji guhertina genên mîna HGT derkevin, ku girîngiya wan ji bo cihêrengiya genetîkî ya adapteyî ya hêja nîşan dide.
Li gel vê analîzê, genên ku pêkhateyên sîstema 3R (tamîrkirina DNAyê, dubarekirin û ji nû ve kombînasyon) kod dikin, li gorî lîsteya ku berê ji hêla dos Vultos û hevkarên wî (2008)39 ve hatiye weşandin, bi tevahî hatine lêkolînkirin. Guhertina perçeyên DNAyê yên yeksan rasterast nayê dîtin, her çend dibe ku pêvajoyek pir caran be dema ku bakteriyên nêzîk têkildar beşdar dibin, wekî di rewşa vê koma daneyan de; ji bilî vê, ev pêvajo dibe ku mifteya rêbazên tamîrkirina DNAyê be72, ji ber vê yekê di ji nû ve kombînasyona homolog de rolek dilîze. Bi tevahî 26 pozîsyonên polîmorfîk ên ku ji hêla 54 genan ve hatine belavkirin hatine destnîşankirin (Tabloya Pêvek 3). Di vê koma genan de, guhertinên NS bi qasî 65% ji encaman pêk anîne, ku ev yek bi raporên berê yên li ser şaneyên Mycobacterium tuberculosis re lihevhatî ye.
Dema weşandinê: 21ê Cotmeha 2021an