Þakka þér fyrir að heimsækja Nature. Vafraútgáfan sem þú notar styður CSS takmarkað. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir nýrri útgáfu af vafranum (eða slökkvir á samhæfingarstillingunni í Internet Explorer). Á sama tíma, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síður án stíla og JavaScript.
Erfðamengisraðgreining hefur blásið nýju lífi í rannsóknir á smitsjúkdómum og afhjúpað faraldsfræði sjúkdóma, meingerð, samskipti hýsils og sýkla og þróunarferli sem sýklar þrýsta á. Mycobacterium tuberculosis flókið (MTBC) telur Mycobacterium bovis vera einn af aðlögunarhæfum dýrameðlimum sínum sem valda berklum (TB) í landdýrum og er dæmigerð fyrirmynd um þróun baktería. Eins og aðrir MTBC meðlimir er gert ráð fyrir að Mycobacterium bovis sé stranglega klónaður, hægt þróandi sýkill og augljóslega eru engin merki um endurröðun eða lárétta genaflutninga. Í þessari vinnu berum við samanburðarerfðafræði við heildarerfðamengisraðgreiningu (WGS) gagnasafn sem samanstendur af 70 nautgripum M. úr mismunandi ætternum (Evrópa og Afríka) til að fá innsýn í erfðafræðilegan fjölbreytileika nautgripa M. Þróunarmáttur. Þrjár mismunandi aðferðir eru notaðar til að meta merki um endurskipulagningu. Á heimsvísu hefur lítill fjöldi endurröðunaratburða verið greindur og staðfestur með tveimur óháðum aðferðum með traustum stuðningi. Engu að síður, samanborið við stökkbreytingar, hefur endurröðun veikari áhrif á fjölbreytileika M. bovis (heildar r/m = 0,037). Mismunurinn á r/m meðaltali sem fékkst í klónafléttunni Mycobacterium bovis í gagnasafni okkar er í samræmi við þá almennu hugmynd að endurröðunarstig geti verið mjög mismunandi milli ættkvísla sem eru flokkaðar til sömu flokkunartegundar. Byggt á þessari vinnu er ekki hægt að útiloka endurröðun í Mycobacterium bovis, þannig að það ætti að vera viðfangsefni frekari vinnu í framtíðar samanburðarrannsóknum á erfðafræði, þar sem heildargreining á stórum gagnasöfnum frá mismunandi faraldsfræðilegum atburðarásum um allan heim er mikilvæg. Viðbótargreining var síðan framkvæmd á minni Mycobacterium bovis gagnasafninu (n = 42) úr fjölhýsils berklatíðni og meira en 1.800 erfðavísar voru greindir, þar af sýndi að minnsta kosti einn stofn staka núkleótíðafjölbreytni (SNP). Flestir (87,1%) eru staðsettir á erfðaskráningarsvæðinu og heildarhlutfall ósamheitabreytinga (dN/dS) samheitabreytinga er meira en 1,5, sem bendir til þess að jákvætt val sé mikilvægur þróunarkraftur sem hefur áhrif á M. bovis. Hærra hlutfall SNP-próteina greindist í genum sem eru rík af virkniflokkum eins og „fituefnaskipti“, „frumuvegg og frumuferli“ og „milliefnaskipti og öndun“, sem sýnir möguleika þeirra í líffræði og þróun mikilvægis Mycobacterium bovis. Nánari skoðun á genin í forfeðrum MTBC sem eru viðkvæm fyrir láréttri genaflutningi og eru hluti af 3R kerfinu (DNA viðgerð, afritun og endurröðun) leiðir í ljós meðaltal neikvæðs gildis á heimsvísu fyrir D hlutlausa prófið í Taijima, sem bendir til fyrri sértækrar skönnunar. Nýlegur flöskuháls eftir stofnfjölgun er enn helsti þróunarþátturinn sem knýr skyldubundna sýkla Mycobacterium bovis til að berjast gegn hýslinum.
Mycobacterium tuberculosis flókið (MTBC) er ein farsælasta flokkun bakteríusýkla og dæmigert dæmi um þróun baktería. Meðlimir þess sýna ótrúlega mikla núkleótíðasamkennd á erfðamengisstigi (> 99%)1,2. Mismunandi vistgerðir MTBC geta valdið berklum (TB), sem er smitandi kyrningasjúkdómur, í fjölbreyttum hýsiltegundum, allt frá örspendýrum til manna3,4,5. Eins og er nær flókið yfir menn [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] og sýkla sem aðlagast dýrum (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" og "dassie")5,6. M. canettii (einnig þekkt sem „Nodobacter glabrata“) Meðal núkleótíðasamsvörun við áðurnefndar mýkóbakteríur er 98% og samanburðarrannsóknir á erfðamengjum hafa sýnt að M. canettii og restin af MTBC hafa nýlega aðskilið sig frá sameiginlegum forföður sínum.7 Miðað við þetta hugtak kalla sumir höfundar M. canettii meðlim MTBC 8.
MTBC er kerfisbundið lýst sem strangt klónað flókið og stofnbygging þess er greinilega stjórnuð af minnkaðri fjölbreytni, flöskuhálsum, sértækri skönnun og erfðafræðilegu reki9,10. Að því gefnu að flókin ströng klónað þróun, svo sem vantar fjölbrigði, sé ekki hægt að endurheimta með endurröðun. Byggt á þessari forsendu hafa samfelldir atburðir erfðaeyðingar mismunandi svæðisins (RD) og TbD1 (Mtb sértækt eyðingarsvæði 1) verið lagðir til sem sameindamerki fyrir þróun MTBC2,5,11. Samanburðarrannsóknir á erfðamengisgreiningu og heildarerfðamengisraðgreiningu (WGS) styðja skiptingu meðlima sem aðlagaðar eru að mönnum í níu ættkvíslir (Mycobacterium tuberculosis L1 til L4, L7 og L8; og Mycobacterium africanum L5, L6 og L9), ættkvíslir L2 til L4 deildu eyðingu TbD1 svæðis2,11,12,13. Að auki er talið að meðlimir sem hafa aðlagað sig að dýrum deili sameiginlegan forföður, sem er skilgreindur með klaða-sértækum eyðingum í RD7, RD8, RD9 og RD102, 5 og 14.
Lárétt erfðaflutningur (HGT) og endurröðunaratburðir eru taldir sjaldgæfir og eiga sér stað hjá forfeðrum MTBC, frekar en vegna mismunandi sögu alls MTBC meðlimsins15,16,17. Tvær fyrri skýrslur eftir Hughes og samstarfsmenn (2002) og Gutacker og samstarfsmenn (2006) bentu til þess að endurröðunaratburðir gætu hjálpað til við að móta fjölbreytileika sem marka ákveðin erfðamengi í M. tuberculosis stofnum18,19. Ástæður augljóss skorts á endurröðun í MTBC eru: (1) vélrænt ferli og tap á getu HGT; (2) sjaldgæfni HGT atburða; (3) engin hætta er á endurröðunaratburðum í MTBC sessinum14,17. Nýlega hafa nokkrar rannsóknir á heildarerfðamengisraðgreiningu (WGS) sem notaðar voru á MTBC stofn 20 og Mycobacterium bovis 21 gefið vísbendingar um endurröðun, þær fyrstu sem sýna að MTBC stofnar skiptast oft á litlum DNA brotum, en vegna takmarkaðrar breytileika í núkleótíðaröð eru þessir atburðir enn ekki teknir eftir.
Mycobacterium bovis er algengasta MTBC meðlimurinn sem finnst úr búfé (aðallega nautgripum), þó að hann sé einnig einangraður úr frjálsum göngum og girtum villidýrum4,22,23,24. M. bovis þróaðist í fimm helstu klónasamstæður [Evrópsk 1 (Eu1), Evrópsk 2 (Eu2), Evrópsk 3 (Eu3), Afrísk 1 (Af1) og Afríka 2 (Af2)], samkvæmt spoligotyping sniðinu, sértækum eyðingum og einstökum núkleótíðafjölbreytni (SNPs)25, 26, 27, 28, 29 í tilteknum genum. Þessir klónasamstæður sýna fram á fjölbreytta uppbyggingu Mycobacterium bovis stofnsins og tengsl hans við landfræðileg svæði. Auk þess hönnuðu nýleg WGS-rannsókn Zimpel og samstarfsmanna (2020) ættfræði byggða á SNP Mycobacterium bovis, með meira en 1.900 erfðamengjum, sem bendir til þess að það séu að minnsta kosti fjórar mismunandi ættlínur (nefndar Lb1 til Lb1 til Lb4). Þær eru ekki alveg í samræmi við áður skilgreinda klónasamstæðu, þó að einnig sé hægt að staðfesta landfræðilega sértækni30. Þessir höfundar framkvæmdu mismunagreiningu á ættfræði og sameindaaldursgreiningu, en rannsökuðu ekki endurröðun30.
Fyrri rannsóknir á mismunandi sameindatækni, svo sem spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) og nýlegri SNP-typing, leiddu í ljós ákveðið stig erfðafræðilegs fjölbreytileika meðal M. bovis stofna 31,32,33, 34,35. Aðgreining erfðabreytileika hefur orðið mikilvægt tæki í rannsóknum á faraldsfræði sjúkdóma, sem er gagnlegt til að skilja meingerð, eiturvirkni og smitdreifingu sjúkdóma ítarlega. Tilkoma WGS-aðferðarinnar býður upp á möguleika á að afhjúpa þróunarþætti sem erfðamengi Mycobacterium bovis hefur valdið í aðlögunar- og viðvarandi aðstæðum að mismunandi hýslum og faraldsfræðilegum aðstæðum.
Í þessari vinnu notum við samanburðarerfðamengisgreiningu á ýmsum gagnasöfnum Mycoplasma bovis (n = 70), þar á meðal einangruðum stofnum úr mismunandi klónasamstæðum, til að fá innsýn í þróunarferli Mycoplasma bovis, sérstaklega til að greina ættfræðileg tengsl og endurröðunaratburði. Sem viðbót við þessa greiningu var undirgagnasafn af M. bovis einangruðum stofnum (n = 42) sem fengust frá vel skilgreindu fjölhýsla berklasvæði í Portúgal 31,36 kannað frekar til að álykta um ósamsvörun. Jafnvægið milli hlutfalls skynsemis (dN) og samheita (dS) núkleótíðskiptingar, sem og þróunarframlag tiltekinna erfðamengja sem getið er í fræðiritum, þau eru 37,38 fengin af forfeðrum MTBC í gegnum HGT og kóða fyrir genaþáttum 3R (DNA viðgerð, afritun og endurröðun) kerfisins 39. Veljið gen sem fengin eru í gegnum HGT vegna þess að þau geta táknað forn fjölbrigði, þannig að það er búist við að þau geti innihaldið hærra hlutfall samheitabreytinga. Genin sem eru hluti af 3R kerfinu voru valin vegna þess að fyrri rannsóknir á stofnum M. tuberculosis bentu til almennra neikvæðra/hreinsunarvala sem virka á þessi gen og þau gætu gegnt mikilvægu hlutverki í þróuninni 39. Annað markmið þessarar vinnu er að álykta um tilvist endurskipulagningaratburða. Þess vegna, þar sem gagnasafn okkar frá Portúgal inniheldur aðeins erfðamengi evrópsks klónfléttu 2 og stofna sem hafa ekki úthlutað klónfléttunni, ákváðum við að taka með opinberlega aðgengileg erfðamengisgögn til að fá loksins dæmigerða mynd af öllum klónfléttum og bæta áreiðanleika og breidd niðurstaðna.
42 nýlega raðgreind erfðamengi Mycoplasma bovis frá portúgalska fjölhýslaberklasjúkdómnum (sjá nánar hér að neðan), sem áður hafa verið greind frá faraldsfræðilegu sjónarhorni36, eru í brennidepli þessarar vinnu. Þar sem gagnasafnið frá Portúgal inniheldur aðeins fulltrúa evrópskra tveggja klónaflétta og stofna án tilgreindra flétta, hefur verið bætt við opinberlega aðgengilegum erfðamengisraðgreiningargögnum til að stækka gagnasafnið sem inniheldur alla fulltrúa M. bovis klónafléttanna. Því voru þrjár gagnalindir fyrir heildarerfðamengisraðgreiningu notaðar í þessari vinnu: heildar/drög að erfðamengissamsetningu, allt að 10 stoðgrindur geymdar í NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 einangruð efni); geymt í SRA (Illumina fastq skránni í raðlestrarsafninu) sem táknar flókna fjölbreytni M. bovis klóna (n = 12 einangruð efni)30; og 42 nýlega raðgreind erfðamengi frá Portúgal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) var útilokað frá NCBI leitinni. M. bovis AF2122/97 er venjulega notað sem viðmiðunarerfðamengi sem á að taka með í gagnasafninu. Vegna þess að öll erfðamengisröðin sem klónunarfléttan African 1 táknar er ekki aðgengileg almenningi, og vegna þess hve fá erfðamengi eru frá dæmigerðum stofnum Af2 og Eu1, voru upprunalegu raðgreiningargögnin frá SRA notuð í þessum tilfellum. Vinna Zimpel og samstarfsmanna hans (2020) hjálpaði til við að bera kennsl á erfðamengið úr fyrrnefndu klónunarfléttunni og valdi Mycobacterium bovis til að taka með í gagnasafninu. Fyrir Eu3 er aðeins ein tegund erfðamengis lýst (Branger o.fl., 2020), þannig að erfðamengið sem við tökum með er aðskilinn fulltrúi Eu3 fléttunnar.
Þetta gagnasafn inniheldur 70 tegundir af nautgripum af gerðinni M. bovis sem einangraðar voru frá 8 hýsiltegundum, dreifðar í 12 löndum frá 1985 til 2016. 36 tegundir eru skilgreindar sem Eu2, 7 tegundir eru Eu1, 1 tegund er Eu3, 3 tegundir eru Af1, 4 tegundir eru Af2 og 19 eru ekki rekjaðar til neins klónísks fléttu (sjá nánar hér að neðan). Ítarlegar upplýsingar (þar á meðal aðgangsnúmer) um Mycobacterium bovis sem notaðar voru í þessari rannsókn eru sýndar í töflu 1 og viðbótartöflu 1.
42 nýlega raðgreind heil erfðamengi Mycobacterium bovis frá berklasóttarsvæðum í Portúgal sem hafa verið dreifð í meira en 12 ár eru í brennidepli þessarar rannsóknar, þar sem möguleg sjúkdómskerfi milli villtra dýra og búfénaðar hafa verið reglulega fylgst með 31,36 (Viðbótarmynd 1). Samkvæmt síðari aðferðum voru þessir stofnar einangraðir úr nautgripum (n = 14), rauðhjörtum (n = 16) og villisvínum (n = 12) frá 2003 til 2015: safnað og meðhöndluð dýr í samræmi við ráðlagðar samskiptareglur. Vefjasýnin eru í handbók OIE um landdýr og eru bólusett á föstu og fljótandi pýrúvatmiðli af gerðinni Stonebrink og Löwenstein-Jensen. Ræktunin er ræktuð við 37°C og vöxtur er kannaður einu sinni í viku í að minnsta kosti 12 vikur. Nýlendurnar eru geymdar beint í glýseróllausn við -80°C. Í Mycobacterium-sértæka ræktunarmiðlinum (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) voru upprunalegu geymdu sýnin send í gegnum eina in vitro leið in vitro til að fá DNA úr WGS forritinu. Til þess var frosna ræktunarstofnlausnin auðguð með 5% natríumpýrúvati og 10% ADS (50 g albúmíni, 20 g glúkósa, 8,5 g natríumklóríði í 1 L af vatni) á Middlebrook 7H9 við 37°C Retrain. Eftir 4 vikna vöxt var ræktunarmiðillinn endurnýjaður og ræktunin fylgst reglulega með þar til vöxtur sást. Frumurnar voru teknar með skilvindu, pelletinn var enduruppleystur í 500 µL af fosfatlausn (PBS), hitaður við 99°C í 30 mínútur, skilvindusettir og ofanfljótandi vökvinn geymdur við -20°C þar til WGS. Allar aðferðir eru framkvæmdar í aðstöðu sem uppfyllir 3. stigs líföryggiskröfur.
Pörunarenda erfðamengissafnið frá WGS er útbúið með því að nota einstaka vísitölu hvers DNA-sýnis og notar Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 sýni) og HiSeq (2 × 150 pb) (tveir einangraðir) tækni (Eurofins Genomics, Þýskalandi) til raðgreiningar. Samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda skal nota Illumina Genome Analyzer með tvíhliða einingarfestingu til að raðgreina erfðamengis DNA-ið og nota Nextera XT DNA Library Prep Kit frá Illumina til að smíða safnið.
Með hliðsjón af gögnunum sem endurheimtust úr SRA (n = 12) er hægt að nota auðkenningu klónfléttunnar sem lýsigögn fyrir samsvarandi útgáfu 30, 41, 43. Þegar heildarerfðamengið er skoðað, að undanskildum Mycobacterium bovis AF2122/97 og Mycobacterium bovis 3601, sem eru viðurkenndir meðlimir Eu1 og Eu3 klónafléttunnar 25, 29, talið í sömu röð, er það það sama og heildarerfðamengi Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI aðgangsnúmer NC_000962.3). Jöfnun erfðamengisins er framkvæmd með því að nota MAFFT (multiple alignment program of amino acid or nucleotide sequence, útgáfa 7.458) og breytuna -addfragments48. Síðan er leitað að fjarveru mismunandi klónafléttna og/eða tilvist SNP-eiginleika.
Nýlega raðgreinda Mycobacterium bovis (n = 42) og upprunalegar niðurstöður úr erfðamengisdrögunum (n = 3) samræma fléttuna við viðmiðunarerfðamengið Mycobacterium tuberculosis H37Rv í gegnum vSNP-leiðslunina og tilvist eyðingar og/eða SNP-eiginleika mismunandi klóna. Leit var gerð.
Safnið upplýsingum um skort á eiginleikum og/eða nærveru/fjarveru SNP og spoligotyping sniða til að tengja erfðafræðileg gögn við samsvarandi klónal flókið. Fyrir fjóra drög að samsetningum er ekki hægt að álykta um spoligotyping sniðið, þannig að þau eru með í hópnum „engin flækjustig“.
Lífupplýsingafræðivinnuflæðið sem fylgt er í þessu verki hefst með nýrri samsetningu og kortlagningu að viðmiðunarstefnu, með það að markmiði að kanna endurröðunaratburði og sértæka fjölbreytni erfðamengis. Mynd 1 sýnir flæðirit af skrefunum sem fylgt er. Við endurröðunargreiningu eru öll erfðamengi notuð til að auka áreiðanleika ályktana og tengdra vísa.
Til að draga úr villum við myndun erfðamengisröðunar, fengum við fyrst de novo samsetningu og síðan kjarna margfeldisröðun. Unicycler leiðslan er nú aðgengileg á https://github.com/rrwick/Unicycler49 og er notuð til að framkvæma de novo samsetningu á 54 raðgreindum erfðamengjum (42 nýlega raðgreind og 12 fastq skrár endurheimtar úr SRA). Í stuttu máli, áður en samsetningin fór fram frá grunni, var greining á lesgæðum framkvæmd í FastQC útgáfu 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) og Trimmomatic útgáfu 0.36 (valkostirnir "klippa millistykki og aðrar lýsingarsértækar raðir úr lestum" og "Klippa grunna frá lokum lestsins, ef lægri en þröskuldsgæði 20" eru notaðir) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Síðan var SPAdes optimizer49 notað fyrir erfðamengissamsetningu og Pilon útgáfa 1.1851 var notuð fyrir bestun eftir samsetningu. Íhaldssöm brúaraðferð var valin til að forðast ranga samsetningu og k-mer stærð var leitað og valin á milli 20% og 95% af leslengdinni. Fylgið SPAdes leiðbeiningunum og takið lesstærðina til greina, eyðið samfelldum einingum sem eru minni en 300 bp og komið á fót 20 lesdýptarmörkum upp á 52. Í de novo samsetningaraðferðinni voru erfðafræðileg svæði eins og mjög endurteknar prólín-glútamat (PE) og prólín-prólín glútamat (PPE) paralogar ekki fjarlægð.
Gæði de novo samsetningarinnar eru metin í gegnum QUAST leiðsluna (http://quast.sourceforge.net/quast.html), sem auðveldar endurnýjun contigsins og kortlagningar erfðamengisins M. bovis AF2122/97 (NCBI aðgangsnúmer LT708304.1) (sjá viðbótartöflu 1 fyrir gæðabreytur).
Með hjálp vSNP leiðslunnar (https://github.com/USDA-VS/vSNP) er FASTQ skrá nýraðgreinds M. bovis úr Illumina raðgreiningu borin saman við viðmiðunarerfðamengi M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Samkvæmt bestu starfsvenjum í Genome Analysis Toolkit (GATK) [53, 54, 55] eru notaðar staðlaðar síunarbreytur eða afbrigðismassastig fyrir endurkvarðun. Niðurstöðurnar eru síaðar með lægsta SAMtools massastiginu, sem er 150 og AC = 2. Einnig er hægt að nota Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) til að athuga mælingarnar og útiloka mengun. vSNP leiðslan sem notuð er til að kortleggja raðgreiningaraðferðir í okkar verki skoðar röð skilgreindra SNP og skotmarka og útilokar einnig blandaðar sýkingaraðstæður. Þekking erfðamengisins sem lesin er er betri en 99% (viðbótartafla 1).
Til að forðast kortlagningarvillur og rangar SNP-greiningar skal sía út afbrigði í eftirfarandi tilvikum: (1) það er stutt af færri en 20 mælingum, (2) það finnst með tíðni undir 0,9, (3) það er í að minnsta kosti einum stofni, en að minnsta kosti eru eyður í öðrum stofni. Samþætt erfðafræðiskoðarinn (IGV) útgáfa 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 var notaður til að staðfesta SNP-greiningar og staðsetningar sjónrænt með kortlagningar- eða röðunarvandamálum. Þar sem genin prólín-glútamat (PE) og prólín-prólín glútamat (PPE) eru mjög tvöföld og eru hluti af fjölgenafjölskyldu, er auðvelt að misskilja þau með raðgreiningu og rangri kortlagningu Illumina, þannig að þau eru æskilegri. Lífupplýsingavinnuflæði fyrir mýkóbakteríur fjarlægði meðlimi berklafléttunnar þegar kortlagning á raðgreiningu var notuð til að staðfesta SNP-greiningar. Þess vegna síuðum við út PE/PPE gen og indels úr greiningunni.
Samkvæmt Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) eru allir SNP-ar flokkaðir í virkniflokka. SnpEff-leiðslan (https://pcingola.github.io/SnpEff/) er notuð til að álykta um afleiðingar SNP-ar (samheitabreytingar eða breytingar sem eru ekki samheitabreytingar). Nýr gagnagrunnur um erfðamengi Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1) var búinn til.
Fjölþátta röðun kjarnaerfðamengis var framkvæmd með Parsnp v1.2, sem er nú aðgengileg á https://github.com/marbl/parsnp57, með því að nota 69 heildarerfðamengi/drög (með valkostinum -c) og M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) er notað sem viðmiðun. Fjórar fjölþátta röðanir voru framkvæmdar: aðeins meðlimir Eu2 klónunarfléttunnar (n = 37), þar á meðal allir meðlimir evrópska klónunarfléttunnar (n = 44), þar á meðal tengipunktur evrópska og afríska klónunarfléttunnar (n = 51), og allar Mycobacterium bovis í þessari rannsókn (n = 70).
Kjarnajöfnunin sem Parsnp býr til er notuð til að álykta um hámarkslíkinda (ML) fylkingartréð með því að nota CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 með RAxML og framkvæma 1000 stýrðar afrit.
Þrjár mismunandi reiknirit og lífupplýsingatól eru notuð til að kanna hvort endurröðunaratburðir eigi sér stað samsíða: SplitsTree4 hugbúnaður, Gubbins leiðsla (óhlutdræg lína í gegnum endurröðun í núkleótíðaröðum) og RDP4 hugbúnaður (endurröðunargreiningarforrit, útgáfa beta 4.101).
Aðferðin við klofning sem notuð er í SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 er notuð til að reikna út rótarlaust þyrpinganet, með því að nota Phi-próf til tölfræðilegrar staðfestingar, og marktækniþröskuldurinn er p = 0,05. Kjarna fjölröðunargreining Parsnp er notuð sem inntak og klofning sem netstaðall er framkvæmdur.
Gubbins leiðsla v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) keyrir með sjálfgefnum breytum sem önnur leið til að meta áhrif endurröðunar á Mycobacterium bovis. Reikniritið sem er útfært í leiðslunni endurskapar viðeigandi klónætterni. Heildarerfðamengi/drög að gagnasafni okkar og viðmiðunarerfðamengið (nautgripir AF2122/97, LT708304.1) eru gagnkvæmt; og skanna staðsetningu SNP á hverri grein trésins til að greina SNP klasa sem táknar endurröðunaratburðinn. Núll greinarinnar. Gert er ráð fyrir að enginn endurröðunaratburður eigi sér stað, sem þýðir að SNP sem eiga sér stað á greininni ættu að vera jafnt dreifðir. Kjarna margfeldisröðunin frá Parsnp og best skoraða ML tréð frá RAxML eru notuð sem inntaksskrár.
Að lokum, til að staðfesta endurskipulagningaratburðinn sem Gubbins-leiðslan lagði til, eru sex reikniritin sem útfærð voru í RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 og SiScan66) notuð á kjarna margfeldisröðun Parsnp með sjálfgefnum stillingum. Við ákváðum að að minnsta kosti þrjú af reikniritunum sem útfærð voru í RDP4 verða stöðugt að sýna mikilvægt merki til að staðfesta hvert endurröðunaratburð.
Þar sem bæði Gubbins og RDP hugbúnaðurinn leita að endurröðunarmerkjum með því að athuga fjölröðun kjarna í glugga allt að 500 bp, og staðfesta að innkoma PE/PPE gena við de novo samsetningu muni ekki trufla endurröðunarmerkin sem finnast, er frekari greining gerð með einsleitnigreiningu (e. homelinearity detection) til að athuga nágrenni gensins sem auðkennir endurröðunaratburðinn. Samlínulegt kort sem notar allt erfðamengið var smíðað með MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) til að útiloka staðbundnar tilfærslur eða umsnúningar erfðamengisins. Að auki var allt erfðamengið notað til að framkvæma einsleitnigreiningu á amínósýruröðinni í gegnum SyntTax vefþjóninn (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Ítarlegri greining á erfðamengisgagnasettinu sem fengið var úr portúgalska fjölhýsla berklakerfinu er að kanna fjölbreytileika gena sem nefnd eru í fræðunum. Þessi gen eru 37, 38 og genið sem kóðar fyrir 3R sem fengust frá MTBC forfeðrum í gegnum HGT (DNA viðgerð, afritun og endurröðun) kerfisþætti 39. Notið ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) og DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) til að reikna út fjölbreytileika gena og fjölbreytileika núkleótíða (π) og inntak Tajima's D hlutlausa prófunarbreytu.
Hámarkslíkindaþyrpingartré (ML) byggt á 69 Mycoplasma bovis stofnum og viðmiðunarerfðamengjum var fengið (Mynd 2A). Í samanburði við tré sem byggja á einu geni eða mörgum genatrjám, gerir þessi aðferð kleift að mynda öflugri tré sem fanga ekki breytileika alls erfðamengisins og sýna því minni getu til að greina á milli tegunda 68,69. Staðarbygging ML trésins er venjulega í samræmi við flókna flokkun klóna. Erfðamengi Eu2 er þyrpt í grein og erfðamengi Af1 er einnig þyrpt saman (Mynd 2A). Niðurstaðan er einnig í samræmi við þekkt þróunartengsl Mycobacterium bovis, það er að segja, það er mikill munur á Eu1 meðlimnum og hópnum sem samanstendur af öllum öðrum klónasamstæðum og erfðamengjum, en klónasamstæðan 30 er ekki tilgreind. Lítið ósamræmi milli klónafléttunnar og tengslanna sem sjást á ættartrénu má skýra með þeirri staðreynd að klónafléttan er lýst út frá tilteknum erfðamengissvæðum, en ættartréð byggir á margvíslegri röðun kjarnaerfðamengja sem tákna allt erfðamengið.
Hámarkslíkindaþyrpingartréð (e. maximum likelihood phylogenetic tree (GTR)) er smíðað út frá kjarnaerfðamengisröðun erfðamengis Mycobacterium bovis fyrir (A) og eftir (B) fjarlægingu endurröðunarstaðar. Litir greina tákna klónfléttuna Mycobacterium bovis: Evrópa 1 er fjólublá, Evrópa 2 er rauð, Evrópa 3 er blá, Afríka 1 er appelsínugult og Afríka 2 er grænt. Tréð er rótað og teiknað í réttum hlutföllum og lengd greina er mæld til að koma í staðinn fyrir hvert svæði.
Mycobacterium tuberculosis fléttan er lýst sem klónaþróuð og flestar vísbendingar sem hafa safnast upp í gegnum árin styðja þá hugmynd að áframhaldandi HGT og endurröðunaratburðir muni ekki eiga sér stað á greinanlegu stigi MTBC15,17,18.
Fyrri rannsóknir hafa sýnt að takmörkuð endurröðun gæti verið milli MTBC stofna20,21, en aðrar hafa ekki tekist að bera kennsl á mælanlega endurröðunaratburði70,71. Ræðið þetta mál aftur með áherslu á Mycobacterium bovis, sem er frábrugðið fyrri rannsóknum sem aðeins tóku til Mycobacterium tuberculosis70,71; eða skoðið MTBC í heild sinni, þar sem nánast enginn M. bovis er 20; eða skoðið aðeins takmarkandi nautgripabrot. Í þessu rannsóknarverkefni eru alls 70 stofnar, sem tákna öll klónafléttur, notaðir til að skima fyrir endurröðun. Gagnasafnið er kvarðað eftir fjórum uppsöfnuðum stigum: (1) Eu2 meðlimir, (2) allir evrópskir klónafléttumeðlimir (þ.e. Evrópa), (3) evrópskur og afrískur klónaflétta (Eu + Af) og (4) öll gagnasöfnin (þar með talið erfðamengi sem eru ekki innifalin í neinum klónunarfléttum sem þegar hafa verið lýst).
Til að rannsaka þessa tilgátu frekar var framkvæmt klofið niðurbrotsnet til að meta fjarveru endurröðunaratburða milli erfðamengja, því þessi aðferð getur sýnt fram á forfeðurleg tengsl milli einstaklinga og sýnt fram á misvísandi ættfræðileg merki. Öll fjögur gagnasöfnin í greiningunni staðfestu tilvist lykkja í netinu (þ.e. svæði sem sameinast ekki í eitt tré), en Phi-prófið hefur enga tölfræðilega stuðning (Eu2, p = 0,0956; Evrópa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; allt gagnasöfnin p = 0,2451), sem veitir lélegar sannanir fyrir tilvist endurskipulagningaratburða (Mynd 3A-D).
Í Evrópu 2 erfðamengjum (n = 37) (A), evrópskum erfðamengjum (n = 44) (B), evrópskum og afrískum erfðamengjum (n = 51) (C) og öllu gagnasafninu (n = 70) (D).
Eftir þessa greiningu, og með hliðsjón af lotubundnum athugunum í öllum netkerfum, var endurgerðarreikniritinu sem var innleitt í Gubbins leiðslunni notað til að endurgera klóníska ætternið og til að bæta við mat á áhrifum endurröðunarinnar á erfðamengi M. bovis. Ályktað er uppsafnaðan fjölda endurröðunaratvika, sem flestir áttu sér stað í endagreinum (þ.e. í einu erfðamengi) (Tafla 2). Þessir vísbendingar sýna samræmi alls gagnasafnsins og gefa til kynna að tíðni endurröðunaratvika sé 200 til 300 sinnum meiri en stökkbreytingar. Þegar rho/theta breytan sem táknar hlutfallslegan hraða endurröðunar og punktstökkbreytinga á greininni virðist vera á milli 0,0037 og 0,0056 (Tafla 3). Nýlega sýndi birt vinna um 38 M. bovis stofninn hærra rho/theta gildi (rho/theta = 0,1) en það sem fæst í þessu gagnasafni, en vinna Patané og samstarfsmanna notaði viðmiðunarbyggða samsetningu til að álykta endurröðunarbreytur. Aðferðarfræðilegt atriði, vegna samsetningarferlisins, hefur verið tengt við fjölda hugsanlegra endurröðunaratburða í endagreininni.
Næst táknar r/m breytan fjölbreytileikahlutfallið endurröðun og stökkbreytingainnleiðingu, og meðalgildi hennar er á milli 0,025 og 0,037, sem bendir til þess að samanborið við stökkbreytingar hefur endurröðun minni heildaráhrif á erfðafræðilegan fjölbreytileika M. bovis (Tafla 3). Til ítarlegrar samanburðar var svipuð aðferð notuð til að meta r/m breytan fyrir MTBC gagnasafn sem samanstóð af 23 erfðamengjum, sem sýnir meðalgildið 0,48620, en fyrir 38 M. bovis gagnasafn Patané og samstarfsmanna reyndist meðalgildið vera 0,98. Í fyrstu rannsókninni voru aðeins tvö af 23 erfðamengjum sem voru með í vinnu M. bovis (M. bovis BCG og viðmiðunarstofninn), þannig að fengin gildi gætu verið skekkt vegna ofurtjáningar á erfðamengi M. tuberculosis. Í annarri skýrslunni voru greindu stofnar Mycobacterium bovis aðallega endurheimtir frá Bandaríkjunum og búfénaði. Í gagnasafni okkar eru hins vegar fleiri landfræðilegar staðsetningar og hýsiltegundir sýndar, og erfðamengi sem flokkuð eru í mismunandi klóna-fléttur með mismunandi erfðafræðilegum eiginleikum stofnsins eru einnig notuð, sem veitir dýpri og víðtækari þekkingu á stofninum. Mismunurinn á r/m meðalgildi sem fæst með gagnasafni okkar er í samræmi við þá hugmynd að endurröðunarstig sé mjög mismunandi milli ættkvísla sem tilheyra sömu flokkunarfræðilegu tegund, þannig að þessar niðurstöður benda til þess að M. bovis klón-fléttan geti sýnt endurröðunarmun. Áhrifin eru einnig eins og Didelot & Maiden72 leggja til. Engu að síður mun veruleg útvíkkun þessa gagnasafns með því að taka með fleiri M. bovis erfðamengi gera kleift að skýra þetta atriði frekar. Bæði r/m og rho/theta breyturnar sýna breytileika milli greina, og þessi niðurstaða er í samræmi við skýrslur um aðrar bakteríutegundir72,73.
Að lokum, til að staðfesta endurskipulagningaratburðina sem Gubbins-leiðslan greindi, voru sex mismunandi reiknirit notuð í RDP4 hugbúnaðinum til að prófa sjálfstætt mismunandi kjarna-fjölsamanburði. Á heimsvísu voru minna en helmingur atburðanna sem Gubbins greindi staðfestir af RDP4 (töflur 4 og 5). Miðað við allt gagnasafnið voru þrír endurröðunaratburðir staðfestir, tveir sem tengdust innri hnútum og hinn sem tengdist einu erfðamengi í endagrein, þar sem ekki var hægt að úthluta klónafléttum (töflur 4 og 5). Greining atburða í endagreinum gæti bent til þess að endurröðunin sé enn í gangi í samtíma M. bovis stofnum eða að niðurstaðan sé á rangri staðsetningu70. Í þessu tilgátulega endurröðunarsvæði hafa um það bil 20% af stöðum óskilgreind núkleótíð (N), sem hefur áhrif á endurröðunarmerkið (viðbótarmynd 2). Að auki hefur þetta svæði áhrif á rrs genið, sem kóðar fyrir 16S ríbósóm RNA sem búist er við að sé mjög varðveitt, þannig að þetta meinta endurröðunarmerki gæti verið afleiðing af raðgreiningarvillum eða rangri röðun. Síðan var heildarröðun erfðamengisins milli Mb0003 og Mycobacterium bovis AF2122/97 framkvæmd og tilvist óskilgreindra núkleótíða og SNP-próteina staðfest, þannig að möguleg vandamál tengd rangri röðun voru ekki vegna líffræðilegra upplýsinga sem útfærðar voru í þessari vinnu. Kom fram eftir að hafa lært forritið.
Engin eyður eða óskilgreind núkleótíð fundust í endurröðunarsvæðum innri hnúta (myndir 4 og 5). Varðandi þessa atburði inniheldur annar aðeins erfðamengið Eu2 og hefur áhrif á pks12 genið, sem kóðar fyrir hugsanlegum pólýketíð syntasa; en hinn er skráður í erfðamenginu Eu1 og hefur áhrif á narX genið sem kóðar fyrir hugsanlegum nítratredúktasa (Tafla 4). Almennt sýnir endurröðunargreiningin að það er takmarkaður fjöldi endurröðunarbrota með tölfræðilegum stuðningi, og ályktanir benda til þess að endurröðunin hafi lítil áhrif á ættkvísl M. bovis. Búist er við að endurröðunarmerkið sé lágt, en það er mikilvægt að greina á milli raunverulegs þróunarmerkis og bakgrunnshávaða, sem er krefjandi verkefni. Til að draga úr hávaðamerkinu sem kemur fram vegna viðmiðunarbundinnar samsetningar og misræmisvandamála 70, 71, voru öll hin nema allt erfðamengið sett saman frá grunni, og gæði samsetningarinnar voru könnuð og tryggð með QUAST leiðslugreiningu (viðbótartafla 1). Að auki var gerð röð viðbótargreininga til að tryggja áreiðanleika og nákvæmni heildarkönnunarinnar. Því var gæði raðgreiningar narX og pks12 gena metin með lestrarkortlagningu gegn Mycobacterium bovis AF2122/97. Ráðlögð staðsetning SNP í endurröðunarsvæðinu var staðfest með því að beita viðmiðunum sem nefnd eru í aðferðakaflanum (að minnsta kosti 20 mælingar og 0,9 breytingartíðni). Fjölbreytileiki narX gensins var að fullu staðfestur í erfðamengjunum tveimur (Mb1792361 og Mb7240415; 2,3%) og erfðamengjum pks12 erfðamengisins: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 og Mb12 genum. Hins vegar, fyrir erfðamengið Mb2043, uppfylla sex af átta stöðum ekki skilyrðið um lesdýpt þar sem SNP er stutt af hámarki 17 lestum, sem er undir viðmiðunarmörkum 20. Því er hægt að staðfesta endurröðun sex erfðamengja (8,6%) á þessum erfðamengisstað (myndir 4 og 5).
Nákvæm myndræn sýn á röðun endurröðunarsvæða Mycobacterium bovis gagnasafnsins hefur áhrif á narX genið sem kóðar fyrir hugsanlegum nítratredúktasa. Engin eyður eða óskilgreindir núkleótíð fundust í endurröðunarsvæði innri hnúta. Þessi tiltekni atburður er skráður í erfðamengi Eu1. Raðgreiningargæði narX gensins voru metin með því að teikna upp niðurstöður Mycobacterium bovis AF2122/97. Staðfestið ráðlagða staðsetningu SNP á endurröðunarsvæðinu með því að beita viðmiðunum sem nefnd eru í aðferðakaflanum (að minnsta kosti 20 mælingar og 0,9 breytingartíðni). Fjölbreytileiki narX gensins var að fullu staðfestur í erfðamengjum Mb1792361 og Mb7240415 (2,3%).
Ítarleg myndræn sýn á röðun endurröðunarsvæða Mycoplasma bovis gagnasafnsins sem hefur áhrif á pks12 genið. Engin eyður eða óskilgreind núkleótíð fundust í endurröðunarsvæði innri hnúta. Varðandi atburðinn sem hefur áhrif á pks12 genið sem kóðar fyrir hugsanlegum pólýketíð syntasa, þá inniheldur það aðeins erfðamengið Eu2. Raðgreiningargæði pks12 voru metin með lestrarkortlagningu Mycobacterium bovis AF2122/97. Staðfestið ráðlagða staðsetningu SNP á endurröðunarsvæðinu með því að beita viðmiðunum sem nefnd eru í aðferðakaflanum (að minnsta kosti 20 mælingar og 0,9 breytingartíðni). Fjölbreytileikar erfðamengjanna Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 og Mb1960 hafa verið að fullu staðfestir.
PE og PPE gen hafa endurteknar svæði sem auðvelt er að misskilja með Illumina raðgreiningu og miskortlagningu, þannig að þau eru venjulega aðeins eytt úr lífupplýsingavinnuflæði M. tuberculosis meðlima þegar kortlagningar-til-raðgreiningaraðferðin er notuð. Ályktunin um endurröðunaratburði sem notuð er í þessari vinnu byggir á de novo samsetningu án þess að sía út PE/PPE. Við teljum að með því að innleiða þrjár mismunandi viðbótaraðferðir og reiknirit í gegnum SplitsTree, Gubbins pipeline og RDP4 hugbúnað, séu aðferðirnar sem notaðar eru traustar til að vinna úr og sía endurskipulögð svæði sem orsakast af villumerkjum. Hins vegar, til að útiloka truflun PE/PPE gensins á Gubbins og RDP4 hugbúnaðinum til að bera kennsl á SNP klasa, og þar með auðkenningu endurröðunarsvæða sem talið er að hafi áhrif á narX og pks12 genin, var nálægð þessara gena skoðuð (Viðbótarmynd 3–5). Í M. bovis AF2122/97 er narX genið aðskilið af narK2 og Mb1764c, en pks12 er umkringt Mb2075c og Mb2073c (viðbótarmynd 3-5). Kortið sem búið var til með MAUVE samheitakortinu af heildarerfðamenginu veitir upplýsingar um varðveislu og endurröðun genaraðar og sýnir fjóra samlínublokki og engin merki um tilfærslu eða umsnúningu erfðamengisins. Að auki sannaði viðbótagreiningin með amínósýruröðinni samsvörun í öllum heildarerfðamengjunum og engin PE/PPE fannst í aðliggjandi svæðum narX eða pks12. Fyrir narX hefur eitt erfðamengi (Mb0030) lægri samheitastig vegna þess að narX genið var greint sem tvö brot (brot 1891 og 1890). Vegna líkinda sýndu Mb0030 og Mb003 lægri samlínuleikastig fyrir pks12, en pks12 greindist í tveimur og þremur brotum, talið í sömu röð, sem táknuðu mismunandi lén próteinsins (viðbótarmynd 3-5). Með hliðsjón af þessum upplýsingum, og með því að Gubbins og RDP4 hugbúnaðurinn framkvæma báðir greiningar, athuguðum við margfeldisröðun kjarnans fyrir hámark 500 bp í glugganum, og staðfestum við að PE/PPE genið muni ekki trufla endurröðunarmerkið sem hefur áhrif á narX og pks12.
Þó að endurröðunarmerkin sem greindust í þessu gagnasafni megi teljast leifar, þá er rétt að ekki er hægt að útiloka endurröðun í M. bovis, þannig að hún ætti að halda áfram að vera viðfangsefni frekari greiningar, þar sem heil erfðamengi úr mismunandi faraldsfræðilegum aðstæðum eru raðgreind til að greina mikilvægi.
Samanburður á ættartré ML sem fengust fyrir og eftir leiðréttingu á endurröðun (mynd 2A, B) leiddi ekki til marktækra breytinga á áætluðum ættartengslum og M. bovis stofnarnir voru flokkaðir í sama hóp.
Eftir að 42 nýraðgreindar M. bovis erfðamengisbrot voru kortlögð með viðmiðunarerfðamengi M. bovis AF2122/97, fékkst SNP röðun sem innihélt 1816 fjölbrigðastöður. Flestir SNP-genarnir (87,1%) eru staðsettir í erfðamengissvæðinu og viðkomandi genin eru einkennd samkvæmt virkniflokkunum sem sýndir eru í Bovilist (mynd 6A, B). Með hliðsjón af heildarfjölda gena í hverjum virkniflokki, sýndu genin í flokknum „fituefnaskipti“ fleiri SNP-gen, þar á eftir komu „frumuveggir og frumuferli“ og „milliefnaskipti og öndun“, sem sýnir að þau eru í þróun M. bovis.
Stigveldisgreining á gagnasafni M. bovis frá Portúgal (n = 42). Heildarfjöldi skráðra SNP-próteina og áhrifa gena fyrir hvern virkniflokk (A). Heildarfjöldi samheita og ósamheita breytinga skráðra eftir virkniflokki (B).
Á heimsvísu er meðaltal dN/dS hlutfallsins betra en 1,5, sem bendir til þess að alþjóðlegur þróunarþrýstingur sé að losna við forfeðurástandið og táknar jákvætt (fjölbreytt eða stýrt) og/eða slakt hreinsunarval. Í flokkunum „meinvirkni, afeitrun, aðlögun“, „innsetningarraðir og fagar“ og „stjórnprótein“ eru meira en tveir þriðju hlutar af SNP-próteinum ekki samheiti (Mynd 6B).
Í öllum flokkum eru gen með marga SNP-prótein, sem leiðir til meðalstökkbreytingartíðni (þ.e. meðaltal SNP á geni) sem er meiri en 1 (Mynd 6A). Pks12 (Mb2074c) með 15 SNP-prótein og fas (Mb2553c) með 8 SNP-prótein hafa hærri stökkbreytingargildi. Bæði þessi gen taka þátt í fitusýruumbrotum. pks-genið kóðar fyrir pólýketíðsyntasa (PKS), sem er fjölvirkt ensím sem tekur þátt í lípíðmyndun frumuveggja mykóbaktería74,75. Þetta gen kóðar fyrir fjölvirku fjölpeptíði sem tekur þátt í myndun mykóketíða74,76. fas-genið tekur þátt í myndun mykólsýru. Bæði þessi gen gegna mikilvægu hlutverki í myndun frumuveggsins sem er í snertingu við hýsilinn.
Til að rannsaka frekar þróun Mycobacterium bovis voru tvö sett af sértækum genum greind. Áður birtar rannsóknir sem notuðu raðsamsetningu og þörungafræðilegar aðferðir greindu gen sem forfeður MTBC höfðu eignast í gegnum HGT fyrir fjölbreytni37,38. Þessi gen eru talin upp í viðbótartöflu 2. SNP dreifing alls 77 gena sem gætu tengst HGT var greind og 26 fjölbrigðastaðir voru greindir, sem í flestum tilfellum (78%) leiddu til ósamheita (NS) breytinga (viðbótartafla 2). Fyrri vinna við erfðamengi MTBC sýndi að hugsanlegt HGT svæði sýnir hærra NS SNP hlutfall samanborið við restina af erfðamenginu. Ef maður heldur að þessi endurröðunarsvæði hafi verið eignast af forfeðrum MTBC og því ofmeti þau forn fjölbrigði, þá er búist við að hlutfall samheitabreytinga sé hærra, þar sem búist er við að NS skiptingar verði útrýmt með neikvæðu vali vegna þess að breytingar á amínósýrum geta breytt virkni próteinsins. Þess vegna benda niðurstöður okkar til þess að virkniafleiðingarnar gætu stafað af því að HGT-lík gena hafa verið skipt út, sem endurspeglar mikilvægi þeirra fyrir verðmæta aðlögunarhæfa erfðafræðilega fjölbreytni.
Samhliða þessari greiningu voru genin sem kóða fyrir þætti 3R (DNA viðgerð, afritun og endurröðun) kerfisins vandlega skoðuð í samræmi við lista sem dos Vultos og samstarfsmenn höfðu áður gefið út (2008)39. Ekki er hægt að fylgjast beint með skiptingu á eins DNA brotum, þó það geti verið algengt ferli þegar náskyldar bakteríur eiga í hlut, eins og í tilviki þessa gagnasafns; auk þess gæti þetta ferli verið lykillinn að DNA viðgerðaraðferðum72, sem gegna hlutverki í samsvörun endurröðunar. Alls voru 26 fjölbrigðastöður, dreifðar af 54 genum, greindar (viðbótartafla 3). Í þessu genasetti voru breytingar á NS um 65% af afleiðingunum, sem er í samræmi við fyrri skýrslur um Mycobacterium tuberculosis stofna.
Birtingartími: 21. október 2021