Təbiəti ziyarət etdiyiniz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS üçün məhdud dəstək var. Ən yaxşı təcrübə üçün brauzerin daha yeni versiyasını istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürün). Eyni zamanda, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz üslub və JavaScript olmadan saytları göstərəcəyik.
Genom ardıcıllığı yoluxucu xəstəliklərin tədqiqi sahəsini canlandırdı, xəstəliyin epidemiologiyasını, patogenezini, ev sahibi-patogen qarşılıqlı təsirini və patogenlərə tətbiq edilən təkamül prosesini aşkar etdi. Mycobacterium tuberculosis kompleksi (MTBC) Mycobacterium bovis-i yerüstü məməlilərdə vərəmə (Vərəm) səbəb olan heyvan uyğunlaşma üzvlərindən biri hesab edir və bakterial təkamülün tipik modelidir. Digər MTBC üzvləri kimi, Mycobacterium bovis-in ciddi şəkildə klonlaşdırılmış, yavaş-yavaş inkişaf edən patogen olduğu güman edilir və açıq-aydın rekombinasiya və ya üfüqi gen transferi əlaməti yoxdur. Bu işdə biz mal-qara M. Təkamül gücünə dair fikirlər əldə etmək üçün müxtəlif cinslərdən (Avropa və Afrika) 70 iribuynuzlu M.-dan ibarət bütün genom ardıcıllığına (WGS) müqayisəli genomikanı tətbiq edirik. Yenidən təşkilin əlamətlərini qiymətləndirmək üçün üç müxtəlif üsuldan istifadə olunur. Qlobal miqyasda az sayda rekombinasiya hadisəsi müəyyən edilmiş və möhkəm dəstək ilə iki müstəqil üsulla təsdiq edilmişdir. Buna baxmayaraq, mutasiyalarla müqayisədə rekombinasiya M. bovisin müxtəlifliyinə daha zəif təsir göstərir (ümumi r/m = 0,037). Məlumat dəstimizdə Mycobacterium bovis-in klonal kompleksində əldə edilən r/m orta fərqi rekombinasiya dərəcəsinin eyni taksonomik növlərə təyin edilmiş nəsillər arasında çox fərqli ola biləcəyi ümumi konsepsiyaya uyğundur. Bu işə əsaslanaraq, Mycobacterium bovis-də rekombinasiya istisna oluna bilməz, buna görə də bu, dünyanın müxtəlif epidemioloji ssenarilərindən böyük məlumat dəstlərinin WGS-nin həlledici olduğu gələcək müqayisəli genomik tədqiqatlarda əlavə səylərin mövzusu olmalıdır. Daha sonra çox hostlu vərəmin yayılmasından daha kiçik Mycobacterium bovis məlumat dəstində (n = 42) əlavə təhlil aparıldı və 1800-dən çox lokus müəyyən edildi, onlardan ən azı bir ştam tək nukleotid polimorfizmini (SNP) göstərdi. Əksəriyyəti (87,1%) kodlaşdırma bölgəsində yerləşir və sinonimik dəyişikliklərin qeyri-sinonim dəyişikliklərinin (dN/dS) qlobal nisbəti 1,5-i ötür, bu da müsbət seçimin M.bovis üzərində tətbiq olunan mühüm təkamül qüvvəsi olduğunu göstərir. SNP-lərin daha yüksək nisbəti "lipid mübadiləsi", "hüceyrə divarı və hüceyrə prosesləri" və "aralıq metabolizm və tənəffüs" funksional kateqoriyaları ilə zəngin olan genlərdə aşkar edildi, onların Mycobacterium bovis-in biologiyası və təkamülündə potensialını üzə çıxardı. MTBC əcdadlarında üfüqi gen transferinə meylli və 3R (DNT təmiri, replikasiyası və rekombinasiyası) sisteminə daxil olan genlərə daha yaxından nəzər salsaq, Taijimanın D neytral testinin qlobal orta mənfi dəyərini ortaya qoyur ki, bu da keçmiş selektiv skan edilməsini göstərir. ev sahibi ilə vuruşun.
Mycobacterium tuberculosis kompleksi (MTBC) bakterial patogenlərin ən uğurlu taksonlarından biridir və bakterial təkamülün tipik halıdır. Onun üzvləri genomik səviyyədə təəccüblü dərəcədə yüksək nukleotid identikliyi nümayiş etdirirlər (> 99%)1,2. Müxtəlif MTBC ekotipləri mikro-məməlilərdən insanlara qədər geniş spektrli ev sahibi növlərində yoluxucu qranulomatoz xəstəlik olan vərəmə (Vərəm) səbəb ola bilər3,4,5. Hazırda kompleksə insanlar daxildir [M. Vərəm (Mtb), Mycobacterium africanum] və heyvanlara uyğunlaşdırılmış patogenlər (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium, Mycobacterium, mycobacterium, miysanicils şimpanze" və "dassie") 5,6. M. canettii (həmçinin "Nodobacter glabrata" kimi tanınır) Yuxarıda qeyd olunan mikobakteriyalarla orta nukleotid eyniliyi 98% təşkil edir və müqayisəli genomik iş M. canettii və MTBC-nin qalan hissəsinin bu yaxınlarda ortaq əcdaddan ayrıldığını göstərdi.7 Bu konsepsiyanı nəzərə alaraq, bəzi canettiilər MBC.
MTBC sistematik olaraq ciddi klonal kompleks kimi təsvir edilir və onun populyasiya strukturu aydın şəkildə azaldılmış müxtəliflik, darboğazlar, seçmə skanlama və genetik sürüşmə ilə idarə olunur9,10. Mürəkkəb ciddi klonal təkamülü fərz etsək, çatışmayan polimorfizmlər rekombinasiya yolu ilə bərpa edilə bilməz. Bu müddəaya əsaslanaraq, diferensial bölgənin (RD) və TbD1 (Mtb xüsusi silinməsi 1 bölgəsi) genomik silinməsinin ardıcıl hadisələri MTBC təkamülünün molekulyar markerləri kimi təklif edilmişdir2,5,11. Müqayisəli genomika və bütöv genom ardıcıllığı (WGS) işi insan tərəfindən uyğunlaşdırılmış üzvlərin doqquz nəslə bölünməsini dəstəkləyir (Mycobacterium tuberculosis L1 - L4, L7 və L8; və Mycobacterium africanum L5, L6 və L9), L2 - L4 bölgələri paylaşılan sil, T111b. Bundan əlavə, heyvanlara uyğunlaşdırılmış üzvlərin RD7, RD8, RD9 və RD102, 5 və 14-də klada-xüsusi silinmələrlə müəyyən edilən ümumi əcdadı paylaşması təklif olunur.
Horizontal gen transferi (HGT) və rekombinasiya hadisələri nadir hesab olunur və bütün MTBC üzvünün fərqli tarixi deyil, MTBC-nin əcdadlarında baş verir15,16,17. Hughes və əməkdaşlıq edənlər (2002) və Qutacker və əməkdaşları (2006) tərəfindən hazırlanmış iki erkən hesabat rekombinasiya hadisələrinin M. tuberculosis suşlarında spesifik lokusları qeyd edən polimorfizmləri formalaşdırmağa kömək edə biləcəyini təklif etdi18,19. MTBC-də rekombinasiyanın aşkar olmamasının səbəbləri bunlardır: (1) mexaniki proses və HGT qabiliyyətinin itirilməsi; (2) HGT hadisələrinin nadirliyi; (3) MTBC nişində rekombinasiya hadisələri şansı yoxdur14,17. Bu yaxınlarda, MTBC ştammı 20 və Mycobacterium bovis 21-ə tətbiq edilən bəzi bütöv genom ardıcıllığı (WGS) tədqiqatları rekombinasiyanın sübutunu təqdim etdi, ilk dəfə olaraq MTBC suşlarının tez-tez kiçik DNT fraqmentləri mübadiləsi etdiyini, lakin məhdud nukleotid ardıcıllığının dəyişməsi səbəbindən bu hadisələr hələ də qeyd olunmur.
Mycobacterium bovis mal-qaradan (əsasən iribuynuzlu mal-qara) ən çox bərpa edilən MTBC üzvüdür, baxmayaraq ki, o, sərbəst gəzən və hasarlanmış vəhşi heyvanlardan da təcrid oluna bilər4,22,23,24. M. bovis beş əsas klonal kompleksə [Avropa 1 (Eu1), Avropa 2 (Eu2), Avropa 3 (Eu3), Afrika 1 (Af1) və Afrika 2 (Af2)] çevrildi, spoliqotipləşdirmə profilinə, spesifik silinmələrə və tək nukleotid polimorfizmlərinə (SNPs) 282, spesifik olaraq 282, genlərdə. Bu klonal komplekslər Mycobacterium bovis populyasiyasının müxtəlif strukturunu və onun coğrafi bölgələrlə əlaqəsini nümayiş etdirir. Bundan əlavə, Zimpel və əməkdaşları (2020) tərəfindən həyata keçirilən son WGS işi 1900-dən çox genomu olan Mycobacterium bovis-in SNP-nə əsaslanan filogeniya tərtib etdi və bu, ən azı dörd fərqli nəslin (Lb1-dən Lb1-dən Lb4-ə qədər) olduğunu göstərir. təsdiq 30. Bu müəlliflər filogeniya və molekulyar tarixləşdirmənin diferensial təhlilini apardılar, lakin rekombinasiyanı öyrənmədilər30.
Spoliqotipləşdirmə, MIRU-VNTR (mikobakteriyaların interspersed təkrar vahid-dəyişən tandem təkrar sayı) və son SNP tipləmə kimi müxtəlif molekulyar üsullardan istifadə edilən əvvəlki iş M. bovis suşları 31,32,33, 34,35 arasında müəyyən bir genetik müxtəliflik səviyyəsini aşkar etdi. Genetik variasiyanın diferensiallaşdırılması xəstəliyin epidemiologiyasının öyrənilməsində mühüm alətə çevrilmişdir ki, bu da patogenezi, virulentliyi və xəstəliyin ötürülməsini dərindən başa düşmək üçün faydalıdır. WGS metodunun ortaya çıxması müxtəlif ev sahiblərinə və epidemioloji ssenarilərə uyğunlaşma və davamlılıq prosesində Mycobacterium bovis genomunun tətbiq etdiyi təkamül hərəkətverici amillərini aşkar etmək imkanı verir.
Bu işdə biz Mycoplasma bovisin təkamül prosesi, xüsusən də filogenetik əlaqələri və rekombinasiya hadisələrini həll etmək üçün müxtəlif klonal komplekslərdən olan izolatlar da daxil olmaqla müxtəlif Mycoplasma bovis verilənlər bazasında (n=70) müqayisəli genomik analizdən istifadə edirik. Bu təhlilə əlavə olaraq, Portuqaliyada 31,36 yaxşı səciyyələndirilmiş çox hostlu vərəm sahəsindən əldə edilmiş M. bovis izolatlarının (n = 42) alt-məlumat dəsti qeyri-identifikasiya haqqında nəticə çıxarmaq üçün daha da tədqiq edilmişdir. ədəbiyyat, onlar HGT vasitəsilə MTBC əcdadları tərəfindən əldə edilən 37,38-dir və 3R (DNT təmiri, replikasiyası və rekombinasiyası) sisteminin gen komponentlərini kodlayır 39. HGT vasitəsilə əldə edilən genləri seçin, çünki onlar qədim polimorfizmləri təmsil edə bilər, ona görə də onların sinonim dəyişikliklərin daha yüksək nisbətini ehtiva edə biləcəyi gözlənilir. 3R sisteminə daxil olan genlər seçilmişdir, çünki M. tuberculosis suşları üzərində əvvəlki iş bu genlər üzərində işləyən ümumi mənfi/təmizləmə seçimlərini göstərmişdir və onlar təkamüldə mühüm rol oynaya bilər 39. Bu işin digər məqsədi yenidən təşkilatlanma hadisələrinin mövcudluğuna dair nəticə çıxarmaqdır. Bu səbəbdən, Portuqaliyadan olan məlumat dəstimizin yalnız Avropa klon kompleksi 2-nin genomlarını və klon kompleksini təyin etməmiş ştammları ehtiva etdiyini nəzərə alaraq, nəhayət bütün klon komplekslərinin nümayəndəsini əldə etmək və nəticələrin möhkəmliyini və genişliyini artırmaq üçün ictimaiyyətə açıq olan genom məlumatlarını daxil etmək qərarına gəldik.
Əvvəllər epidemioloji baxımdan səciyyələndirilən36 Portuqaliya endemik multi-host vərəm səhnəsindən 42 yeni ardıcıllaşdırılmış Mycoplasma bovis genomu bu işin mərkəzidir. Portuqaliyadan alınan məlumat toplusunun yalnız Avropa 2 klon komplekslərinin və təyin edilmiş kompleksləri olmayan ştamların nümayəndələrinə malik olduğunu nəzərə alaraq, M. bovis klon komplekslərinin bütün nümayəndələrini əhatə edən məlumat dəstini genişləndirmək üçün ictimaiyyətə açıq olan tam genom ardıcıllığı məlumatları əlavə edilmişdir. Buna görə də, bu işdə üç tam genom ardıcıllığı məlumat mənbəyi istifadə edilmişdir: tam/qaralama genom montajı, NCBI-də (Milli Biotexnologiya Məlumat Mərkəzi) saxlanılan 10-a qədər skafold (n = 15 izolat); SRA-da saxlanılır ( Oxuma ardıcıllığının Illumina fastq faylı) M. bovis klonlarının (n = 12 izolat) kompleks müxtəlifliyini təmsil edir30; və Portuqaliyadan 42 yeni ardıcıl genom. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) NCBI axtarışından çıxarılıb. M. bovis AF2122/97 adətən verilənlər bazasına daxil ediləcək istinad genomu kimi istifadə olunur. Afrika 1 klonlama kompleksi ilə təmsil olunan bütün genom ardıcıllığının ictimaiyyətə açıq olmaması və Af2 və Eu1 reprezentativ suşlarının genomlarının az olması səbəbindən bu hallarda SRA tərəfindən təqdim edilən orijinal ardıcıllıq məlumatlarından istifadə edilmişdir. Zimpel və onun əməkdaşlarının işi (2020) yuxarıda qeyd olunan klonlama kompleksindən genomu müəyyən etməyə kömək etdi və məlumat dəstinə daxil edilmək üçün Mycobacterium bovis-in seçilməsinə kömək etdi. Eu3 üçün yalnız bir növ genom təsvir edilmişdir (Branger et al., 2020), buna görə də daxil etdiyimiz genom Eu3 kompleksinin ayrıca nümayəndəsidir.
Qlobal miqyasda bu məlumat dəstinə 1985-ci ildən 2016-cı ilədək 12 ölkədə yayılmış 8 ev sahibi növündən təcrid olunmuş 70 iribuynuzlu M. bovis daxildir. 36 növ Eu2, 7 növ Eu1, 1 növ Eu3, 3 növ Af1, 4 növ Af2 və 19 növ hər hansı bir kompleksə aid deyil (cədvəldən aşağı deyil). Bu tədqiqatda istifadə edilən Mycobacterium bovis haqqında ətraflı məlumat (qoşulma nömrəsi daxil olmaqla) Cədvəl 1 və Əlavə Cədvəl 1-də göstərilmişdir.
Portuqaliyanın heyvan vərəmi qaynar nöqtələrindən Mycobacterium bovis-in 42 yeni ardıcıllaşdırılmış bütöv genomu və 12 ildən çox müddətə paylanmış genomları bu tədqiqatın mərkəzidir, çünki potensial vəhşi təbiət-mal-qara xəstəlikləri sistemləri mütəmadi olaraq izlənilir 31,36 (Əlavə Şəkil 1). Sonrakı prosedurlara əsasən, bu ştamlar 2003-cü ildən 2015-ci ilə qədər iribuynuzlu mal-qaradan (n = 14), maraldan (n = 16) və çöl donuzundan (n = 12) təcrid edilmişdir: tövsiyə olunan protokol qaydalarına uyğun olaraq heyvanları toplayın və idarə edin Toxuma nümunələri OIE Quru Heyvanları Kitabçasındadır və Stonebrensen-Jen-Jen-Jen-Jen-Jen piruvat bərk mühit və maye mühit. Kulturalar 37 °C-də inkubasiya edilir və böyüməsi ən azı 12 həftə ərzində həftədə bir dəfə yoxlanılır. Koloniyalar birbaşa qliserin məhlulunda -80ºC-də saxlanılır. Mycobacterium selektiv mühitində (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) orijinal arxivləşdirilmiş nümunələr WGS proqramının DNT-sini əldə etmək üçün in vitro tək keçiddən keçirildi. Bunun üçün dondurulmuş kultura məhlulu Middlebrook 7H9-da 37°C Retrain-də 5% natrium piruvat və 10% ADS (50 q albumin, 20 q qlükoza, 1 L suda 8,5 q natrium xlorid) ilə zənginləşdirilmişdir. 4 həftəlik böyümədən sonra mühit yeniləndi və böyümə müşahidə olunana qədər mədəniyyətə müntəzəm olaraq nəzarət edildi. Hüceyrələr sentrifuqa ilə yığıldı, qranul 500 µL fosfat tamponlu salin (PBS) içində yenidən dayandırıldı, 30 dəqiqə 99 °C-də qızdırıldı, sentrifuqa edildi və supernatant WGS-ə qədər -20 °C-də saxlanıldı. Bütün prosedurlar 3-cü səviyyəli biotəhlükəsizlik obyektlərində həyata keçirilir.
WGS cütləşdirilmiş genom kitabxanası hər bir DNT nümunəsinin unikal indeksindən istifadə etməklə hazırlanır və ardıcıllıq üçün Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 nümunə) və HiSeq (2 × 150 pb) (iki izolat) texnologiyasından (Eurofins Genomics, Almaniya) istifadə edir. İstehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq, genomik DNT-ni ardıcıllıqla sıralamaq üçün ikitərəfli modul əlavəsi olan Illumina Genom Analizatorundan istifadə edin və kitabxananı qurmaq üçün Illumina-dan Nextera XT DNT Kitabxanası Hazırlıq Kitindən istifadə edin.
SRA-dan (n = 12) bərpa edilmiş məlumatları nəzərə alaraq, klon kompleksinin identifikasiyası müvafiq nəşrin 30, 41, 43-ün metadatası kimi istifadə edilə bilər. Tam genomu nəzərdən keçirərkən, Mycobacterium bovis AF2122/97 və Mycobacterium bovis istisna olmaqla, E. 3601 və E. 25, 29, müvafiq olaraq, Mycobacterium tuberculosis H37Rv-nin tam genomu ilə eynidir (NCBI giriş nömrəsi NC_000962.3). Genomun uyğunlaşdırılması MAFFT (amin turşusu və ya nukleotid ardıcıllığının çoxlu düzülmə proqramı, versiya 7.458) və -addfragments48 parametrindən istifadə etməklə həyata keçirilir. Sonra, müxtəlif klonal komplekslərin olmamasını və/və ya SNP xüsusiyyətlərinin mövcudluğunu axtarın.
Yeni ardıcıllaşdırılmış Mycobacterium bovis (n = 42) və yığılmış genom layihəsinin orijinal oxunuşları (n = 3) kompleksi vSNP boru kəməri vasitəsilə Mycobacterium tuberculosis H37Rv istinad genomu ilə uyğunlaşdırır və müxtəlif klonların silinməsi və/və ya SNP xüsusiyyətlərinin mövcudluğu Axtarış aparılıb.
Müvafiq klonal kompleksə genomik məlumatları təyin etmək üçün xüsusiyyətlərin olmaması və/və ya SNP və spoligotipləmə profillərinin olmaması/olmaması barədə məlumat toplayın. Dörd layihə məclisləri üçün spoloqotipləmə profilini çıxarmaq mümkün deyil, ona görə də onlar “mürəkkəblik” qrupuna daxildir.
Bu işin ardınca gedən bioinformatika iş axını rekombinasiya hadisələrini və spesifik genom polimorfizmlərini araşdırmaq məqsədi ilə de novo montaj və xəritələşdirmədən istinad strategiyasına qədər başlayır. Şəkil 1 izlənilən addımların axın sxemini təqdim edir. Rekombinasiya analizi üçün bütün genomlar çıxarışların və əlaqəli göstəricilərin möhkəmliyini artırmaq üçün istifadə olunur.
Genom konsensus ardıcıllığının yaradılmasında səhvləri azaltmaq üçün biz əvvəlcə de novo montajını əldə etdik, sonra isə əsas çoxlu uyğunlaşdırma əldə etdik. Unicycler boru kəməri hazırda https://github.com/rrwick/Unicycler49 saytında mövcuddur və 54 ardıcıl genomun de novo yığılmasını həyata keçirmək üçün istifadə olunur (SRA-dan bərpa edilmiş 42 yeni ardıcıl və 12 fastq faylı). Qısacası, sıfırdan yığılmazdan əvvəl FastQC versiya 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) və Trimmomatic versiya 0.36-da oxu keyfiyyətinin təhlili aparıldı (seçim "Oxumalardan Adapterləri və digər işıqlandırmaya xas ardıcıllığı kəsin" və "Oxuma keyfiyyəti 0-dan aşağı olarsa, əsasları kəsin") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Daha sonra genom yığılması üçün SPAdes optimiser49, montajdan sonrakı optimallaşdırma üçün isə Pilon versiyası 1.1851 istifadə edilmişdir. Yanlış montajın qarşısını almaq üçün mühafizəkar körpü rejimi seçildi və k-mer ölçüsü axtarıldı və oxunma uzunluğunun 20%-95%-i arasında seçildi. SPAdes təlimatlarına əməl edin və oxunma ölçüsünü nəzərdən keçirin, 300 bp-dən kiçik kontigləri silin və 52-dən 20 oxu dərinliyi əhatə dairəsini təyin edin. De novo montaj strategiyasında yüksək təkrarlanan prolin-qlutamat (PE) və prolin-prolin qlutamat (PPE) paraloqları kimi genomik bölgələr silinmədi.
De novo montajının keyfiyyəti QUAST boru kəməri (http://quast.sourceforge.net/quast.html) vasitəsilə qiymətləndirilir, bu da kontig və M. bovis AF2122/97 istinad genomunun (NCBI qoşulma nömrəsi LT708304.1) Xəritəçəkmənin (Əlavə keyfiyyət parametrləri üçün 1-ə baxın) yenilənməsini asanlaşdırır.
vSNP boru kəmərinin (https://github.com/USDA-VS/vSNP) köməyi ilə Illumina ardıcıllığından yeni ardıcıllaşdırılmış M. bovisin FASTQ faylı M. bovis AF2122/97 istinad genomu (LT708304.1) ilə müqayisə edilir. Genom Analizi Alətlər dəstinin (GATK) 53, 54, 55 ən yaxşı təcrübə tövsiyələrinə uyğun olaraq yenidən kalibrləmə üçün standart filtr parametrləri və ya variant kütlə ballarını tətbiq edin. Nəticələr 150 və AC = 2 olan ən aşağı SAMtools kütlə balı ilə süzülür. Çirklənməni istisna etmək üçün oxunuşları yoxlamaq üçün həmçinin Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) istifadə edin. İşimizdə strategiyaları ardıcıllıqla xəritələmək üçün istifadə edilən vSNP boru kəməri bir sıra müəyyən edilmiş SNP və hədəfləri araşdırır, həmçinin qarışıq infeksiya ssenarilərini istisna edir. Oxunan genomun əhatə dairəsi 99% -dən daha yaxşıdır (Əlavə Cədvəl 1).
Xəritəçəkmə xətalarının və yanlış SNP-lərin qarşısını almaq üçün aşağıdakı hallarda variantı süzün: (1) 20-dən az oxunuşla dəstəklənir, (2) 0,9-dan az tezliyə malikdir, (3) ən azı bir Ştammdadır, lakin ən azı başqa bir gərginlikdə boşluqlar var. İnteqrasiya edilmiş genomika baxıcısı (IGV) versiyası 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 SNP-ləri və mövqeləri xəritələşdirmə və ya hizalama problemləri ilə vizual yoxlamaq üçün istifadə edilmişdir. Prolin-qlutamat (PE) və prolin-prolin glutamat (PPE) genləri yüksək dərəcədə dublikasiya olunduğundan və çoxgenli ailənin bir hissəsi olduğundan, onlar Illumina ardıcıllığı və yanlış xəritələşdirilməsi ilə asanlıqla səhv başa düşülür, buna görə də onlara üstünlük verilir. Buna görə də, analizdən PE/PPE genlərini və indelləri süzdük.
Bovilistə görə (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), bütün SNP-lər funksional kateqoriyalara bölünür. SnpEff boru kəməri (https://pcingola.github.io/SnpEff/) SNP nəticələrini (sinonim və ya sinonim olmayan dəyişikliklər) çıxarmaq üçün istifadə olunur. Mycobacterium bovis AF2122/97 genomunun (LT708304.1) yeni məlumat bazası yaradıldı.
Əsas genomun çoxlu uyğunlaşdırılması Parsnp v1.2 istifadə edərək həyata keçirilib, hazırda https://github.com/marbl/parsnp57 saytında mövcuddur, 69 tam genom/qaralama birləşmələri (-c variantı ilə) və M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) istinad kimi istifadə olunur. Dörd əsas çoxlu uyğunlaşdırma yerinə yetirildi: yalnız Eu2 klonlama kompleksinin üzvləri (n = 37), Avropa klonlama kompleksinin bütün üzvləri (n = 44), Avropa və Afrika klonlama kompleksinin birləşmə nöqtəsi (n = 51) və bu tədqiqata bütün Mycobacterium bovis daxildir (n = 70).
Parsnp tərəfindən yaradılan əsas düzülmə RAxML istifadə edərək CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 istifadə edərək maksimum ehtimal (ML) filogenetik ağacını çıxarmaq və 1000 idarə olunan replikasiyanı yerinə yetirmək üçün istifadə olunur.
Paralel olaraq rekombinasiya hadisələrinin mövcudluğunu yoxlamaq üçün üç müxtəlif alqoritm və bioinformatika alətindən istifadə olunur: SplitsTree4 proqramı, Gubbins (nukleotid ardıcıllığında rekombinasiya vasitəsilə qərəzsiz nəsil) boru kəməri və RDP4 (rekombinasiya aşkarlama proqramı, beta 4.101 versiyası) proqramı.
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59-da həyata keçirilən split parçalanma metodu statistik yoxlama üçün Phi testindən istifadə edərək köksüz filogenetik şəbəkəni hesablamaq üçün istifadə olunur və əhəmiyyət həddi p = 0,05-dir. Parsnp-in əsas multi-alignment analizi giriş kimi istifadə olunur və şəbəkə standartı kimi parçalanma parçalanması həyata keçirilir.
Gubbins boru kəməri v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 rekombinasiyanın Mycobacterium bovis-ə təsirini qiymətləndirmək üçün başqa bir üsul kimi defolt parametrlərlə işləyir. Boru kəmərində həyata keçirilən alqoritm müvafiq klon xəttini yenidən qurur. AF2122/97, LT708304.1) qarşılıqlıdır və rekombinasiya hadisəsini təmsil edən SNP klasterini aşkar etmək üçün ağacın hər budağında SNP-nin vəziyyətini skan edin RAxML-dən ML ağacı giriş faylları kimi istifadə olunur.
Nəhayət, Gubbins boru kəmərinin təklif etdiyi yenidən təşkil hadisəsini təsdiqləmək üçün RDP467-də (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 və SiScan66) həyata keçirilən altı alqoritm Parsnp-in əsas çoxlu düzülüşünə standart parametrlər altında tətbiq edilir. Müəyyən etdik ki, RDP4-də həyata keçirilən alqoritmlərdən ən azı üçü hər bir rekombinasiya hadisəsini yoxlamaq üçün ardıcıl olaraq mühüm siqnal nümayiş etdirməlidir.
Həm Gubbins, həm də RDP proqram təminatının 500 bp-ə qədər bir pəncərədə əsas çoxsaylı düzülmələri yoxlayaraq və de novo montaj zamanı PE/PPE genlərinin daxil edilməsinin tapılan rekombinasiya siqnallarına mane olmayacağını təsdiq edərək rekombinasiya siqnalları axtardığını nəzərə alaraq, sonrakı təhlillər homolinearlıq vasitəsilə həyata keçirilir. Hadisənin yaxınlığını yoxlayın. Tam genomdan istifadə edən sinxətti xəritə yerli genom translokasiyalarını və ya inversiyalarını istisna etmək üçün MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) istifadə edərək qurulmuşdur. Bundan əlavə, bütün genom SyntTax veb serveri (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) vasitəsilə amin turşusu ardıcıllığı üzrə homolinerlik analizini aparmaq üçün istifadə edilmişdir.
Portuqaliya multi-host vərəm sistemindən əldə edilən genom məlumat dəstinin daha dərin təhlili ədəbiyyatda qeyd olunan genlərin polimorfizmini yoxlamaqdan ibarətdir. Bu genlər 37,38 və HGT (DNT təmiri, replikasiyası və rekombinasiyası) sistem komponentləri vasitəsilə MTBC əcdadları tərəfindən əldə edilən 3R-ni kodlayan gendir. nukleotid müxtəlifliyi (π) və Tajimanın D neytral test parametrinin girişi.
69 Mycoplasma bovis təcridinə və istinad genomlarına əsaslanan maksimum ehtimal (ML) filogenetik ağac əldə edilmişdir (Şəkil 2A). Tək gen əsaslı ağaclarla və ya çox yerli ağaclarla müqayisədə bu strategiya bütün genomun dəyişkənliyini tutmayan və buna görə də 68,69 növlər arasında ayrı-seçkilik etmək qabiliyyətini aşağı salan daha güclü ağacların yaranmasına imkan verir. ML ağacının topoloji quruluşu adətən klonların kompleks təsnifatı ilə uyğun gəlir. Eu2-nin genomu bir budaqda toplanır və Af1-in genomu da birlikdə toplanır (Şəkil 2A). Nəticə həm də Mycobacterium bovis-in məlum təkamül əlaqəsinə uyğundur, yəni Eu1 üzvü ilə bütün digər klonal komplekslərdən və genomlardan ibarət qrup arasında böyük fərq var, lakin klon kompleksi 30 göstərilməyib. Klon kompleksi ilə filogenetik ağacda müşahidə edilən əlaqə arasındakı kiçik uyğunsuzluq, klonal kompleksin spesifik genomik bölgələrə əsaslanaraq təsvir edilməsi, filogenetik ağacın isə bütün genomu təmsil edən əsas genomların çoxsaylı düzülüşünə əsaslanması ilə izah edilə bilər.
Maksimum ehtimal filogenetik ağacı (GTR) rekombinasiya sahəsinin çıxarılmasından əvvəl (A) və (B) sonra Mycobacterium bovis genomunun əsas genom düzülüşünə əsasən qurulur. Budaq rəngləri Mycobacterium bovis klon kompleksini təmsil edir: Avropa 1 bənövşəyi, Avropa 2 qırmızı, Avropa 3 mavi, Afrika 1 narıncı və Afrika 2 yaşıldır. Ağac köklənir və miqyasda çəkilir və budaq uzunluğu hər bir sahə üçün əvəz kimi ölçülür.
Mycobacterium tuberculosis kompleksi klonal təkamülə uğramış kimi təsvir edilir və illər ərzində toplanmış sübutların əksəriyyəti davam edən HGT və rekombinasiya hadisələrinin MTBC15,17,18 aşkar edilə bilən səviyyədə baş verməyəcəyi fikrini dəstəkləyir.
Əvvəlki iş göstərdi ki, MTBC suşları20,21 arasında məhdud rekombinasiya ola bilər, digərləri isə ölçülə bilən rekombinasiya hadisələrini müəyyən edə bilmədi70,71. Yalnız Mycobacterium tuberculosis hesab edilən əvvəlki işdən fərqli olan Mycobacterium bovis-ə diqqət yetirməklə bu məsələni yenidən müzakirə edin 70,71; və ya MTBC-ni bütövlükdə nəzərdən keçirin, demək olar ki, heç bir M. bovis 20-ni təmsil etmir; və ya yalnız məhdudlaşdırıcı mal-qara fraksiyalarını nəzərə alın. Bu işdə mikobakteriya məlumat dəsti, rekombinasiya üçün skrininq üçün istifadə edilən bütün klonal kompleksləri təmsil edən cəmi 70 suşdan ibarətdir. Məlumat dəsti dörd məcmu səviyyəyə görə miqyaslanır: (1) Eu2 üzvləri, (2) bütün Avropa klon kompleksi üzvləri (yəni Avropa), (3) Avropa və Afrika klon kompleksi (Eu + Af) və (4) bütün məlumat Kolleksiyaları (əvvəlcə təsvir edilmiş heç bir klonlama kompleksinə daxil olmayan genomlar daxil olmaqla).
Bu fərziyyəni daha da öyrənmək üçün genomlar arasında rekombinasiya hadisələrinin olmamasını qiymətləndirmək üçün split-dekombinasiya şəbəkəsi həyata keçirilmişdir, çünki bu üsul fərdlər arasında əcdadların əlaqəsini vizuallaşdıra və ziddiyyətli filogenetik siqnalları göstərə bilər. Təhlildəki bütün dörd məlumat dəsti şəbəkədə döngələrin (yəni bir ağaca birləşməyən sahələr) mövcudluğunu təsdiqlədi, lakin Phi testinin statistik dəstəyi yoxdur (Eu2, p = 0,0956; Avropa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; bütün məlumat dəsti p45 və ya zəif olduğunu sübut edir). hadisələr (Şəkil 3A-D).
Avropada 2 genom (n = 37) (A), Avropa genomları (n = 44) (B), Avropa və Afrika genomları (n = 51) (C) və bütün məlumat dəsti (n = 70) (D).
Bu təhlildən sonra və bütün şəbəkələrdə dövri müşahidələr nəzərə alınmaqla, Qubbins boru kəmərində həyata keçirilən rekonstruksiya alqoritmi klonal nəslin yenidən qurulması və rekombinasiyanın M.bovis genomuna təsirinin qiymətləndirilməsini tamamlamaq üçün tətbiq edilmişdir. Əksəriyyəti terminal filiallarda (yəni tək genomda) baş verən rekombinasiya hadisələrinin məcmu sayını çıxarın (Cədvəl 2). Bu göstəricilər bütün məlumat dəstinin ardıcıllığını göstərir və rekombinasiya hadisələrinin tezliyinin mutasiyalardan 200-300 dəfə çox olduğunu göstərir. Budaqda rekombinasiya və nöqtə mutasiyalarının nisbi dərəcələrini təmsil edən rho/teta parametri 0,0037 ilə 0,0056 arasında görünür (Cədvəl 3). Bu yaxınlarda, 38 M. bovis ştammının nəşr olunmuş işi bu verilənlər bazasında əldə ediləndən daha yüksək rho/teta dəyərini (rho/teta = 0.1) nümayiş etdirdi, lakin Patané və həmkarlarının işi rekombinasiya parametrlərini çıxarmaq üçün istinad əsaslı montajdan istifadə etdi. terminal filialı.
Sonra, r/m parametri rekombinasiya və mutasiya tətbiqinin müxtəliflik nisbətini təmsil edir və onun orta dəyəri 0,025 ilə 0,037 arasındadır ki, bu da mutasiyalarla müqayisədə rekombinasiyanın M. bovisin genetik müxtəlifliyinə daha az ümumi təsir göstərdiyini göstərir (Cədvəl 3)). Geniş müqayisə üçün 23 genomdan ibarət MTBC verilənlər bazası üçün r/m parametrini qiymətləndirmək üçün oxşar metoddan istifadə edilib və orta qiymət 0,48620, Patané və həmkarlarının 38 M. bovis verilənlər bazası üçün isə orta dəyərin 0,98 olduğunu sübut edib. İlk araşdırmada, M. bovis (M. bovis BCG və istinad ştammı) işinə daxil olan 23 genomdan yalnız ikisi, buna görə də əldə edilən dəyər M. tuberculosis genomunun həddindən artıq ifadəsi səbəbindən qərəzli ola bilər. İkinci hesabatda təhlil edilən Mycobacterium bovis populyasiyaları əsasən ABŞ-dan və mal-qara sahiblərindən götürülüb. Bunun əksinə olaraq, məlumat dəstimizdə daha çox coğrafi yerlər və ev sahibi növlər təmsil olunur və müxtəlif populyasiya genetik xüsusiyyətlərinə malik müxtəlif klonal komplekslərdə qruplaşdırılmış genomlar da istifadə olunur, beləliklə, daha dərin və daha geniş Əhali bilikləri əldə edilir. Bizim məlumat dəstimizlə əldə edilən fərq r/m orta dəyəri rekombinasiya dərəcəsinin eyni taksonomik növlərə təyin edilmiş nəsillər arasında çox fərqli olduğu konsepsiyasına uyğundur, ona görə də bu nəticələr M. bovis klon kompleksinin rekombinasiya fərqləri nümayiş etdirə biləcəyini göstərir. Təsir də Didelot & Maiden72 tərəfindən təklif edildiyi kimidir. Buna baxmayaraq, daha çox sayda M. bovis genomunu daxil etməklə bu məlumat dəstini əhəmiyyətli dərəcədə genişləndirmək bu məqamı daha da aydınlaşdırmağa imkan verəcəkdir. Həm r/m, həm də rho/teta parametrləri budaqlar arasında dəyişkənlik göstərir və bu nəticə digər bakteriya növləri üzrə hesabatlara uyğundur72,73.
Nəhayət, Qubbins boru kəməri ilə müəyyən edilmiş yenidən təşkiletmə hadisələrini təsdiqləmək üçün RDP4 proqram təminatında müxtəlif əsas çoxlu müqayisələri müstəqil şəkildə sınaqdan keçirmək üçün altı müxtəlif alqoritmdən istifadə edilmişdir. Qlobal olaraq, Qubbins tərəfindən müəyyən edilmiş hadisələrin yarısından azı RDP4 tərəfindən təsdiq edilmişdir (Cədvəl 4 və 5). Bütün məlumat dəstini nəzərə alaraq, ikisi daxili düyünləri əhatə edən üç rekombinasiya hadisəsi təsdiqləndi, digəri isə klonal komplekslərin təyin edilə bilməyən terminal filialında tək genomu əhatə edir (Cədvəl 4 və 5). Terminal budaqlarındakı hadisələrin identifikasiyası müasir M. bovis ştammlarında rekombinasiyanın hələ də davam etdiyini və ya nəticənin yanlış yerləşdirildiyini göstərə bilər70. Bu hipotetik rekombinasiya bölgəsində mövqelərin təxminən 20%-i təyin olunmamış nukleotidlərə (N) malikdir və beləliklə, rekombinasiya siqnalına təsir göstərir (Əlavə Şəkil 2). Bundan əlavə, bu bölgə yüksək qorunub saxlanması gözlənilən 16S ribosomal RNT-ni kodlayan rrs geninə təsir edir, ona görə də bu ehtimal olunan rekombinasiya siqnalı ardıcıllıq səhvlərinin və ya uyğunsuzluğun nəticəsi ola bilər. Sonra Mb0003 və Mycobacterium bovis AF2122/97 arasında bütün genom düzülüşü həyata keçirildi və qeyri-müəyyən nukleotidlərin və SNP-lərin mövcudluğu təsdiqləndi, buna görə də səhv düzülmə ilə bağlı mümkün problemlər bu işdə həyata keçirilən bioloji məlumatlarla bağlı deyildi. Proqramı öyrəndikdən sonra ortaya çıxdı.
Daxili qovşaqların rekombinasiya bölgələrində boşluqlar və ya müəyyən edilməmiş nukleotidlər aşkar edilməmişdir (Şəkil 4 və 5). Bu hadisələrlə əlaqədar olaraq, biri yalnız Eu2 genomunu ehtiva edir və mümkün poliketid sintazını kodlayan pks12 geninə təsir edir; digəri isə Eu1 genomunda qeydə alınır və mümkün nitrat reduktazını kodlayan narX geninə təsir göstərir (Cədvəl 4). Ümumiyyətlə, rekombinasiya təhlili göstərir ki, statistik dəstək ilə məhdud sayda rekombinasiya fraqmentləri mövcuddur və nəticələnən göstəricilər rekombinasiyanın M.bovis nəslinə aşağı təsir göstərdiyini göstərir. Rekombinasiya siqnalının aşağı olması gözlənilir, lakin əsl təkamül siqnalını çətin iş olan fon səs-küyündən ayırmaq vacibdir. İstinad əsaslı montaj və uyğunsuzluq problemləri 70, 71 tərəfindən təqdim edilən səs-küy siqnalını azaltmaq üçün tam genomdan başqa bütün qalanlar sıfırdan yığıldı və montaj keyfiyyəti QUAST boru kəməri analizi ilə yoxlanıldı və təmin edildi (Əlavə Cədvəl 1). Bundan əlavə, ümumi sorğunun möhkəmliyini və düzgünlüyünü təmin etmək üçün bir sıra əlavə təhlillər aparılmışdır. Buna görə də, narX və pks12 genlərinin ardıcıllıq keyfiyyəti Mycobacterium bovis AF2122/97-yə qarşı oxunmuş xəritələmə ilə qiymətləndirilmişdir. Rekombinasiya bölgəsində tövsiyə olunan SNP mövqeyi metod bölməsində qeyd olunan meyarların tətbiqi ilə təsdiqləndi (ən azı 20 oxunuş və 0,9 dəyişiklik tezliyi). NarX geninin polimorfizmi iki genomda (Mb1792361 və Mb7240415; 2,3%) və pks12 genomunun genomlarında: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1716es və Mb17176b. Bununla belə, Mb2043 genomu üçün səkkiz mövqedən altısı oxunma dərinliyi meyarına uyğun gəlmir, çünki SNP maksimum 17 oxunuşla dəstəklənir ki, bu da müəyyən edilmiş kəsilmə dəyərindən 20-dən aşağıdır. Buna görə də, bu genom yerində altı genomun (8,6%) rekombinasiyası təsdiqlənə bilər (Şəkil 4 və 5).
Mycobacterium bovis məlumat dəstinin rekombinasiya bölgəsinin uyğunlaşdırılmasının təfərrüatlı vizuallaşdırılması mümkün nitrat reduktazını kodlayan narX geninə təsir göstərir. Daxili qovşaqların rekombinasiya bölgəsində boşluqlar və ya müəyyən edilməmiş nukleotidlər aşkar edilməmişdir. Bu xüsusi hadisə Eu1 genomunda qeydə alınıb. NarX geninin ardıcıllıq keyfiyyəti Mycobacterium bovis AF2122/97-nin oxunuşlarını tərtib etməklə qiymətləndirilib. Metod bölməsində qeyd olunan meyarları tətbiq etməklə (ən azı 20 oxunuş və 0,9 dəyişmə tezliyi) rekombinasiya sahəsində tövsiyə olunan SNP yerini təsdiq edin. NarX geninin polimorfizmi Mb1792361 və Mb7240415 (2,3%) genomlarında tam təsdiqlənib.
Pks12 geninə təsir edən Mycoplasma bovis məlumat dəstinin rekombinasiya bölgəsinin uyğunlaşdırılmasının ətraflı vizuallaşdırılması. Daxili qovşaqların rekombinasiya bölgəsində boşluqlar və ya müəyyən edilməmiş nukleotidlər aşkar edilməmişdir. Mümkün poliketid sintazı kodlayan pks12 geninə təsir edən hadisəyə gəldikdə, o, yalnız Eu2 genomunu ehtiva edir. Pks12-nin ardıcıllıq keyfiyyəti Mycobacterium bovis AF2122/97-nin oxunmuş xəritələşdirilməsi ilə qiymətləndirilmişdir. Metod bölməsində qeyd olunan meyarları tətbiq etməklə (ən azı 20 oxunuş və 0,9 dəyişmə tezliyi) rekombinasiya sahəsində tövsiyə olunan SNP yerini təsdiq edin. Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 və Mb1960 genomlarının polimorfizmləri tam təsdiq edilmişdir.
PE və PPE genlərinin təkrarlanan bölgələri var ki, onlar Illumina ardıcıllığı və yanlış xəritələşdirilməsi ilə asanlıqla səhv oxunur, buna görə də onlar adətən M. tuberculosis üzvlərinin bioinformatika iş axınından yalnız ardıcıllıqla xəritələşdirmə strategiyasından istifadə edərkən silinir. Bu işdə tətbiq olunan rekombinasiya hadisələrinin nəticəsi PE/PPE-ni süzmədən de novo montaja əsaslanır. İnanırıq ki, SplitsTree, Gubbins boru kəməri və RDP4 proqramı vasitəsilə üç fərqli tamamlayıcı üsul və alqoritm tətbiq etməklə, tətbiq olunan strategiyalar səhv siqnallarının yaratdığı yenidən təşkil edilmiş bölgələri emal etmək və süzmək üçün möhkəmdir. Bununla birlikdə, SNP çoxluqlarını müəyyən etmək üçün PE/PPE geninin Gubbins və RDP4 proqram təminatına müdaxiləsini istisna etmək və buna görə də narX və pks12 genlərinə təsir etmək üçün təklif olunan rekombinasiya bölgələrinin müəyyən edilməsi üçün bu genlərin qonşuluğu araşdırıldı (Əlavə Şəkil 3-5). M. bovis AF2122/97-də narX geni narK2 və Mb1764c ilə ayrılır, pks12 isə Mb2075c e Mb2073c ilə əhatə olunur (Əlavə Şəkil 3-5). Tam genomun MAUVE sinline xəritəsindən istifadə etməklə yaradılan xəritə dörd kollinear bloku göstərən gen ardıcıllığının qorunması və yenidən təşkili haqqında məlumat verir və genomun translokasiyası və ya inversiyasının əlamətləri yoxdur. Bundan əlavə, amin turşusu ardıcıllığı ilə komplementasiya təhlili bütün tam genomlarda homologiyanı sübut etdi və narX və ya pks12-nin bitişik bölgələrində heç bir PE/PPE tapılmadı. NarX üçün bir genomun (Mb0030) daha aşağı sinonimik xalı var, çünki narX geni iki fraqment (1891 və 1890 fraqmentləri) kimi müəyyən edilib. Pks12 üçün, oxşarlıqlara görə, Mb0030 və Mb003 daha aşağı sinlinearlıq balları nümayiş etdirdi, pks12 isə zülalın müxtəlif sahələrini təmsil edən müvafiq olaraq iki və üç fraqmentdə müəyyən edildi (Əlavə Şəkil 3-5). Bu məlumatı nəzərə alaraq, Gubbins və RDP4 proqram təminatı hər ikisi analiz aparır, pəncərədə maksimum 500 bp-nin əsas çoxlu düzülməsini yoxlayın, PE/PPE geninin narX və pks12-yə təsir edən rekombinasiya siqnalına müdaxilə etməyəcəyini təsdiq etdik.
Bu məlumat dəstində aşkar edilən rekombinasiya siqnalları qalıq hesab oluna bilsə də, doğrudur ki, M. bovisdə rekombinasiya istisna oluna bilməz, ona görə də o, müxtəlif epidemioloji ssenarilərdən olan bütöv genomların Əhəmiyyətli olaraq sıralandığı sonrakı təhlillərin mövzusu olmağa davam etməlidir.
Rekombinasiya korreksiyasından əvvəl və sonra əldə edilən ML filogenetik ağaclarının müqayisəsi (Şəkil 2A, B) fərz edilən filogenetik əlaqədə əhəmiyyətli dəyişikliklərə səbəb olmadı və M. bovis ştammları eyni qrupda toplandı.
M. bovis AF2122/97 istinad genomu ilə 42 yeni ardıcıl M. bovis oxunmasını xəritələşdirdikdən sonra 1816 polimorfik mövqedən ibarət SNP düzülüşü əldə edildi. SNP-lərin əksəriyyəti (87.1%) kodlaşdırma bölgəsində yerləşir və təsirlənmiş genlər Bovilist-də göstərilən funksional kateqoriyalara uyğun olaraq xarakterizə olunur (Şəkil 6A, B). Hər bir funksional kateqoriyada olan genlərin ümumi sayını nəzərə alaraq, “lipid mübadiləsi” kateqoriyasındakı genlər daha çox SNP göstərmiş, ardınca “hüceyrə divarı və hüceyrə prosesləri” və “aralıq metabolizm və tənəffüs” onların M.bovis təkamülündə olduqlarını ortaya çıxarmışdır.
Portuqaliyadan M. bovis məlumat dəstinin iyerarxik təhlili (n = 42). Hər bir funksional kateqoriya (A) üçün qeydə alınmış SNP və təsirlənmiş genlərin ümumi sayı. Funksiya kateqoriyası (B) üzrə qeydə alınmış sinonim və qeyri-sinonim dəyişikliklərin ümumi sayı.
Qlobal miqyasda orta dN/dS nisbəti 1,5-dən daha yaxşıdır, bu, qlobal təkamül təzyiqinin ata-baba dövlətindən xilas olmaq olduğunu göstərir və müsbət (şaxələndirilmiş və ya yönəldilmiş) və/və ya rahat təmizlənmə seçim ssenarisini təmsil edir. "Virulentlik, detoksifikasiya, uyğunlaşma", "yerləşdirmə ardıcıllığı və faqlar" və "tənzimləyici zülallar" kateqoriyalarında SNP-lərin üçdə ikisindən çoxu qeyri-sinonimdir (Şəkil 6B).
Bütün kateqoriyalarda çoxlu SNP olan genlər var ki, nəticədə orta mutasiya sürəti (yəni gen başına orta SNP) 1-dən çox olur (Şəkil 6A). 15 SNP ilə Pks12 (Mb2074c) və 8 SNP ilə fas (Mb2553c) daha yüksək mutasiya qiymətlərinə malikdir. Bu genlərin hər ikisi yağ turşularının mübadiləsində iştirak edir. Pks geni mikobakteriyaların hüceyrə divarının lipid biosintezində iştirak edən çoxfunksiyalı ferment olan poliketid sintazı (PKS) kodlayır74,75. Bu gen mikoketidlərin sintezində iştirak edən çoxfunksiyalı polipeptidi kodlayır74,76. Fas geni mikolik turşunun sintezində iştirak edir. Bu genlərin hər ikisi ev sahibi ilə təmasda olan hüceyrə divarının biosintezində mühüm rol oynayır.
Mycobacterium bovis-in təkamülünü daha da öyrənmək üçün iki xüsusi gen dəsti təhlil edilmişdir. Ardıcıllıq tərkibi və filogenetik üsullardan istifadə edərək əvvəllər nəşr olunmuş əsərlər diversifikasiyadan əvvəl HGT vasitəsilə MTBC əcdadları tərəfindən əldə edilmiş genləri müəyyən etdi37,38. Bu genlər Əlavə Cədvəl 2-də verilmişdir. HGT ilə əlaqəli ola biləcək cəmi 77 genin SNP paylanması təhlil edilmiş və əksər hallarda (78%) sinonim olmayan (NS) dəyişikliklərlə nəticələnən 26 polimorfik sahə müəyyən edilmişdir (Əlavə Cədvəl 2). MTBC genomu üzərində əvvəlki iş, ehtimal olunan HGT bölgəsinin genomun qalan hissəsi ilə müqayisədə daha yüksək NS SNP nisbəti nümayiş etdirdiyini nümayiş etdirdi. Əgər bu rekombinasiya bölgələrinin MTBC əcdadları tərəfindən alındığını və buna görə də onların qədim polimorfizmləri çox təmsil etdiyini düşünsəniz, o zaman sinonim dəyişikliklərin nisbətinin daha yüksək olacağı gözlənilir, çünki amin turşularının dəyişməsi səbəbindən NS əvəzetmələrinin mənfi seçimlə aradan qaldırılacağı gözlənilir. Zülalın funksiyasını dəyişə bilər. Buna görə də, nəticələrimiz göstərir ki, funksional nəticələr HGT kimi genlərin dəyişdirilməsindən qaynaqlana bilər ki, bu da onların dəyərli adaptiv genetik müxtəliflik üçün əhəmiyyətini əks etdirir.
Bu analizlə paralel olaraq, 3R (DNT təmiri, replikasiyası və rekombinasiyası) sisteminin komponentlərini kodlayan genlər dos Vultos və əməkdaşları (2008)39 tərəfindən əvvəllər dərc edilmiş siyahıya uyğun olaraq hərtərəfli tədqiq edilmişdir. Eyni DNT fraqmentlərinin mübadiləsini birbaşa müşahidə etmək mümkün deyil, baxmayaraq ki, bu, yaxından əlaqəli bakteriyaların iştirak etdiyi zaman tez-tez baş verən proses ola bilər, məsələn, bu məlumat toplusunda olduğu kimi; əlavə olaraq, bu proses DNT təmiri üsullarının açarı ola bilər72, ona görə də homoloji rekombinasiyada rol oynayın. 54 gen tərəfindən paylanmış cəmi 26 polimorfik mövqe müəyyən edilmişdir (Əlavə Cədvəl 3). Bu gen dəstində NS dəyişiklikləri nəticələrin təxminən 65%-ni təşkil etmişdir ki, bu da Mycobacterium tuberculosis suşları ilə bağlı əvvəlki hesabatlara uyğundur.
Göndərmə vaxtı: 21 oktyabr 2021-ci il