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U sequenziamentu di u genomu hà rivitalizatu u campu di a ricerca nantu à e malatie infettive, rivelendu l'epidemiologia di e malatie, a patogenesi, l'interazzione ospite-patogenu è u prucessu evolutivu impostu à i patogeni. U cumplessu Mycobacterium tuberculosis (MTBC) cunsidereghja Mycobacterium bovis cum'è unu di i so membri adattativi animali chì causanu a tuberculosi (TB) in i mammiferi terrestri, è hè un mudellu tipicu di evoluzione batterica. Cum'è l'altri membri di MTBC, si presume chì Mycobacterium bovis sia un patogenu strettamente clonatu, in evoluzione lenta, è ùn ci hè ovviamente alcun segnu di ricombinazione o trasferimentu di geni orizzontale. In questu travagliu, applichemu a genomica comparativa à un inseme di dati di sequenza di genomu interu (WGS) cumpostu da 70 bovini M. da diverse genealogie (Europa è Africa) per ottene informazioni nantu à a diversità genetica di i bovini M. Putere evolutivu. Trè metudi diversi sò aduprati per stimà i segni di riurganizazione. À u livellu mundiale, un picculu numeru di eventi di ricombinazione sò stati identificati è cunfirmati da dui metudi indipendenti cù un supportu solidu. Eppuru, paragunatu à e mutazioni, a ricombinazione hà un effettu più debule nantu à a diversità di M. bovis (r/m generale = 0,037). A differenza r/m media ottenuta in u cumplessu clonale di Mycobacterium bovis in u nostru inseme di dati hè coerente cù u cuncettu generale chì u gradu di ricombinazione pò varià assai trà i lignaggi assignati à a stessa spezia tassonomica. Basatu annantu à questu travagliu, a ricombinazione in Mycobacterium bovis ùn pò esse esclusa, dunque duveria esse l'ughjettu di ulteriori sforzi in a futura ricerca di genomica comparativa, in a quale u WGS di grandi insemi di dati da diversi scenarii epidemiologichi in u mondu hè cruciale. Un'analisi supplementaria hè stata dopu realizata nantu à u più chjucu inseme di dati Mycobacterium bovis (n = 42) da a prevalenza di a tuberculosi multi-ospite, è sò stati identificati più di 1.800 loci, di i quali almenu un ceppo hà mostratu un polimorfismu à un solu nucleotide (SNP). A maiò parte (87,1%) sò situati in a regione codificante, è u rapportu glubale di cambiamenti non sinonimi (dN/dS) di cambiamenti sinonimi supera 1,5, ciò chì indica chì a selezzione pusitiva hè una forza evolutiva impurtante esercitata nantu à M. bovis. Una proporzione più alta di SNP hè stata rilevata in geni ricchi di categurie funziunali di "metabolismu lipidicu", "parete cellulare è prucessi cellulari", è "metabolismu intermediu è respirazione", rivelendu u so putenziale in a biologia è l'evoluzione di l'impurtanza di Mycobacterium bovis. Un sguardu più vicinu à i geni in l'antenati MTBC chì sò propensi à u trasferimentu di geni horizontale è inclusi in u sistema 3R (riparazione, replicazione è ricombinazione di u DNA) rivela u valore negativu mediu glubale di u test neutru D di Taijima, chì indica a scansione selettiva passata. U recente collu di buttiglia dopu l'espansione di a pupulazione hè sempre u principale fattore evolutivu per u patogenu obligatoriu Mycobacterium bovis per cumbatte l'ospite.
U cumplessu di Mycobacterium tuberculosis (MTBC) hè unu di i taxa i più riesciuti di patogeni batterichi è un casu tipicu di evoluzione batterica. I so membri mostranu una identità di nucleotidi sorprendentemente alta à u livellu genomicu (> 99%)1,2. Diversi ecotipi MTBC ponu causà a tuberculosi (TB), chì hè una malattia granulomatosa infettiva, in una vasta gamma di spezie ospiti da i micromammiferi à l'umani3,4,5. Attualmente, u cumplessu include l'umani [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] è patogeni adattati à l'animali (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" è "dassie")5,6. M. canettii (cunnisciutu ancu cum'è "Nodobacter glabrata") L'identità media di i nucleotidi cù e micobatterie sopra menzionate hè di 98%, è u travagliu di genomica comparativa hà dimustratu chì M. canettii è u restu di MTBC anu recentemente divergitu da l'antenatu cumunu.7 Cunsiderendu questu cuncettu, certi autori chjamanu M. canettii Membru di MTBC 8.
U MTBC hè discrittu sistematicamente cum'è un cumplessu clonale strettu, è a so struttura di pupulazione hè chjaramente guvernata da una diversità ridutta, colli di buttiglia, scansione selettiva è deriva genetica9,10. Supponendu chì l'evoluzione clonale stretta cumplessa, cum'è i polimorfismi mancanti, ùn pò esse restaurata da a ricombinazione. Basatu annantu à sta premessa, l'eventi cunsecutivi di a delezione genomica di a regione differenziale (RD) è TbD1 (regione di delezione specifica di Mtb 1) sò stati pruposti cum'è marcatori moleculari di l'evoluzione MTBC2,5,11. U travagliu di genomica cumparativa è di sequenziamentu di u genomu interu (WGS) sustene a divisione di i membri adattati à l'omu in nove lignaggi (Mycobacterium tuberculosis L1 à L4, L7 è L8; è Mycobacterium africanum L5, L6 è L9), i lignaggi L2 à L4 anu spartutu a regione TbD1 di delezione2,11,12,13. Inoltre, si propone chì i membri adattati à l'animali spartinu un antenatu cumunu, chì hè definitu da delezioni specifiche di clade in RD7, RD8, RD9 è RD102, 5 è 14.
L'eventi di trasferimentu geneticu horizontale (HGT) è di ricombinazione sò cunsiderati rari è si verificanu in l'antenati di MTBC, invece di a storia diversa di tuttu u membru MTBC15,16,17. Dui primi rapporti di Hughes è collaboratori (2002) è Gutacker è collaboratori (2006) anu suggeritu chì l'eventi di ricombinazione ponu aiutà à furmà polimorfismi chì marcanu loci specifici in ceppi di M. tuberculosis18,19. I motivi di l'evidente mancanza di ricombinazione in MTBC sò: (1) u prucessu meccanicu è a perdita di capacità di HGT; (2) a rarità di l'eventi HGT; (3) ùn ci hè alcuna chance di eventi di ricombinazione in a nicchia MTBC14,17. Recentemente, alcuni studii di sequenziamento di u genomu interu (WGS) applicati à u ceppo MTBC 20 è Mycobacterium bovis 21 anu furnitu evidenze di ricombinazione, i primi à mustrà chì i ceppi MTBC scambianu spessu picculi frammenti di DNA, ma per via di a variazione limitata di a sequenza di nucleotidi, questi eventi ùn sò ancu nutati.
Mycobacterium bovis hè u membru MTBC u più cumunamente recuperatu da u bestiame (principalmente bovini), ancu s'ellu pò ancu esse isolatu da animali salvatichi in libertà è recintati4,22,23,24. M. bovis hà evolutu in cinque principali cumplessu clonali [Europeu 1 (Eu1), Europeu 2 (Eu2), Europeu 3 (Eu3), Africanu 1 (Af1) è Africa 2 (Af2)], secondu u prufilu di spoligotipizzazione, delezioni specifiche è polimorfismi di nucleotidi singuli (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 in geni specifici. Quessi cumplessu clonali dimustranu a struttura diversa di a pupulazione di Mycobacterium bovis è a so associazione cù e regioni geografiche. Inoltre, u recente travagliu WGS realizatu da Zimpel è i so collaboratori (2020) hà cuncipitu una filogenia basata annantu à u SNP di Mycobacterium bovis, cù più di 1.900 genomi, chì indicanu chì ci sò almenu quattru lignaggi diffirenti (chjamati Lb1 à Lb1 à Lb4), ùn sò micca cumpletamente coerenti cù u cumplessu clonale definitu prima, ancu s'è a specificità geografica pò ancu esse cunfirmata30. Quessi autori anu realizatu analisi differenziali di a filogenia è a datazione moleculare, ma ùn anu micca studiatu a ricombinazione30.
I travagli precedenti chì utilizanu diverse tecniche moleculari, cum'è a spoligotipizzazione, MIRU-VNTR (numeru di ripetizioni in tandem variabile trà unità di ripetizione intersperse di micobatteri), è a recente tipizzazione SNP anu rivelatu un certu livellu di diversità genetica trà i ceppi di M. bovis 31,32,33, 34,35. A differenziazione di a variazione genetica hè diventata un strumentu impurtante in u studiu di l'epidemiologia di e malatie, chì hè utile per una comprensione approfondita di a patogenesi, a virulenza è a trasmissione di e malatie. L'emergenza di u metudu WGS offre a pussibilità di revelà i fattori evolutivi chì guidanu u genomu di Mycobacterium bovis in u prucessu di adattazione è persistenza à diversi ospiti è scenarii epidemiologichi.
In questu travagliu, usemu l'analisi genomica cumparativa annantu à diversi insemi di dati di Mycoplasma bovis (n = 70), cumpresi isolati da diversi complessi clonali, per ottene informazioni nantu à u prucessu evolutivu di Mycoplasma bovis, in particulare per risolve e relazioni filogenetiche è l'eventi di ricombinazione. Cum'è supplementu à sta analisi, un inseme di sottodati di isolati di M. bovis (n = 42) ottenuti da una zona di tuberculosi multi-ospite ben caratterizzata in Portugallu 31,36 hè statu ulteriormente esploratu per deduce a non identità. L'equilibriu trà u rapportu relativu di sustituzioni di nucleotidi sensu (dN) à sinonimi (dS), è ancu u cuntributu evolutivu di genomi specifici citati in a literatura, sò 37,38 ottenuti da antenati MTBC attraversu HGT, è codificanu i cumpunenti di u genu di u sistema 3R (riparazione, replicazione è ricombinazione di u DNA) 39. Sceglite i geni ottenuti attraversu HGT perchè ponu rapprisintà polimorfismi antichi, dunque si prevede chì ponu cuntene una proporzione più alta di cambiamenti sinonimi. I geni inclusi in u sistema 3R sò stati selezziunati perchè u travagliu precedente nantu à i ceppi di M. tuberculosis indicava selezioni generali negative/di purificazione chì funzionanu nantu à questi geni, è ponu ghjucà un rolu impurtante in l'evoluzione 39. Un altru scopu di questu travagliu hè di deduce l'esistenza di eventi di riurganizazione. Per questa ragione, cunsiderendu chì u nostru inseme di dati da u Portugallu cuntene solu i genomi di u cumplessu clonale europeu 2 è i ceppi chì ùn anu micca assignatu u cumplessu clonale, avemu decisu di include dati di genomu dispunibili publicamente per ottene infine un rappresentativu di tutti i cumplessi clonali, è migliurà a robustezza è l'ampiezza di i risultati.
42 genomi di Mycoplasma bovis recentemente sequenziati da a scena endemica portoghese di tuberculosi multi-ospite (dettagli sottu), precedentemente caratterizati da una perspettiva epidemiologica36, sò u centru di stu travagliu. Cunsiderendu chì u set di dati da u Portugallu hà solu rapprisentanti di i cumplessi di cloni europei 2 è ceppi senza cumplessi designati, i dati di sequenziamentu di u genomu interu dispunibili publicamente sò stati aghjunti per espansione u set di dati chì include tutti i rapprisentanti di i cumplessi di cloni M. bovis. Dunque, trè fonti di dati di sequenziamentu di u genomu interu sò state aduprate in questu travagliu: assemblaggio di genomu cumpletu / bozza, finu à 10 scaffold almacenati in NCBI (Centru Naziunale per l'Informazione Biotecnologica) (n = 15 isolati); almacenatu in SRA (u schedariu Illumina fastq di l'archiviu di lettura di sequenze) rapprisenta a diversità cumplessa di i cloni M. bovis (n = 12 isolati)30; è 42 genomi recentemente sequenziati da u Portugallu. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) hè statu esclusu da a ricerca NCBI. M. bovis AF2122/97 hè generalmente adupratu cum'è genomu di riferimentu da include in u set di dati. A causa di a mancanza di dispunibilità publica di a sequenza cumpleta di u genomu rapprisentata da u cumplessu di clonazione African 1, è u picculu numeru di genomi da ceppi rapprisentativi di Af2 è Eu1, i dati di sequenziamentu originali furniti da SRA sò stati aduprati in questi casi. U travagliu di Zimpel è i so collaboratori (2020) hà aiutatu à identificà u genomu da u cumplessu di clonazione sopra menzionatu è hà aiutatu à selezziunà Mycobacterium bovis per l'inclusione in u set di dati. Per Eu3, solu un tipu di genomu hè discrittu (Branger et al., 2020), dunque u genomu chì includemu hè un rappresentante separatu di u cumplessu Eu3.
À u livellu mundiale, questu inseme di dati include 70 bovini M. bovis isolati da 8 spezie ospiti, distribuiti in 12 paesi da u 1985 à u 2016. 36 spezie sò designate cum'è Eu2, 7 spezie sò Eu1, 1 spezie hè Eu3, 3 spezie sò Af1, 4 spezie sò Af2 è 19 ùn sò micca attribuibili à alcun cumplessu clonale (dettagli quì sottu). L'infurmazioni dettagliate (cumpresu u numeru d'accessu) di Mycobacterium bovis utilizati in questu studiu sò mostrati in a Tabella 1 è in a Tabella Supplementare 1.
42 genomi interi di Mycobacterium bovis, recentemente sequenziati, da i punti caldi di tuberculosi animale in Portugallu è distribuiti per più di 12 anni sò u centru di questu studiu, postu chì i sistemi potenziali di malatie trà a fauna salvatica è u bestiame sò stati monitorati regularmente 31,36 (Figura supplementare 1). Sicondu e procedure successive, questi ceppi sò stati isolati da bovini (n = 14), cervi rossi (n = 16) è cinghiali (n = 12) da u 2003 à u 2015: raccoglie è maneghjà l'animali in cunfurmità cù e linee guida di u protocolu raccomandate. I campioni di tessuti sò in u Manuale di l'Animali Terrestri di l'OIE è sò inoculati nantu à u mezu solidu è u mezu liquidu di piruvatu Stonebrink è Löwenstein-Jensen. E culture sò incubate à 37 °C è a crescita hè verificata una volta à settimana per almenu 12 settimane. E culonie sò conservate direttamente in una soluzione di glicerolo à -80ºC. In u mezu selettivu Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), i campioni originali archiviati sò stati passati per un unicu passaghju in vitro in vitro per ottene u DNA di u prugramma WGS. Per questu, a suluzione di cultura congelata hè stata arricchita cù 5% di piruvatu di sodiu è 10% di ADS (50 g di albumina, 20 g di glucosiu, 8,5 g di cloruru di sodiu in 1 L d'acqua) nantu à Middlebrook 7H9 à 37 °C Retrain. Dopu à 4 settimane di crescita, u mezu hè statu rinnuvatu è a cultura hè stata monitorata regularmente finu à chì a crescita hè stata osservata. E cellule sò state raccolte per centrifugazione, u pellet hè statu risospesu in 500 µL di soluzione salina tamponata cù fosfatu (PBS), riscaldatu à 99 °C per 30 minuti, centrifugatu è u surnatante hè statu cunservatu à -20 °C finu à WGS. Tutte e procedure sò realizate in strutture di biosicurezza di livellu 3.
A biblioteca di genomi à estremità appaiate WGS hè preparata aduprendu l'indice unicu di ogni campione di DNA, è usa a tecnulugia Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 campioni) è HiSeq (2 × 150 pb) (dui isolati) (Eurofins Genomics, Germania) per u sequenziamentu. Sicondu l'istruzzioni di u fabricatore, aduprate l'Illumina Genome Analyzer cù un modulu à doppia estremità per sequenzià u DNA genomicu, è aduprate u Nextera XT DNA Library Prep Kit di Illumina per custruisce a biblioteca.
Tenendu contu di i dati recuperati da l'SRA (n = 12), l'identificazione di u cumplessu clonale pò esse aduprata cum'è metadati di a publicazione currispundente 30, 41, 43. Quandu si cunsidereghja u genomu cumpletu, eccettu per Mycobacterium bovis AF2122/97 è Mycobacterium bovis 3601, chì sò membri ricunnisciuti di u cumplessu clonale Eu1 è Eu3 25, 29, rispettivamente, hè listessu chè u genomu cumpletu di Mycobacterium tuberculosis H37Rv (numeru d'accessu NCBI NC_000962.3). L'allineamentu di u genomu hè realizatu aduprendu MAFFT (prugramma d'allineamentu multiplu di sequenze d'aminoacidi o di nucleotidi, versione 7.458) è u parametru -addfragments48. Dopu, cercate l'assenza di diversi cumplessu clonali è/o a presenza di caratteristiche SNP.
U Mycobacterium bovis appena sequenziatu (n = 42) è e letture uriginale di a bozza di u genomu assemblatu (n = 3) allineanu u cumplessu cù u genomu di riferimentu Mycobacterium tuberculosis H37Rv attraversu a pipeline vSNP è a presenza di e caratteristiche di delezione è/o SNP di diversi cloni. Una ricerca hè stata realizata.
Raccoglie informazioni da a mancanza di caratteristiche è/o a presenza/assenza di SNP è profili di spoligotipizzazione per assignà dati genomici à u cumplessu clonale currispundente. Per i quattru assemblaggi in bozza, u profilo di spoligotipizzazione ùn pò esse deduttu, dunque sò inclusi in u gruppu "senza cumplessità".
U flussu di travagliu bioinformaticu seguitatu da questu travagliu principia da l'assemblementu de novo è a mappatura à una strategia di riferimentu, cù l'ubbiettivu di esplorà l'eventi di ricombinazione è i polimorfismi specifichi di u genomu. A Figura 1 furnisce un diagramma di flussu di i passi seguitati. Per l'analisi di ricombinazione, tutti i genomi sò aduprati per aumentà a robustezza di l'inferenze è di l'indicatori cunnessi.
Per riduce l'errori in a generazione di sequenze di consensu di u genomu, avemu prima ottenutu un assemblaggio de novo, è dopu avemu ottenutu allineamenti multipli core. A pipeline Unicycler hè attualmente dispunibule à https://github.com/rrwick/Unicycler49 è hè aduprata per realizà l'assemblaggio de novo di 54 genomi sequenziati (42 appena sequenziati è 12 fugliali fastq recuperati da SRA). In breve, prima di l'assemblaggio da zero, l'analisi di a qualità di lettura hè stata effettuata in FastQC versione 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), è Trimmomatic versione 0.36 (l'opzione "taglià l'adattatori è altre sequenze specifiche per l'illuminazione da letture" è "Tagliare e basi da a fine di a lettura, se inferiore à a qualità di soglia di 20" sò applicate) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Dopu, SPAdes optimizer49 hè statu utilizatu per l'assemblaggio di u genomu, è Pilon versione 1.1851 hè stata aduprata per l'ottimizazione post-assemblaggio. Una modalità di bridging cunservativa hè stata scelta per evità un assemblaggio incorrectu, è a dimensione di u k-mer hè stata cercata è selezziunata trà u 20% è u 95% di a lunghezza di lettura. Seguitate e linee guida SPAdes è cunsiderate a dimensione di lettura, eliminate i contig più chjuchi di 300 bp è stabilite un limite di copertura di prufundità di lettura di 20 di 52. In a strategia di assemblaggio de novo, e regioni genomiche cum'è i paraloghi altamente ripetitivi di prolina-glutamatu (PE) è prolina-prolina glutamatu (PPE) ùn sò stati rimossi.
A qualità di l'assemblea de novo hè valutata per mezu di u pipeline QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), chì facilita u rinnovu di u contig è a mappatura di u genomu di riferimentu M. bovis AF2122/97 (numeru d'accessu NCBI LT708304.1) (vede a Tabella Supplementare 1 per i parametri di qualità).
Cù l'aiutu di a pipeline vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), u schedariu FASTQ di u M. bovis appena sequenziatu da u sequenziamentu Illumina hè paragunatu cù u genomu di riferimentu M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Sicondu e raccomandazioni di e migliori pratiche di u Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, applicate parametri di filtru standard o punteggi di massa varianti per a ricalibrazione. I risultati sò filtrati utilizendu u punteggio di massa SAMtools più bassu di 150 è AC = 2. Aduprate ancu Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) per verificà e letture per escludere a contaminazione. A pipeline vSNP aduprata per mappà à strategie di sequenza in u nostru travagliu esamina una seria di SNP è bersagli definiti, è esclude ancu scenarii d'infezzione mista. A cupertura di u genomu lettu hè megliu cà 99% (Tabella Supplementare 1).
Per evità errori di mappatura è SNP sbagliati, filtrate una variante in i seguenti casi: (1) hè supportata da menu di 20 letture, (2) si trova cù una frequenza inferiore à 0,9, (3) hè in almenu un ceppo, ma almenu ci sò lacune in un altru ceppo. U visualizzatore di genomica integratu (IGV) versione 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 hè statu utilizatu per verificà visivamente i SNP è e pusizioni cù prublemi di mappatura o allineamentu. Siccomu i geni prolina-glutamatu (PE) è prolina-prolina glutamatu (PPE) sò assai duplicati è facenu parte di una famiglia multi-geni, sò facilmente fraintesi da u sequenziamentu Illumina è da a mappatura errata, dunque sò preferiti. U flussu di travagliu di bioinformatica micobatterica hà eliminatu i membri di u cumplessu di a tuberculosi quandu si usa a strategia di mappatura à sequenza per cunfirmà i SNP. Dunque, avemu filtratu i geni PE/PPE è l'indel da l'analisi.
Sicondu Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), tutti i SNP sò divisi in categurie funziunali. U pipeline SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) hè utilizatu per deduce e cunsequenze di i SNP (cambiamenti sinonimi o micca sinonimi). Creazione di una nova basa di dati di u genomu di Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
L'allineamentu multiplu di u genomu core hè statu realizatu cù Parsnp v1.2, attualmente dispunibule à https://github.com/marbl/parsnp57, utilizendu 69 genomi cumpleti/assemblaggi di bozza (cù l'opzione -c) è M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) hè utilizatu cum'è riferimentu. Quattru allineamenti multipli core sò stati realizati: solu i membri di u cumplessu di clonazione Eu2 (n = 37), cumpresi tutti i membri di u cumplessu di clonazione europeu (n = 44), cumpresi u puntu di ghjunzione di u cumplessu di clonazione europeu è africanu (n = 51), è includenu tutti i Mycobacterium bovis in questu studiu (n = 70).
L'allineamentu di u core generatu da Parsnp hè adupratu per deduce l'arburu filogeneticu di massima probabilità (ML) aduprendu CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 aduprendu RAxML, è realizà 1000 replicazioni guidate.
Trè algoritmi è strumenti bioinformatici diffirenti sò aduprati per verificà a presenza di eventi di ricombinazione in parallelu: u software SplitsTree4, a pipeline Gubbins (lignaggio imparziale per via di a ricombinazione in sequenze di nucleotidi) è u software RDP4 (prugramma di rilevazione di ricombinazione, versione beta 4.101).
U metudu di decomposizione divisa implementatu in SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 hè utilizatu per calculà a rete filogenetica senza radiche, utilizendu u test Phi per a verificazione statistica, è a soglia di significatività hè p = 0,05. L'analisi multi-allineamentu core di Parsnp hè utilizata cum'è input, è a decomposizione di divisione cum'è standard di rete hè realizata.
A pipeline Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) funziona cù parametri predefiniti cum'è un altru modu per valutà l'impattu di a ricombinazione nantu à Mycobacterium bovis. L'algoritmu implementatu in a pipeline ricustruisce a ligna di cloni pertinente. L'assemblea cumpleta di u genomu / bozza di u nostru inseme di dati è u genomu di riferimentu (bovide bovinu AF2122 / 97, LT708304.1) sò mutualmente; è scansionanu a pusizione di u SNP nantu à ogni ramu di l'arburu per rilevà u cluster SNP chì rapprisenta l'eventu di ricombinazione. U zeru di u ramu Supponemu chì ùn ci sia micca avvenimentu di ricombinazione, ciò significa chì i SNP chì si verificanu nantu à u ramu devenu esse distribuiti uniformemente. L'allineamentu multiplu core da Parsnp è l'arburu ML cù u megliu puntuatu da RAxML sò aduprati cum'è fugliali d'input.
Infine, per cunfirmà l'eventu di riurganizazione suggeritu da u pipeline Gubbins, i sei algoritmi implementati in RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 è SiScan66) sò applicati à l'allineamentu multiplu core di Parsnp sottu i paràmetri predefiniti. Avemu determinatu chì almenu trè di l'algoritmi implementati in RDP4 devenu dimustrà in modu coerente un signale impurtante per verificà ogni avvenimentu di ricombinazione.
Cunsiderendu chì i software Gubbins è RDP cercanu signali di ricombinazione verificendu l'allineamenti multipli core in una finestra finu à 500 bp, è cunfirmendu chì l'inclusione di geni PE/PPE durante l'assemblaggio de novo ùn interferirà micca cù i signali di ricombinazione truvati, un'ulteriore analisi hè fatta per omolinearità. Verificate a vicinanza di u genu chì identifica l'eventu di ricombinazione. A mappa sinlineare chì utilizza u genomu cumpletu hè stata custruita utilizendu l'allineamentu MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) per escludere traslocazioni o inversioni di genomu lucali. Inoltre, u genomu interu hè statu utilizatu per realizà l'analisi di omolinearità nantu à a sequenza di aminoacidi attraversu u servitore web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Un'analisi più approfondita di u set di dati di u genomu ottenutu da u sistema di tuberculosi multi-ospite portoghese hè di verificà u polimorfismu di i geni citati in a literatura. Quessi geni sò 37,38 è u genu chì codifica 3R ottenutu da l'antenati MTBC attraversu i cumpunenti di u sistema HGT (riparazione, replicazione è ricombinazione di u DNA) 39. Aduprate ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) è aduprate DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) per calculà a diversità di i geni è a diversità di i nucleotidi (π) è l'input di u parametru di test D neutru di Tajima.
Un arburu filogeneticu di massima probabilità (ML) basatu annantu à 69 isolati di Mycoplasma bovis è genomi di riferimentu hè statu ottenutu (Figura 2A). In paragone cù l'arburi basati annantu à un solu genu o l'arburi basati annantu à più locus, sta strategia permette a generazione d'arburi più putenti chì ùn catturanu micca a variabilità di tuttu u genomu è dunque mostranu una capacità più bassa di discriminà trà e spezie 68,69. A struttura topologica di l'arburu ML hè generalmente coerente cù a classificazione cumplessa di i cloni. U genomu di Eu2 hè raggruppatu in un ramu, è u genomu di Af1 hè ancu raggruppatu inseme (Figura 2A). U risultatu hè ancu coerente cù a relazione evolutiva cunnisciuta di Mycobacterium bovis, vale à dì, ci hè una grande differenza trà u membru Eu1 è u gruppu custituitu da tutti l'altri cumplessu è genomi clonali, ma u cumplessu clonale 30 ùn hè micca specificatu. A piccula inconsistenza trà u cumplessu clonale è a relazione osservata nantu à l'arburu filogeneticu pò esse spiegata da u fattu chì u cumplessu clonale hè discrittu basendu si nantu à regioni genomiche specifiche, mentre chì l'arburu filogeneticu hè basatu annantu à parechji allineamenti di genomi core chì rapprisentanu u genomu sanu.
L'arburu filogeneticu di massima probabilità (GTR) hè custruitu basatu annantu à l'allineamentu di u genomu core di Mycobacterium bovis prima (A) è dopu (B) a rimuzione di u situ di ricombinazione. I culori di i rami rapprisentanu u cumplessu di cloni di Mycobacterium bovis: Europa 1 hè viola, Europa 2 hè rossa, Europa 3 hè blu, Africa 1 hè aranciu è Africa 2 hè verde. L'arburu hè radicatu è disegnatu in scala, è a lunghezza di u ramu hè misurata cum'è rimpiazzamentu per ogni situ.
U cumplessu di Mycobacterium tuberculosis hè discrittu cum'è evoluzionatu clonalmente, è a maiò parte di l'evidenza accumulata annantu à l'anni sustene l'idea chì l'eventi di HGT è di ricombinazione in corsu ùn si verificanu micca à u livellu rilevabile di MTBC15,17,18.
U travagliu precedente hà dimustratu chì ci pò esse una ricombinazione limitata trà i ceppi di MTBC20,21, mentre chì altri ùn anu micca riesciutu à identificà eventi di ricombinazione misurabili70,71. Ridiscute stu prublema cù l'attenzione nantu à Mycobacterium bovis, chì hè differente da u travagliu precedente chì cunsiderava solu Mycobacterium tuberculosis 70,71; o cunsiderate MTBC in tuttu, cù quasi nisun M. bovis chì rapprisenta 20; o cunsiderate solu e frazioni restrittive di bovini. U dataset di micobatteri, in questu travagliu, ci sò un totale di 70 ceppi, chì rapprisentanu tutti i complessi clonali, aduprati per screening per a ricombinazione. U dataset hè scalatu secondu quattru livelli cumulativi: (1) membri Eu2, (2) tutti i membri di u cumplessu clonale europeu (vale à dì l'Europa), (3) cumplessu clonale europeu è africanu (Eu + Af) è (4) l'intera cullezzione di dati (cumpresi i genomi chì ùn sò micca inclusi in alcun cumplessu di clonazione digià descrittu).
Per studià più in prufundità sta ipotesi, hè stata realizata una rete di decomposizione divisa per valutà l'assenza di eventi di ricombinazione trà i genomi, perchè stu metudu pò visualizà a relazione ancestrale trà l'individui è mustrà signali filogenetici cunflittuali. Tutti i quattru insemi di dati in l'analisi anu cunfirmatu l'esistenza di loop in a rete (vale à dì, zone chì ùn cunvergenu micca in un unicu arburu), ma u test Phi ùn hà micca supportu statisticu (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; tuttu l'inseme di dati p = 0,2451), ciò chì furnisce una scarsa evidenza di l'esistenza di eventi di riurganizazione (Figura 3A-D).
In Europa 2 genomi (n = 37) (A), genomi europei (n = 44) (B), genomi europei è africani (n = 51) (C) è l'inseme di dati interu (n = 70) (D).
Dopu à sta analisi, è tenendu contu di l'osservazioni cicliche in tutte e rete, l'algoritmu di ricustruzzione implementatu in a pipeline Gubbins hè statu applicatu per ricustruisce a ligna clonale è per cumplementà a stima di l'effettu di a ricombinazione nantu à u genomu di M. bovis. Deduce u numeru cumulativu di eventi di ricombinazione, a maiò parte di i quali si sò verificati in rami terminali (vale à dì, in un unicu genomu) (Tabella 2). Quessi indicatori mostranu a cunsistenza di tuttu u set di dati è indicanu chì a frequenza di l'eventi di ricombinazione hè da 200 à 300 volte quella di e mutazioni. Una volta chì u parametru rho/theta chì rapprisenta i tassi relativi di ricombinazione è di mutazioni puntuali nantu à u ramu pare esse trà 0,0037 è 0,0056 (Tabella 3). Recentemente, u travagliu publicatu di a ceppa 38 di M. bovis hà dimustratu un valore rho/theta più altu (rho/theta = 0.1) chè quellu ottenutu in questu inseme di dati, ma u travagliu di Patané è i so culleghi hà utilizatu l'assemblaggio basatu nantu à riferimenti per deduce i parametri di ricombinazione. Un dettagliu procedurale, per via di a prucedura di assemblaggio, hè statu assuciatu à l'abbundanza di putativi eventi di ricombinazione in u ramu terminale.
Dopu, u parametru r/m rapprisenta u rapportu di diversità di ricombinazione è introduzione di mutazioni, è u so valore mediu hè trà 0,025 è 0,037, chì indica chì, paragunata à e mutazioni, a ricombinazione hà un impattu generale più bassu nantu à a diversità genetica di M. bovis (Tavula 3). Per una paragone estensiva, un metudu simile hè statu utilizatu per stimà u parametru r/m per u dataset MTBC cumpostu da 23 genomi, mustrendu un valore mediu di 0,48620, mentre chì per u dataset di 38 M. bovis di Patané è culleghi, hà dimustratu chì u valore mediu hè 0,98. In u primu studiu, solu dui di i 23 genomi inclusi in u travagliu di M. bovis (M. bovis BCG è a ceppa di riferimentu), dunque u valore ottenutu pò esse sbilanciatu per via di a sovraespressione di u genomu di M. tuberculosis. In u secondu rapportu, e pupulazioni di Mycobacterium bovis analizate sò state recuperate principalmente da i Stati Uniti è da l'ospiti di bestiame. In cuntrastu, in u nostru inseme di dati, sò rapprisentati più lochi geografici è spezie ospiti, è sò ancu aduprati genomi raggruppati in diversi cumplessu clonali cù diverse caratteristiche genetiche di a pupulazione, ottenendu cusì una cunniscenza di a pupulazione più prufonda è più larga. A differenza di valore mediu r/m ottenuta cù u nostru inseme di dati hè coerente cù u cuncettu chì u gradu di ricombinazione varieghja assai trà i lignaggi assignati à a stessa spezia tassonomica, dunque questi risultati indicanu chì u cumplessu di cloni M. bovis pò esibisce differenze di ricombinazione. L'impattu hè ancu cum'è suggeritu da Didelot & Maiden72. Tuttavia, espansione significativa di questu inseme di dati includendu un numeru più grande di genomi M. bovis permetterà una ulteriore chiarificazione di questu puntu. Sia i parametri r/m sia rho/theta mostranu variabilità trà i rami, è questu risultatu hè coerente cù i rapporti nantu à altre spezie batteriche72,73.
Infine, per cunfirmà l'eventi di riurganizazione identificati da a pipeline di Gubbins, sei algoritmi diversi sò stati utilizati in u software RDP4 per testà indipindentamente diverse multi-paragoni core. Globalmente, menu di a metà di l'eventi identificati da Gubbins sò stati cunfirmati da RDP4 (Tavule 4 è 5). Cunsiderendu tuttu u set di dati, trè eventi di ricombinazione sò stati cunfirmati, dui chì implicanu nodi interni è l'altru chì implica un unicu genomu in una branca terminale, per a quale ùn si pudianu assignà cumplessu clonali (Tavule 4 è 5). L'identificazione di eventi in e branche terminali pò indicà chì a ricombinazione hè sempre in corsu in i ceppi cuntempuranii di M. bovis o chì u risultatu hè mal piazzatu70. In questa ipotetica regione di ricombinazione, circa u 20% di e pusizioni anu nucleotidi (N) indefiniti, affettendu cusì u signale di ricombinazione (Figura Supplementare 2). Inoltre, sta regione affetta u genu rrs, chì codifica l'RNA ribosomiale 16S chì si prevede chì sia altamente cunservatu, dunque questu putativu signale di ricombinazione pò esse u risultatu di errori di sequenziamentu o di disallineamentu. Dopu hè statu realizatu l'allineamentu di tuttu u genomu trà Mb0003 è Mycobacterium bovis AF2122/97, è hè stata cunfirmata l'esistenza di nucleotidi è SNP indefiniti, dunque i pussibuli prublemi ligati à l'allineamentu sbagliatu ùn eranu micca dovuti à l'infurmazioni biologiche implementate in questu travagliu apparse dopu avè amparatu u prugramma.
Nisuna lacuna o nucleotidi indefiniti sò stati trovati in e regioni di ricombinazione di i nodi interni (Figure 4 è 5). Riguardu à questi eventi, unu cuntene solu u genomu Eu2 è affetta u genu pks12, chì codifica una pussibile poliketide sintasi; mentre chì l'altru hè registratu in u genomu Eu1 è affetta u genu narX chì codifica una pussibile nitrate reduttasi (Tabella 4). In generale, l'analisi di ricombinazione mostra chì ci hè un numeru limitatu di frammenti di ricombinazione cù supportu statisticu, è l'indicatori dedotti indicanu chì a ricombinazione hà un impattu bassu nantu à a ligna M. bovis. U signale di ricombinazione hè previstu per esse bassu, ma hè impurtante distingue u veru signale di evoluzione da u rumore di fondu, chì hè un compitu difficiule. Per riduce u signale di rumore introduttu da l'assemblea basata nantu à riferimenti è i prublemi di mismatch 70, 71, tuttu u restu eccettu u genomu cumpletu hè statu assemblatu da zero, è a qualità di l'assemblea hè stata verificata è assicurata da l'analisi di a pipeline QUAST (Tabella Supplementare 1). Inoltre, una seria d'analisi supplementari sò state realizate per furnisce a robustezza è a precisione di l'indagine generale. Dunque, a qualità di sequenziamentu di i geni narX è pks12 hè stata valutata per mezu di a mappatura di lettura contr'à Mycobacterium bovis AF2122/97. A pusizione SNP raccomandata in a regione di ricombinazione hè stata cunfirmata applicendu i criteri citati in a sezione di u metudu (almenu 20 letture è una frequenza di cambiamentu di 0,9). U polimorfismu di u genu narX hè statu cumpletamente cunfirmatu in i dui genomi (Mb1792361 è Mb7240415; 2,3%) è i genomi di u genomu pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 è Mb12. Tuttavia, per u genomu Mb2043, sei di l'ottu pusizioni ùn rispondenu micca à u criteriu di prufundità di lettura perchè u SNP hè sustinutu da un massimu di 17 letture, chì hè sottu à u valore limite stabilitu di 20. Dunque, a ricombinazione di sei genomi (8,6%) in questu situ di u genomu pò esse cunfirmata (Figure 4 è 5).
A visualizazione dettagliata di l'allineamentu di a regione di ricombinazione di u dataset Mycobacterium bovis affetta u genu narX chì codifica una pussibile nitrate reduttasi. Nisuna lacuna o nucleotidi indefiniti sò stati trovati in a regione di ricombinazione di i nodi interni. Questu avvenimentu particulare hè registratu in u genomu Eu1. A qualità di sequenziamentu di u genu narX hè stata valutata tracciendu e letture di Mycobacterium bovis AF2122/97. Cunfirmate a pusizione SNP raccomandata in l'area di ricombinazione applicendu i criteri citati in a sezione di u metudu (almenu 20 letture è una frequenza di cambiamentu di 0,9). U polimorfismu di u genu narX hè statu cumpletamente cunfirmatu in i genomi di Mb1792361 è Mb7240415 (2,3%).
Visualizazione dettagliata di l'allineamentu di a regione di ricombinazione di u dataset di Mycoplasma bovis chì affetta u genu pks12. Nisuna lacuna o nucleotidi indefiniti sò stati trovati in a regione di ricombinazione di i nodi interni. In quantu à l'eventu chì affetta u genu pks12 chì codifica a pussibile poliketide sintasi, cuntene solu u genomu Eu2. A qualità di sequenziamentu di pks12 hè stata valutata da a mappa di lettura di Mycobacterium bovis AF2122/97. Cunfirmate a pusizione SNP raccomandata in l'area di ricombinazione applicendu i criteri citati in a sezione di u metudu (almenu 20 letture è una frequenza di cambiamentu di 0,9). I polimorfismi di i genomi Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 è Mb1960 sò stati cumpletamente cunfirmati.
I geni PE è PPE anu regioni ripetitive chì sò facilmente lette male da u sequenziamentu è a mappatura Illumina, dunque sò generalmente eliminate da u flussu di travagliu bioinformaticu di i membri di M. tuberculosis solu quandu si usa a strategia di mappatura à sequenza. L'inferenza di l'eventi di ricombinazione applicata in questu travagliu hè basata nantu à l'assemblaggio de novo senza filtrà PE/PPE. Credemu chì implementendu trè diversi metudi è algoritmi cumplementari attraversu SplitsTree, a pipeline Gubbins è u software RDP4, e strategie applicate sò robuste à u trattamentu è u filtraggio di e regioni riurganizate causate da segnali d'errore. Tuttavia, per escludere l'interferenza di u genu PE/PPE nantu à u software Gubbins è RDP4 per identificà i cluster SNP, è dunque l'identificazione di e regioni di ricombinazione pruposte per influenzà i geni narX è pks12, hè statu esaminatu u vicinariu di questi geni (Fig. Supplementare 3-5). In M. bovis AF2122/97, u genu narX hè siparatu da narK2 è Mb1764c, mentre chì pks12 hè circundatu da Mb2075c è Mb2073c (Figura Supplementare 3-5). A mappa generata cù a mappa di sinlinea MAUVE di u genomu cumpletu furnisce informazioni nantu à a cunservazione è u riarrangiamentu di a sequenza genica, mustrendu quattru blocchi collineari, è nisun segnu di traslocazione o inversione di u genomu. Inoltre, l'analisi di cumplementazione cù a sequenza di aminoacidi hà dimustratu l'omologia in tutti i genomi cumpleti, è nisun PE/PPE hè statu trovu in e regioni adiacenti di narX o pks12. Per narX, un genomu (Mb0030) hà un puntuatu di sinonimia più bassu perchè u genu narX hè statu identificatu cum'è dui frammenti (frammenti 1891 è 1890). Per pks12, per via di similitudini, Mb0030 è Mb003 anu mostratu punteggi di sinlinearità più bassi, mentre chì pks12 hè statu identificatu rispettivamente in dui è trè frammenti, chì rapprisentanu diversi duminii di a proteina (Figura Supplementare 3-5). Tenendu contu di sta infurmazione, è di i software Gubbins è RDP4 chì eseguiscenu tramindui l'analisi, verificanu l'allineamentu multiplu core di u massimu di 500 bp in a finestra, avemu cunfirmatu chì u genu PE/PPE ùn interferirà micca cù u signale di ricombinazione chì affetta narX è pks12.
Ancu s'è i signali di ricombinazione rilevati in questu inseme di dati ponu esse cunsiderati residuali, hè veru chì a ricombinazione in M. bovis ùn pò esse esclusa, dunque duveria cuntinuà à esse ughjettu di ulteriori analisi, in quale i genomi interi da diversi scenarii epidemiologichi sò sequenziati per esse impurtanti.
A paragunazione di l'arburi filogenetici ML ottenuti prima è dopu a currezzione di ricombinazione (Figura 2A, B) ùn hà micca purtatu à cambiamenti significativi in a relazione filogenetica inferita, è i ceppi di M. bovis sò stati raggruppati in u listessu gruppu.
Dopu avè mappatu 42 letture di M. bovis appena sequenziate cù u genomu di riferimentu di M. bovis AF2122/97, hè statu ottenutu un allineamentu di SNP chì cuntene 1816 pusizioni polimorfiche. A maiò parte di i SNP (87,1%) sò situati in a regione codificante, è i geni affettati sò carattarizati secondu e categurie funziunali mostrate in Bovilist (Figura 6A, B). Tenendu contu di u numeru tutale di geni in ogni categuria funziunale, i geni in a categuria "metabolismu di i lipidi" anu mostratu più SNP, seguitati da "prucessi di a parete cellulare è cellulari" è "metabolismu è respirazione intermedi", rivelendu chì sò in l'evoluzione di M. bovis.
Analisi gerarchica di u dataset di M. bovis da u Portugallu (n = 42). U numeru tutale di SNP registrati è geni affettati per ogni categuria funzionale (A). U numeru tutale di cambiamenti sinonimi è non sinonimi registrati per categuria di funzione (B).
À scala glubale, u rapportu mediu dN/dS hè megliu cà 1,5, ciò chì indica chì a pressione evolutiva glubale hè di sbarrazzassi di u statu ancestrale è rapprisenta un scenariu di scelta di purificazione pusitivu (diversificatu o direttu) è/o rilassatu. In e categurie di "virulenza, disintossicazione, adattazione", "sequenze d'inserzione è fagi" è "proteine regulatorie", più di dui terzi di i SNP ùn sò micca sinonimi (Figura 6B).
In tutte e categurie, ci sò geni cù parechji SNP, chì risultanu in un tassu di mutazione mediu (vale à dì, u SNP mediu per genu) più grande di 1 (Figura 6A). Pks12 (Mb2074c) cù 15 SNP è fas (Mb2553c) cù 8 SNP anu valori di mutazione più alti. Tramindui sti geni sò implicati in u metabolismu di l'acidi grassi. U genu pks codifica a poliketide sintasi (PKS), chì hè un enzima multifunzionale implicatu in a biosintesi di i lipidi di a parete cellulare micobatterica74,75. Stu genu codifica un polipeptide multifunzionale chì hè implicatu in a sintesi di micochetidi74,76. U genu fas hè implicatu in a sintesi di l'acidu micolicu. Tramindui sti geni ghjocanu un rolu impurtante in a biosintesi di a parete cellulare in cuntattu cù l'ospite.
Per studià più in prufundità l'evoluzione di Mycobacterium bovis, sò stati analizati dui insemi di geni specifichi. I travagli publicati prima, utilizendu a cumpusizione di sequenze è i metudi filogenetici, anu identificatu geni chì sò stati acquistati da l'antenati MTBC per via di HGT prima di a diversificazione37,38. Quessi geni sò elencati in a Tabella Supplementare 2. Hè stata analizata a distribuzione di SNP di un totale di 77 geni chì ponu esse ligati à HGT, è sò stati identificati 26 siti polimorfichi, chì in a maiò parte di i casi (78%) anu risultatu in cambiamenti non sinonimi (NS) (Tabella Supplementare 2). U travagliu precedente nantu à u genomu MTBC hà dimustratu chì a putativa regione HGT presenta un rapportu SNP NS più altu paragunatu à u restu di u genomu. Sè si pensa chì ste regioni di ricombinazione sò state acquistate da l'antenati MTBC, è dunque, sovrarappresentanu polimorfismi antichi, allora si prevede chì a proporzione di cambiamenti sinonimi sia più alta, perchè si prevede chì e sustituzioni NS sianu eliminate da a selezzione negativa per via di i cambiamenti di l'aminoacidi chì ponu cambià a funzione di a proteina. Dunque, i nostri risultati indicanu chì e cunsequenze funziunali ponu derivà da a sustituzione di geni simili à HGT, ciò chì riflette a so impurtanza per una preziosa diversità genetica adattativa.
In parallelu cù sta analisi, i geni chì codificanu i cumpunenti di u sistema 3R (riparazione, replicazione è ricombinazione di u DNA) sò stati esaminati accuratamente in cunfurmità cù a lista publicata prima da dos Vultos è i so collaboratori (2008)39. U scambiu di frammenti di DNA identichi ùn pò esse osservatu direttamente, ancu s'ellu pò esse un prucessu frequente quandu sò implicati batteri strettamente correlati, cum'è in u casu di questu inseme di dati; in più, questu prucessu pò esse a chjave per i metudi di riparazione di u DNA72, dunque ghjocanu un rolu in a ricombinazione omologa. Un totale di 26 pusizioni polimorfiche distribuite da 54 geni sò state identificate (Tabella Supplementare 3). In questu inseme di geni, i cambiamenti NS anu rapprisentatu circa u 65% di e cunsequenze, ciò chì hè coerente cù i rapporti precedenti nantu à i ceppi di Mycobacterium tuberculosis.
Data di publicazione: 21 d'ottobre di u 2021