Köszönjük, hogy ellátogattál a Nature oldalára. Az általad használt böngészőverzió korlátozottan támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében azt javasoljuk, hogy a böngésző egy újabb verzióját használd (vagy kapcsold ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Ugyanakkor a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalakat.
A genomszekvenálás új lendületet adott a fertőző betegségek kutatásának területén, feltárva a betegségek epidemiológiáját, patogenezisét, gazda-kórokozó kölcsönhatásokat és a kórokozókra kényszerített evolúciós folyamatot. A Mycobacterium tuberculosis komplex (MTBC) a Mycobacterium bovis-t a szárazföldi emlősökben tuberkulózist (TBC) okozó állati adaptív tagjai közé sorolja, és a bakteriális evolúció tipikus modellje. A többi MTBC taghoz hasonlóan a Mycobacterium bovis-t is szigorúan klónozott, lassan fejlődő kórokozónak tekintik, és nyilvánvalóan nincs jele rekombinációnak vagy horizontális génátvitelnek. Ebben a munkában összehasonlító genomikát alkalmazunk egy 70 különböző származású (Európa és Afrika) szarvasmarha M.-ből álló teljes genomszekvencia (WGS) adatkészletre, hogy betekintést nyerjünk a szarvasmarha M. genetikai diverzitására. Evolúciós erő. Három különböző módszert alkalmazunk az átszerveződés jeleinek becslésére. Globálisan kis számú rekombinációs eseményt azonosítottunk és két független módszerrel megerősítettünk szilárd alátámasztással. Mindazonáltal a mutációkhoz képest a rekombináció gyengébb hatással van az M. bovis diverzitására (összességében r/m = 0,037). Az adatkészletünkben a Mycobacterium bovis klonális komplexumában kapott r/m átlagkülönbség összhangban van azzal az általános elképzeléssel, hogy a rekombináció mértéke nagymértékben változhat az ugyanazon taxonómiai fajhoz rendelt leszármazási vonalak között. E munka alapján a Mycobacterium bovis rekombinációja nem zárható ki, ezért további erőfeszítések tárgyát kell képeznie a jövőbeli összehasonlító genomikai kutatásokban, amelyekben a világ különböző epidemiológiai forgatókönyveiből származó nagy adatkészletek WGS-e kulcsfontosságú. Ezután további elemzést végeztünk a több gazdaszervezet TBC prevalenciájából származó kisebb Mycobacterium bovis adatkészleten (n = 42), és több mint 1800 lókuszt azonosítottunk, amelyek közül legalább egy törzs egyetlen nukleotid polimorfizmust (SNP) mutatott. A legtöbb (87,1%) a kódoló régióban található, és a szinonim változások nem szinonim változásainak globális aránya (dN/dS) meghaladja az 1,5-öt, ami azt jelzi, hogy a pozitív szelekció az M. bovis-ra ható fontos evolúciós erő. Nagyobb arányban mutattak ki SNP-ket a "lipid-anyagcsere", a "sejtfal és sejtfolyamatok", valamint az "intermedier anyagcsere és légzés" funkcionális kategóriáiban gazdag génekben, ami feltárja ezeknek a Mycobacterium bovis biológiájában és evolúciójában betöltött fontos szerepét. Az MTBC ősök horizontális génátvitelre hajlamos és a 3R (DNS-javítás, replikáció és rekombináció) rendszerbe tartozó génjeinek közelebbi vizsgálata a Taijima D-neutrális teszt globális átlagos negatív értékét mutatja, ami a szelektív szkennelés múltbeli lefolyását jelzi. A populációbővülés utáni szűk keresztmetszet továbbra is a fő evolúciós hajtóerő a Mycobacterium bovis kötelező kórokozójának a gazdaszervezet elleni küzdelemben.
A Mycobacterium tuberculosis komplex (MTBC) a bakteriális kórokozók egyik legsikeresebb taxonja és a bakteriális evolúció tipikus esete. Tagjai meglepően magas nukleotidazonosságot mutatnak genomiális szinten (> 99%)1,2. A különböző MTBC ökotípusok a mikroemlősöktől az emberig számos gazdafajban okozhatnak tuberkulózist (TBC), amely egy fertőző granulomatózus betegség3,4,5. Jelenleg a komplexumba emberek [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] és állatokhoz adaptálódott kórokozók (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimanzene" és "dassie") 5,6 tartoznak. Az M. canettii (más néven "Nodobacter glabrata") átlagos nukleotidazonossága a fent említett mikobaktériumokkal 98%, és az összehasonlító genomikai munkák kimutatták, hogy az M. canettii és az MTBC többi része a közelmúltban eltávolodott a közös őstől.7 Ezt a koncepciót figyelembe véve egyes szerzők az M. canettii-t az MTBC 8. tagjának nevezik.
Az MTBC-t szisztematikusan szigorú klonális komplexumként írják le, és populációs szerkezetét egyértelműen a csökkent diverzitás, a szűk keresztmetszetek, a szelektív szkennelés és a genetikai sodródás szabályozza9,10. Feltételezve, hogy a komplex szigorú klonális evolúció, például a hiányzó polimorfizmusok, nem állíthatók vissza rekombinációval. Ezen előfeltevés alapján a differenciális régió (RD) genomiális delécióját és a TbD1-et (Mtb-specifikus deléciós 1-es régió) egymást követő eseményeit javasolták az MTBC evolúciójának molekuláris markereiként2,5,11. Az összehasonlító genomikai és teljes genom szekvenálási (WGS) munka alátámasztja az emberhez adaptált tagok kilenc leszármazási vonalra (Mycobacterium tuberculosis L1-L4, L7 és L8; valamint Mycobacterium africanum L5, L6 és L9) való felosztását, az L2-L4 leszármazási vonalakban közös a TbD1 régió deléciója2,11,12,13. Ezenkívül az állathoz adaptált tagok esetében feltételezik, hogy közös ősük van, amelyet az RD7, RD8, RD9 és RD102, 5 és 14 kládspecifikus deléciói határoznak meg.
A horizontális génátvitel (HGT) és a rekombinációs események ritkának tekinthetők, és az MTBC őseiben fordulnak elő, nem pedig az egész MTBC-tag eltérő történetében15,16,17. Hughes és munkatársai (2002), valamint Gutacker és munkatársai (2006) két korai jelentése azt sugallta, hogy a rekombinációs események segíthetnek olyan polimorfizmusok kialakításában, amelyek specifikus lokuszokat jelölnek az M. tuberculosis törzsekben18,19. Az MTBC-ben a rekombináció nyilvánvaló hiányának okai a következők: (1) a HGT mechanikai folyamata és képességének elvesztése; (2) a HGT események ritkasága; (3) a rekombinációs eseményeknek nincs esélye az MTBC niche-ben14,17. Az utóbbi időben néhány, az MTBC 20-as törzsére és a Mycobacterium bovis 21-re alkalmazott teljes genom szekvenálási (WGS) vizsgálat bizonyítékot szolgáltatott a rekombinációra, elsőként kimutatva, hogy az MTBC törzsek gyakran kis DNS-fragmenseket cserélnek, de a korlátozott nukleotidszekvencia-variáció miatt ezeket az eseményeket még mindig nem észlelték.
A Mycobacterium bovis a leggyakrabban haszonállatokból (főként szarvasmarhákból) visszanyert MTBC-tag, bár szabadon tartott és bekerített vadon élő állatokból is izolálható4,22,23,24. Az M. bovis öt fő klonális komplexumra fejlődött [európai 1 (Eu1), európai 2 (Eu2), európai 3 (Eu3), afrikai 1 (Af1) és afrikai 2 (Af2)] a spoligotípus-profil, a specifikus deléciók és az egypontos nukleotid polimorfizmusok (SNP-k)25, 26, 27, 28, 29 szerint specifikus génekben. Ezek a klonális komplexek a Mycobacterium bovis populáció változatos szerkezetét és földrajzi régiókkal való kapcsolatát mutatják. Ezenkívül Zimpel és munkatársai (2020) a közelmúltban végzett WGS-munka során a Mycobacterium bovis SNP-jén alapuló filogenetikát terveztek, több mint 1900 genommal, ami arra utal, hogy legalább négy különböző leszármazási vonal létezik (Lb1-től Lb1-ig és Lb4-ig), ezek azonban nem teljesen összhangban vannak a korábban meghatározott klonális komplexummal, bár a földrajzi specificitás is megerősíthető30. Ezek a szerzők a filogenitás és a molekuláris kormeghatározás differenciálanalízisét végezték, de a rekombinációt nem vizsgálták30.
Különböző molekuláris technikákat alkalmazó korábbi munkák, mint például a spoligotípus-vizsgálat, a MIRU-VNTR (mycobacteriális interpersed repeat unit-variable tandem repeat number – változó tandem ismétlődési szám) és a közelmúltbeli SNP-tipizálás, bizonyos szintű genetikai diverzitást tártak fel az M. bovis törzsek között 31,32,33, 34,35. A genetikai variáció differenciálása fontos eszközzé vált a betegségek epidemiológiájának tanulmányozásában, ami segít a patogenezis, a virulencia és a betegségátvitel mélyreható megértésében. A WGS módszer megjelenése lehetőséget ad arra, hogy feltárjuk a Mycobacterium bovis genom által a különböző gazdaszervezetekhez és epidemiológiai forgatókönyvekhez való alkalmazkodás és fennmaradás folyamatában szerepet játszó evolúciós mozgatórugókat.
Ebben a munkában összehasonlító genomikai elemzést alkalmazunk különféle Mycoplasma bovis adatkészleteken (n=70), beleértve a különböző klonális komplexekből származó izolátumokat is, hogy betekintést nyerjünk a Mycoplasma bovis evolúciós folyamatába, különösen a filogenetikai kapcsolatok és a rekombinációs események felderítése érdekében. Ezen elemzés kiegészítéseként egy jól jellemzett, több gazdával rendelkező portugáliai tuberkulózis területről származó M. bovis izolátumok (n = 42) aladatkészletét31,36 tovább vizsgáltuk, hogy megállapítsuk a nem azonosságot. A szensz (dN) és szinonim (dS) nukleotidszubsztitúciók relatív aránya közötti egyensúly, valamint az irodalomban említett specifikus genomok evolúciós hozzájárulása közötti egyensúlyt37,38 MTBC ősök szerezték HGT-n keresztül, és 3R (DNS-javító, replikációs és rekombinációs) rendszer génkomponenseit kódolják39. Válasszunk HGT-n keresztül kapott géneket, mert ezek ősi polimorfizmusokat képviselhetnek, így várható, hogy nagyobb arányban tartalmaznak szinonim változásokat. A 3R rendszerbe foglalt géneket azért választottuk ki, mert az M. tuberculosis törzsekkel végzett korábbi munkák általános negatív/tisztító szelekciókat mutattak ki, amelyek működnek ezeken a géneken, és ezek fontos szerepet játszhatnak az evolúcióban39. E munka egy másik célja a reorganizációs események létezésének megállapítása. Emiatt, figyelembe véve, hogy a portugáliai adatkészletünk csak az európai 2-es klónkomplex és a klónkomplexet nem tartalmazó törzsek genomját tartalmazza, úgy döntöttünk, hogy nyilvánosan elérhető genomadatokat is bevonunk, hogy végül az összes klónkomplex reprezentatív adatait kapjuk, és javítsuk az eredmények robusztusságát és szélességét.
A munka középpontjában 42 újonnan szekvenált Mycoplasma bovis genom áll a portugál endémiás többgazdás tuberkulózis színteréről (részletek alább), amelyeket korábban epidemiológiai szempontból jellemeztek36. Tekintettel arra, hogy a portugáliai adatkészlet csak az európai 2 klón komplexek és a kijelölt komplexek nélküli törzsek képviselőit tartalmazza, nyilvánosan elérhető teljes genom szekvenálási adatokat adtunk hozzá az adatkészlet bővítéséhez, amely az M. bovis klón komplexek összes képviselőjét tartalmazza. Ezért három teljes genom szekvenálási adatforrást használtunk ebben a munkában: teljes/tervezet genom összeállítás, legfeljebb 10 NCBI-ben (Nemzeti Biotechnológiai Információs Központ) tárolt állványzat (n = 15 izolátum); az SRA-ban (a szekvenciaolvasási archívum Illumina fastq fájlja) tárolt, az M. bovis klónok komplex diverzitását reprezentáló (n = 12 izolátum)30; és 42 újonnan szekvenált genom Portugáliából. A Mycobacterium bovis BCG-t (Bacille Calmette-Guerin) kizártuk az NCBI keresésből. Az M. bovis AF2122/97 törzset általában referencia genomként használják az adathalmazba való felvételhez. Mivel az afrikai 1 klónozó komplex által képviselt teljes genomszekvencia nyilvánosan nem érhető el, valamint az Af2 és Eu1 reprezentatív törzseiből származó genomok száma kis, ezekben az esetekben az SRA által biztosított eredeti szekvenálási adatokat használtuk. Zimpel és munkatársai (2020) munkája segített azonosítani a fent említett klónozó komplexből származó genomot, és segített kiválasztani a Mycobacterium bovist az adathalmazba való felvételhez. Az Eu3 esetében csak egy típusú genomot írtak le (Branger et al., 2020), így az általunk figyelembe vett genom az Eu3 komplex egy különálló képviselője.
Globálisan ez az adathalmaz 70 szarvasmarha M. bovis-t tartalmaz, melyeket 8 gazdafajból izoláltak 12 országban 1985 és 2016 között. 36 faj Eu2, 7 faj Eu1, 1 faj Eu3, 3 faj Af1, 4 faj Af2 és 19 faj nem tulajdonítható semmilyen klonális komplexnek (részletek alább). A Mycobacterium bovis-ról ebben a vizsgálatban használt részletes információkat (beleértve a hozzáférési számot is) az 1. táblázat és az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza.
A tanulmány középpontjában 42 újonnan szekvenált, több mint 12 éve elterjedt Mycobacterium bovis teljes genom áll, amelyek Portugália állati tuberkulózis gócpontjaiból származnak, mivel a potenciális vadon élő állatok és az állatállomány közötti betegségrendszereket rendszeresen monitorozták31,36 (1. kiegészítő ábra). A későbbi eljárások szerint ezeket a törzseket szarvasmarhákból (n = 14), gímszarvasból (n = 16) és vaddisznóból (n = 12) izolálták 2003 és 2015 között: az állatokat az ajánlott protokoll irányelveknek megfelelően kell gyűjteni és kezelni. A szövetminták az OIE Terrestrial Animal Handbookjában találhatók, és Stonebrink és Löwenstein-Jensen piruvát szilárd és folyékony táptalajon inokulálták őket. A tenyészeteket 37 °C-on inkubálják, és a növekedést legalább 12 héten keresztül hetente egyszer ellenőrzik. A kolóniákat közvetlenül glicerinoldatban tárolják -80 °C-on. A Mycobacterium szelektív táptalajban (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) az eredetileg archivált mintákat egyetlen in vitro passzázson vitro bocsátották át a WGS program DNS-ének kinyerése érdekében. Ehhez a fagyasztott törzsoldatot 5% nátrium-piruváttal és 10% ADS-sel (50 g albumin, 20 g glükóz, 8,5 g nátrium-klorid 1 liter vízben) dúsították Middlebrook 7H9 táptalajban 37°C-on (Retrain) újra befagyasztva. 4 hét tenyésztés után a táptalajt megújították, és a tenyészetet rendszeresen monitorozták, amíg növekedést nem figyeltek meg. A sejteket centrifugálással kinyerték, a pelletet 500 µl foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) reszuszpendálták, 30 percig 99°C-on melegítették, centrifugálták, és a felülúszót -20°C-on tárolták a WGS programig. Minden eljárást 3. szintű biológiai biztonsági létesítményekben végeztek.
A WGS párosított végű genomkönyvtárat az egyes DNS-minták egyedi indexének felhasználásával készítik el, és a szekvenáláshoz Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 minta) és HiSeq (2 × 150 pb) (két izolátum) technológiát (Eurofins Genomics, Németország) használnak. A gyártó utasításai szerint az Illumina Genome Analyzer kétvégű modulcsatlakozóval ellátott készülékét használják a genomiális DNS szekvenálásához, és az Illumina Nextera XT DNA Library Prep Kitjét használják a könyvtár összeállításához.
Az SRA-ból kinyerett adatokat (n = 12) figyelembe véve a klónkomplex azonosítása a megfelelő publikáció metaadataként használható 30, 41, 43. A teljes genomot tekintve – a Mycobacterium bovis AF2122/97 és a Mycobacterium bovis 3601 kivételével, amelyek az Eu1 és Eu3 klonális komplex felismert tagjai 25, 29 – megegyezik a Mycobacterium tuberculosis H37Rv teljes genomjával (NCBI hozzáférési szám: NC_000962.3). A genomillesztést a MAFFT (aminosav- vagy nukleotidszekvencia többszörös illesztési programja, 7.458-as verzió) és az -addfragments48 paraméterrel végezzük. Ezután keressük meg a különböző klonális komplexek hiányát és/vagy az SNP-jellemzők jelenlétét.
Az újonnan szekvenált Mycobacterium bovis (n = 42) és az összeállított genomvázlat eredeti leolvasásai (n = 3) a komplexet a Mycobacterium tuberculosis H37Rv referencia genomhoz igazítják a vSNP-folyamaton és a különböző klónok deléciós és/vagy SNP-jellemzőinek jelenlétén keresztül. Keresést végeztek.
Információk gyűjtése a jellemzők hiányából és/vagy az SNP jelenlétéből/hiányából, valamint a spoligotípus-profilokból, hogy a genomikai adatokat a megfelelő klonális komplexhez rendelhessük. A négy vázlatos összeállítás esetében a spoligotípus-profil nem következtethető ki, ezért a „komplexitás nélküli” csoportba tartoznak.
A munka során követett bioinformatikai munkafolyamat a de novo összeállítástól és egy referenciastratégiához való leképezéstől kezdődik, azzal a céllal, hogy rekombinációs eseményeket és specifikus genompolimorfizmusokat vizsgáljon. Az 1. ábra a követett lépések folyamatábráját mutatja. A rekombinációs elemzéshez az összes genomot felhasználjuk a következtetések és a kapcsolódó indikátorok robusztusságának növelése érdekében.
A genom konszenzus szekvenciák generálása során előforduló hibák csökkentése érdekében először de novo összeállítást végeztünk, majd többszörös illesztéseket. Az Unicycler folyamat jelenleg a https://github.com/rrwick/Unicycler49 címen érhető el, és 54 szekvenált genom (42 újonnan szekvenált és 12 SRA-ból kinyert fastq fájl) de novo összeállítására szolgál. Röviden, az összeállítás megkezdése előtt leolvasási minőségelemzést végeztünk a FastQC 0.11.7-es verziójában (https://github.com/s-andrews/FastQC), valamint a Trimmomatic 0.36-os verziójában (az „Adapterek és egyéb világításspecifikus szekvenciák kivágása leolvasásokból” és a „Bázisok kivágása az leolvasás végéről, ha a minőség a 20-as küszöbértéknél alacsonyabb” opciók alkalmazása) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Ezután az SPAdes optimalizálót49-et használtuk a genom összeállításához, és a Pilon 1.1851-es verzióját az összeállítás utáni optimalizáláshoz. A helytelen összeszerelés elkerülése érdekében konzervatív áthidaló módot választottunk, és a k-mer méretet a leolvasási hossz 20% és 95%-a között kerestük és választottuk ki. Követtük az SPAdes irányelveit, és vettük figyelembe a leolvasási méretet, töröltük a 300 bp-nál kisebb kontigokat, és 52-es leolvasási mélységi lefedettségi határértéket határoztunk meg. A de novo összeszerelési stratégiában a genomiális régiókat, mint például a magas ismétlődési arányú prolin-glutamát (PE) és prolin-prolin glutamát (PPE) paralógokat, nem távolítottuk el.
A de novo összeállítás minőségét a QUAST folyamaton (//quast.sourceforge.net/quast.html) keresztül értékelik, amely megkönnyíti a kontig és az M. bovis AF2122/97 referencia genom (NCBI hozzáférési szám: LT708304.1) leképezésének megújítását (lásd az 1. kiegészítő táblázatot a minőségi paraméterekért).
A vSNP folyamatirányítás (https://github.com/USDA-VS/vSNP) segítségével az Illumina szekvenálásból származó újonnan szekvenált M. bovis FASTQ fájlját összehasonlítjuk az M. bovis AF2122/97 referencia genommal (LT708304.1). A Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55 legjobb gyakorlati ajánlásai szerint standard szűrőparamétereket vagy variáns tömegpontszámokat alkalmazunk az újrakalibráláshoz. Az eredményeket a legalacsonyabb, 150-es SAMtools tömegpontszám és AC = 2 alapján szűrjük. A szennyeződés kizárása érdekében a leolvasások ellenőrzéséhez a Kraken programot (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) is használjuk. A munkánkban a szekvenálási stratégiákhoz használt vSNP folyamatirányítás meghatározott SNP-k és célpontok sorozatát vizsgálja, és kizárja a vegyes fertőzési forgatókönyveket. Az olvasott genom lefedettsége jobb, mint 99% (1. kiegészítő táblázat).
A leképezési hibák és a hibás SNP-k elkerülése érdekében a következő esetekben szűrjünk ki egy variánst: (1) kevesebb mint 20 leolvasás támasztja alá, (2) 0,9-nél kisebb gyakorisággal található meg, (3) legalább egy törzsben megtalálható, de legalább egy másik törzsben vannak hiányosságok. Az integrált genomikai megjelenítő (IGV) 2.4.19-es verzióját (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 használtuk a leképezési vagy igazítási problémákkal küzdő SNP-k és pozíciók vizuális ellenőrzésére. Mivel a prolin-glutamát (PE) és a prolin-prolin glutamát (PPE) gének erősen duplikáltak és egy többgénes család részét képezik, az Illumina szekvenálás és a helytelen leképezés könnyen félreértheti őket, ezért ezeket részesítjük előnyben. A mikobakteriális bioinformatikai munkafolyamat eltávolította a tuberkulózis komplex tagjait, amikor a szekvenáláshoz való leképezés stratégiáját alkalmazta az SNP-k megerősítésére. Ezért kiszűrtük a PE/PPE géneket és az indeleket az elemzésből.
A Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) szerint minden SNP funkcionális kategóriákba sorolható. Az SnpEff folyamatot (https://pcingola.github.io/SnpEff/) használják az SNP-következmények (szinonim vagy nem szinonim változások) kikövetkeztetésére. Létrehoztak egy új adatbázist a Mycobacterium bovis AF2122/97 genomról (LT708304.1).
A többszörös illesztést a Parsnp v1.2 programmal végeztük, amely jelenleg a https://github.com/marbl/parsnp57 címen érhető el, 69 teljes genom/vázlat összeállítás felhasználásával (-c opcióval), és az M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) törzset használtuk referenciaként. Négy többszörös illesztést végeztünk: csak az Eu2 klónozó komplex tagjait (n = 37), beleértve az európai klónozó komplex összes tagját (n = 44), beleértve az európai és afrikai klónozó komplex csatlakozási pontját (n = 51), és a vizsgálatba bevontuk az összes Mycobacterium bovist (n = 70).
A Parsnp által generált magillesztést a CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 segítségével, RAxML használatával a maximum likelihood (ML) filogenetikai fa kikövetkeztetésére használják, és 1000 irányított replikációt hajtanak végre.
Három különböző algoritmust és bioinformatikai eszközt használnak a rekombinációs események jelenlétének párhuzamos ellenőrzésére: a SplitsTree4 szoftvert, a Gubbins (elfogulatlan leszármazási vonal vizsgálata nukleotidszekvenciákban rekombináción keresztül) folyamatcsatornát és az RDP4 (rekombináció-detektáló program, béta 4.101 verzió) szoftvert.
A gyökértelen filogenetikai hálózat kiszámításához a SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59-ben implementált split dekompozíciós módszert használjuk, statisztikailag Phi tesztet használunk, a szignifikancia küszöbértéke p = 0,05. Bemenetként a Parsnp mag többszörös illesztési elemzését használjuk, és a splitting decomposition-t hálózati szabványként valósítjuk meg.
A Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) alapértelmezett paraméterekkel fut, ami egy másik módja a rekombináció Mycobacterium bovisra gyakorolt hatásának értékelésére. A pipeline-ban implementált algoritmus rekonstruálja a releváns klónvonalat. Az adatkészletünk teljes genom/vázlat összeállítása és a referencia genom (szarvasmarha AF2122/97, LT708304.1) kölcsönösen befolyásolják az SNP pozícióját a fa minden ágán, hogy kimutassa a rekombinációs eseményt reprezentáló SNP klasztert. Az ág nullpontja: Tegyük fel, hogy nincs rekombinációs esemény, ami azt jelenti, hogy az ágon előforduló SNP-knek egyenletesen kell eloszlásúnak lenniük. Bemeneti fájlként a Parsnp többszörös illesztését és a RAxML legjobb pontszámú ML fáját használjuk.
Végül, a Gubbins-folyamat által javasolt reorganizációs esemény megerősítése érdekében az RDP467-ben implementált hat algoritmust (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 és SiScan66) alkalmaztuk a Parsnp mag többszörös illesztésére alapértelmezett beállításokkal. Megállapítottuk, hogy az RDP4-ben implementált algoritmusok közül legalább háromnak következetesen fontos jelet kell mutatnia minden egyes rekombinációs esemény ellenőrzéséhez.
Tekintettel arra, hogy mind a Gubbins, mind az RDP szoftver a rekombinációs jeleket a többszörös illesztések ellenőrzésével keresi egy legfeljebb 500 bp-os ablakban, és megerősíti, hogy a PE/PPE gének de novo összeszerelés során történő beépítése nem zavarja a talált rekombinációs jeleket, további elemzést végeznek homolinearitási módszerrel, amely a rekombinációs eseményt azonosító gén környezetének ellenőrzését teszi lehetővé. A teljes genomot használó szinlineáris térképet MAUVE-multi-genome illesztéssel (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) készítették a lokális genom transzlokációk vagy inverziók kizárása érdekében. Ezenkívül a teljes genomot felhasználták az aminosav-szekvencián végzett homolinearitási elemzéshez a SyntTax webszerveren (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) keresztül.
A portugál multi-host tuberkulózis rendszerből származó genom adatkészlet mélyebb elemzése a szakirodalomban említett gének polimorfizmusának ellenőrzését célozza. Ezek a gének a 37,38, valamint a 3R-t kódoló gén, amelyet az MTBC ősök a HGT (DNS-javító, replikációs és rekombinációs) rendszerkomponenseken keresztül szereztek be 39. A gén-diverzitás és a nukleotid-diverzitás (π) kiszámításához, valamint a Tajima-féle D semleges teszt paramétereinek bemenetéhez ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) és DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) szoftvereket kell használni.
Egy maximum likelihood (ML) filogenetikai fát kaptunk 69 Mycoplasma bovis izolátum és referencia genom alapján (2A. ábra). Az egygénes vagy többlókuszos fákkal összehasonlítva ez a stratégia lehetővé teszi erősebb fák létrehozását, amelyek nem ragadják meg a teljes genom variabilitását, és ezért alacsonyabb fajmegkülönböztetési képességet mutatnak 68,69. Az ML fa topológiai szerkezete általában összhangban van a klónok komplex osztályozásával. Az Eu2 genomja egy ágban csoportosul, és az Af1 genomja is egy csoportba tartozik (2A. ábra). Az eredmény összhangban van a Mycobacterium bovis ismert evolúciós kapcsolatával is, azaz nagy különbség van az Eu1 tag és az összes többi klonális komplexből és genomból álló csoport között, de a 30. klonális komplex nincs meghatározva. A klonális komplex és a filogenetikai fán megfigyelt kapcsolat közötti kis ellentmondás azzal magyarázható, hogy a klonális komplexet specifikus genomiális régiók alapján írják le, míg a filogenetikai fa a teljes genomot reprezentáló maggenomok többszörös illesztésén alapul.
A maximum likelihood filogenetikai fát (GTR) a Mycobacterium bovis genomjának a rekombinációs hely eltávolítása előtti (A) és utáni (B) genom-illesztése alapján szerkesztettük meg. Az ágak színei a Mycobacterium bovis klónkomplexet jelölik: az Európa 1 lila, az Európa 2 piros, az Európa 3 kék, az Afrika 1 narancssárga és az Afrika 2 zöld. A fa gyökeres és méretarányos, az ágak hosszát pedig minden hely helyettesítéseként mértük.
A Mycobacterium tuberculosis komplexet klonálisan evolúció útján fejlődőnek írják le, és az évek során felhalmozott bizonyítékok többsége alátámasztja azt az elképzelést, hogy a folyamatban lévő HGT és rekombinációs események nem fognak kimutatható MTBC-szinten bekövetkezni15,17,18.
Korábbi munkák kimutatták, hogy az MTBC törzsek között korlátozott rekombináció lehet20,21, míg mások nem tudtak mérhető rekombinációs eseményeket azonosítani70,71. Vitassuk meg újra ezt a kérdést a Mycobacterium bovisra összpontosítva, ami eltér a korábbi munkától, amely csak a Mycobacterium tuberculosis-t vette figyelembe 70,71; vagy tekintsük az MTBC-t egészében, szinte semmilyen M. bovis képviselet nélkül 20; vagy csak a korlátozó szarvasmarha-frakciókat vegyük figyelembe. A mikobaktérium-adatbázis ebben a munkában összesen 70 törzset tartalmaz, amelyek az összes klonális komplexet képviselik, és amelyeket a rekombináció szűrésére használnak. Az adatkészlet négy kumulatív szint szerint van skálázva: (1) Eu2 tagok, (2) az összes európai klónkomplexum tagja (azaz Európa), (3) európai és afrikai klónkomplexum (Eu + Af) és (4) a teljes adatgyűjtemények (beleértve azokat a genomokat is, amelyek nem szerepelnek a már leírt klónozó komplexekben).
A hipotézis további vizsgálatához egy osztott dekompozíciós hálózatot végeztek a genomok közötti rekombinációs események hiányának felmérésére, mivel ez a módszer képes vizualizálni az egyedek közötti ősi kapcsolatot, és ellentmondó filogenetikai jeleket megjeleníteni. Az elemzésben szereplő mind a négy adathalmaz megerősítette a hálózatban lévő hurkok létezését (azaz olyan területeket, amelyek nem konvergálnak egyetlen fává), de a Phi-tesztnek nincs statisztikai alátámasztása (Eu2, p = 0,0956; Európa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; a teljes adathalmaz p = 0,2451), ami gyenge bizonyítékot szolgáltat az reorganizációs események létezésére (3A-D. ábra).
Európában 2 genom (n = 37) (A), európai genomok (n = 44) (B), európai és afrikai genomok (n = 51) (C) és a teljes adathalmaz (n = 70) (D).
Ezt az elemzést követően, és figyelembe véve az összes hálózatban végzett ciklikus megfigyeléseket, a Gubbins-folyamatban implementált rekonstrukciós algoritmust alkalmazták a klonális leszármazási vonal rekonstruálására és a rekombináció M. bovis genomra gyakorolt hatásának becslésének kiegészítésére. Kikövetkeztették a rekombinációs események kumulatív számát, amelyek többsége terminális ágakban (azaz egyetlen genomban) történt (2. táblázat). Ezek a mutatók a teljes adathalmaz konzisztenciáját mutatják, és azt jelzik, hogy a rekombinációs események gyakorisága 200-300-szorosa a mutációk gyakoriságának. Amint a rho/theta paraméter, amely a rekombináció és a pontmutációk relatív arányát reprezentálja az ágon, 0,0037 és 0,0056 között van (3. táblázat). A 38 M. bovis törzzsel kapcsolatos, nemrég publikált munka magasabb rho/theta értéket mutatott (rho/theta = 0,1), mint amit ebben az adathalmazban kaptunk, de Patané és kollégái referencia-alapú összeállítást használtak a rekombinációs paraméterek következtetésére. Az összeállítási eljárásból adódó eljárási részlet a terminális ágban található feltételezett rekombinációs események bőségével hozható összefüggésbe.
Ezután az r/m paraméter a rekombináció és a mutáció bevezetésének diverzitási arányát jelenti, átlagos értéke 0,025 és 0,037 között van, ami azt jelzi, hogy a mutációkhoz képest a rekombinációnak kisebb az összhatása az M. bovis genetikai diverzitására (3. táblázat). A szélesebb körű összehasonlítás érdekében hasonló módszert alkalmaztunk az r/m paraméter becslésére a 23 genomból álló MTBC adatkészlet esetében, amely 0,48620 átlagos értéket mutatott, míg Patané és munkatársai 38 M. bovis adatkészlete esetében az átlagos érték 0,98 volt. Az első tanulmányban a 23 genom közül csak kettőt (az M. bovis BCG-t és a referencia törzset) vontunk be az M. bovis munkájába, így a kapott érték torzított lehet az M. tuberculosis genom túltermelése miatt. A második jelentésben az elemzett Mycobacterium bovis populációkat főként az Egyesült Államokból és haszonállatokból nyertük ki. Ezzel szemben a mi adatkészletünkben több földrajzi helyszín és gazdafaj képviselteti magát, és különböző populációgenetikai jellemzőkkel rendelkező, különböző klonális komplexekbe csoportosított genomokat is felhasználunk, így mélyebb és szélesebb körű populációs ismereteket érünk el. Az adatkészletünkkel kapott r/m átlagérték különbség összhangban van azzal az elképzeléssel, hogy a rekombináció mértéke nagymértékben változik az ugyanazon taxonómiai fajhoz rendelt leszármazási vonalak között, így ezek az eredmények azt jelzik, hogy az M. bovis klónkomplexum rekombinációs különbségeket mutathat. A hatás Didelot és Maiden72 által is javasolt. Mindazonáltal az adatkészlet jelentős bővítése nagyobb számú M. bovis genom bevonásával lehetővé teszi ennek a pontnak a további tisztázását. Mind az r/m, mind az rho/theta paraméterek változékonyságot mutatnak az ágak között, és ez az eredmény összhangban van más baktériumfajokról szóló jelentésekkel72,73.
Végül, a Gubbins-folyamat által azonosított reorganizációs események megerősítése érdekében hat különböző algoritmust használtak az RDP4 szoftverben a különböző alapvető többszörös összehasonlítások független tesztelésére. Globálisan a Gubbins által azonosított események kevesebb mint felét erősítette meg az RDP4 (4. és 5. táblázat). A teljes adathalmazt tekintve három rekombinációs eseményt erősítettek meg, kettőt belső csomópontokkal, a másikat pedig egyetlen genommal egy terminális ágban, amelyhez klonális komplexek nem rendelhetők hozzá (4. és 5. táblázat). A terminális ágakban található események azonosítása arra utalhat, hogy a rekombináció még folyamatban van a kortárs M. bovis törzsekben, vagy az eredmény rossz helyen van70. Ebben a hipotetikus rekombinációs régióban a pozíciók körülbelül 20%-a tartalmaz meghatározatlan nukleotidokat (N), így befolyásolja a rekombinációs jelet (2. kiegészítő ábra). Ezenkívül ez a régió érinti az rrs gént, amely a várhatóan erősen konzervált 16S riboszomális RNS-t kódolja, így ez a feltételezett rekombinációs jel szekvenálási hibák vagy eltérések eredménye lehet. Ezután elvégezték az Mb0003 és a Mycobacterium bovis AF2122/97 teljes genomillesztését, és megerősítették a meghatározatlan nukleotidok és SNP-k létezését, így a hibás illesztéssel kapcsolatos lehetséges problémák nem a jelen munkában alkalmazott biológiai információknak tudhatók be, hanem a program elsajátítása után jelentek meg.
A belső csomópontok rekombinációs régióiban nem találtunk réseket vagy meghatározatlan nukleotidokat (4. és 5. ábra). Ezen események közül az egyik csak az Eu2 genomot tartalmazza, és a pks12 gént érinti, amely egy lehetséges poliketid szintázt kódol; míg a másik az Eu1 genomban van regisztrálva, és a narX gént érinti, amely egy lehetséges nitrát reduktázt kódol (4. táblázat). Általánosságban elmondható, hogy a rekombinációs elemzés azt mutatja, hogy korlátozott számú, statisztikailag alátámasztott rekombinációs fragmens van, és a következtetett indikátorok azt jelzik, hogy a rekombinációnak alacsony hatása van az M. bovis leszármazási vonalra. A rekombinációs jel várhatóan alacsony, de fontos megkülönböztetni a valódi evolúciós jelet a háttérzajtól, ami kihívást jelentő feladat. A referencia-alapú összeszerelési és illesztési problémák 70, 71 által bevezetett zajjel csökkentése érdekében a teljes genom kivételével az összes többit a nulláról állították össze, és az összeszerelés minőségét QUAST pipeline elemzéssel ellenőrizték és biztosították (1. kiegészítő táblázat). Ezenkívül egy sor kiegészítő elemzést végeztek a teljes felmérés robusztusságának és pontosságának biztosítása érdekében. Ezért a narX és pks12 gének szekvenálási minőségét Mycobacterium bovis AF2122/97 elleni leolvasási térképezéssel értékelték. A rekombinációs régióban ajánlott SNP-pozíciót a módszertani részben említett kritériumok alkalmazásával igazolták (legalább 20 leolvasás és 0,9-es változási frekvencia). A narX gén polimorfizmusát teljes mértékben igazolták a két genomban (Mb1792361 és Mb7240415; 2,3%), valamint a pks12 genom genomjaiban: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 és Mb12 gének. Az Mb2043 genom esetében azonban a nyolc pozícióból hat nem felel meg az olvasási mélység kritériumnak, mivel az SNP-t maximum 17 olvasás támogatja, ami a megállapított 20-as határérték alatt van. Ezért hat genom (8,6%) rekombinációja ezen a genomhelyen megerősíthető (4. és 5. ábra).
A Mycobacterium bovis adatkészlet rekombinációs régió illesztésének részletes vizualizációja befolyásolja a narX gént, amely egy lehetséges nitrát-reduktázt kódol. A belső csomópontok rekombinációs régiójában nem találtunk réseket vagy meghatározatlan nukleotidokat. Ez a konkrét esemény az Eu1 genomban regisztrálódott. A narX gén szekvenálási minőségét a Mycobacterium bovis AF2122/97 leolvasásainak ábrázolásával értékeltük. A rekombinációs területen az ajánlott SNP helyet a módszertani részben említett kritériumok alkalmazásával igazoltuk (legalább 20 leolvasás és 0,9-es változási frekvencia). A narX gén polimorfizmusát teljes mértékben megerősítettük az Mb1792361 és az Mb7240415 genomjában (2,3%).
A Mycoplasma bovis adatkészlet pks12 gént érintő rekombinációs régió illesztésének részletes vizualizációja. A belső csomópontok rekombinációs régiójában nem találtunk hézagokat vagy meghatározatlan nukleotidokat. A lehetséges poliketid szintázt kódoló pks12 gént érintő eseményt illetően az csak az Eu2 genomot tartalmazza. A pks12 szekvenálási minőségét a Mycobacterium bovis AF2122/97 leolvasási térképezésével értékeltük. A rekombinációs területen az ajánlott SNP helyet a módszertani részben említett kritériumok alkalmazásával igazoltuk (legalább 20 leolvasás és 0,9-es változási frekvencia). Az Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 és Mb1960 genomok polimorfizmusait teljes mértékben megerősítettük.
A PE és PPE gének ismétlődő régiókat tartalmaznak, amelyeket az Illumina szekvenálás és a téves leképezés könnyen félreolvashat, ezért általában csak a szekvenciához való leképezés stratégiájának alkalmazásakor törlődnek az M. tuberculosis tagjainak bioinformatikai munkafolyamatából. Az ebben a munkában alkalmazott rekombinációs események következtetése a PE/PPE kiszűrése nélküli de novo összeállításon alapul. Úgy véljük, hogy három különböző, egymást kiegészítő módszer és algoritmus SplitsTree, Gubbins pipeline és RDP4 szoftver segítségével történő megvalósításával az alkalmazott stratégiák robusztusak a hibajelek által okozott átszervezett régiók feldolgozásában és szűrésében. Azonban annak érdekében, hogy kizárjuk a PE/PPE gén interferenciáját a Gubbins és az RDP4 szoftverekkel az SNP-klaszterek azonosításában, és ezáltal a narX és pks12 géneket befolyásoló rekombinációs régiók azonosításában, megvizsgáltuk ezen gének szomszédságát (3–5. kiegészítő ábra). Az M. bovis AF2122/97 esetében a narX gént a narK2 és az Mb1764c választja el, míg a pks12-t az Mb2075c és az Mb2073c veszi körül (3-5. kiegészítő ábra). A teljes genom MAUVE szinline térképével generált térkép információt nyújt a génszekvencia konzervációjáról és átrendeződéséről, négy kollineáris blokkot mutat, és nem mutat genom transzlokációra vagy inverzióra utaló jeleket. Ezenkívül az aminosav-szekvenciával végzett komplementációs analízis igazolta a homológiát az összes teljes genomban, és a narX vagy a pks12 szomszédos régióiban nem találtak PE/PPE-t. A narX esetében az egyik genom (Mb0030) alacsonyabb szinonimitás pontszámmal rendelkezik, mivel a narX gént két fragmensként azonosították (1891 és 1890 fragmensek). A pks12 esetében a hasonlóságok miatt az Mb0030 és az Mb003 alacsonyabb szinlinearitási pontszámot mutatott, míg a pks12-t két, illetve három fragmensben azonosították, amelyek a fehérje különböző doménjeit képviselik (3-5. kiegészítő ábra). Ezt az információt figyelembe véve, valamint a Gubbins és az RDP4 szoftverek által végzett elemzés és az ablakban a maximum 500 bp-os többszörös illesztés ellenőrzése alapján megerősítettük, hogy a PE/PPE gén nem zavarja a narX-et és a pks12-t érintő rekombinációs jelet.
Bár az ebben az adatkészletben detektált rekombinációs jelek reziduálisnak tekinthetők, igaz, hogy az M. bovisban a rekombináció nem zárható ki, ezért további elemzések tárgyát kell képeznie, amelyek során különböző epidemiológiai forgatókönyvekből származó teljes genomokat szekvenálnak Fontos besorolás szerint.
A rekombinációs korrekció előtt és után kapott ML filogenetikai fák összehasonlítása (2A., B. ábra) nem vezetett szignifikáns változásokhoz a következtetett filogenetikai kapcsolatban, és az M. bovis törzsek ugyanabba a csoportba kerültek.
Miután 42 újonnan szekvenált M. bovis leolvasást feltérképeztek az M. bovis AF2122/97 referencia genomjával, egy 1816 polimorf pozíciót tartalmazó SNP-illesztést kaptak. A legtöbb SNP (87,1%) a kódoló régióban található, és az érintett géneket a Bovilist táblázatban bemutatott funkcionális kategóriák szerint jellemezték (6A., B. ábra). Az egyes funkcionális kategóriákba tartozó gének teljes számát figyelembe véve a "lipidanyagcsere" kategóriába tartozó gének mutattak több SNP-t, ezt követte a "sejtfal és sejtfolyamatok", valamint az "intermedier anyagcsere és légzés", ami arra utal, hogy ezek az M. bovis evolúciójában részt vesznek.
A portugáliai M. bovis adatkészlet hierarchikus elemzése (n = 42). A regisztrált SNP-k és az érintett gének teljes száma funkcionális kategóriánként (A). A regisztrált szinonim és nem szinonim változások teljes száma funkciókategória szerint (B).
Globális szinten az átlagos dN/dS arány jobb, mint 1,5, ami azt jelzi, hogy a globális evolúciós nyomás az ősi állapottól való megszabadulásra irányul, és egy pozitív (diverzifikált vagy irányított) és/vagy laza tisztítási választási forgatókönyvet képvisel. A „virulencia, méregtelenítés, adaptáció”, az „inszerciós szekvenciák és fágok”, valamint a „szabályozó fehérjék” kategóriákban az SNP-k több mint kétharmada nem szinonima (6B. ábra).
Minden kategóriában vannak olyan gének, amelyek több SNP-vel rendelkeznek, ami 1-nél nagyobb átlagos mutációs rátát (azaz génenkénti átlagos SNP-t) eredményez (6A. ábra). A 15 SNP-vel rendelkező Pks12 (Mb2074c) és a 8 SNP-vel rendelkező fas (Mb2553c) magasabb mutációs értékekkel rendelkezik. Mindkét gén részt vesz a zsírsav-anyagcserében. A pks gén poliketid-szintázt (PKS) kódol, amely egy multifunkcionális enzim, amely a mikobakteriális sejtfal lipidbioszintézisében vesz részt74,75. Ez a gén egy multifunkcionális polipeptidet kódol, amely a mikoketidek szintézisében vesz részt74,76. A fas gén a mikolsav szintézisében vesz részt. Mindkét gén fontos szerepet játszik a gazdaszervezettel érintkező sejtfal bioszintézisében.
A Mycobacterium bovis evolúciójának további vizsgálata érdekében két specifikus génkészletet elemeztek. Korábban szekvencia-összetételt és filogenetikai módszereket alkalmazó munkák azonosították azokat a géneket, amelyeket az MTBC ősök a diverzifikáció előtt a HGT-n keresztül szereztek37,38. Ezeket a géneket a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza. Összesen 77, a HGT-hez kapcsolódó gén SNP-eloszlását elemezték, és 26 polimorf helyet azonosítottak, amelyek a legtöbb esetben (78%) nem szinonim (NS) változásokat eredményeztek (2. kiegészítő táblázat). Az MTBC genommal kapcsolatos korábbi munkák kimutatták, hogy a feltételezett HGT régió magasabb NS SNP-arányt mutat a genom többi részéhez képest. Ha azt gondoljuk, hogy ezeket a rekombinációs régiókat az MTBC ősök szerezték meg, és ezért felülreprezentálják az ősi polimorfizmusokat, akkor a szinonim változások aránya várhatóan magasabb lesz, mivel az NS-szubsztitúciók várhatóan negatív szelekcióval kiküszöbölődnek, mivel az aminosav-változások megváltoztathatják a fehérje funkcióját. Ezért eredményeink azt mutatják, hogy a funkcionális következmények a HGT-szerű gének cseréjéből fakadhatnak, ami tükrözi azok fontosságát az értékes adaptív genetikai diverzitás szempontjából.
Ezzel az elemzéssel párhuzamosan a 3R (DNS-javító, replikációs és rekombinációs) rendszer komponenseit kódoló géneket alaposan megvizsgálták a dos Vultos és munkatársai által korábban publikált lista (2008)39 szerint. Az azonos DNS-fragmensek cseréje nem figyelhető meg közvetlenül, bár gyakori folyamat lehet, ha közeli rokon baktériumokról van szó, mint például a jelen adathalmaz esetében; továbbá ez a folyamat lehet a DNS-javító módszerek kulcsa72, így szerepet játszhat a homológ rekombinációban. Összesen 26 polimorf pozíciót azonosítottak, amelyek 54 gén között oszlanak el (3. kiegészítő táblázat). Ebben a génkészletben az NS-változások a következmények mintegy 65%-át tették ki, ami összhangban van a Mycobacterium tuberculosis törzsekről szóló korábbi jelentésekkel.
Közzététel ideje: 2021. október 21.