អរគុណសម្រាប់ការទស្សនាធម្មជាតិ។ កំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលអ្នកកំពុងប្រើមានកម្រិតគាំទ្រសម្រាប់ CSS ។ សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកំណែថ្មីនៃកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិត (ឬបិទរបៀបភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ ទន្ទឹមនឹងនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្ត យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript ។
លំដាប់ហ្សែនបានធ្វើឱ្យមានជីវិតឡើងវិញនូវវិស័យស្រាវជ្រាវជំងឺឆ្លង ការបង្ហាញអំពីរោគរាតត្បាតជំងឺ ការបង្កើតរោគ អន្តរកម្មនៃធាតុបង្កជំងឺ និងដំណើរការវិវត្តន៍ដែលដាក់លើធាតុបង្កជំងឺ។ ស្មុគស្មាញ Mycobacterium tuberculosis (MTBC) ចាត់ទុក Mycobacterium bovis ថាជាសត្វមួយក្នុងចំនោមសមាជិកនៃការសម្របខ្លួនរបស់សត្វដែលបណ្តាលឱ្យកើតជំងឺរបេង (TB) នៅក្នុងថនិកសត្វលើដី និងជាគំរូធម្មតានៃការវិវត្តនៃបាក់តេរី។ ដូចសមាជិក MTBC ផ្សេងទៀតដែរ Mycobacterium bovis ត្រូវបានគេសន្មត់ថាជាការក្លូនយ៉ាងតឹងរ៉ឹង មានការវិវត្តន៍នៃមេរោគ ហើយច្បាស់ជាមិនមានសញ្ញានៃការផ្សំឡើងវិញ ឬការផ្ទេរហ្សែនផ្តេកទេ។ នៅក្នុងការងារនេះ យើងអនុវត្តពន្ធុវិទ្យាប្រៀបធៀបទៅនឹងសំណុំទិន្នន័យលំដាប់ហ្សែនទាំងមូល (WGS) ដែលផ្សំឡើងដោយគោក្របី 70 M. ពីពូជផ្សេងៗគ្នា (អឺរ៉ុប និងអាហ្រ្វិក) ដើម្បីទទួលបានការយល់ដឹងអំពីភាពចម្រុះហ្សែនរបស់គោក្របី M. ថាមពលវិវត្តន៍។ វិធីសាស្រ្តបីផ្សេងគ្នាត្រូវបានប្រើដើម្បីប៉ាន់ប្រមាណសញ្ញានៃការរៀបចំឡើងវិញ។ នៅទូទាំងពិភពលោក ព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញមួយចំនួនតូចត្រូវបានកំណត់ និងបញ្ជាក់ដោយវិធីសាស្រ្តឯករាជ្យពីរដោយមានការគាំទ្រយ៉ាងរឹងមាំ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ បើប្រៀបធៀបជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរ ការផ្សំឡើងវិញមានឥទ្ធិពលខ្សោយលើភាពចម្រុះនៃ M. bovis (សរុប r/m = 0.037) ។ ភាពខុសគ្នាជាមធ្យម r/m ដែលទទួលបាននៅក្នុងស្មុគ្រស្មាញ clonal នៃ Mycobacterium bovis នៅក្នុងសំណុំទិន្នន័យរបស់យើងគឺស្របជាមួយនឹងគោលគំនិតទូទៅដែលកម្រិតនៃការផ្សំឡើងវិញអាចប្រែប្រួលយ៉ាងខ្លាំងរវាងពូជពង្សដែលត្រូវបានចាត់តាំងចំពោះប្រភេទពន្ធុវិទ្យាដូចគ្នា។ ដោយផ្អែកលើការងារនេះ ការផ្សំឡើងវិញនៅក្នុង Mycobacterium bovis មិនអាចត្រូវបានគេច្រានចោលទេ ដូច្នេះវាគួរតែជាកម្មវត្ថុនៃកិច្ចខិតខំប្រឹងប្រែងបន្ថែមទៀតនៅក្នុងការស្រាវជ្រាវហ្សែនប្រៀបធៀបនាពេលអនាគត ដែលក្នុងនោះ WGS នៃទិន្នន័យដ៏ធំកំណត់ពីសេណារីយ៉ូរោគរាតត្បាតផ្សេងៗគ្នាជុំវិញពិភពលោកមានសារៈសំខាន់ណាស់។ បន្ទាប់មកការវិភាគបន្ថែមត្រូវបានអនុវត្តលើសំណុំទិន្នន័យ Mycobacterium bovis តូចជាង (n = 42) ពីអត្រាប្រេវ៉ាឡង់នៃជំងឺរបេងពហុម៉ាស៊ីន ហើយច្រើនជាង 1,800 loci ត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណ ដែលក្នុងនោះយ៉ាងហោចណាស់មួយប្រភេទបានបង្ហាញពី polymorphism nucleotide (SNP) តែមួយ។ ភាគច្រើន (87.1%) មានទីតាំងនៅក្នុងតំបន់សរសេរកូដ ហើយសមាមាត្រសកលនៃការផ្លាស់ប្តូរមិនមានន័យដូចគ្នា (dN/dS) នៃការផ្លាស់ប្តូរមានន័យដូចលើសពី 1.5 ដែលបង្ហាញថាការជ្រើសរើសវិជ្ជមានគឺជាកម្លាំងវិវត្តន៍ដ៏សំខាន់ដែលបានអនុវត្តលើ M. bovis ។ សមាមាត្រខ្ពស់នៃ SNPs ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងហ្សែនដែលសំបូរទៅដោយប្រភេទមុខងារនៃ "ការរំលាយអាហារជាតិខ្លាញ់" "ជញ្ជាំងកោសិកា និងដំណើរការកោសិកា" និង "ការរំលាយអាហារកម្រិតមធ្យម និងការដកដង្ហើម" ដែលបង្ហាញពីសក្តានុពលរបស់ពួកគេនៅក្នុងជីវវិទ្យា និងការវិវត្តនៃសារៈសំខាន់ Mycobacterium bovis ។ ការក្រឡេកមើលហ្សែននៅក្នុងបុព្វបុរស MTBC ដែលងាយនឹងផ្ទេរហ្សែនផ្តេក និងរួមបញ្ចូលនៅក្នុងប្រព័ន្ធ 3R (ការជួសជុល DNA ការចម្លង និងការផ្សំឡើងវិញ) បង្ហាញពីតម្លៃអវិជ្ជមានជាសកលនៃការធ្វើតេស្តអព្យាក្រឹត D របស់ Taijima ដែលបង្ហាញពីការស្កែនជ្រើសរើសអតីតកាល ការប្រយុទ្ធប្រឆាំងនឹងការរាំងស្ទះនាពេលថ្មីៗនេះបន្ទាប់ពីការពង្រីកចំនួនប្រជាជននៅតែជាកត្តាជំរុញការវិវត្តនៃបាក់តេរី Myogenvisary ។ ម្ចាស់ផ្ទះ។
Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) គឺជាថ្នាំដែលទទួលបានជោគជ័យបំផុតនៃមេរោគបាក់តេរី និងជាករណីធម្មតានៃការវិវត្តនៃបាក់តេរី។ សមាជិករបស់វាបង្ហាញអត្តសញ្ញាណនុយក្លេអូទីតខ្ពស់គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើលនៅកម្រិតហ្សែន (> 99%)1,2 ។ ប្រភេទអេកូ MTBC ផ្សេងៗគ្នាអាចបង្កឱ្យមានជំងឺរបេង (TB) ដែលជាជំងឺ granulomatous ឆ្លងនៅក្នុងជួរដ៏ធំទូលាយនៃប្រភេទសត្វពីមីក្រូថនិកសត្វដល់មនុស្ស3,4,5។ បច្ចុប្បន្ននេះ ស្មុគស្មាញរួមមានមនុស្ស [M. ជំងឺរបេង (Mtb), Mycobacterium africanum] និងភ្នាក់ងារបង្ករោគដែលប្រែប្រួលដោយសត្វ (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus "5" និង 6) ។ M. canettii (ត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា "Nodobacter glabrata") អត្តសញ្ញាណនុយក្លេអូទីតជាមធ្យមជាមួយនឹង mycobacteria ដែលបានរៀបរាប់ខាងលើគឺ 98% ហើយការងារហ្សែនប្រៀបធៀបបានបង្ហាញថា M. canettii និងនៅសល់នៃ MTBC ថ្មីៗនេះបានផ្លាស់ប្តូរពីបុព្វបុរសទូទៅ។7 ដោយពិចារណាលើគោលគំនិតនេះ អ្នកនិពន្ធខ្លះហៅថាសមាជិក MT BC. canetti
MTBC ត្រូវបានពិពណ៌នាជាប្រព័ន្ធថាជាស្មុគ្រស្មាញក្លូនដ៏តឹងរឹង ហើយរចនាសម្ព័ន្ធចំនួនប្រជាជនរបស់វាត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងច្បាស់ដោយការកាត់បន្ថយភាពចម្រុះ ការស្ទះ ការស្កែនជ្រើសរើស និងការរសាត់ហ្សែន9,10។ ការសន្មត់ថាការវិវត្តន៍ក្លូនដ៏តឹងរឹងដ៏ស្មុគស្មាញ ដូចជាប៉ូលីម័រហ្វីសដែលបាត់មិនអាចត្រូវបានស្ដារឡើងវិញដោយការផ្សំឡើងវិញ។ ដោយផ្អែកលើការសន្និដ្ឋាននេះ ព្រឹត្តិការណ៍ជាប់គ្នានៃការលុបហ្សែននៃតំបន់ឌីផេរ៉ង់ស្យែល (RD) និង TbD1 (តំបន់លុបជាក់លាក់ Mtb 1) ត្រូវបានស្នើឡើងជាសញ្ញាសម្គាល់ម៉ូលេគុលនៃការវិវត្តន៍ MTBC 2,5,11។ ការងារប្រៀបធៀបហ្សែន និងការធ្វើលំដាប់ហ្សែនទាំងមូល (WGS) គាំទ្រដល់ការបែងចែកសមាជិកដែលសម្របខ្លួនដោយមនុស្សទៅជាប្រាំបួនត្រកូល (Mycobacterium tuberculosis L1 to L4, L7, and L8; និង Mycobacterium africanum L5, L6, and L9) តំណពូជ L2 ទៅ L4 ដែលបានចែករំលែក លុបតំបន់ TbD112, 13112 លើសពីនេះ សមាជិកដែលសម្របសម្រួលសត្វត្រូវបានស្នើឱ្យចែករំលែកបុព្វបុរសទូទៅ ដែលត្រូវបានកំណត់ដោយការលុបជាក់លាក់នៅក្នុង RD7, RD8, RD9 និង RD102, 5, និង 14 ។
ការផ្ទេរហ្សែនផ្តេក (HGT) និងព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញត្រូវបានចាត់ទុកថាកម្រ និងកើតឡើងនៅក្នុងបុព្វបុរសរបស់ MTBC ជាជាងប្រវត្តិផ្សេងគ្នានៃសមាជិក MTBC ទាំងមូល15,16,17។ របាយការណ៍ដំបូងចំនួនពីរដោយ Hughes និងអ្នកសហការ (2002) និង Gutacker និងអ្នកសហការ (2006) បានផ្តល់យោបល់ថាព្រឹត្តិការណ៍នៃការផ្សំឡើងវិញអាចជួយបង្កើតពហុម៉ូហ្វីសដែលសម្គាល់ទីតាំងជាក់លាក់នៅក្នុង M. tuberculosis strains18,19។ ហេតុផលសម្រាប់ការខ្វះខាតជាក់ស្តែងនៃការផ្សំឡើងវិញនៅក្នុង MTBC គឺ: (1) ដំណើរការមេកានិក និងការបាត់បង់សមត្ថភាពរបស់ HGT; (2) កម្រមាននៃព្រឹត្តិការណ៍ HGT; (3) មិនមានឱកាសនៃព្រឹត្តិការណ៍រួមបញ្ចូលគ្នានៅក្នុង MTBC niche14,17 ទេ។ ថ្មីៗនេះ ការសិក្សាមួយចំនួននៃលំដាប់ហ្សែនទាំងមូល (WGS) បានអនុវត្តចំពោះ MTBC strain 20 និង Mycobacterium bovis 21 បានផ្តល់ភស្តុតាងនៃការផ្សំឡើងវិញ ដែលជាដំបូងដែលបង្ហាញថា ពូជ MTBC ជារឿយៗផ្លាស់ប្តូរបំណែក DNA តូចៗ ប៉ុន្តែដោយសារការប្រែប្រួលនៃលំដាប់ nucleotide មានកម្រិត ព្រឹត្តិការណ៍ទាំងនេះនៅតែមិនត្រូវបានកត់សម្គាល់។
Mycobacterium bovis គឺជាសមាជិក MTBC ដែលត្រូវបានរកឃើញញឹកញាប់បំផុតពីសត្វពាហនៈ (ជាចម្បងគោក្របី) ទោះបីជាវាក៏អាចដាច់ដោយឡែកពីសត្វព្រៃដែលហ៊ុមព័ទ្ធបានដែរ 4,22,23,24។ M. bovis បានវិវត្តទៅជាស្មុគ្រស្មាញធំៗចំនួនប្រាំ [អ៊ឺរ៉ុប 1 (Eu1), អឺរ៉ុប 2 (Eu2), អឺរ៉ុប 3 (Eu3), អាហ្រ្វិក 1 (Af1) និងអាហ្វ្រិក 2 (Af2)] យោងទៅតាមទម្រង់ spoligotyping ការលុបជាក់លាក់ និង polymorphisms នុយក្លេអូទីតតែមួយ (SNP2 7, 28, 25) ហ្សែន។ ស្មុគ្រស្មាញក្លូនទាំងនេះបង្ហាញពីរចនាសម្ព័ន្ធចម្រុះនៃចំនួនប្រជាជន Mycobacterium bovis និងការផ្សារភ្ជាប់របស់វាជាមួយតំបន់ភូមិសាស្ត្រ។ លើសពីនេះ ការងារ WGS ថ្មីៗដែលធ្វើឡើងដោយ Zimpel និងអ្នកសហការ (2020) បានរចនារូបវិទ្យាដោយផ្អែកលើ SNP នៃ Mycobacterium bovis ដែលមានហ្សែនច្រើនជាង 1,900 ដែលបង្ហាញថាមានយ៉ាងហោចណាស់បួនពូជខុសៗគ្នា (ដាក់ឈ្មោះ Lb1 ដល់ Lb1 ដល់ Lb4) ពួកវាមិនស៊ីសង្វាក់គ្នាទាំងស្រុងជាមួយនឹងភាពស្មុគស្មាញ 3 ពីមុនក៏អាចបញ្ជាក់បានដែរ។ អ្នកនិពន្ធទាំងនេះបានធ្វើការវិភាគឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃ phylogeny និងការណាត់ជួបម៉ូលេគុល ប៉ុន្តែមិនបានសិក្សាការផ្សំឡើងវិញ30ទេ។
ការងារពីមុនដោយប្រើបច្ចេកទេសម៉ូលេគុលផ្សេងគ្នាដូចជា spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) និងការវាយ SNP ថ្មីៗនេះបានបង្ហាញពីកម្រិតជាក់លាក់នៃភាពចម្រុះនៃហ្សែនក្នុងចំណោម M. bovis strains 31,32,33,34,35។ ភាពខុសគ្នានៃការប្រែប្រួលហ្សែនបានក្លាយជាឧបករណ៍សំខាន់ក្នុងការសិក្សាអំពីរោគរាតត្បាតជំងឺ ដែលមានប្រយោជន៍សម្រាប់ការយល់ដឹងស៊ីជម្រៅអំពីការបង្កើតជំងឺ មេរោគ និងការចម្លងជំងឺ។ ការលេចឡើងនៃវិធីសាស្ត្រ WGS ផ្តល់នូវលទ្ធភាពដើម្បីបង្ហាញពីកត្តាជំរុញការវិវត្តន៍ដែលកំណត់ដោយហ្សែន Mycobacterium bovis នៅក្នុងដំណើរការនៃការសម្របខ្លួន និងការបន្តទៅម៉ាស៊ីនផ្សេងៗគ្នា និងសេណារីយ៉ូរោគរាតត្បាត។
នៅក្នុងការងារនេះ យើងប្រើប្រាស់ការវិភាគហ្សែនប្រៀបធៀបលើសំណុំទិន្នន័យ Mycoplasma bovis ផ្សេងៗ (n=70) រួមទាំងឯកោពីស្មុគស្មាញក្លូនផ្សេងៗគ្នា ដើម្បីទទួលបានការយល់ដឹងអំពីដំណើរការវិវត្តនៃ Mycoplasma bovis ជាពិសេសដើម្បីដោះស្រាយទំនាក់ទំនង phylogenetic និងព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញ។ ជាការបន្ថែមទៅលើការវិភាគនេះ សំណុំទិន្នន័យរងនៃ M. bovis isolates (n = 42) ដែលទទួលបានពីតំបន់ជំងឺរបេងពហុម៉ាស៊ីនដែលមានលក្ខណៈល្អនៅក្នុងប្រទេសព័រទុយហ្គាល់ 31,36 ត្រូវបានរុករកបន្ថែមទៀតដើម្បីសន្និដ្ឋានអំពីភាពមិនមែនជាអត្តសញ្ញាណនៃតុល្យភាពរវាងសមាមាត្រទាក់ទងនៃអារម្មណ៍ (dN) ទៅនឹងការជំនួសនុយក្លេអូទីតដែលមានន័យដូចគ្នា (dS) ក៏ដូចជាការជំនួសហ្សែនជាក់លាក់ដែលបានលើកឡើងផងដែរ។ អក្សរសិល្ប៍ ពួកគេមាន 37,38 ដែលទទួលបានដោយបុព្វបុរស MTBC តាមរយៈ HGT និងអ៊ិនកូដ 3R (ការជួសជុល DNA ការចម្លង និងការផ្សំឡើងវិញ) ធាតុផ្សំហ្សែននៃប្រព័ន្ធ 39. ជ្រើសរើសហ្សែនដែលទទួលបានតាមរយៈ HGT ព្រោះពួកវាអាចតំណាងឱ្យពហុម៉ូហ្វិចបុរាណ ដូច្នេះវាត្រូវបានគេរំពឹងថាពួកគេអាចមានសមាមាត្រខ្ពស់ជាងនៃការផ្លាស់ប្តូរមានន័យដូច។ ហ្សែនដែលរួមបញ្ចូលនៅក្នុងប្រព័ន្ធ 3R ត្រូវបានជ្រើសរើស ដោយសារការងារពីមុនលើប្រភេទជំងឺរបេង M. បង្ហាញពីការជ្រើសរើសអវិជ្ជមាន/ការបន្សុតទូទៅដែលដំណើរការលើហ្សែនទាំងនេះ ហើយពួកវាអាចដើរតួយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការវិវត្តន៍ 39។ គោលដៅមួយទៀតនៃការងារនេះគឺដើម្បីបង្ហាញពីអត្ថិភាពនៃព្រឹត្តិការណ៍រៀបចំឡើងវិញ។ ដោយហេតុផលនេះ ដោយពិចារណាថាសំណុំទិន្នន័យរបស់យើងពីព័រទុយហ្គាល់មានផ្ទុកតែហ្សែននៃស្មុគ្រស្មាញក្លូនអ៊ឺរ៉ុប 2 និងប្រភេទដែលមិនបានកំណត់ស្មុគស្មាញក្លូន យើងបានសម្រេចចិត្តបញ្ចូលទិន្នន័យហ្សែនដែលមានជាសាធារណៈដើម្បីទទួលបានតំណាងនៃស្មុគស្មាញក្លូនទាំងអស់ និងកែលម្អភាពរឹងមាំ និងវិសាលភាពនៃលទ្ធផល។
42 ហ្សែន Mycoplasma bovis ដែលត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ថ្មីពីឈុតជំងឺរបេងពហុម៉ាស៊ីនរបស់ព័រទុយហ្គាល់ (ព័ត៌មានលម្អិតខាងក្រោម) ដែលពីមុនត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈពីទស្សនវិស័យរោគរាតត្បាត36 គឺជាចំណុចកណ្តាលនៃការងារនេះ។ ដោយពិចារណាថាសំណុំទិន្នន័យមកពីប្រទេសព័រទុយហ្គាល់មានតែតំណាងនៃស្មុគ្រស្មាញក្លូនអ៊ឺរ៉ុប 2 និងសំពាធដោយគ្មានស្មុគស្មាញដែលបានកំណត់ ទិន្នន័យលំដាប់ហ្សែនទាំងមូលដែលមានជាសាធារណៈត្រូវបានបន្ថែមដើម្បីពង្រីកសំណុំទិន្នន័យដែលរួមបញ្ចូលតំណាងទាំងអស់នៃស្មុគស្មាញក្លូន M. bovis ។ ដូច្នេះប្រភពទិន្នន័យលំដាប់ហ្សែនទាំងមូលចំនួនបីត្រូវបានប្រើប្រាស់ក្នុងការងារនេះ៖ ការប្រមូលផ្តុំហ្សែនពេញលេញ/ព្រាង រហូតដល់ទៅ 10 រន្ទាដែលរក្សាទុកនៅក្នុង NCBI (មជ្ឈមណ្ឌលជាតិសម្រាប់ព័ត៌មានជីវបច្ចេកវិទ្យា) (n = 15 ឯកោ); រក្សាទុកក្នុង SRA (ឯកសារ Illumina fastq នៃលំដាប់ដែលបានអានបណ្ណសារ) តំណាងឱ្យភាពចម្រុះដ៏ស្មុគស្មាញនៃ M. bovis clones (n = 12 isolates)30; និង 42 genomes លំដាប់ថ្មីពីព័រទុយហ្គាល់។ Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ត្រូវបានដកចេញពីការស្វែងរក NCBI ។ M. bovis AF2122/97 ជាធម្មតាត្រូវបានគេប្រើជាហ្សែនយោងដែលត្រូវបញ្ចូលក្នុងសំណុំទិន្នន័យ។ ដោយសារភាពមិនមានជាសាធារណៈនៃលំដាប់ហ្សែនទាំងមូលដែលតំណាងដោយស្មុគស្មាញក្លូនអាហ្វ្រិក 1 និងចំនួនហ្សែនតិចតួចពីប្រភេទតំណាងនៃ Af2 និង Eu1 ទិន្នន័យលំដាប់ដើមដែលផ្តល់ដោយ SRA ត្រូវបានប្រើនៅក្នុងករណីទាំងនេះ។ ការងាររបស់ Zimpel និងអ្នកសហការរបស់គាត់ (2020) បានជួយកំណត់អត្តសញ្ញាណហ្សែនពីស្មុគស្មាញក្លូនដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ និងបានជួយជ្រើសរើស Mycobacterium bovis សម្រាប់ដាក់បញ្ចូលក្នុងសំណុំទិន្នន័យ។ សម្រាប់ Eu3 មានតែប្រភេទហ្សែនមួយប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានពិពណ៌នា (Branger et al ។ , 2020) ដូច្នេះហ្សែនដែលយើងរួមបញ្ចូលគឺជាតំណាងដាច់ដោយឡែកនៃស្មុគស្មាញ Eu3 ។
ជាសកល សំណុំទិន្នន័យនេះរួមមានគោក្របី 70 ប្រភេទ M. bovis ដាច់ដោយឡែកពី 8 ប្រភេទសត្វដែលចែកចាយក្នុង 12 ប្រទេសពីឆ្នាំ 1985 ដល់ឆ្នាំ 2016 ។ 36 ប្រភេទត្រូវបានកំណត់ថាជា Eu2, 7 ប្រភេទគឺ Eu1, 1 ប្រភេទគឺ Eu3, 3 ប្រភេទគឺ Af1, 4 ប្រភេទគឺ Af2 និង 19 ប្រភេទគឺមិនអាចកំណត់បានឡើយ។ ពត៌មានលំអិត (រួមទាំងលេខចូល) នៃ Mycobacterium bovis ដែលប្រើក្នុងការសិក្សានេះត្រូវបានបង្ហាញក្នុងតារាងទី 1 និងតារាងបន្ថែមទី 1 ។
ហ្សែន Mycobacterium bovis សរុបចំនួន 42 ដែលត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ថ្មីពីចំណុចក្តៅនៃជំងឺរបេងសត្វរបស់ប្រទេសព័រទុយហ្គាល់ និងត្រូវបានចែកចាយអស់រយៈពេលជាង 12 ឆ្នាំគឺជាចំណុចកណ្តាលនៃការសិក្សានេះ ដោយសារប្រព័ន្ធជំងឺសត្វព្រៃ-បសុសត្វមានសក្តានុពលត្រូវបានត្រួតពិនិត្យជាប្រចាំ 31,36 (រូបភាពបន្ថែម 1) ។ យោងតាមនីតិវិធីជាបន្តបន្ទាប់ ពូជទាំងនេះត្រូវបានញែកចេញពីគោក្របី (n=14) សត្វក្តាន់ក្រហម (n=16) និងជ្រូកព្រៃ (n=12) ពីឆ្នាំ 2003 ដល់ឆ្នាំ 2015៖ ប្រមូល និងដោះស្រាយសត្វដោយអនុលោមតាមគោលការណ៍ណែនាំពិធីសារដែលបានណែនាំ។ គំរូជាលិកាមាននៅក្នុងសៀវភៅដៃសត្វនៅលើដី OIE Stonewense និងត្រូវបានពិនិត្យ និងធ្វើពិសោធលើសត្វ។ មធ្យមនិងរាវ។ វប្បធម៌ត្រូវបាន incubated នៅ 37 ° C ហើយការលូតលាស់ត្រូវបានត្រួតពិនិត្យម្តងក្នុងមួយសប្តាហ៍យ៉ាងហោចណាស់ 12 សប្តាហ៍។ អាណានិគមត្រូវបានរក្សាទុកដោយផ្ទាល់នៅក្នុងដំណោះស្រាយ glycerol នៅ -80ºC ។ នៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកជ្រើសរើស Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) គំរូដែលបានរក្សាទុកដើមត្រូវបានឆ្លងកាត់ការអនុម័តតែមួយនៅក្នុង vitro ដើម្បីទទួលបាន DNA នៃកម្មវិធី WGS ។ ចំពោះបញ្ហានេះ ដំណោះស្រាយស្តុកវប្បធម៌កកត្រូវបានសំបូរទៅដោយសារធាតុសូដ្យូម pyruvate 5% និង 10% ADS (50 g albumin, 20 g glucose, 8.5 g sodium chloride in 1 L water) នៅលើ Middlebrook 7H9 នៅ 37 ° C Retrain ។ បន្ទាប់ពីការលូតលាស់រយៈពេល 4 សប្តាហ៍ ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានបន្ត ហើយវប្បធម៌ត្រូវបានត្រួតពិនិត្យជាប្រចាំរហូតដល់ការលូតលាស់ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ។ កោសិកាត្រូវបានប្រមូលផលដោយការ centrifugation គ្រាប់ត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញក្នុង 500 µL phosphate buffered saline (PBS) កំដៅនៅ 99 °C រយៈពេល 30 នាទី centrifuged ហើយ supernatant ត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -20 °C រហូតដល់ WGS ។ នីតិវិធីទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងកន្លែងជីវសុវត្ថិភាពកម្រិត 3 ។
បណ្ណាល័យហ្សែនដែលផ្គូផ្គង WGS ត្រូវបានរៀបចំដោយប្រើសន្ទស្សន៍តែមួយគត់នៃគំរូ DNA នីមួយៗ ហើយប្រើ Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 សំណាក) និងបច្ចេកវិទ្យា HiSeq (2 × 150 pb) (ពីរឯកោ) (Eurofins Genomics, Germany) សម្រាប់ការតម្រៀប។ យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត សូមប្រើ Illumina Genome Analyzer ជាមួយនឹងការភ្ជាប់ម៉ូឌុលទ្វេចុង ដើម្បីតម្រៀប DNA ហ្សែន ហើយប្រើ Nextera XT DNA Library Prep Kit ពី Illumina ដើម្បីសាងសង់បណ្ណាល័យ។
ដោយគិតគូរពីទិន្នន័យដែលបានយកមកវិញពី SRA (n=12) ការកំណត់អត្តសញ្ញាណនៃស្មុគ្រស្មាញក្លូនអាចត្រូវបានប្រើជាទិន្នន័យមេតានៃការបោះពុម្ពផ្សាយដែលត្រូវគ្នា 30, 41, 43។ នៅពេលពិចារណាលើហ្សែនពេញលេញ លើកលែងតែ Mycobacterium bovis AF2122/97 និង Mycobacterium bovis គឺជាសមាជិកនៃ clone 3601 និងស្មុគស្មាញ 25, 29 រៀងគ្នា វាដូចគ្នាទៅនឹងហ្សែនពេញលេញនៃ Mycobacterium tuberculosis H37Rv (លេខចូល NCBI NC_000962.3)។ ការតម្រឹមហ្សែនត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ MAFFT (កម្មវិធីតម្រឹមច្រើននៃអាស៊ីតអាមីណូ ឬលំដាប់នុយក្លេអូទីត កំណែ 7.458) និងប៉ារ៉ាម៉ែត្រ -addfragments48 ។ បន្ទាប់មក ស្វែងរកអវត្ដមាននៃស្មុគ្រស្មាញក្លូនផ្សេងៗគ្នា និង/ឬវត្តមាននៃលក្ខណៈពិសេស SNP ។
Mycobacterium bovis (n = 42) ដែលត្រូវបានបន្តបន្ទាប់គ្នាថ្មី និងការអានដើមនៃពង្រាងហ្សែនដែលបានជួបប្រជុំគ្នា (n = 3) តម្រឹមស្មុគស្មាញជាមួយនឹងហ្សែនយោង Mycobacterium tuberculosis H37Rv តាមរយៈបំពង់ vSNP និងវត្តមាននៃការលុប និង/ឬលក្ខណៈពិសេស SNP នៃក្លូនផ្សេងៗគ្នា ការស្វែងរកត្រូវបានធ្វើឡើង។
ប្រមូលព័ត៌មានពីការខ្វះខាតមុខងារ និង/ឬវត្តមាន/អវត្តមាននៃ SNP និងទម្រង់ spoligotyping ដើម្បីផ្តល់ទិន្នន័យហ្សែនទៅស្មុគស្មាញក្លូនដែលត្រូវគ្នា។ សម្រាប់សភាពង្រាងទាំងបួន ទម្រង់ spoligotyping មិនអាចសន្និដ្ឋានបានទេ ដូច្នេះពួកវាត្រូវបានបញ្ចូលក្នុងក្រុម "គ្មានភាពស្មុគស្មាញ"។
លំហូរការងារជីវព័ត៌មានវិទ្យាដែលបន្តដោយការងារនេះចាប់ផ្តើមពីការជួបប្រជុំគ្នារបស់ ដឺណូវ៉ូ និងការធ្វើផែនទីទៅជាយុទ្ធសាស្ត្រយោង ដោយមានគោលដៅស្វែងរកព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញ និងពហុហ្សែនជាក់លាក់។ រូបភាពទី 1 ផ្តល់នូវតារាងលំហូរនៃជំហានដែលធ្វើតាម។ សម្រាប់ការវិភាគផ្សំឡើងវិញ ហ្សែនទាំងអស់ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើនភាពរឹងមាំនៃការសន្និដ្ឋាន និងសូចនាករពាក់ព័ន្ធ។
ដើម្បីកាត់បន្ថយកំហុសឆ្គងក្នុងការបង្កើតលំដាប់នៃការយល់ស្របហ្សែននេះ ដំបូងយើងទទួលបាន de novo assembly ហើយបន្ទាប់មកទទួលបានការតម្រឹមច្រើនស្នូល។ បំពង់ Unicycler បច្ចុប្បន្នមាននៅ https://github.com/rrwick/Unicycler49 ហើយត្រូវបានប្រើដើម្បីអនុវត្តការជួបប្រជុំគ្នា de novo នៃ 54 genomes បន្តបន្ទាប់គ្នា (42 ដែលទើបនឹងបន្តបន្ទាប់គ្នា និង 12 fastq ឯកសារដែលបានទាញយកពី SRA) ។ សរុបមក មុនពេលដំឡើងពីដំបូង ការវិភាគគុណភាពនៃការអានត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុង FastQC កំណែ 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) និង Trimmomatic កំណែ 0.36 (ជម្រើស "កាត់អាដាប់ទ័រ និងលំដាប់ជាក់លាក់នៃពន្លឺផ្សេងទៀតពីការអាន" និង "កាត់មូលដ្ឋានពីចុងបញ្ចប់នៃគុណភាព 2" ត្រូវបានប្រើប្រាស់ឡើងវិញ) ប្រសិនបើអានឡើងវិញ (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. បន្ទាប់មក SPAdes optimiser49 ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការផ្គុំហ្សែន ហើយ Pilon កំណែ 1.1851 ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពក្រោយការជួបប្រជុំគ្នា។ របៀបស្ពានបែបអភិរក្សត្រូវបានជ្រើសរើស ដើម្បីជៀសវាងការជួបប្រជុំគ្នាមិនត្រឹមត្រូវ ហើយទំហំ k-mer ត្រូវបានស្វែងរក និងជ្រើសរើសចន្លោះពី 20% ទៅ 95% នៃប្រវែងអាន។ អនុវត្តតាមគោលការណ៍ណែនាំរបស់ SPAdes និងពិចារណាលើទំហំអាន លុប contigs តូចជាង 300 bp និងបង្កើតការកាត់ 20 read depth coverage នៃ 52។ នៅក្នុងយុទ្ធសាស្រ្ត de novo assembly តំបន់ហ្សែនដូចជា proline-glutamate (PE) ច្រំដែលខ្លាំង និង proline-proline glutamate (PPE) មិនត្រូវបានយកចេញ paralogs
គុណភាពនៃការផ្គុំ de novo ត្រូវបានវាយតម្លៃតាមរយៈបំពង់ QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html) ដែលសម្របសម្រួលការបន្តនៃ contig និង M. bovis AF2122/97 ហ្សែនយោង (លេខចូល NCBI LT708304.1) ការធ្វើផែនទី (សូមមើលតារាងបន្ថែមសម្រាប់គុណភាព 1) ។
ដោយមានជំនួយពីបំពង់ vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP) ឯកសារ FASTQ នៃ M. bovis ដែលទើបនឹងកើតពីលំដាប់ Illumina ត្រូវបានប្រៀបធៀបជាមួយនឹងហ្សែនយោង M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) ។ យោងតាមអនុសាសន៍អនុវត្តដ៏ល្អបំផុតនៃកញ្ចប់ឧបករណ៍វិភាគហ្សែន (GATK) 53, 54, 55 អនុវត្តប៉ារ៉ាម៉ែត្រតម្រងស្តង់ដារ ឬពិន្ទុចម្រុះសម្រាប់ការគណនាឡើងវិញ។ លទ្ធផលត្រូវបានត្រងដោយប្រើពិន្ទុ SAMtools ទាបបំផុតគឺ 150 និង AC = 2។ សូមប្រើ Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) ដើម្បីពិនិត្យមើលការអានដើម្បីកំចាត់ការចម្លងរោគ។ បំពង់ vSNP ដែលប្រើដើម្បីគូសផែនទីដើម្បីតម្រៀបយុទ្ធសាស្ត្រនៅក្នុងការងាររបស់យើងពិនិត្យស៊េរីនៃ SNPs និងគោលដៅដែលបានកំណត់ ហើយវាក៏មិនរាប់បញ្ចូលសេណារីយ៉ូនៃការឆ្លងមេរោគចម្រុះផងដែរ។ ការគ្របដណ្តប់ហ្សែនដែលបានអានគឺប្រសើរជាង 99% (តារាងបន្ថែម 1) ។
ដើម្បីជៀសវាងកំហុសក្នុងការគូសផែនទី និង SNPs ខុស សូមត្រងវ៉ារ្យ៉ង់មួយនៅក្នុងករណីដូចខាងក្រោមៈ (1) វាត្រូវបានគាំទ្រដោយការអានតិចជាង 20, (2) វាត្រូវបានរកឃើញជាមួយនឹងប្រេកង់តិចជាង 0.9, (3) វាមានយ៉ាងហោចណាស់មួយខ្សែ ប៉ុន្តែយ៉ាងហោចណាស់មានចន្លោះប្រហោងក្នុងប្រភេទផ្សេងទៀត។ កម្មវិធីមើលពន្ធុវិទ្យារួមបញ្ចូលគ្នា (IGV) កំណែ 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 ត្រូវបានប្រើដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់ SNPs និងទីតាំងដោយមើលឃើញជាមួយនឹងបញ្ហាផែនទី ឬការតម្រឹម។ ដោយសារហ្សែន proline-glutamate (PE) និង proline-proline glutamate (PPE) ត្រូវបានចម្លងគ្នាយ៉ាងខ្លាំង ហើយជាផ្នែកមួយនៃគ្រួសារពហុហ្សែន ពួកគេត្រូវបានយល់ច្រឡំយ៉ាងងាយស្រួលដោយ Illumina sequencing និងមិនត្រឹមត្រូវ ដូច្នេះពួកគេត្រូវបានគេពេញចិត្តចំពោះដំណើរការការងារជីវវិទ្យា mycobacterial ដកចេញសមាជិកនៃស្មុគ្រស្មាញជំងឺរបេង ដើម្បីបញ្ជាក់លំដាប់លំដោយនៃ SNP ។ ដូច្នេះហើយ យើងបានត្រងចេញហ្សែន PE/PPE និង indels ពីការវិភាគ។
យោងតាម Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) SNPs ទាំងអស់ត្រូវបានបែងចែកទៅជាប្រភេទមុខងារ។ បំពង់ SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) ត្រូវបានប្រើដើម្បីសន្និដ្ឋានអំពីផលវិបាក SNP (ការផ្លាស់ប្តូរមានន័យដូច ឬមិនមានន័យដូច)។ បានបង្កើតមូលដ្ឋានទិន្នន័យថ្មីនៃ Mycobacterium bovis AF2122/97 genome (LT708304.1)។
ការតម្រឹមពហុហ្សែនស្នូលត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ Parsnp v1.2 ដែលបច្ចុប្បន្នមាននៅ https://github.com/marbl/parsnp57 ដោយប្រើ 69 genomes/draft assemblies (ជាមួយជម្រើស -c) និង M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) ត្រូវបានប្រើជាឯកសារយោង។ ការតម្រឹមពហុស្នូលចំនួនបួនត្រូវបានអនុវត្ត: មានតែសមាជិកនៃស្មុគស្មាញក្លូន Eu2 (n = 37) រួមទាំងសមាជិកទាំងអស់នៃស្មុគស្មាញក្លូនអ៊ឺរ៉ុប (n = 44) រួមទាំងចំណុចប្រសព្វនៃស្មុគស្មាញក្លូនអឺរ៉ុបនិងអាហ្រ្វិក (n = 51) និងរួមបញ្ចូល Mycobacterium bovis ទាំងអស់នៅក្នុងការសិក្សានេះ (n = 70) ។
ការតម្រឹមស្នូលដែលបង្កើតដោយ Parsnp ត្រូវបានប្រើដើម្បីសន្និដ្ឋានអំពីលទ្ធភាពអតិបរិមានៃមែកធាង phylogenetic (ML) ដោយប្រើ CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 ដោយប្រើ RAxML និងអនុវត្តការចម្លងតាមការណែនាំចំនួន 1000 ។
ក្បួនដោះស្រាយ និងឧបករណ៍ជីវព័ត៌មានចំនួនបីផ្សេងគ្នាត្រូវបានប្រើដើម្បីពិនិត្យមើលវត្តមាននៃព្រឹត្តិការណ៍នៃការផ្សំឡើងវិញស្របគ្នា៖ កម្មវិធី SplitsTree4, Gubbins (តំណពូជដែលមិនលំអៀងតាមរយៈការផ្សំឡើងវិញនៅក្នុងលំដាប់នុយក្លេអូទីត) និងកម្មវិធី RDP4 (កម្មវិធីរកឃើញការផ្សំឡើងវិញកំណែបែតា 4.101)។
វិធីសាស្រ្តបំបែកបំបែកដែលបានអនុវត្តនៅក្នុង SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 ត្រូវបានប្រើដើម្បីគណនាបណ្តាញ phylogenetic គ្មានឫសគល់ ដោយប្រើការធ្វើតេស្ត Phi សម្រាប់ការផ្ទៀងផ្ទាត់ស្ថិតិ ហើយកម្រិតសារៈសំខាន់គឺ p = 0.05 ។ ការវិភាគពហុតម្រឹមស្នូលនៃ Parsnp ត្រូវបានប្រើជាធាតុបញ្ចូល ហើយការបំបែកការបំបែកជាស្តង់ដារបណ្តាញត្រូវបានដឹង។
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 ដំណើរការជាមួយប៉ារ៉ាម៉ែត្រលំនាំដើមជាវិធីមួយផ្សេងទៀតដើម្បីវាយតម្លៃផលប៉ះពាល់នៃការផ្សំឡើងវិញលើ Mycobacterium bovis ។ ក្បួនដោះស្រាយដែលបានអនុវត្តនៅក្នុងបំពង់បង្ហូរនេះបង្កើតឡើងវិញនូវខ្សែបន្ទាត់ក្លូនដែលពាក់ព័ន្ធ។ ហ្សែនពេញលេញ/សំណុំទិន្នន័យបូវីត និងការជួបប្រជុំគ្នានៃហ្សែនរបស់យើង AF2122/97, LT708304.1) គឺទៅវិញទៅមក ហើយស្កេនទីតាំងរបស់ SNP នៅលើសាខានីមួយៗនៃមែកធាង ដើម្បីរកមើលចង្កោម SNP ដែលតំណាងឱ្យព្រឹត្តិការណ៍នៃការបញ្ចូលគ្នាឡើងវិញ សូន្យនៃសាខា សន្មតថាមិនមានព្រឹត្តិការណ៍ recombination ទេ ដែលមានន័យថា SNPs ដែលកើតឡើងនៅលើសាខាគួរតែត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នា MLX ពិន្ទុ ប្រើជាឯកសារបញ្ចូល។
ជាចុងក្រោយ ដើម្បីបញ្ជាក់ពីព្រឹត្តិការណ៍រៀបចំឡើងវិញដែលបានស្នើដោយបំពង់ Gubbins ក្បួនដោះស្រាយប្រាំមួយដែលបានអនុវត្តនៅក្នុង RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 និង SiScan66) ត្រូវបានអនុវត្តចំពោះការតម្រឹមពហុស្នូលរបស់ Parsnp ក្រោមការកំណត់លំនាំដើម។ យើងបានកំណត់ថាយ៉ាងហោចណាស់ 3 នៃក្បួនដោះស្រាយដែលបានអនុវត្តនៅក្នុង RDP4 ត្រូវតែបង្ហាញជាសញ្ញាដ៏សំខាន់មួយដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់ព្រឹត្តិការណ៍រួមបញ្ចូលគ្នានីមួយៗ។
ដោយពិចារណាថាទាំងកម្មវិធី Gubbins និង RDP រកមើលសញ្ញានៃការផ្សំឡើងវិញដោយពិនិត្យមើលការតម្រឹមពហុស្នូលនៅក្នុងបង្អួចរហូតដល់ 500 bp ហើយការបញ្ជាក់ថាការដាក់បញ្ចូលហ្សែន PE/PPE កំឡុងការជួបប្រជុំ de novo នឹងមិនរំខានដល់សញ្ញា recombination ដែលបានរកឃើញទេ ការវិភាគបន្ថែមគឺធ្វើឡើងដោយ homolinearity ពិនិត្យមើលការភ្ជាប់ហ្សែនជុំវិញ។ ផែនទីស៊ីនេអ៊ែរដោយប្រើហ្សែនពេញលេញត្រូវបានសាងសង់ដោយប្រើការតម្រឹម MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ដើម្បីមិនរាប់បញ្ចូលការផ្ទេរហ្សែនក្នុងតំបន់ ឬការបញ្ច្រាស់។ លើសពីនេះ ហ្សែនទាំងមូលត្រូវបានប្រើដើម្បីអនុវត្តការវិភាគភាពដូចគ្នាលើលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូតាមរយៈម៉ាស៊ីនមេគេហទំព័រ SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) ។
ការវិភាគស៊ីជម្រៅបន្ថែមទៀតនៃសំណុំទិន្នន័យហ្សែនដែលទទួលបានពីប្រព័ន្ធជំងឺរបេងពហុម៉ាស៊ីនព័រទុយហ្គាល់គឺដើម្បីពិនិត្យមើលពហុមេននៃហ្សែនដែលបានរៀបរាប់នៅក្នុងអក្សរសិល្ប៍។ ហ្សែនទាំងនេះគឺ 37,38 និងការអ៊ិនកូដហ្សែន 3R ដែលទទួលបានដោយបុព្វបុរស MTBC តាមរយៈសមាសធាតុប្រព័ន្ធ HGT (DNA repair, replication and recombination) 39. ប្រើប្រាស់ ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) ហើយប្រើ DnaSP v6.12.03 (http://www.clustal.org/clustal2/) និងប្រើប្រាស់ DnaSP v6.12.03 (http://www. ភាពចម្រុះនៃនុយក្លេអូទីត (π) និងការបញ្ចូលប៉ារ៉ាម៉ែត្រតេស្តអព្យាក្រឹត D របស់តាជីម៉ា។
លទ្ធភាពអតិបរិមានៃមែកធាង phylogenetic (ML) ដោយផ្អែកលើ 69 Mycoplasma bovis ដាច់ដោយឡែក និងហ្សែនយោងត្រូវបានទទួល (រូបភាព 2A) ។ បើប្រៀបធៀបជាមួយដើមឈើដែលមានមូលដ្ឋានហ្សែនតែមួយ ឬដើមឈើដែលមានមូលដ្ឋានច្រើនកន្លែង យុទ្ធសាស្ត្រនេះអនុញ្ញាតឱ្យបង្កើតដើមឈើដែលមានថាមពលខ្លាំងជាងមុន ដែលមិនចាប់យកភាពប្រែប្រួលនៃហ្សែនទាំងមូល ហើយដូច្នេះវាបង្ហាញសមត្ថភាពទាបជាងក្នុងការរើសអើងរវាងប្រភេទសត្វ 68,69 ។ រចនាសម្ព័ន្ធ topological នៃមែកធាង ML ជាធម្មតាស្របជាមួយនឹងការចាត់ថ្នាក់ស្មុគស្មាញនៃក្លូន។ ហ្សែនរបស់ Eu2 ត្រូវបានចង្កោមនៅក្នុងសាខាមួយ ហើយហ្សែនរបស់ Af1 ក៏ត្រូវបានចង្កោមជាមួយគ្នាផងដែរ (រូបភាពទី 2A) ។ លទ្ធផលក៏ស្របជាមួយនឹងទំនាក់ទំនងវិវត្តន៍ដែលគេស្គាល់របស់ Mycobacterium bovis ពោលគឺមានភាពខុសប្លែកគ្នាយ៉ាងខ្លាំងរវាងសមាជិក Eu1 និងក្រុមដែលមានស្មុគស្មាញក្លូន និងហ្សែនដទៃទៀត ប៉ុន្តែស្មុគស្មាញក្លូន 30 មិនត្រូវបានបញ្ជាក់ទេ។ ភាពមិនស៊ីសង្វាក់គ្នាតិចតួចរវាងស្មុគ្រស្មាញក្លូន និងទំនាក់ទំនងដែលបានសង្កេតនៅលើមែកធាង phylogenetic អាចត្រូវបានពន្យល់ដោយការពិតដែលថាស្មុគស្មាញក្លូនត្រូវបានពិពណ៌នាដោយផ្អែកលើតំបន់ហ្សែនជាក់លាក់ ខណៈពេលដែលមែកធាង phylogenetic គឺផ្អែកលើការតម្រឹមច្រើននៃហ្សែនស្នូលដែលតំណាងឱ្យហ្សែនទាំងមូល។
លទ្ធភាពអតិបរិមានៃមែកធាង phylogenetic tree (GTR) ត្រូវបានសាងសង់ដោយផ្អែកលើការតម្រឹមហ្សែនស្នូលនៃហ្សែន Mycobacterium bovis មុន (A) និងបន្ទាប់ពីការដក (B) នៃកន្លែងផ្សំឡើងវិញ។ ពណ៌សាខាតំណាងឱ្យស្មុគ្រស្មាញ Mycobacterium bovis clone៖ អឺរ៉ុប 1 មានពណ៌ស្វាយ អឺរ៉ុប 2 មានពណ៌ក្រហម អឺរ៉ុប 3 មានពណ៌ខៀវ អាហ្រ្វិកទី 1 គឺពណ៌ទឹកក្រូច និងអាហ្វ្រិក 2 មានពណ៌បៃតង។ មែកធាងត្រូវបានចាក់ឬស និងគូរតាមខ្នាត ហើយប្រវែងមែកត្រូវបានវាស់ជាការជំនួសកន្លែងនីមួយៗ។
ស្មុគ្រស្មាញ Mycobacterium tuberculosis ត្រូវបានពិពណ៌នាថាមានការវិវត្តន៍ដោយក្លូន ហើយភស្តុតាងភាគច្រើនដែលបានប្រមូលក្នុងរយៈពេលជាច្រើនឆ្នាំគាំទ្រគំនិតដែលថា HGT ដែលកំពុងបន្ត និងព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញនឹងមិនកើតឡើងនៅកម្រិតដែលអាចរកឃើញនៃ MTBC15,17,18 នោះទេ។
ការងារពីមុនបានបង្ហាញថាអាចមានការផ្សំឡើងវិញមានកម្រិតរវាង MTBC strains20,21 ខណៈពេលដែលអ្នកផ្សេងទៀតមិនបានកំណត់អត្តសញ្ញាណព្រឹត្តិការណ៍ recombination ដែលអាចវាស់វែងបាន 70,71 ។ ពិភាក្សាអំពីបញ្ហានេះឡើងវិញដោយផ្តោតលើ Mycobacterium bovis ដែលខុសពីការងារមុនដែលចាត់ទុកតែ Mycobacterium tuberculosis 70,71; ឬពិចារណា MTBC ទាំងមូល ដោយស្ទើរតែគ្មាន M. bovis តំណាងឱ្យ 20; ឬពិចារណាតែប្រភាគគោក្របី។ សំណុំទិន្នន័យ mycobacteria នៅក្នុងការងារនេះមានសរុបចំនួន 70 ប្រភេទ ដែលតំណាងឱ្យស្មុគ្រស្មាញក្លូនទាំងអស់ ដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីពិនិត្យសម្រាប់ការផ្សំឡើងវិញ។ សំណុំទិន្នន័យត្រូវបានធ្វើមាត្រដ្ឋានយោងទៅតាមកម្រិតប្រមូលផ្តុំចំនួនបួន៖ (1) សមាជិក Eu2 (2) សមាជិកស្មុគ្រស្មាញក្លូនអ៊ឺរ៉ុបទាំងអស់ (ឧទាហរណ៍ អឺរ៉ុប) (3) ស្មុគ្រស្មាញក្លូនអឺរ៉ុប និងអាហ្រ្វិក (Eu + Af) និង (4) បណ្តុំទិន្នន័យទាំងមូល (រួមទាំងហ្សែនដែលមិនត្រូវបានរួមបញ្ចូលនៅក្នុងស្មុគស្មាញក្លូនណាមួយដែលបានពិពណ៌នារួចហើយ)។
ដើម្បីសិក្សាបន្ថែមលើសម្មតិកម្មនេះ បណ្តាញបំបែកបំបែកត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីវាយតម្លៃអវត្តមាននៃព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញរវាងហ្សែន ពីព្រោះវិធីសាស្ត្រនេះអាចស្រមៃមើលទំនាក់ទំនងដូនតារវាងបុគ្គល និងបង្ហាញសញ្ញា phylogenetic ផ្ទុយគ្នា។ សំណុំទិន្នន័យទាំងបួននៅក្នុងការវិភាគបានបញ្ជាក់ពីអត្ថិភាពនៃរង្វិលជុំនៅក្នុងបណ្តាញ (នោះគឺតំបន់ដែលមិនបញ្ចូលគ្នាជាដើមឈើតែមួយ) ប៉ុន្តែការធ្វើតេស្ត Phi មិនមានការគាំទ្រផ្នែកស្ថិតិទេ (Eu2, p = 0.0956; Europe, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; ទិន្នន័យទាំងមូលនៃការរៀបចំឡើងវិញ p = 0.2) ដែលទិន្នន័យទាំងមូលមានភស្តុតាងនៃព្រឹត្តិការណ៍មិនល្អ។ (រូបភាព 3A-D) ។
នៅអឺរ៉ុប 2 ហ្សែន (n = 37) (A) ហ្សែនអឺរ៉ុប (n = 44) (B) ហ្សែនអឺរ៉ុប និងអាហ្រ្វិក (n = 51) (C) និងសំណុំទិន្នន័យទាំងមូល (n = 70) (D) ។
បន្ទាប់ពីការវិភាគនេះហើយ ដោយគិតគូរពីការសង្កេតរង្វិលនៅក្នុងបណ្តាញទាំងអស់ ក្បួនដោះស្រាយការកសាងឡើងវិញដែលបានអនុវត្តនៅក្នុងបំពង់បង្ហូរឧស្ម័ន Gubbins ត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីបង្កើតឡើងវិញនូវត្រកូល clonal និងដើម្បីបន្ថែមការប៉ាន់ប្រមាណនៃឥទ្ធិពលនៃការផ្សំឡើងវិញលើហ្សែន M. bovis ។ រាប់ចំនួនសរុបនៃព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញ ដែលភាគច្រើនបានកើតឡើងនៅក្នុងសាខាស្ថានីយ (នោះគឺនៅក្នុងហ្សែនតែមួយ) (តារាងទី 2)។ សូចនាករទាំងនេះបង្ហាញពីភាពស៊ីសង្វាក់គ្នានៃសំណុំទិន្នន័យទាំងមូល ហើយបង្ហាញថាភាពញឹកញាប់នៃព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញគឺពី 200 ទៅ 300 ដងនៃការផ្លាស់ប្តូរ។ នៅពេលដែលប៉ារ៉ាម៉ែត្រ rho/theta តំណាងឱ្យអត្រាដែលទាក់ទងនៃការផ្សំឡើងវិញ និងការផ្លាស់ប្តូរចំណុចនៅលើសាខាហាក់ដូចជាស្ថិតនៅចន្លោះ 0.0037 និង 0.0056 (តារាងទី 3)។ ថ្មីៗនេះ ការងារដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយនៃ 38 M. bovis strain បានបង្ហាញពីតម្លៃ rho/theta ខ្ពស់ជាង (rho/theta = 0.1) ជាងអ្វីដែលទទួលបាននៅក្នុងសំណុំទិន្នន័យនេះ ប៉ុន្តែការងាររបស់Patané និងសហការីបានប្រើការជួបប្រជុំគ្នាដោយផ្អែកលើឯកសារយោងដើម្បីសន្និដ្ឋានប៉ារ៉ាម៉ែត្រ recombination លម្អិតនៃនីតិវិធី ដោយសារតែដំណើរការជួបប្រជុំគ្នាត្រូវបានភ្ជាប់ជាមួយ abunderation នៃការជួបប្រជុំគ្នា។ សាខា។
បន្ទាប់មក ប៉ារ៉ាម៉ែត្រ r/m តំណាងឱ្យសមាមាត្រភាពចម្រុះនៃការផ្សំឡើងវិញ និងការណែនាំនៃការផ្លាស់ប្តូរ ហើយតម្លៃជាមធ្យមរបស់វាគឺនៅចន្លោះ 0.025 និង 0.037 ដែលបង្ហាញថាបើប្រៀបធៀបជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរ ការផ្សំឡើងវិញមានផលប៉ះពាល់ជារួមទាបជាងលើភាពចម្រុះហ្សែនរបស់ M. bovis (តារាង 3) ។ សម្រាប់ការប្រៀបធៀបយ៉ាងទូលំទូលាយ វិធីសាស្ត្រស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេប្រើដើម្បីប៉ាន់ប្រមាណប៉ារ៉ាម៉ែត្រ r/m សម្រាប់សំណុំទិន្នន័យ MTBC ដែលមាន 23 ហ្សែន ដែលបង្ហាញពីតម្លៃជាមធ្យម 0.48620 ខណៈពេលដែលសម្រាប់សំណុំទិន្នន័យ 38 M. bovis របស់ប៉ាតាណេ និងសហសេវិក វាបានបង្ហាញថាតម្លៃជាមធ្យមគឺ 0.98 ។ នៅក្នុងការសិក្សាដំបូង មានតែហ្សែនចំនួន 2 ប៉ុណ្ណោះក្នុងចំណោម 23 ហ្សែនដែលរួមបញ្ចូលនៅក្នុងការងាររបស់ M. bovis (M. bovis BCG និងប្រភេទយោង) ដូច្នេះតម្លៃដែលទទួលបានអាចមានភាពលំអៀងដោយសារតែការបញ្ចេញជ្រុលនៃហ្សែន M. tuberculosis ។ នៅក្នុងរបាយការណ៍ទីពីរ ប្រជាជន Mycobacterium bovis ដែលបានវិភាគត្រូវបានគេរកឃើញជាចម្បងពីសហរដ្ឋអាមេរិក និងសត្វចិញ្ចឹម។ ផ្ទុយទៅវិញ នៅក្នុងសំណុំទិន្នន័យរបស់យើង ទីតាំងភូមិសាស្រ្តកាន់តែច្រើន និងប្រភេទម៉ាស៊ីនត្រូវបានតំណាង ហើយហ្សែនដែលបានដាក់ជាក្រុមទៅជាស្មុគ្រស្មាញក្លូនផ្សេងៗគ្នា ដែលមានលក្ខណៈហ្សែនចំនួនប្រជាជនខុសៗគ្នា ក៏ត្រូវបានប្រើប្រាស់ផងដែរ ដូច្នេះហើយទើបទទួលបានចំណេះដឹងអំពីចំនួនប្រជាជនកាន់តែស៊ីជម្រៅ និងទូលំទូលាយ។ ភាពខុសគ្នានៃតម្លៃមធ្យម r/m ដែលទទួលបានជាមួយនឹងសំណុំទិន្នន័យរបស់យើងគឺស្របជាមួយនឹងគំនិតដែលថាកម្រិតនៃការផ្សំឡើងវិញប្រែប្រួលយ៉ាងខ្លាំងរវាងពូជពង្សដែលត្រូវបានចាត់តាំងសម្រាប់ប្រភេទពន្ធុវិទ្យាដូចគ្នា ដូច្នេះលទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថាស្មុគស្មាញក្លូន M. bovis អាចបង្ហាញភាពខុសគ្នានៃការផ្សំឡើងវិញ ផលប៉ះពាល់ក៏ត្រូវបានស្នើដោយ Didelot & Maiden72 ផងដែរ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការពង្រីកទិន្នន័យនេះយ៉ាងសំខាន់ដោយរួមបញ្ចូលនូវចំនួនដ៏ច្រើននៃហ្សែន M. bovis នឹងអនុញ្ញាតឱ្យមានការបញ្ជាក់បន្ថែមអំពីចំណុចនេះ។ ទាំងប៉ារ៉ាម៉ែត្រ r/m និង rho/theta បង្ហាញពីភាពប្រែប្រួលរវាងសាខា ហើយលទ្ធផលនេះគឺស្របជាមួយនឹងរបាយការណ៍អំពីប្រភេទបាក់តេរីផ្សេងទៀត 72,73 ។
ជាចុងក្រោយ ដើម្បីបញ្ជាក់ពីព្រឹត្តិការណ៍រៀបចំឡើងវិញដែលកំណត់ដោយបំពង់ Gubbins ក្បួនដោះស្រាយចំនួនប្រាំមួយផ្សេងគ្នាត្រូវបានប្រើនៅក្នុងកម្មវិធី RDP4 ដើម្បីសាកល្បងដោយឯករាជ្យនូវការប្រៀបធៀបពហុស្នូលផ្សេងៗគ្នា។ នៅទូទាំងពិភពលោក តិចជាងពាក់កណ្តាលនៃព្រឹត្តិការណ៍ដែលកំណត់ដោយ Gubbins ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយ RDP4 (តារាងទី 4 និងទី 5)។ ដោយពិចារណាលើសំណុំទិន្នន័យទាំងមូល ព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញចំនួនបីត្រូវបានបញ្ជាក់ ពីរពាក់ព័ន្ធនឹងថ្នាំងខាងក្នុង និងមួយទៀតពាក់ព័ន្ធនឹងហ្សែនតែមួយនៅក្នុងសាខាស្ថានីយ ដែលស្មុគស្មាញក្លូនមិនអាចត្រូវបានកំណត់ (តារាង 4 និង 5) ។ ការកំណត់អត្តសញ្ញាណនៃព្រឹត្តិការណ៍នៅក្នុងសាខាស្ថានីយអាចបង្ហាញថាការផ្សំឡើងវិញនៅតែដំណើរការនៅក្នុងប្រភេទ M. bovis សហសម័យ ឬលទ្ធផលគឺមិនត្រឹមត្រូវ 70 ។ នៅក្នុងតំបន់ផ្សំសម្មតិកម្មនេះ ប្រហែល 20% នៃមុខតំណែងមាន nucleotides ដែលមិនបានកំណត់ (N) ដូច្នេះប៉ះពាល់ដល់សញ្ញានៃការផ្សំឡើងវិញ (រូបភាពបន្ថែម 2) ។ លើសពីនេះ តំបន់នេះប៉ះពាល់ដល់ហ្សែន rrs ដោយបានអ៊ិនកូដ 16S ribosomal RNA ដែលត្រូវបានគេរំពឹងថានឹងត្រូវបានរក្សាទុកយ៉ាងខ្លាំង ដូច្នេះសញ្ញានៃការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ putative នេះអាចជាលទ្ធផលនៃកំហុសលំដាប់លំដោយ ឬការតម្រឹមមិនត្រឹមត្រូវ។ បន្ទាប់មកការតម្រឹមហ្សែនទាំងមូលរវាង Mb0003 និង Mycobacterium bovis AF2122/97 ត្រូវបានអនុវត្ត ហើយអត្ថិភាពនៃ nucleotides និង SNPs ដែលមិនបានកំណត់ត្រូវបានបញ្ជាក់ ដូច្នេះបញ្ហាដែលអាចកើតមានទាក់ទងនឹងការតម្រឹមខុសគឺមិនមែនដោយសារតែព័ត៌មានជីវសាស្រ្តដែលបានអនុវត្តនៅក្នុងការងារនេះបានលេចឡើងបន្ទាប់ពីសិក្សាកម្មវិធី។
គ្មានចន្លោះ ឬនុយក្លេអូទីតដែលមិនបានកំណត់ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងតំបន់ផ្សំឡើងវិញនៃថ្នាំងខាងក្នុង (រូបភាពទី 4 និងទី 5)។ ទាក់ទងនឹងព្រឹត្តិការណ៍ទាំងនេះ មួយមានតែហ្សែន Eu2 ហើយប៉ះពាល់ដល់ហ្សែន pks12 ដែលអ៊ិនកូដសំយោគ polyketide ដែលអាចធ្វើទៅបាន។ ខណៈពេលដែលមួយទៀតត្រូវបានចុះបញ្ជីនៅក្នុងហ្សែន Eu1 និងប៉ះពាល់ដល់ហ្សែន narX ដែលអ៊ិនកូដនីត្រាត reductase ដែលអាចធ្វើទៅបាន (តារាងទី 4) ។ ជាទូទៅ ការវិភាគនៃការផ្សំឡើងវិញបង្ហាញថាមានចំនួនកំណត់នៃបំណែកនៃការផ្សំឡើងវិញជាមួយនឹងការគាំទ្រផ្នែកស្ថិតិ ហើយសូចនាករដែលបានសន្និដ្ឋានបង្ហាញថាការផ្សំឡើងវិញមានផលប៉ះពាល់តិចតួចលើពូជពង្ស M. bovis ។ សញ្ញានៃការផ្សំឡើងវិញត្រូវបានគេរំពឹងថានឹងមានកម្រិតទាប ប៉ុន្តែវាមានសារៈសំខាន់ក្នុងការបែងចែកសញ្ញាការវិវត្តពិតពីសំឡេងរំខានពីផ្ទៃខាងក្រោយ ដែលជាកិច្ចការដ៏លំបាកមួយ។ ដើម្បីកាត់បន្ថយសញ្ញាសំឡេងរំខានដែលណែនាំដោយការជួបប្រជុំគ្នាដែលមានមូលដ្ឋានលើឯកសារយោង និងបញ្ហាមិនស៊ីគ្នា 70, 71 នៅសល់ទាំងអស់លើកលែងតែហ្សែនពេញលេញត្រូវបានផ្គុំពីទទេ ហើយគុណភាពនៃការដំឡើងត្រូវបានត្រួតពិនិត្យ និងធានាដោយការវិភាគបំពង់ QUAST (តារាងបន្ថែម 1) ។ លើសពីនេះទៀត ការវិភាគបន្ថែមជាបន្តបន្ទាប់ត្រូវបានធ្វើឡើង ដើម្បីផ្តល់នូវភាពរឹងមាំ និងភាពត្រឹមត្រូវនៃការស្ទង់មតិរួម។ ដូច្នេះគុណភាពលំដាប់នៃហ្សែន narX និង pks12 ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយការអានផែនទីប្រឆាំងនឹង Mycobacterium bovis AF2122/97 ។ ទីតាំង SNP ដែលបានណែនាំនៅក្នុងតំបន់ផ្សំឡើងវិញត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការអនុវត្តលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យដែលបានរៀបរាប់នៅក្នុងផ្នែកវិធីសាស្រ្ត (យ៉ាងហោចណាស់ 20 ការអាន និង 0.9 ការផ្លាស់ប្តូរប្រេកង់) ។ polymorphism នៃហ្សែន narX ត្រូវបានបញ្ជាក់យ៉ាងពេញលេញនៅក្នុងហ្សែនពីរ (Mb1792361 និង Mb7240415; 2.3%) និងហ្សែននៃហ្សែន pks12៖ Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17, Mb17 និងហ្សែន ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សម្រាប់ហ្សែន Mb2043 មុខតំណែងប្រាំមួយក្នុងចំណោមប្រាំបីមិនបំពេញតាមលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យជម្រៅនៃការអានទេ ពីព្រោះ SNP ត្រូវបានគាំទ្រដោយការអានអតិបរមា 17 ដែលទាបជាងតម្លៃកាត់ដែលបានបង្កើតឡើងនៃ 20។ ដូច្នេះការបញ្ចូលគ្នានៃហ្សែនចំនួនប្រាំមួយ (8.6%) នៅកន្លែងហ្សែននេះអាចត្រូវបានបញ្ជាក់ (រូបភាព 4 និង 5) ។
ការមើលឃើញលម្អិតនៃការតម្រឹមតំបន់នៃការផ្សំឡើងវិញនៃសំណុំទិន្នន័យ Mycobacterium bovis ប៉ះពាល់ដល់ហ្សែន narX ដែលបំលែងកូដនីត្រាត reductase ដែលអាចធ្វើទៅបាន។ គ្មានចន្លោះ ឬនុយក្លេអូទីតដែលមិនបានកំណត់ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងតំបន់ផ្សំឡើងវិញនៃថ្នាំងខាងក្នុងនោះទេ។ ព្រឹត្តិការណ៍ពិសេសនេះត្រូវបានចុះបញ្ជីនៅក្នុងហ្សែន Eu1 ។ គុណភាពលំដាប់លំដោយនៃហ្សែន narX ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយរៀបចំការអានរបស់ Mycobacterium bovis AF2122/97 ។ បញ្ជាក់ទីតាំង SNP ដែលបានណែនាំនៅក្នុងតំបន់ផ្សំឡើងវិញដោយអនុវត្តលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យដែលបានរៀបរាប់នៅក្នុងផ្នែកវិធីសាស្រ្ត (យ៉ាងហោចណាស់ 20 ការអាន និង 0.9 ការផ្លាស់ប្តូរប្រេកង់) ។ polymorphism នៃហ្សែន narX ត្រូវបានបញ្ជាក់យ៉ាងពេញលេញនៅក្នុងហ្សែន Mb1792361 និង Mb7240415 (2.3%) ។
ការមើលឃើញលម្អិតនៃការតម្រឹមតំបន់ផ្សំឡើងវិញនៃសំណុំទិន្នន័យ Mycoplasma bovis ដែលប៉ះពាល់ដល់ហ្សែន pks12 ។ គ្មានចន្លោះ ឬនុយក្លេអូទីតដែលមិនបានកំណត់ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងតំបន់ផ្សំឡើងវិញនៃថ្នាំងខាងក្នុងនោះទេ។ ទាក់ទងនឹងព្រឹត្តិការណ៍ដែលប៉ះពាល់ដល់ការអ៊ិនកូដហ្សែន pks12 ដែលអាចធ្វើទៅបាន polyketide synthase វាផ្ទុកតែហ្សែន Eu2 ប៉ុណ្ណោះ។ គុណភាពលំដាប់លំដោយនៃ pks12 ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយការអានផែនទីនៃ Mycobacterium bovis AF2122/97 ។ បញ្ជាក់ទីតាំង SNP ដែលបានណែនាំនៅក្នុងតំបន់ផ្សំឡើងវិញដោយអនុវត្តលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យដែលបានរៀបរាប់នៅក្នុងផ្នែកវិធីសាស្រ្ត (យ៉ាងហោចណាស់ 20 ការអាន និង 0.9 ការផ្លាស់ប្តូរប្រេកង់) ។ Polymorphisms នៃហ្សែន Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, និង Mb1960 ត្រូវបានបញ្ជាក់យ៉ាងពេញលេញ។
ហ្សែន PE និង PPE មានតំបន់ច្រំដែលដែលងាយអានខុសដោយលំដាប់ Illumina និងការគូសផែនទីមិនត្រឹមត្រូវ ដូច្នេះជាធម្មតាពួកវាត្រូវបានលុបចេញពីដំណើរការការងារជីវព័ត៌មានវិទ្យារបស់សមាជិក M. tuberculosis តែនៅពេលប្រើយុទ្ធសាស្ត្រគូសផែនទីទៅលំដាប់។ ការសន្និដ្ឋាននៃព្រឹត្តិការណ៍ផ្សំឡើងវិញដែលបានអនុវត្តនៅក្នុងការងារនេះគឺផ្អែកលើការជួបប្រជុំគ្នា de novo ដោយមិនចាំបាច់ត្រង PE/PPE ចេញទេ។ យើងជឿជាក់ថា តាមរយៈការអនុវត្តវិធីសាស្រ្ត និងក្បួនដោះស្រាយបន្ថែមចំនួនបីផ្សេងគ្នាតាមរយៈ SplitsTree, Gubbins pipeline និងកម្មវិធី RDP4 យុទ្ធសាស្ត្រដែលបានអនុវត្តគឺមានភាពរឹងមាំក្នុងការដំណើរការ និងត្រងតំបន់ដែលបានរៀបចំឡើងវិញដែលបណ្តាលមកពីសញ្ញាកំហុស។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ដើម្បីមិនរាប់បញ្ចូលការជ្រៀតជ្រែកនៃហ្សែន PE/PPE នៅលើកម្មវិធី Gubbins និង RDP4 ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណចង្កោម SNP ហើយដូច្នេះការកំណត់អត្តសញ្ញាណនៃតំបន់ផ្សំឡើងវិញដែលស្នើឱ្យប៉ះពាល់ដល់ហ្សែន narX និង pks12 សង្កាត់នៃហ្សែនទាំងនេះត្រូវបានពិនិត្យ (រូបភាពបន្ថែម 3-5)។ នៅក្នុង M. bovis AF2122/97 ហ្សែន narX ត្រូវបានបំបែកដោយ narK2 និង Mb1764c ខណៈពេលដែល pks12 ត្រូវបានហ៊ុំព័ទ្ធដោយ Mb2075c e Mb2073c (រូបភាពបន្ថែម 3-5) ។ ផែនទីដែលបានបង្កើតដោយប្រើផែនទី MAUVE synline នៃហ្សែនពេញលេញផ្តល់នូវព័ត៌មានអំពីការអភិរក្ស និងការរៀបចំឡើងវិញនូវលំដាប់ហ្សែន ដោយបង្ហាញប្លុក collinear ចំនួនបួន និងមិនមានសញ្ញានៃការប្តូរហ្សែន ឬការដាក់បញ្ច្រាសទេ។ លើសពីនេះទៀត ការវិភាគបំពេញបន្ថែមជាមួយនឹងលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូបានបង្ហាញពីភាពដូចគ្នានៅក្នុងហ្សែនពេញលេញទាំងអស់ ហើយគ្មាន PE/PPE ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងតំបន់ដែលនៅជាប់គ្នានៃ narX ឬ pks12 នោះទេ។ សម្រាប់ narX ហ្សែនមួយ (Mb0030) មានពិន្ទុដូចគ្នាបេះបិទ ពីព្រោះហ្សែន narX ត្រូវបានកំណត់ថាជាបំណែកពីរ (បំណែក 1891 និង 1890)។ សម្រាប់ pks12 ដោយសារតែភាពស្រដៀងគ្នា Mb0030 និង Mb003 បានបង្ហាញពិន្ទុនៃភាពស៊ីសង្វាក់គ្នាទាប ខណៈពេលដែល pks12 ត្រូវបានកំណត់ជាបំណែកពីរ និងបីរៀងគ្នា ដែលតំណាងឱ្យដែនផ្សេងៗគ្នានៃប្រូតេអ៊ីន (រូបភាពបន្ថែម 3-5) ។ ដោយគិតពីព័ត៌មាននេះ ហើយកម្មវិធី Gubbins និង RDP4 ទាំងពីរធ្វើការវិភាគ ពិនិត្យមើលការតម្រឹមពហុស្នូលនៃអតិបរមា 500 bp នៅក្នុងបង្អួច យើងបានបញ្ជាក់ថាហ្សែន PE/PPE នឹងមិនជ្រៀតជ្រែកជាមួយសញ្ញា recombination ដែលប៉ះពាល់ដល់ narX និង pks12 ទេ។
ទោះបីជាសញ្ញា recombination ដែលបានរកឃើញនៅក្នុងសំណុំទិន្នន័យនេះអាចចាត់ទុកថាជាសំណល់ក៏ដោយ វាគឺជាការពិតដែលថាការផ្សំឡើងវិញនៅក្នុង M. bovis មិនអាចត្រូវបានគេច្រានចោលទេ ដូច្នេះវាគួរតែបន្តជាកម្មវត្ថុនៃការវិភាគបន្ថែមទៀត ដែលហ្សែនទាំងមូលពីសេណារីយ៉ូរោគរាតត្បាតផ្សេងៗត្រូវបានបន្តបន្ទាប់គ្នាជាសំខាន់។
ការប្រៀបធៀបដើមឈើ phylogenetic ML ដែលទទួលបានមុន និងក្រោយការកែផ្សំឡើងវិញ (រូបភាពទី 2A, B) មិនបាននាំឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងទំនាក់ទំនង phylogenetic សន្និដ្ឋានទេ ហើយពូជ M. bovis ត្រូវបានចង្កោមក្នុងក្រុមតែមួយ។
បន្ទាប់ពីការគូសផែនទី M. bovis ដែលបានបន្តបន្ទាប់គ្នាចំនួន 42 អានជាមួយនឹងហ្សែនយោងនៃ M. bovis AF2122/97 ការតម្រឹម SNP ដែលមានទីតាំងប៉ូលីម័រ 1816 ត្រូវបានទទួល។ SNPs ភាគច្រើន (87.1%) មានទីតាំងនៅក្នុងតំបន់សរសេរកូដ ហើយហ្សែនដែលរងផលប៉ះពាល់ត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈដោយយោងទៅតាមប្រភេទមុខងារដែលបានបង្ហាញនៅក្នុង Bovilist (រូបភាព 6A, B) ។ ដោយគិតពីចំនួនហ្សែនសរុបនៅក្នុងប្រភេទមុខងារនីមួយៗ ហ្សែននៅក្នុងប្រភេទ "ការរំលាយអាហារ lipid" បានបង្ហាញ SNPs បន្ថែមទៀត បន្ទាប់មកដោយ "ជញ្ជាំងកោសិកា និងដំណើរការកោសិកា" និង "ការរំលាយអាហារកម្រិតមធ្យម និងការដកដង្ហើម" ដែលបង្ហាញថាពួកគេស្ថិតនៅក្នុងការវិវត្តន៍របស់ M. bovis ។
ការវិភាគតាមឋានានុក្រមនៃសំណុំទិន្នន័យ M. bovis មកពីប្រទេសព័រទុយហ្គាល់ (n = 42) ។ ចំនួនសរុបនៃ SNPs ដែលបានចុះឈ្មោះ និងហ្សែនដែលរងផលប៉ះពាល់សម្រាប់ប្រភេទមុខងារនីមួយៗ (A)។ ចំនួនសរុបនៃការផ្លាស់ប្តូរដែលមានន័យដូចនិងមិនមានន័យដូចគ្នាបានចុះបញ្ជីដោយប្រភេទមុខងារ (B) ។
នៅលើមាត្រដ្ឋានសកល សមាមាត្រ dN/dS ជាមធ្យមគឺប្រសើរជាង 1.5 ដែលបង្ហាញថាសម្ពាធនៃការវិវត្តន៍សកលគឺដើម្បីកម្ចាត់រដ្ឋបុព្វបុរស និងតំណាងឱ្យសេណារីយ៉ូជម្រើសនៃការបន្សុតវិជ្ជមាន (ចម្រុះ ឬដឹកនាំ) និង/ឬបន្ធូរបន្ថយ។ នៅក្នុងប្រភេទនៃ "មេរោគ ការបន្សាបជាតិពុល ការបន្សាំ" "លំដាប់នៃការបញ្ចូល និង phages" និង "ប្រូតេអ៊ីននិយតកម្ម" ច្រើនជាង 2/3 នៃ SNP គឺមិនមានន័យដូច (រូបភាព 6B)។
នៅគ្រប់ប្រភេទទាំងអស់ មានហ្សែនដែលមាន SNPs ច្រើន ដែលបណ្តាលឱ្យមានអត្រាផ្លាស់ប្តូរជាមធ្យម (នោះគឺ SNP ជាមធ្យមក្នុងមួយហ្សែន) ធំជាង 1 (រូបភាព 6A)។ Pks12 (Mb2074c) ដែលមាន 15 SNPs និង fas (Mb2553c) ដែលមាន 8 SNPs មានតម្លៃផ្លាស់ប្តូរខ្ពស់ជាង។ ហ្សែនទាំងពីរនេះត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងការរំលាយអាហារអាស៊ីតខ្លាញ់។ ហ្សែន pks អ៊ិនកូដ polyketide synthase (PKS) ដែលជាអង់ស៊ីមពហុមុខងារដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការសំយោគជាតិខ្លាញ់ជញ្ជាំងកោសិកា mycobacterial74,75។ ហ្សែននេះបំលែងកូដពហុមុខងារ polypeptide ដែលចូលរួមក្នុងការសំយោគ mycoketides74,76។ ហ្សែន fas ចូលរួមក្នុងការសំយោគអាស៊ីត mycolic ។ ហ្សែនទាំងពីរនេះដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងជីវសំយោគនៃជញ្ជាំងកោសិកាក្នុងការទាក់ទងជាមួយម៉ាស៊ីន។
ដើម្បីសិក្សាបន្ថែមលើការវិវត្តនៃ Mycobacterium bovis សំណុំហ្សែនជាក់លាក់ពីរត្រូវបានវិភាគ។ ការងារដែលបានបោះពុម្ពពីមុនដោយប្រើសមាសភាពលំដាប់និងវិធីសាស្រ្ត phylogenetic បានកំណត់ហ្សែនដែលត្រូវបានទទួលដោយបុព្វបុរស MTBC តាមរយៈ HGT មុនពេលធ្វើពិពិធកម្ម37,38។ ហ្សែនទាំងនេះត្រូវបានរាយក្នុងតារាងបន្ថែម 2. ការចែកចាយ SNP នៃហ្សែនសរុបចំនួន 77 ដែលអាចទាក់ទងនឹង HGT ត្រូវបានវិភាគ ហើយទីតាំងប៉ូលីម័រហ្វីកចំនួន 26 ត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណ ដែលក្នុងករណីភាគច្រើន (78%) បណ្តាលឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរមិនមានន័យដូច (NS) (តារាងបន្ថែម 2)។ ការងារពីមុននៅលើហ្សែន MTBC បានបង្ហាញថាតំបន់ HGT ដែលដាក់បង្ហាញបង្ហាញសមាមាត្រ NS SNP ខ្ពស់ជាងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងហ្សែនដែលនៅសល់។ ប្រសិនបើនរណាម្នាក់គិតថាតំបន់ផ្សំឡើងវិញទាំងនេះត្រូវបានទទួលដោយបុព្វបុរសរបស់ MTBC ដូច្នេះហើយ ពួកវាតំណាងឱ្យពហុវចនៈបុរាណ នោះសមាមាត្រនៃការផ្លាស់ប្តូរមានន័យដូចគ្នាត្រូវបានគេរំពឹងថានឹងខ្ពស់ជាងនេះ ពីព្រោះការជំនួស NS ត្រូវបានគេរំពឹងថានឹងត្រូវបានលុបចោលដោយជម្រើសអវិជ្ជមានដោយសារតែការផ្លាស់ប្តូរអាស៊ីតអាមីណូអាចផ្លាស់ប្តូរមុខងារនៃប្រូតេអ៊ីន។ ដូច្នេះហើយ លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា ផលវិបាកមុខងារអាចកើតចេញពីការជំនួសហ្សែនដូច HGT ដែលឆ្លុះបញ្ចាំងពីសារៈសំខាន់របស់វាសម្រាប់ភាពចម្រុះហ្សែនដែលមានលក្ខណៈប្រែប្រួលដ៏មានតម្លៃ។
ស្របជាមួយនឹងការវិភាគនេះ ហ្សែនដែលអ៊ិនកូដធាតុផ្សំនៃប្រព័ន្ធ 3R (DNA repair, replication, and recombination) ត្រូវបានពិនិត្យយ៉ាងល្អិតល្អន់ដោយអនុលោមតាមបញ្ជីដែលបានបោះពុម្ពពីមុនដោយ dos Vultos និងអ្នកសហការ (2008)39 ។ ការផ្លាស់ប្តូរបំណែក DNA ដូចគ្នាបេះបិទមិនអាចត្រូវបានសង្កេតឃើញដោយផ្ទាល់ទេ ទោះបីជាវាអាចជាដំណើរការញឹកញាប់នៅពេលដែលបាក់តេរីដែលទាក់ទងយ៉ាងជិតស្និទ្ធត្រូវបានចូលរួម ដូចជានៅក្នុងករណីនៃសំណុំទិន្នន័យនេះក៏ដោយ។ លើសពីនេះទៅទៀត ដំណើរការនេះអាចជាគន្លឹះក្នុងការជួសជុល DNA72 ដូច្នេះហើយទើបដើរតួនាទីក្នុងការផ្សំឡើងវិញដោយភាពដូចគ្នា។ ទីតាំងប៉ូលីម័រសរុបចំនួន 26 ដែលត្រូវបានចែកចាយដោយហ្សែនចំនួន 54 ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ (តារាងបន្ថែម 3) ។ នៅក្នុងសំណុំនៃហ្សែននេះ ការផ្លាស់ប្តូរ NS មានចំនួនប្រហែល 65% នៃផលវិបាក ដែលវាស៊ីគ្នានឹងរបាយការណ៍មុនស្តីពីជំងឺរបេង Mycobacterium ។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី ២១ ខែតុលា ឆ្នាំ ២០២១