पुनर्संयोजन, उत्परिवर्तन और सकारात्मक चयन के जीनोम-व्यापी अनुमान माइकोबैक्टीरियम बोविस के विविध चालकों को प्रेरित करते हैं

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जीनोम अनुक्रमण ने संक्रामक रोग अनुसंधान के क्षेत्र को पुनर्जीवित किया है, जिससे रोग महामारी विज्ञान, रोगजनन, मेज़बान-रोगज़नक़ अंतःक्रियाओं और रोगजनकों पर आरोपित विकासवादी प्रक्रिया का पता चला है। माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस कॉम्प्लेक्स (MTBC) माइकोबैक्टीरियम बोविस को अपने जंतु अनुकूली सदस्यों में से एक मानता है जो स्थलीय स्तनधारियों में तपेदिक (TB) का कारण बनता है, और यह जीवाणु विकास का एक विशिष्ट मॉडल है। अन्य MTBC सदस्यों की तरह, माइकोबैक्टीरियम बोविस को एक क्लोनित, धीरे-धीरे विकसित होने वाला रोगजनक माना जाता है, और इसमें पुनर्संयोजन या क्षैतिज जीन स्थानांतरण का कोई स्पष्ट संकेत नहीं है। इस कार्य में, हम विभिन्न वंशावली (यूरोप और अफ्रीका) से 70 मवेशी M. से बने एक संपूर्ण जीनोम अनुक्रम (WGS) डेटासेट पर तुलनात्मक जीनोमिक्स लागू करते हैं ताकि मवेशी M. की आनुवंशिक विविधता के बारे में जानकारी प्राप्त की जा सके। विकासवादी शक्ति। पुनर्गठन के संकेतों का अनुमान लगाने के लिए तीन अलग-अलग विधियों का उपयोग किया जाता है। वैश्विक स्तर पर, कुछ पुनर्संयोजन घटनाओं की पहचान की गई है और दो स्वतंत्र विधियों द्वारा ठोस समर्थन के साथ पुष्टि की गई है। फिर भी, उत्परिवर्तनों की तुलना में, पुनर्संयोजन का एम. बोविस की विविधता पर कमजोर प्रभाव पड़ता है (समग्र आर/एम = 0.037)। हमारे डेटा सेट में माइकोबैक्टीरियम बोविस के क्लोनल कॉम्प्लेक्स में प्राप्त अंतर आर/एम औसत सामान्य अवधारणा के अनुरूप है कि पुनर्संयोजन की डिग्री एक ही टैक्सोनोमिक प्रजातियों को सौंपी गई वंशावली के बीच बहुत भिन्न हो सकती है। इस काम के आधार पर, माइकोबैक्टीरियम बोविस में पुनर्संयोजन को खारिज नहीं किया जा सकता है, इसलिए यह भविष्य के तुलनात्मक जीनोमिक्स शोध में आगे के प्रयासों का विषय होना चाहिए, जिसमें दुनिया भर के विभिन्न महामारी विज्ञान परिदृश्यों से बड़े डेटा सेटों का डब्ल्यूजीएस महत्वपूर्ण है। फिर मल्टी-होस्ट टीबी प्रचलन से छोटे माइकोबैक्टीरियम बोविस डेटा सेट (n = 42) पर एक अतिरिक्त विश्लेषण किया गया अधिकांश (87.1%) कोडिंग क्षेत्र में स्थित हैं, और समानार्थी परिवर्तनों के गैर-समानार्थी परिवर्तनों (dN/dS) का वैश्विक अनुपात 1.5 से अधिक है, जो दर्शाता है कि सकारात्मक चयन एम. बोविस पर लगाया गया एक महत्वपूर्ण विकासवादी बल है। "लिपिड चयापचय", "कोशिका भित्ति और कोशिकीय प्रक्रियाओं" और "मध्यवर्ती चयापचय और श्वसन" की कार्यात्मक श्रेणियों में समृद्ध जीनों में एसएनपी का एक उच्च अनुपात पाया गया, जिससे माइकोबैक्टीरियम बोविस के जीव विज्ञान और विकास में उनकी क्षमता का पता चलता है। एमटीबीसी पूर्वजों के जीनों पर एक करीबी नज़र जो क्षैतिज जीन स्थानांतरण के लिए प्रवण हैं और 3आर (डीएनए मरम्मत, प्रतिकृति और पुनर्संयोजन) प्रणाली में शामिल हैं, ताइजिमा के डी न्यूट्रल परीक्षण के वैश्विक औसत नकारात्मक मूल्य को प्रकट करता है
माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस कॉम्प्लेक्स (MTBC) जीवाणु रोगजनकों के सबसे सफल वर्गों में से एक है और जीवाणु विकास का एक विशिष्ट उदाहरण है। इसके सदस्य जीनोमिक स्तर (> 99%)1,2 पर आश्चर्यजनक रूप से उच्च न्यूक्लियोटाइड पहचान दर्शाते हैं। विभिन्न MTBC इकोटाइप क्षय रोग (TB) का कारण बन सकते हैं, जो सूक्ष्म स्तनधारियों से लेकर मनुष्यों3,4,5 तक की मेजबान प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक संक्रामक ग्रैनुलोमैटस रोग है। वर्तमान में, इस कॉम्प्लेक्स में मनुष्य [एम. ट्यूबरकुलोसिस (Mtb), माइकोबैक्टीरियम अफ्रिकैनम] और पशु-अनुकूलित रोगजनक (माइकोबैक्टीरियम बोविस, माइकोबैक्टीरियम कैपिटम, माइकोबैक्टीरियम पिनिपेडम, माइकोबैक्टीरियम माइक्रोटोबैक्टर, माइकोबैक्टीरियम मोंगी, माइकोबैक्टीरियम मिएसानी, माइकोबैक्टीरियम सुरिका, "बैसिलस चिंपैंजी" और "डैसी") 5,6 शामिल हैं। एम. कैनेटी (जिसे "नोडोबैक्टर ग्लाब्रेटा" के नाम से भी जाना जाता है) में उपर्युक्त माइकोबैक्टीरिया के साथ औसत न्यूक्लियोटाइड पहचान 98% है, और तुलनात्मक जीनोमिक्स कार्य से पता चला है कि एम. कैनेटी और शेष एमटीबीसी हाल ही में सामान्य पूर्वज से अलग हो गए हैं।7 इस अवधारणा को ध्यान में रखते हुए, कुछ लेखक एम. कैनेटी को एमटीबीसी 8 का सदस्य कहते हैं।
एमटीबीसी को व्यवस्थित रूप से एक सख्त क्लोनल कॉम्प्लेक्स के रूप में वर्णित किया गया है, और इसकी जनसंख्या संरचना स्पष्ट रूप से कम विविधता, अड़चनों, चयनात्मक स्कैनिंग और आनुवंशिक बहाव9,10 द्वारा नियंत्रित होती है। जटिल सख्त क्लोनल विकास को मानते हुए, जैसे कि लुप्त बहुरूपताओं को पुनर्संयोजन द्वारा बहाल नहीं किया जा सकता है। इस आधार पर, विभेदक क्षेत्र (आरडी) और टीबीडी1 (एमटीबी विशिष्ट विलोपन 1 क्षेत्र) के जीनोमिक विलोपन की क्रमिक घटनाओं को एमटीबीसी विकास2,5,11 के आणविक मार्कर के रूप में प्रस्तावित किया गया है। तुलनात्मक जीनोमिक्स और संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) कार्य मानव-अनुकूलित सदस्यों को नौ वंशों (माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस L1 से L4, L7 और L8; और माइकोबैक्टीरियम अफ्रिकैनम L5, L6 और L9) में विभाजित करने का समर्थन करता है, वंश L2 से L4 साझा विलोपन टीबीडी1 क्षेत्र2,11,12,13। इसके अलावा, पशु अनुकूलित सदस्यों को एक सामान्य पूर्वज साझा करने का प्रस्ताव दिया गया है, जिसे RD7, RD8, RD9 और RD102, 5, और 14 में क्लेड-विशिष्ट विलोपन द्वारा परिभाषित किया गया है।
क्षैतिज जीन स्थानांतरण (HGT) और पुनर्संयोजन की घटनाओं को दुर्लभ माना जाता है और ये MTBC के पूर्वजों में होती हैं, न कि संपूर्ण MTBC सदस्य के अलग इतिहास में15,16,17। ह्यूजेस और सहयोगियों (2002) और गुटाकर और सहयोगियों (2006) की दो प्रारंभिक रिपोर्टों ने सुझाव दिया कि पुनर्संयोजन की घटनाएँ उन बहुरूपताओं को आकार देने में मदद कर सकती हैं जो एम. ट्यूबरकुलोसिस उपभेदों में विशिष्ट स्थानों को चिह्नित करती हैं18,19। MTBC में पुनर्संयोजन की स्पष्ट कमी के कारण हैं: (1) HGT की यांत्रिक प्रक्रिया और क्षमता का ह्रास; (2) HGT घटनाओं की दुर्लभता; (3) MTBC निचे में पुनर्संयोजन की घटनाओं की कोई संभावना नहीं है14,17। हाल ही में, एमटीबीसी स्ट्रेन 20 और माइकोबैक्टीरियम बोविस 21 पर लागू कुछ संपूर्ण-जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) अध्ययनों ने पुनर्संयोजन के साक्ष्य प्रदान किए हैं, जो यह दिखाने वाला पहला है कि एमटीबीसी स्ट्रेन अक्सर छोटे डीएनए टुकड़ों का आदान-प्रदान करते हैं, लेकिन सीमित न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम भिन्नता के कारण, ये घटनाएं अभी भी वहां ध्यान में नहीं आई हैं।
माइकोबैक्टीरियम बोविस पशुधन (मुख्यतः मवेशियों) से सबसे अधिक पाया जाने वाला एमटीबीसी सदस्य है, हालाँकि इसे खुले में रहने वाले और बाड़ों में बंद जंगली जानवरों से भी अलग किया जा सकता है4,22,23,24। एम. बोविस स्पोलिगोटाइपिंग प्रोफ़ाइल, विशिष्ट विलोपन और विशिष्ट जीनों में एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) 25, 26, 27, 28, 29 के अनुसार पाँच प्रमुख क्लोनल कॉम्प्लेक्स [यूरोपीय 1 (Eu1), यूरोपीय 2 (Eu2), यूरोपीय 3 (Eu3), अफ्रीकी 1 (Af1) और अफ्रीका 2 (Af2)] में विकसित हुआ। ये क्लोनल कॉम्प्लेक्स माइकोबैक्टीरियम बोविस आबादी की विविध संरचना और भौगोलिक क्षेत्रों के साथ इसके जुड़ाव को प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, ज़िम्पेल और उनके सहयोगियों (2020) द्वारा हाल ही में किए गए WGS कार्य ने माइकोबैक्टीरियम बोविस के SNP पर आधारित एक फ़ाइलोजेनी डिज़ाइन की, जिसमें 1,900 से अधिक जीनोम थे, जो दर्शाता है कि कम से कम चार अलग-अलग वंश (Lb1 से Lb1 और फिर Lb4 नाम) हैं। ये पहले से परिभाषित क्लोनल कॉम्प्लेक्स के साथ पूरी तरह से संगत नहीं हैं, हालाँकि भौगोलिक विशिष्टता की भी पुष्टि की जा सकती है। इन लेखकों ने फ़ाइलोजेनी और आणविक काल-निर्धारण का विभेदक विश्लेषण किया, लेकिन पुनर्संयोजन का अध्ययन नहीं किया।
स्पोलिगोटाइपिंग, MIRU-VNTR (माइकोबैक्टीरियल इंटरस्पर्स्ड रिपीट यूनिट-वेरिएबल टेंडम रिपीट नंबर) जैसी विभिन्न आणविक तकनीकों और हाल ही में SNP टाइपिंग का उपयोग करके किए गए पिछले अध्ययनों से एम. बोविस स्ट्रेन 31,32,33, 34,35 में एक निश्चित स्तर की आनुवंशिक विविधता का पता चला है। आनुवंशिक विविधता का विभेदन रोग महामारी विज्ञान के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है, जो रोगजनन, विषाणुता और रोग संचरण की गहन समझ के लिए सहायक है। WGS पद्धति के उद्भव से विभिन्न मेज़बानों और महामारी विज्ञान परिदृश्यों के अनुकूलन और दृढ़ता की प्रक्रिया में माइकोबैक्टीरियम बोविस जीनोम द्वारा लगाए गए विकासवादी प्रेरक कारकों को उजागर करने की संभावना मिलती है।
इस कार्य में, हम माइकोप्लाज्मा बोविस के विकासवादी प्रक्रिया में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, विशेष रूप से फ़ायलोजेनेटिक संबंधों और पुनर्संयोजन घटनाओं को हल करने के लिए, विभिन्न क्लोनल परिसरों से अलगाव सहित विभिन्न माइकोप्लाज्मा बोविस डेटासेट (एन = 70) पर तुलनात्मक जीनोमिक विश्लेषण का उपयोग करते हैं। इस विश्लेषण के पूरक के रूप में, पुर्तगाल में एक अच्छी तरह से चिह्नित बहु-मेजबान तपेदिक क्षेत्र से प्राप्त एम. बोविस आइसोलेट्स (n = 42) के उप-डेटा सेट 31,36 को गैर-पहचान का अनुमान लगाने के लिए आगे खोजा गया था। अर्थ (dN) से पर्यायवाची (dS) न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन के सापेक्ष अनुपात के बीच संतुलन, साथ ही साहित्य में उल्लिखित विशिष्ट जीनोम के विकासवादी योगदान, वे 37,38 MTBC पूर्वजों द्वारा HGT के माध्यम से प्राप्त किए जाते हैं, और 3R (डीएनए मरम्मत, प्रतिकृति और पुनर्संयोजन) प्रणाली जीन घटकों 39 को एनकोड करते हैं। एचजीटी के माध्यम से प्राप्त जीन चुनें क्योंकि वे प्राचीन बहुरूपता का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, इसलिए यह उम्मीद की जाती है कि उनमें पर्यायवाची परिवर्तनों का अनुपात अधिक हो सकता है। इस कारण से, यह देखते हुए कि पुर्तगाल से हमारे डेटासेट में केवल यूरोपीय क्लोन कॉम्प्लेक्स 2 और उन उपभेदों के जीनोम शामिल हैं, जिन्होंने क्लोन कॉम्प्लेक्स को निर्दिष्ट नहीं किया है, हमने अंततः सभी क्लोन कॉम्प्लेक्स का प्रतिनिधि प्राप्त करने और परिणामों की मजबूती और चौड़ाई में सुधार करने के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जीनोम डेटा को शामिल करने का निर्णय लिया।
पुर्तगाली स्थानिक बहु-मेजबान तपेदिक दृश्य (नीचे विवरण) से 42 नए अनुक्रमित माइकोप्लाज्मा बोविस जीनोम, जिन्हें पहले महामारी विज्ञान के नजरिए से चित्रित किया गया था36, इस काम का केंद्र हैं। यह देखते हुए कि पुर्तगाल के डेटा सेट में केवल यूरोपीय 2 क्लोन कॉम्प्लेक्स और निर्दिष्ट कॉम्प्लेक्स के बिना उपभेदों के प्रतिनिधि हैं, एम। बोविस क्लोन कॉम्प्लेक्स के सभी प्रतिनिधियों को शामिल करने वाले डेटा सेट का विस्तार करने के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध पूरे जीनोम अनुक्रमण डेटा को जोड़ा गया है। इसलिए, इस काम में तीन पूरे जीनोम अनुक्रमण डेटा स्रोतों का उपयोग किया गया था: पूर्ण/ड्राफ्ट जीनोम असेंबली, NCBI (नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इन्फॉर्मेशन) में संग्रहीत 10 स्कैफोल्ड तक (n = 15 आइसोलेट्स); SRA में संग्रहीत ( माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी (बैसिल कैलमेट-गुएरिन) को एनसीबीआई खोज से बाहर रखा गया था। एम. बोविस एएफ2122/97 को आमतौर पर डेटासेट में शामिल करने के लिए संदर्भ जीनोम के रूप में उपयोग किया जाता है। अफ्रीकी 1 क्लोनिंग कॉम्प्लेक्स द्वारा दर्शाए गए संपूर्ण जीनोम अनुक्रम की सार्वजनिक अनुपलब्धता और एएफ2 और यू1 के प्रतिनिधि उपभेदों से जीनोम की कम संख्या के कारण, इन मामलों में एसआरए द्वारा प्रदान किए गए मूल अनुक्रमण डेटा का उपयोग किया गया था। जिम्पेल और उनके सहयोगियों (2020) के कार्य ने उपरोक्त क्लोनिंग कॉम्प्लेक्स से जीनोम की पहचान करने और डेटासेट में शामिल करने के लिए माइकोबैक्टीरियम बोविस का चयन करने में मदद की। यू3 के लिए, केवल एक प्रकार के जीनोम का वर्णन किया गया है (ब्रेंजर एट अल., 2020), इसलिए हम जिस जीनोम को शामिल करते हैं वह यू3 कॉम्प्लेक्स का एक अलग प्रतिनिधि है।
वैश्विक स्तर पर, इस डेटा सेट में 8 मेज़बान प्रजातियों से पृथक 70 मवेशी एम. बोविस शामिल हैं, जो 1985 से 2016 तक 12 देशों में वितरित किए गए। 36 प्रजातियों को Eu2, 7 प्रजातियों को Eu1, 1 प्रजाति को Eu3, 3 प्रजातियों को Af1, 4 प्रजातियों को Af2 और 19 प्रजातियों को किसी भी क्लोनल कॉम्प्लेक्स (विवरण नीचे) के लिए जिम्मेदार नहीं ठहराया गया है। इस अध्ययन में प्रयुक्त माइकोबैक्टीरियम बोविस की विस्तृत जानकारी (परिग्रहण संख्या सहित) तालिका 1 और अनुपूरक तालिका 1 में दी गई है।
पुर्तगाल के पशु तपेदिक हॉटस्पॉट से माइकोबैक्टीरियम बोविस के 42 नए अनुक्रमित पूरे जीनोम और 12 से अधिक वर्षों से वितरित इस अध्ययन का केंद्र हैं, क्योंकि संभावित वन्यजीव-पशुधन रोग प्रणालियों की नियमित रूप से निगरानी की गई है 31,36 (पूरक चित्र 1)। बाद की प्रक्रियाओं के अनुसार, इन उपभेदों को 2003 से 2015 तक मवेशियों (n = 14), लाल हिरण (n = 16) और जंगली सूअर (n = 12) से अलग किया गया था: अनुशंसित प्रोटोकॉल दिशानिर्देशों के अनुसार जानवरों को इकट्ठा करना और संभालना ऊतक के नमूने OIE स्थलीय पशु पुस्तिका में हैं और स्टोनब्रिंक और लोवेनस्टीन-जेन्सन पाइरूवेट ठोस माध्यम और तरल माध्यम पर टीका लगाए गए हैं। संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है और माइकोबैक्टीरियम चयनात्मक माध्यम (मिडलब्रुक 7H9, बीडी डायग्नोस्टिक्स) में, मूल संग्रहीत नमूनों को WGS कार्यक्रम का डीएनए प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में एक एकल मार्ग से गुजारा गया था। इसके लिए, जमे हुए संवर्धन स्टॉक समाधान को 37°C रिट्रेन पर मिडलब्रुक 7H9 पर 5% सोडियम पाइरूवेट और 10% ADS (50 ग्राम एल्ब्यूमिन, 20 ग्राम ग्लूकोज, 1 लीटर पानी में 8.5 ग्राम सोडियम क्लोराइड) से समृद्ध किया गया था। विकास के 4 सप्ताह बाद, माध्यम को नवीनीकृत किया गया और विकास देखे जाने तक संस्कृति की नियमित निगरानी की गई। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया, गोली को 500 µL फॉस्फेट बफर सलाइन (PBS) में फिर से निलंबित किया गया
डब्ल्यूजीएस युग्मित-अंत जीनोम लाइब्रेरी प्रत्येक डीएनए नमूने के विशिष्ट सूचकांक का उपयोग करके तैयार की जाती है, और अनुक्रमण के लिए इल्लुमिना मिसेक (2 × 250 पीबी) (40 नमूने) और हाईसेक (2 × 150 पीबी) (दो आइसोलेट्स) तकनीक (यूरोफिन्स जीनोमिक्स, जर्मनी) का उपयोग करती है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, जीनोमिक डीएनए को अनुक्रमित करने के लिए डबल-एंडेड मॉड्यूल अटैचमेंट वाले इल्लुमिना जीनोम एनालाइज़र का उपयोग करें, और लाइब्रेरी बनाने के लिए इल्लुमिना के नेक्स्टेरा एक्सटी डीएनए लाइब्रेरी प्रेप किट का उपयोग करें।
एसआरए (n = 12) से प्राप्त आंकड़ों को ध्यान में रखते हुए, क्लोन कॉम्प्लेक्स की पहचान को संबंधित प्रकाशन 30, 41, 43 के मेटाडेटा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। माइकोबैक्टीरियम बोविस AF2122/97 और माइकोबैक्टीरियम बोविस 3601 को छोड़कर, जो क्रमशः Eu1 और Eu3 क्लोनल कॉम्प्लेक्स 25, 29 के मान्यता प्राप्त सदस्य हैं, संपूर्ण जीनोम पर विचार करते समय, यह माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस H37Rv (NCBI परिग्रहण संख्या NC_000962.3) के संपूर्ण जीनोम के समान है। जीनोम संरेखण MAFFT (एमिनो एसिड या न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का बहु संरेखण कार्यक्रम, संस्करण 7.458) और पैरामीटर -addfragments48 का उपयोग करके किया जाता है। फिर, विभिन्न क्लोनल कॉम्प्लेक्स की अनुपस्थिति और/या SNP विशेषताओं की उपस्थिति की खोज करें।
नव अनुक्रमित माइकोबैक्टीरियम बोविस (n = 42) और एकत्रित जीनोम ड्राफ्ट (n = 3) के मूल रीड्स ने vSNP पाइपलाइन के माध्यम से कॉम्प्लेक्स को संदर्भ जीनोम माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस H37Rv के साथ संरेखित किया और विभिन्न क्लोनों के विलोपन और/या SNP विशेषताओं की उपस्थिति की खोज की गई।
संबंधित क्लोनल कॉम्प्लेक्स को जीनोमिक डेटा असाइन करने के लिए विशेषताओं की कमी और/या SNP और स्पोलिगोटाइपिंग प्रोफाइल की उपस्थिति/अनुपस्थिति से जानकारी एकत्र करें। चार ड्राफ्ट असेंबलियों के लिए, स्पोलिगोटाइपिंग प्रोफाइल का अनुमान नहीं लगाया जा सकता है, इसलिए उन्हें "कोई जटिलता नहीं" समूह में शामिल किया गया है।
इस कार्य में जैव सूचना विज्ञान कार्यप्रवाह नए सिरे से संयोजन और संदर्भ रणनीति के मानचित्रण से शुरू होता है, जिसका लक्ष्य पुनर्संयोजन घटनाओं और विशिष्ट जीनोम बहुरूपताओं का अन्वेषण करना है। चित्र 1 अनुसरण किए गए चरणों का एक प्रवाह आरेख प्रदान करता है। पुनर्संयोजन विश्लेषण के लिए, निष्कर्षों और संबंधित संकेतकों की सुदृढ़ता बढ़ाने के लिए सभी जीनोम का उपयोग किया जाता है।
जीनोम सर्वसम्मति अनुक्रमों के निर्माण में त्रुटियों को कम करने के लिए, हमने पहले डी नोवो असेंबली प्राप्त की, और फिर कोर मल्टीपल अलाइनमेंट प्राप्त किए। यूनीसाइक्लर पाइपलाइन वर्तमान में https://github.com/rrwick/Unicycler49 पर उपलब्ध है और इसका उपयोग 54 अनुक्रमित जीनोम (42 नए अनुक्रमित और SRA से पुनर्प्राप्त 12 फास्टक्यू फ़ाइलें) की डी नोवो असेंबली करने के लिए किया जाता है। संक्षेप में, स्क्रैच से संयोजन करने से पहले, FastQC संस्करण 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) और ट्रिममोमैटिक संस्करण 0.36 (विकल्प "रीड्स से एडेप्टर और अन्य प्रकाश-विशिष्ट अनुक्रमों को काटना" और "यदि 20 की सीमा गुणवत्ता से कम है, तो रीड के अंत से आधारों को काटना" लागू होता है) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50 में रीड गुणवत्ता विश्लेषण किया गया। फिर, जीनोम संयोजन के लिए SPAdes ऑप्टिमाइज़र49 का उपयोग किया गया, और संयोजन-पश्चात अनुकूलन के लिए Pilon संस्करण 1.1851 का उपयोग किया गया। गलत संयोजन से बचने के लिए एक रूढ़िवादी ब्रिजिंग मोड का चयन किया गया, और k-mer आकार को रीड लंबाई के 20% से 95% के बीच खोजा और चुना गया। एसपीएड्स दिशानिर्देशों का पालन करें और रीड साइज पर विचार करें, 300 बीपी से छोटे कंटिग्स को हटा दें, और 52 की 20 रीड डेप्थ कवरेज कटऑफ स्थापित करें। डी नोवो असेंबली रणनीति में, अत्यधिक दोहराव वाले प्रोलाइन-ग्लूटामेट (पीई) और प्रोलाइन-प्रोलाइन ग्लूटामेट (पीपीई) पैरालॉग जैसे जीनोमिक क्षेत्रों को नहीं हटाया गया।
डी नोवो असेंबली की गुणवत्ता का मूल्यांकन QUAST पाइपलाइन (http://quast.sourceforge.net/quast.html) के माध्यम से किया जाता है, जो कॉन्टिग के नवीकरण और एम. बोविस AF2122/97 संदर्भ जीनोम (NCBI परिग्रहण संख्या LT708304.1) मैपिंग (गुणवत्ता मापदंडों के लिए अनुपूरक तालिका 1 देखें) को सुविधाजनक बनाता है।
vSNP पाइपलाइन (https://github.com/USDA-VS/vSNP) की मदद से, इल्लुमिना अनुक्रमण से नए अनुक्रमित एम. बोविस की FASTQ फ़ाइल की तुलना एम. बोविस AF2122/97 संदर्भ जीनोम (LT708304.1) के साथ की जाती है। जीनोम विश्लेषण टूलकिट (GATK) 53, 54, 55 की सर्वोत्तम अभ्यास सिफारिशों के अनुसार पुन: अंशांकन के लिए मानक फ़िल्टर पैरामीटर या वैरिएंट द्रव्यमान स्कोर लागू करें। परिणाम 150 और AC = 2 के न्यूनतम SAMtools द्रव्यमान स्कोर का उपयोग करके फ़िल्टर किए गए हैं। संदूषण को बाहर करने के लिए रीडिंग की जांच हेतु क्रैकेन (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) का भी उपयोग करें।
मैपिंग त्रुटियों और गलत एसएनपी से बचने के लिए, निम्नलिखित मामलों में एक वेरिएंट को फ़िल्टर करें: (1) यह 20 से कम रीडिंग द्वारा समर्थित है, (2) यह 0.9 से कम की आवृत्ति के साथ पाया जाता है, (3) यह कम से कम एक उपभेदों में है, लेकिन कम से कम एक और उपभेद में अंतराल हैं। एकीकृत जीनोमिक्स व्यूअर (IGV) संस्करण 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 का उपयोग मैपिंग या संरेखण समस्याओं के साथ एसएनपी और पदों को दृष्टिगत रूप से सत्यापित करने के लिए किया गया था। चूंकि प्रोलाइन-ग्लूटामेट (पीई) और प्रोलाइन-प्रोलाइन ग्लूटामेट (पीपीई) जीन अत्यधिक डुप्लिकेट हैं और एक मल्टी-जीन परिवार का हिस्सा हैं, इसलिए उन्हें इल्लुमिना अनुक्रमण और मिसमैपिंग द्वारा आसानी से गलत समझा जाता है, इसलिए उन्हें प्राथमिकता दी जाती है इसलिए, हमने विश्लेषण से PE/PPE जीन और इनडेल्स को फ़िल्टर कर दिया।
बोविलिस्ट (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) के अनुसार, सभी SNP को कार्यात्मक श्रेणियों में विभाजित किया जाता है। SnpEff पाइपलाइन (https://pcingola.github.io/SnpEff/) का उपयोग SNP परिणामों (समानार्थी या गैर-समानार्थी परिवर्तन) का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। माइकोबैक्टीरियम बोविस AF2122/97 जीनोम (LT708304.1) का एक नया डेटाबेस बनाया गया।
कोर जीनोम मल्टीपल अलाइनमेंट Parsnp v1.2 का उपयोग करके किया गया था, जो वर्तमान में https://github.com/marbl/parsnp57 पर उपलब्ध है। इसमें 69 पूर्ण जीनोम/ड्राफ्ट असेंबली (विकल्प -c के साथ) का उपयोग किया गया है और M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) को संदर्भ के रूप में उपयोग किया गया है। चार कोर मल्टीपल अलाइनमेंट किए गए: केवल Eu2 क्लोनिंग कॉम्प्लेक्स (n = 37) के सदस्य, जिसमें यूरोपीय क्लोनिंग कॉम्प्लेक्स (n = 44) के सभी सदस्य शामिल हैं, जिसमें यूरोपीय और अफ्रीकी क्लोनिंग कॉम्प्लेक्स का जंक्शन बिंदु (n = 51) शामिल है, और इस अध्ययन में सभी माइकोबैक्टीरियम बोविस (n = 70) शामिल हैं।
Parsnp द्वारा उत्पन्न कोर संरेखण का उपयोग RAxML का उपयोग करके CIPRES साइंस गेटवे v3.3 (http://www.phylo.org/)58 का उपयोग करके अधिकतम संभावना (ML) फ़ाइलोजेनेटिक वृक्ष का अनुमान लगाने और 1000 निर्देशित प्रतिकृतियां करने के लिए किया जाता है।
पुनर्संयोजन घटनाओं की उपस्थिति की समानांतर जांच के लिए तीन अलग-अलग एल्गोरिदम और जैव सूचना विज्ञान उपकरणों का उपयोग किया जाता है: स्प्लिट्सट्री4 सॉफ्टवेयर, गुबिन्स (न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों में पुनर्संयोजन के माध्यम से निष्पक्ष वंशावली) पाइपलाइन, और आरडीपी4 (पुनर्संयोजन पहचान कार्यक्रम, संस्करण बीटा 4.101) सॉफ्टवेयर।
स्प्लिट्सट्री4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 में कार्यान्वित स्प्लिट अपघटन विधि का उपयोग रूटलेस फ़ाइलोजेनेटिक नेटवर्क की गणना के लिए किया जाता है, सांख्यिकीय सत्यापन के लिए Phi परीक्षण का उपयोग करते हुए, और महत्व सीमा p = 0.05 है। Parsnp के कोर मल्टी-अलाइनमेंट विश्लेषण को इनपुट के रूप में उपयोग किया जाता है, और नेटवर्क मानक के रूप में स्प्लिट अपघटन को साकार किया जाता है।
गुबिन्स पाइपलाइन v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 माइकोबैक्टीरियम बोविस पर पुनर्संयोजन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के एक अन्य तरीके के रूप में डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ चलता है। पाइपलाइन में लागू किया गया एल्गोरिदम प्रासंगिक क्लोन वंश का पुनर्निर्माण करता है हमारे डेटा सेट और संदर्भ जीनोम (बोवाइन बोविड AF2122/97, LT708304.1) का पूरा जीनोम/ड्राफ्ट संयोजन पारस्परिक रूप से होता है; और पुनर्संयोजन घटना का प्रतिनिधित्व करने वाले एसएनपी क्लस्टर का पता लगाने के लिए पेड़ की प्रत्येक शाखा पर एसएनपी की स्थिति को स्कैन करता है। शाखा का शून्य मान लें कि कोई पुनर्संयोजन घटना नहीं है, जिसका अर्थ है कि शाखा पर होने वाले एसएनपी समान रूप से वितरित होने चाहिए। Parsnp से कोर मल्टीपल अलाइनमेंट और RAxML से सर्वश्रेष्ठ स्कोर वाले एमएल ट्री को इनपुट फाइलों के रूप में उपयोग किया जाता है।
अंत में, गबिन्स पाइपलाइन द्वारा सुझाई गई पुनर्गठन घटना की पुष्टि करने के लिए, RDP467 में कार्यान्वित छह एल्गोरिदम (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 और SiScan66) को डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के तहत Parsnp के कोर मल्टीपल अलाइनमेंट पर लागू किया जाता है। हमने निर्धारित किया कि RDP4 में कार्यान्वित कम से कम तीन एल्गोरिदम को प्रत्येक पुनर्संयोजन घटना की पुष्टि के लिए लगातार एक महत्वपूर्ण संकेत प्रदर्शित करना चाहिए।
यह देखते हुए कि गबिन्स और आरडीपी सॉफ्टवेयर दोनों 500 बीपी तक की विंडो में कोर मल्टीपल अलाइनमेंट की जाँच करके पुनर्संयोजन संकेतों की तलाश करते हैं, और यह पुष्टि करते हैं कि डी नोवो असेंबली के दौरान पीई/पीपीई जीन का समावेश प्राप्त पुनर्संयोजन संकेतों में बाधा नहीं डालेगा, आगे का विश्लेषण होमोलीनियरिटी द्वारा किया जाता है। पुनर्संयोजन घटना की पहचान करने वाले जीन के आसपास के क्षेत्र की जाँच करें। स्थानीय जीनोम ट्रांसलोकेशन या व्युत्क्रम को बाहर करने के लिए MAUVE-मल्टी-जीनोम अलाइनमेंट (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) का उपयोग करके संपूर्ण जीनोम का उपयोग करते हुए सिनलाइनियर मानचित्र का निर्माण किया गया था। इसके अतिरिक्त, SyntTax वेब सर्वर (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) के माध्यम से अमीनो एसिड अनुक्रम पर होमोलीनियरिटी विश्लेषण करने के लिए संपूर्ण जीनोम का उपयोग किया गया था।
पुर्तगाली बहु-मेजबान क्षय रोग प्रणाली से प्राप्त जीनोम डेटा सेट का अधिक गहन विश्लेषण साहित्य में उल्लिखित जीनों की बहुरूपता की जाँच के लिए किया जाना चाहिए। ये जीन 37,38 और एमटीबीसी पूर्वजों द्वारा एचजीटी (डीएनए मरम्मत, प्रतिकृति और पुनर्संयोजन) प्रणाली घटकों 39 के माध्यम से प्राप्त जीन एन्कोडिंग 3R हैं। जीन विविधता और न्यूक्लियोटाइड विविधता (π) और ताजिमा के डी न्यूट्रल परीक्षण पैरामीटर इनपुट की गणना के लिए ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) और DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) का उपयोग करें।
69 माइकोप्लाज्मा बोविस आइसोलेट्स और संदर्भ जीनोम पर आधारित एक अधिकतम संभावना (एमएल) फ़ाइलोजेनेटिक ट्री प्राप्त किया गया (चित्र 2ए)। एकल-जीन-आधारित ट्री या बहु-लोकस-आधारित ट्री की तुलना में, यह रणनीति अधिक शक्तिशाली ट्री उत्पन्न करने की अनुमति देती है जो पूरे जीनोम की परिवर्तनशीलता को नहीं पकड़ते हैं और इसलिए प्रजातियों के बीच भेदभाव करने की कम क्षमता प्रदर्शित करते हैं 68,69। एमएल ट्री की टोपोलॉजिकल संरचना आमतौर पर क्लोनों के जटिल वर्गीकरण के अनुरूप होती है। Eu2 का जीनोम एक शाखा में समूहीकृत होता है, और Af1 का जीनोम भी एक साथ समूहीकृत होता है (चित्र 2ए)। परिणाम माइकोबैक्टीरियम बोविस के ज्ञात विकासवादी संबंध के भी अनुरूप है, अर्थात, Eu1 सदस्य और अन्य सभी क्लोनल कॉम्प्लेक्स और जीनोम वाले समूह के बीच एक बड़ा अंतर है क्लोनल कॉम्प्लेक्स और फ़ाइलोजेनेटिक वृक्ष पर देखे गए संबंध के बीच छोटी असंगतता को इस तथ्य से समझाया जा सकता है कि क्लोनल कॉम्प्लेक्स का वर्णन विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों के आधार पर किया जाता है, जबकि फ़ाइलोजेनेटिक वृक्ष संपूर्ण जीनोम का प्रतिनिधित्व करने वाले कोर जीनोम के कई संरेखणों पर आधारित होता है।
अधिकतम संभावना वाले फ़ाइलोजेनेटिक वृक्ष (GTR) का निर्माण माइकोबैक्टीरियम बोविस जीनोम के कोर जीनोम संरेखण के आधार पर पुनर्संयोजन स्थल को हटाने से पहले (A) और बाद में (B) किया जाता है। शाखाओं के रंग माइकोबैक्टीरियम बोविस क्लोन कॉम्प्लेक्स को दर्शाते हैं: यूरोप 1 बैंगनी है, यूरोप 2 लाल है, यूरोप 3 नीला है, अफ्रीका 1 नारंगी है, और अफ्रीका 2 हरा है। वृक्ष को जड़ से उखाड़कर पैमाने पर खींचा जाता है, और प्रत्येक स्थल के प्रतिस्थापन के रूप में शाखा की लंबाई मापी जाती है।
माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस कॉम्प्लेक्स को क्लोन रूप से विकसित बताया गया है, और वर्षों से एकत्रित अधिकांश साक्ष्य इस विचार का समर्थन करते हैं कि चल रही एचजीटी और पुनर्संयोजन घटनाएं एमटीबीसी15,17,18 के पता लगाने योग्य स्तर पर नहीं होंगी।
पिछले कार्यों से पता चला है कि एमटीबीसी उपभेदों के बीच सीमित पुनर्संयोजन हो सकता है20,21, जबकि अन्य मापनीय पुनर्संयोजन घटनाओं की पहचान करने में विफल रहे हैं70,71। माइकोबैक्टीरियम बोविस पर ध्यान केंद्रित करते हुए इस मुद्दे पर फिर से चर्चा करें, जो पिछले कार्य से अलग है जिसमें केवल माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस 70,71 पर विचार किया गया था; या एमटीबीसी को एक पूरे के रूप में देखें, जिसमें लगभग कोई एम. बोविस 20 का प्रतिनिधित्व नहीं करता है; या केवल प्रतिबंधात्मक मवेशी अंशों पर विचार करें। माइकोबैक्टीरिया डेटासेट, इस काम में, कुल 70 उपभेद हैं, जो सभी क्लोनल परिसरों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिनका उपयोग पुनर्संयोजन के लिए स्क्रीनिंग करने के लिए किया जाता है। डेटा सेट को चार संचयी स्तरों के अनुसार बढ़ाया गया है: (1) Eu2 सदस्य, (2) सभी यूरोपीय क्लोन परिसर सदस्य (यानी यूरोप),
इस परिकल्पना का और अधिक अध्ययन करने के लिए, जीनोम के बीच पुनर्संयोजन की घटनाओं की अनुपस्थिति का आकलन करने हेतु एक विभाजित-विघटन नेटवर्क का प्रयोग किया गया, क्योंकि यह विधि व्यक्तियों के बीच पैतृक संबंध को दृश्यमान कर सकती है और परस्पर विरोधी जातिवृत्तीय संकेतों को प्रदर्शित कर सकती है। विश्लेषण में सभी चार डेटा सेटों ने नेटवर्क में लूप्स (अर्थात, ऐसे क्षेत्र जो एक ही वृक्ष में अभिसरित नहीं होते) के अस्तित्व की पुष्टि की, लेकिन Phi परीक्षण का कोई सांख्यिकीय समर्थन नहीं है (Eu2, p = 0.0956; यूरोप, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; संपूर्ण डेटा सेट p = 0.2451), जो पुनर्गठन घटनाओं के अस्तित्व के लिए अपर्याप्त साक्ष्य प्रदान करता है (चित्र 3A-D)।
यूरोप में 2 जीनोम (n = 37) (A), यूरोपीय जीनोम (n = 44) (B), यूरोपीय और अफ्रीकी जीनोम (n = 51) (C) और संपूर्ण डेटा सेट (n = 70) (D)।
इस विश्लेषण के बाद, और सभी नेटवर्कों में चक्रीय अवलोकनों को ध्यान में रखते हुए, गुबिन्स पाइपलाइन में कार्यान्वित पुनर्निर्माण एल्गोरिदम को क्लोनल वंश के पुनर्निर्माण और एम. बोविस जीनोम पर पुनर्संयोजन के प्रभाव के अनुमान को पूरक करने के लिए लागू किया गया था। पुनर्संयोजन घटनाओं की संचयी संख्या का अनुमान लगाएं, जिनमें से अधिकांश टर्मिनल शाखाओं (यानी, एक ही जीनोम में) में हुईं (तालिका 2)। ये संकेतक पूरे डेटा सेट की स्थिरता दिखाते हैं और संकेत देते हैं कि पुनर्संयोजन घटनाओं की आवृत्ति उत्परिवर्तन की तुलना में 200 से 300 गुना है। एक बार शाखा पर पुनर्संयोजन और बिंदु उत्परिवर्तन की सापेक्ष दरों का प्रतिनिधित्व करने वाला रो/थीटा पैरामीटर 0.0037 और 0.0056 के बीच प्रतीत होता है (तालिका 3)। हाल ही में, 38 एम. बोविस स्ट्रेन के प्रकाशित कार्य ने इस डेटासेट में प्राप्त की तुलना में एक उच्च रो/थीटा मूल्य (रो/थीटा = 0.1) प्रदर्शित किया, लेकिन पटाने और सहकर्मियों के काम ने पुनर्संयोजन मापदंडों का अनुमान लगाने के लिए संदर्भ-आधारित असेंबली का उपयोग किया, असेंबली प्रक्रिया के कारण एक प्रक्रियात्मक विवरण, टर्मिनल शाखा में अनुमानित पुनर्संयोजन घटनाओं की प्रचुरता से जुड़ा हुआ है।
इसके बाद, आर/एम पैरामीटर पुनर्संयोजन और उत्परिवर्तन परिचय के विविधता अनुपात को दर्शाता है और इसका औसत मान 0.025 और 0.037 के बीच है, जो दर्शाता है कि उत्परिवर्तनों की तुलना में, पुनर्संयोजन का एम. बोविस की आनुवंशिक विविधता पर कम समग्र प्रभाव पड़ता है (तालिका 3))। व्यापक तुलना के लिए, 23 जीनोमों से बने एमटीबीसी डेटासेट के लिए आर/एम पैरामीटर का अनुमान लगाने के लिए एक समान विधि का उपयोग किया गया था, जो 0.48620 का औसत मान दर्शाता है, जबकि पटाने और सहकर्मियों के 38 एम. बोविस डेटासेट के लिए, यह साबित हुआ कि औसत मान 0.98 है। पहले अध्ययन में, एम. बोविस (एम. बोविस बीसीजी और संदर्भ स्ट्रेन) के काम में 23 जीनोमों में से केवल दो शामिल थे, इसलिए प्राप्त मान एम. ट्यूबरकुलोसिस जीनोम की अधिक अभिव्यक्ति के कारण पक्षपाती हो सकता है। इसके विपरीत, हमारे डेटा सेट में, अधिक भौगोलिक स्थानों और मेजबान प्रजातियों का प्रतिनिधित्व किया जाता है, और विभिन्न जनसंख्या आनुवंशिक विशेषताओं के साथ विभिन्न क्लोनल परिसरों में समूहीकृत जीनोम का भी उपयोग किया जाता है, इस प्रकार एक गहरा और व्यापक जनसंख्या ज्ञान प्राप्त होता है। हमारे डेटा सेट के साथ प्राप्त अंतर आर/एम औसत मूल्य इस अवधारणा के अनुरूप है कि पुनर्संयोजन की डिग्री एक ही टैक्सोनोमिक प्रजातियों को सौंपी गई वंशावली के बीच बहुत भिन्न होती है, इसलिए ये परिणाम संकेत देते हैं कि एम। बोविस क्लोन परिसर पुनर्संयोजन अंतर प्रदर्शित कर सकता है प्रभाव भी डिडेलोट और मेडेन72 द्वारा सुझाया गया है। फिर भी, बड़ी संख्या में एम। बोविस जीनोम को शामिल करके इस डेटा सेट का महत्वपूर्ण रूप से विस्तार करने से इस बिंदु को और स्पष्ट करने की अनुमति मिलेगी। आर/एम और रो/थीटा दोनों पैरामीटर शाखाओं के बीच परिवर्तनशीलता दिखाते हैं
अंत में, गबिन्स पाइपलाइन द्वारा पहचानी गई पुनर्गठन घटनाओं की पुष्टि करने के लिए, विभिन्न कोर बहु-तुलनाओं का स्वतंत्र रूप से परीक्षण करने हेतु RDP4 सॉफ्टवेयर में छह विभिन्न एल्गोरिदम का उपयोग किया गया। वैश्विक स्तर पर, गबिन्स द्वारा पहचानी गई घटनाओं में से आधे से भी कम की पुष्टि RDP4 द्वारा की गई (तालिका 4 और 5)। संपूर्ण डेटा सेट पर विचार करने पर, तीन पुनर्संयोजन घटनाओं की पुष्टि हुई, जिनमें से दो में आंतरिक नोड्स शामिल थे और एक अन्य में एक टर्मिनल शाखा में एकल जीनोम शामिल था, जिसके लिए क्लोनल कॉम्प्लेक्स निर्दिष्ट नहीं किए जा सके (तालिका 4 और 5)। टर्मिनल शाखाओं में घटनाओं की पहचान यह संकेत दे सकती है कि समकालीन एम. बोविस उपभेदों में पुनर्संयोजन अभी भी प्रगति पर है या परिणाम गलत है70। इस काल्पनिक पुनर्संयोजन क्षेत्र में, लगभग 20% स्थितियों में अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड (N) हैं, जिससे पुनर्संयोजन संकेत प्रभावित होता है (पूरक चित्र 2)। इसके अलावा, यह क्षेत्र 16S राइबोसोमल आरएनए को एन्कोड करने वाले आरआरएस जीन को प्रभावित करता है, जिसके अत्यधिक संरक्षित होने की उम्मीद है, इसलिए यह संभावित पुनर्संयोजन संकेत अनुक्रमण त्रुटियों या गलत संरेखण का परिणाम हो सकता है। फिर Mb0003 और माइकोबैक्टीरियम बोविस AF2122/97 के बीच संपूर्ण जीनोम संरेखण किया गया, और अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड्स और एसएनपी के अस्तित्व की पुष्टि की गई, इसलिए गलत संरेखण से संबंधित संभावित समस्याएँ इस कार्य में कार्यान्वित जैविक जानकारी के कारण नहीं, बल्कि प्रोग्राम सीखने के बाद सामने आईं।
आंतरिक नोड्स के पुनर्संयोजन क्षेत्रों में कोई अंतराल या अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड नहीं पाए गए (चित्र 4 और 5)। इन घटनाओं के संबंध में, एक में केवल Eu2 जीनोम होता है और यह pks12 जीन को प्रभावित करता है, जो संभावित पॉलीकेटाइड सिंथेज़ को एन्कोड करता है; जबकि दूसरा Eu1 जीनोम में पंजीकृत होता है और narX जीन को प्रभावित करता है जो संभावित नाइट्रेट रिडक्टेस को एन्कोड करता है (तालिका 4)। सामान्य तौर पर, पुनर्संयोजन विश्लेषण से पता चलता है कि सांख्यिकीय समर्थन वाले पुनर्संयोजन अंशों की संख्या सीमित है, और अनुमानित संकेतक यह संकेत देते हैं कि पुनर्संयोजन का एम. बोविस वंश पर कम प्रभाव पड़ता है। पुनर्संयोजन संकेत कम होने की उम्मीद है, लेकिन वास्तविक विकास संकेत को पृष्ठभूमि शोर से अलग करना महत्वपूर्ण है, जो एक चुनौतीपूर्ण कार्य है। संदर्भ-आधारित संयोजन और बेमेल समस्याओं 70, 71 द्वारा प्रस्तुत शोर संकेत को कम करने इसके अतिरिक्त, समग्र सर्वेक्षण की सुदृढ़ता और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए पूरक विश्लेषणों की एक श्रृंखला आयोजित की गई। इसलिए, माइकोबैक्टीरियम बोविस AF2122/97 के विरुद्ध रीड मैपिंग द्वारा narX और pks12 जीनों की अनुक्रमण गुणवत्ता का मूल्यांकन किया गया। पुनर्संयोजन क्षेत्र में अनुशंसित SNP स्थिति की पुष्टि विधि अनुभाग में उल्लिखित मानदंडों (कम से कम 20 रीडिंग और 0.9 परिवर्तन आवृत्ति) को लागू करके की गई। narX जीन की बहुरूपता की पुष्टि दोनों जीनोमों (Mb1792361 और Mb7240415; 2.3%) और pks12 जीनोम के जीनोम: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, और Mb12 जीनों में पूरी तरह से की गई। हालांकि, जीनोम Mb2043 के लिए, आठ में से छह स्थितियां रीड डेप्थ मानदंड को पूरा नहीं करती हैं क्योंकि एसएनपी अधिकतम 17 रीड्स द्वारा समर्थित है, जो 20 के स्थापित कटऑफ मान से नीचे है। इसलिए, इस जीनोम साइट पर छह जीनोम (8.6%) के पुनर्संयोजन की पुष्टि की जा सकती है (चित्र 4 और 5)।
माइकोबैक्टीरियम बोविस डेटासेट के पुनर्संयोजन क्षेत्र संरेखण का विस्तृत दृश्य narX जीन को प्रभावित करता है जो एक संभावित नाइट्रेट रिडक्टेस को एनकोड करता है। आंतरिक नोड्स के पुनर्संयोजन क्षेत्र में कोई अंतराल या अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड नहीं पाए गए। यह विशेष घटना Eu1 जीनोम में दर्ज की गई है। माइकोबैक्टीरियम बोविस AF2122/97 के रीड्स को प्लॉट करके narX जीन की अनुक्रमण गुणवत्ता का मूल्यांकन किया गया। विधि अनुभाग में उल्लिखित मानदंडों (कम से कम 20 रीडिंग और 0.9 परिवर्तन आवृत्ति) को लागू करके पुनर्संयोजन क्षेत्र में अनुशंसित SNP स्थान की पुष्टि करें। Mb1792361 और Mb7240415 (2.3%) के जीनोम में narX जीन की बहुरूपता की पूरी तरह से पुष्टि की गई।
pks12 जीन को प्रभावित करने वाले माइकोप्लाज्मा बोविस डेटासेट के पुनर्योजन क्षेत्र संरेखण का विस्तृत दृश्य। आंतरिक नोड्स के पुनर्योजन क्षेत्र में कोई रिक्त स्थान या अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइड नहीं पाए गए। संभावित पॉलीकेटाइड सिंथेज़ को एन्कोड करने वाले pks12 जीन को प्रभावित करने वाली घटना के संबंध में, इसमें केवल Eu2 जीनोम शामिल है। pks12 की अनुक्रमण गुणवत्ता का मूल्यांकन माइकोबैक्टीरियम बोविस AF2122/97 की रीड मैपिंग द्वारा किया गया था। विधि अनुभाग में उल्लिखित मानदंडों (कम से कम 20 रीडिंग और 0.9 परिवर्तन आवृत्ति) को लागू करके पुनर्योजन क्षेत्र में अनुशंसित SNP स्थान की पुष्टि करें। Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, और Mb1960 जीनोम के बहुरूपताओं की पूरी तरह से पुष्टि हो चुकी है।
पीई और पीपीई जीन में दोहराव वाले क्षेत्र होते हैं जिन्हें इल्लुमिना अनुक्रमण और मिसमैपिंग द्वारा आसानी से गलत पढ़ा जा सकता है, इसलिए वे आमतौर पर एम. ट्यूबरकुलोसिस सदस्यों के जैव सूचना विज्ञान वर्कफ़्लो से केवल मैपिंग-टू-सीक्वेंस रणनीति का उपयोग करते समय हटा दिए जाते हैं। इस कार्य में लागू पुनर्संयोजन घटनाओं का अनुमान पीई/पीपीई को फ़िल्टर किए बिना नए सिरे से संयोजन पर आधारित है। हमारा मानना ​​है कि स्प्लिट्सट्री, गबिन्स पाइपलाइन और आरडीपी4 सॉफ्टवेयर के माध्यम से तीन अलग-अलग पूरक विधियों और एल्गोरिदम को लागू करने से, लागू की गई रणनीतियाँ त्रुटि संकेतों के कारण पुनर्गठित क्षेत्रों को संसाधित करने और फ़िल्टर करने के लिए मजबूत हैं। हालांकि, एसएनपी समूहों की पहचान करने के लिए गबिन्स और आरडीपी4 सॉफ्टवेयर पर पीई/पीपीई जीन के हस्तक्षेप को बाहर करने के लिए एम. बोविस AF2122/97 में, narX जीन narK2 और Mb1764c द्वारा पृथक होता है, जबकि pks12, Mb2075c e Mb2073c से घिरा होता है (पूरक चित्र 3-5)। संपूर्ण जीनोम के MAUVE सिनलाइन मानचित्र का उपयोग करके उत्पन्न मानचित्र जीन अनुक्रम संरक्षण और पुनर्व्यवस्था के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जिसमें चार संरेखीय खंड दिखाई देते हैं, और जीनोम स्थानांतरण या व्युत्क्रमण के कोई संकेत नहीं दिखाई देते हैं। इसके अतिरिक्त, अमीनो अम्ल अनुक्रम के साथ पूरक विश्लेषण ने सभी संपूर्ण जीनोम में समरूपता सिद्ध की, और narX या pks12 के निकटवर्ती क्षेत्रों में कोई PE/PPE नहीं पाया गया। narX के लिए, एक जीनोम (Mb0030) का पर्यायवाची स्कोर कम है क्योंकि narX जीन की पहचान दो खंडों (खंड 1891 और 1890) के रूप में की गई थी। pks12 के लिए, समानताओं के कारण, Mb0030 और Mb003 ने कम सिनलाइनियरिटी स्कोर प्रदर्शित किए, जबकि pks12 की पहचान क्रमशः दो और तीन खंडों में हुई, जो प्रोटीन के विभिन्न डोमेन का प्रतिनिधित्व करते हैं (पूरक चित्र 3-5)। इस जानकारी को ध्यान में रखते हुए, और गुबिन्स और RDP4 सॉफ़्टवेयर दोनों ने विश्लेषण किया, विंडो में अधिकतम 500 bp के कोर मल्टीपल अलाइनमेंट की जाँच की, हमने पुष्टि की कि PE/PPE जीन narX और pks12 को प्रभावित करने वाले पुनर्संयोजन संकेत में हस्तक्षेप नहीं करेगा।
यद्यपि इस डेटा सेट में पाए गए पुनर्संयोजन संकेतों को अवशिष्ट माना जा सकता है, यह सच है कि एम. बोविस में पुनर्संयोजन को खारिज नहीं किया जा सकता है, इसलिए इसे आगे के विश्लेषण का विषय बना रहना चाहिए, जिसमें विभिन्न महामारी विज्ञान परिदृश्यों से पूरे जीनोम को अनुक्रमित किया जाता है।
पुनर्संयोजन सुधार से पहले और बाद में प्राप्त एम.एल. फाईलोजेनेटिक वृक्षों की तुलना करने पर (चित्र 2ए, बी) अनुमानित फाईलोजेनेटिक संबंध में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुए, और एम. बोविस उपभेदों को एक ही समूह में समूहीकृत किया गया।
एम. बोविस AF2122/97 के संदर्भ जीनोम के साथ 42 नए अनुक्रमित एम. बोविस रीड्स का मानचित्रण करने के बाद, 1816 बहुरूपी स्थितियों वाला एक SNP संरेखण प्राप्त हुआ। अधिकांश SNP (87.1%) कोडिंग क्षेत्र में स्थित हैं, और प्रभावित जीनों को बोविलिस्ट (चित्र 6A, B) में दर्शाई गई कार्यात्मक श्रेणियों के अनुसार वर्गीकृत किया गया है। प्रत्येक कार्यात्मक श्रेणी में जीनों की कुल संख्या को ध्यान में रखते हुए, "लिपिड चयापचय" श्रेणी के जीनों में अधिक SNP पाए गए, उसके बाद "कोशिका भित्ति और कोशिका प्रक्रियाएँ" और "मध्यवर्ती चयापचय और श्वसन" के जीन पाए गए, जिससे पता चलता है कि वे एम. बोविस के विकास में हैं।
पुर्तगाल से प्राप्त एम. बोविस डेटासेट का पदानुक्रमित विश्लेषण (n = 42)। प्रत्येक कार्यात्मक श्रेणी (A) के लिए पंजीकृत SNP और प्रभावित जीनों की कुल संख्या। कार्य श्रेणी (B) द्वारा पंजीकृत पर्यायवाची और गैर-पर्यायवाची परिवर्तनों की कुल संख्या।
वैश्विक स्तर पर, औसत dN/dS अनुपात 1.5 से बेहतर है, जो दर्शाता है कि वैश्विक विकासवादी दबाव पैतृक अवस्था से छुटकारा पाने का है और एक सकारात्मक (विविध या निर्देशित) और/या शिथिल शुद्धिकरण विकल्प परिदृश्य का प्रतिनिधित्व करता है। "विषाणुता, विषहरण, अनुकूलन", "प्रविष्टन अनुक्रम और चरण", और "नियामक प्रोटीन" श्रेणियों में, दो-तिहाई से अधिक SNP समानार्थी नहीं हैं (चित्र 6B)।
सभी श्रेणियों में, कई एसएनपी वाले जीन होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप औसत उत्परिवर्तन दर (यानी, प्रति जीन औसत एसएनपी) 1 से अधिक होती है (चित्र 6ए)। 15 एसएनपी वाले Pks12 (Mb2074c) और 8 एसएनपी वाले fas (Mb2553c) में उत्परिवर्तन मान अधिक होते हैं। ये दोनों जीन फैटी एसिड मेटाबोलिज्म में शामिल होते हैं। pks जीन पॉलीकेटाइड सिंथेज़ (PKS) को एनकोड करता है, जो माइकोबैक्टीरियल कोशिका भित्ति लिपिड जैवसंश्लेषण74,75 में शामिल एक बहुक्रियाशील एंजाइम है। यह जीन एक बहुक्रियाशील पॉलीपेप्टाइड को एनकोड करता है जो माइकोकेटाइड्स74,76 के संश्लेषण में शामिल होता है। fas जीन माइकोलिक एसिड के संश्लेषण में शामिल होता है
माइकोबैक्टीरियम बोविस के विकास का और अध्ययन करने के लिए, विशिष्ट जीनों के दो समूहों का विश्लेषण किया गया। अनुक्रम संरचना और फ़ायलोजेनेटिक विधियों का उपयोग करते हुए पूर्व में प्रकाशित कार्यों ने उन जीनों की पहचान की जो MTBC पूर्वजों द्वारा विविधीकरण से पहले HGT के माध्यम से प्राप्त किए गए थे37,38। ये जीन अनुपूरक तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं। कुल 77 जीनों के SNP वितरण का विश्लेषण किया गया जो HGT से संबंधित हो सकते हैं, और 26 बहुरूपी स्थलों की पहचान की गई, जो अधिकांश मामलों (78%) में गैर-समानार्थी (NS) परिवर्तनों के परिणामस्वरूप हुए (अनुपूरक तालिका 2)। MTBC जीनोम पर पिछले कार्य ने प्रदर्शित किया कि संभावित HGT क्षेत्र शेष जीनोम की तुलना में उच्च NS SNP अनुपात प्रदर्शित करता है। यदि कोई सोचता है कि ये पुनर्संयोजन क्षेत्र MTBC पूर्वजों द्वारा प्राप्त किए गए थे इसलिए, हमारे परिणाम संकेत देते हैं कि कार्यात्मक परिणाम HGT-जैसे जीनों के प्रतिस्थापन से उत्पन्न हो सकते हैं, जो मूल्यवान अनुकूली आनुवंशिक विविधता के लिए उनके महत्व को दर्शाता है।
इस विश्लेषण के समानांतर, 3R (डीएनए मरम्मत, प्रतिकृति और पुनर्संयोजन) प्रणाली के घटकों को एन्कोड करने वाले जीन की डॉस वुल्टोस और सहयोगियों (2008)39 द्वारा पहले प्रकाशित सूची के अनुसार पूरी तरह से जांच की गई थी। समान डीएनए टुकड़ों के आदान-प्रदान को सीधे नहीं देखा जा सकता है, हालांकि यह एक लगातार प्रक्रिया हो सकती है जब निकट से संबंधित बैक्टीरिया शामिल होते हैं, जैसे कि इस डेटा सेट के मामले में; इसके अलावा, यह प्रक्रिया डीएनए मरम्मत के तरीकों72 की कुंजी हो सकती है, इसलिए समजातीय पुनर्संयोजन में भूमिका निभाएं। 54 जीनों द्वारा वितरित कुल 26 बहुरूपी स्थितियों की पहचान की गई (पूरक तालिका 3)। जीन के इस सेट में, एनएस परिवर्तनों के कारण लगभग 65% परिणाम सामने आए