Eskerrik asko Nature bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSSrako laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzailearen bertsio berriago bat erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Aldi berean, laguntza jarraitua bermatzeko, estilorik eta JavaScriptik gabeko guneak erakutsiko ditugu.
Genomaren sekuentziazioak gaixotasun infekziosoen ikerketaren arloa berpiztu du, gaixotasunen epidemiologia, patogenia, ostalari-patogeno elkarrekintzak eta patogenoei ezarritako eboluzio-prozesua agerian utziz. Mycobacterium tuberculosis konplexuak (MTBC) Mycobacterium bovis ugaztun lehorrekoetan tuberkulosia (TB) eragiten duen animalia-egokitze kideetako bat dela uste du, eta bakterioen eboluzioaren eredu tipikoa da. Beste MTBC kide batzuk bezala, Mycobacterium bovis patogeno klonazio zorrotzeko eta eboluzio motelekoa dela suposatzen da, eta, jakina, ez dago birkonbinazio edo gene-transferentzia horizontalaren zantzurik. Lan honetan, genomika konparatiboa aplikatzen diogu genoma osoko sekuentzia (WGS) datu-multzo bati, arbaso desberdinetako (Europa eta Afrika) 70 behi-M.-z osatutakoari, behi-M.-ren dibertsitate genetikoari buruzko informazioa lortzeko. Eboluzio-ahalmena. Hiru metodo desberdin erabiltzen dira berrantolaketaren zantzuak kalkulatzeko. Mundu mailan, birkonbinazio-gertaera kopuru txiki bat identifikatu eta berretsi da bi metodo independenteren bidez, euskarri sendoarekin. Hala ere, mutazioekin alderatuta, birkonbinazioak eragin ahulagoa du M. bovis-en dibertsitatean (r/m orokorra = 0,037). Gure datu-multzoan Mycobacterium bovis-en konplexu klonalean lortutako r/m batez besteko aldea bat dator birkonbinazio-maila espezie taxonomiko berari esleitutako leinuen artean asko alda daitekeela dioen kontzeptu orokorrarekin. Lan honetan oinarrituta, ezin da baztertu Mycobacterium bovis-en birkonbinazioa, beraz, etorkizuneko genomika konparatiboko ikerketan ahalegin gehiago egin beharko lirateke, non mundu osoko eszenatoki epidemiologiko desberdinetako datu-multzo handien WGS funtsezkoa den. Ondoren, analisi gehigarri bat egin zen Mycobacterium bovis datu-multzo txikiagoan (n = 42), ostalari anitzeko TB prebalentziatik abiatuta, eta 1.800 lokus baino gehiago identifikatu ziren, eta horietatik gutxienez andui batek nukleotido polimorfismo bakarreko (SNP) bat erakutsi zuen. Gehienak (% 87,1) kodetze eskualdean daude, eta sinonimoen aldaketa ez-sinonimoen ratio globala (dN/dS) 1,5etik gorakoa da, eta horrek adierazten du hautespen positiboa M. bovis-engan eragiten duen eboluzio-indar garrantzitsua dela. SNP proportzio handiagoa detektatu zen "lipidoen metabolismoa", "zelula-horma eta zelula-prozesuak" eta "tarteko metabolismoa eta arnasketa" bezalako kategoria funtzionaletan aberatsak diren geneetan, eta horrek agerian uzten du Mycobacterium bovis-en biologian eta eboluzioan duten garrantzia. MTBC arbasoetan geneen transferentzia horizontalerako joera duten eta 3R (DNAren konponketa, erreplikazioa eta birkonbinazioa) sisteman sartutako geneei erreparatuta, Taijima-ren D neutro probaren batez besteko balio negatibo globala agerian geratzen da, eta horrek iraganeko eskaneatu selektiboa adierazten du. Populazioaren hedapenaren ondorengo azken oztopoa da oraindik ere Mycobacterium bovis patogeno derrigorrezkoak ostalariaren aurka borrokatzeko duen eboluzio-faktore nagusia.
Mycobacterium tuberculosis konplexua (MTBC) bakterio patogenoen taxon arrakastatsuenetako bat da eta bakterioen eboluzioaren kasu tipikoa. Bere kideek nukleotidoen identitate harrigarriro handia erakusten dute maila genomikoan (> % 99)1,2. MTBC ekotipo desberdinek tuberkulosia (TB) eragin dezakete, hau da, gaixotasun granulomatoso infekziosoa, mikrougaztunetatik hasi eta gizakietarainoko ostalari espezie ugaritan3,4,5. Gaur egun, konplexuak gizakiak [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] eta animalietara egokitutako patogenoak (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" eta "dassie") barne hartzen ditu5,6. M. canettii ("Nodobacter glabrata" bezala ere ezaguna) Aipatutako mikobakterioekin batez besteko nukleotido-identitatea % 98koa da, eta genomika konparatiboko lanak erakutsi du M. canettii eta MTBC gainerakoa duela gutxi arbaso komunetik bereizi direla.7 Kontzeptu hau kontuan hartuta, egile batzuek M. canettii MTBCko kide 8 deitzen diote.
MTBC sistematikoki deskribatzen da konplexu klonal zorrotz gisa, eta bere populazio-egitura argi eta garbi dibertsitate murriztuak, oztopoak, eskaneatze selektiboak eta jito genetikoak arautzen dute9,10. Eboluzio klonal zorrotz konplexua, hala nola polimorfismo faltak, ezin dela birkonbinazio bidez leheneratu suposatuz. Premisa honetan oinarrituta, eskualde diferentzialaren (RD) eta TbD1 (Mtb 1. eskualde espezifikoko ezabapen genomikoaren) gertaera jarraiak proposatu dira MTBC eboluzioaren markatzaile molekular gisa2,5,11. Genomika konparatiboaren eta genoma osoaren sekuentziazioaren (WGS) lanak gizakiei egokitutako kideak bederatzi leinutan banatzea onartzen du (Mycobacterium tuberculosis L1etik L4ra, L7ra eta L8ra; eta Mycobacterium africanum L5, L6 eta L9), L2tik L4ra leinuek TbD1 eskualdea ezabatzen dute2,11,12,13. Gainera, animaliei egokitutako kideek arbaso komun bat partekatzea proposatzen da, eta hori RD7, RD8, RD9 eta RD102, 5 eta 14 klado espezifikoen ezabapenek definitzen dute.
Geneen transferentzia horizontala (HGT) eta birkonbinazio gertaerak arrarotzat hartzen dira eta MTBCren arbasoetan gertatzen dira, MTBC kide osoaren historia desberdina izan beharrean15,16,17. Hughes eta kolaboratzaileek (2002) eta Gutacker eta kolaboratzaileek (2006) egindako bi txosten goiztiarrek iradoki zuten birkonbinazio gertaerek M. tuberculosis anduietan lokus espezifikoak markatzen dituzten polimorfismoak moldatzen lagun dezaketela18,19. MTBCn birkonbinazio falta agerikoaren arrazoiak hauek dira: (1) HGTren prozesu mekanikoa eta gaitasun-galera; (2) HGT gertaeren arraroa; (3) ez dago birkonbinazio gertaeren aukerarik MTBC nitxoan14,17. Duela gutxi, MTBC 20 anduira eta Mycobacterium bovis 21era aplikatutako genoma osoko sekuentziazio (WGS) ikerketa batzuek birkonbinazioaren frogak eman dituzte, lehenak MTBC anduiek askotan DNA zati txikiak trukatzen dituztela erakusten dutenak, baina nukleotidoen sekuentziaren aldakuntza mugatua dela eta, gertaera horiek oraindik ez dira nabaritzen.
Mycobacterium bovis abeltzaintzatik (batez ere behietatik) gehien berreskuratzen den MTBC kidea da, nahiz eta askatasunean eta hesietan bizi diren animalia basatietatik ere isolatu daitekeen4,22,23,24. M. bovis bost konplexu klonal nagusitan eboluzionatu zuen [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) eta Africa 2 (Af2)], spoligotyping profilean, gene espezifikoetan dauden ezabatze espezifikoetan eta nukleotido bakarreko polimorfismoen (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 arabera. Konplexu klonal hauek Mycobacterium bovis populazioaren egitura anitza eta eskualde geografikoekin duen lotura erakusten dute. Gainera, Zimpel eta bere kolaboratzaileek (2020) egindako WGS lanak Mycobacterium bovis-en SNP-an oinarritutako filogenia bat diseinatu zuen, 1.900 genoma baino gehiagorekin, gutxienez lau leinu desberdin daudela adieraziz (Lb1etik Lb1era eta Lb4ra izendatuak), eta ez dira guztiz koherenteak aurretik definitutako konplexu klonalarekin, nahiz eta espezifikotasun geografikoa ere baieztatu daitekeen30. Egile hauek filogeniaren analisi diferentziala eta datazio molekularra egin zituzten, baina ez zuten birkonbinaziorik aztertu30.
Aurreko lanek hainbat teknika molekular erabiliz, hala nola spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) eta azken SNP tiping-ek, dibertsitate genetiko maila jakin bat agerian utzi zuten M. bovis anduien artean 31,32,33, 34,35. Aldakortasun genetikoaren bereizketa tresna garrantzitsua bihurtu da gaixotasunen epidemiologiaren azterketan, patogenesia, birulentzia eta gaixotasunen transmisioa sakon ulertzeko lagungarria baita. WGS metodoaren sorrerak aukera ematen du Mycobacterium bovis genomak ostalari eta eszenatoki epidemiologiko desberdinetara egokitzeko eta iraunkortasun prozesuan ezarritako eboluzio-faktoreak agerian uzteko.
Lan honetan, Mycoplasma bovis datu-multzo ezberdinen (n=70) analisi genomiko konparatiboa erabili dugu, konplexu klonal desberdinetako isolatuak barne, Mycoplasma bovis-en eboluzio-prozesuari buruzko informazioa lortzeko, batez ere harreman filogenetikoak eta birkonbinazio gertaerak ebazteko. Analisi honen osagarri gisa, Portugalgo tuberkulosi-eremu anitzeko ondo karakterizatu batetik lortutako M. bovis isolatuen azpi-datu multzo bat (n = 42) aztertu zen gehiago, identitate eza ondorioztatzeko. Zentzumen-nukleotidoen (dN) eta sinonimo-nukleotidoen (dS) ordezkapenen arteko erlazio erlatiboaren eta literaturan aipatutako genoma espezifikoen eboluzio-ekarpena ere bai; hauek MTBC arbasoek HGT bidez lortutakoak dira, eta 3R (DNAren konponketa, erreplikazioa eta birkonbinazioa) sistemaren gene-osagaiak kodetzen dituzte. HGT bidez lortutako geneak aukeratu ditugu, antzinako polimorfismoak ordezka ditzaketelako, beraz, espero da sinonimo-aldaketa proportzio handiagoa izan dezaketela. 3R sisteman sartutako geneak hautatu ziren M. tuberculosis anduiei buruzko aurreko lanek gene hauetan eragina duten hautespen negatibo/purifikazio orokorrak adierazten zituztelako, eta eboluzioan paper garrantzitsua izan dezaketelako 39. Lan honen beste helburu bat berrantolaketa gertaeren existentzia ondorioztatzea da. Horregatik, Portugalgo gure datu-multzoak 2. klon konplexu europarraren eta klon konplexua esleitu ez duten anduien genomak bakarrik dituela kontuan hartuta, publikoki eskuragarri dauden genoma datuak sartzea erabaki genuen, azkenean klon konplexu guztien ordezkari bat lortzeko, eta emaitzen sendotasuna eta zabalera hobetzeko.
Portugalgo tuberkulosi endemiko anitzeko eszenatokitik lortutako 42 Mycoplasma bovis genoma berri sekuentziatu (xehetasunak behean), aurretik ikuspegi epidemiologiko batetik karakterizatuak36, dira lan honen erdigunea. Portugalgo datu-multzoak Europako 2 klon konplexuen eta konplexu izendaturik gabeko anduien ordezkariak baino ez dituela kontuan hartuta, publikoki eskuragarri dauden genoma osoko sekuentziazio datuak gehitu dira M. bovis klon konplexuen ordezkari guztiak barne hartzen dituen datu-multzoa zabaltzeko. Hori dela eta, hiru genoma osoko sekuentziazio datu-iturri erabili dira lan honetan: genoma osoa/zirriborroaren muntaketa, NCBI-n (Bioteknologia Informaziorako Zentro Nazionala) gordetako 10 eskafold gehienez (n = 15 isolatu); SRA-n gordetakoak (sekuentzia irakurtzeko artxiboko Illumina fastq fitxategiak) M. bovis klonen dibertsitate konplexua adierazten du (n = 12 isolatu)30; eta Portugalgo 42 genoma berri sekuentziatu. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) NCBI bilaketatik kanpo utzi zen. M. bovis AF2122/97 erabili ohi da erreferentziazko genoma gisa datu-multzoan sartzeko. African 1 klonazio-konplexuak ordezkatutako genoma-sekuentzia osoaren eskuragarritasun publikoa ez dagoenez, eta Af2 eta Eu1-en andui adierazgarrietatik datozen genoma kopuru txikia dagoenez, SRA-k emandako jatorrizko sekuentziazio-datuak erabili ziren kasu hauetan. Zimpel eta bere kolaboratzaileen lanak (2020) aipatutako klonazio-konplexuko genoma identifikatzen lagundu zuen eta Mycobacterium bovis hautatzen lagundu zuen datu-multzoan sartzeko. Eu3-rentzat, genoma mota bakarra deskribatzen da (Branger et al., 2020), beraz, sartzen dugun genoma Eu3 konplexuaren ordezkari bereizi bat da.
Mundu mailan, datu multzo honek 70 M. bovis behi barne hartzen ditu, 8 ostalari espezietatik isolatuta, 12 herrialdetan banatuta 1985etik 2016ra. 36 espezie Eu2 gisa izendatu dira, 7 espezie Eu1 dira, espezie 1 Eu3 da, 3 espezie Af1 dira, 4 espezie Af2 dira eta 19 ez dira inongo konplexu klonalen ondorioztagarriak (xehetasunak behean). Ikerketa honetan erabilitako Mycobacterium bovis-en informazio zehatza (eskuratze zenbakia barne) 1. taulan eta 1. taula osagarrian ageri da.
Portugalgo animalien tuberkulosi gune beroetatik lortutako eta 12 urte baino gehiagoz banatutako Mycobacterium bovis-en 42 genoma oso sekuentziatu berri dira ikerketa honen erdigunea, faunaren eta abeltzaintzaren arteko gaixotasun sistema potentzialak aldizka kontrolatu baitira 31,36 (1. irudi osagarria). Ondorengo prozeduren arabera, andui hauek behietatik (n = 14), orein gorrietatik (n = 16) eta basurdeetatik (n = 12) isolatu ziren 2003tik 2015era: bildu eta maneiatu animaliak gomendatutako protokolo jarraibideen arabera. Ehunen laginak OIEren Lurreko Animalien Eskuliburuan daude eta Stonebrink eta Löwenstein-Jensen piruvato medio solidoan eta medio likidoan txertatzen dira. Kultiboak 37 °C-tan inkubatzen dira eta hazkundea astean behin egiaztatzen da gutxienez 12 astez. Koloniak zuzenean glizerol disoluzio batean gordetzen dira -80ºC-tan. Mycobacterium hazkuntza-ingurune selektiboan (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), jatorrizko artxibatutako laginak in vitro pasabide bakar batetik pasa ziren WGS programaren DNA lortzeko. Horretarako, izoztutako kultura-soluzioa % 5eko sodio piruvatoarekin eta % 10eko ADSarekin aberastu zen (50 g albumina, 20 g glukosa, 8,5 g sodio kloruro 1 L uretan) Middlebrook 7H9-n 37 °C-tan. Hazkuntza-prozesua 4 aste igaro ondoren, ingurunea berritu zen eta kultura aldizka kontrolatu zen hazkundea ikusi arte. Zelulak zentrifugazio bidez bildu ziren, pelleta 500 µL fosfato-bufferdun gatz-soluzioan (PBS) berriro eseki zen, 99 °C-tan berotu zen 30 minutuz, zentrifugatu zen eta gainnadantea -20 °C-tan gorde zen WGS arte. Prozedura guztiak 3. mailako biosegurtasun-instalazioetan egiten dira.
WGS mutur parekatuen genoma liburutegia DNA lagin bakoitzaren indize bakarra erabiliz prestatzen da, eta Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 lagin) eta HiSeq (2 × 150 pb) (bi isolatu) teknologiak erabiltzen ditu (Eurofins Genomics, Alemania) sekuentziaziorako. Fabrikatzailearen argibideen arabera, erabili Illumina Genome Analyzer mutur bikoitzeko modulu eranskinarekin DNA genomikoa sekuentziatzeko, eta erabili Illumina-ren Nextera XT DNA Library Prep Kit liburutegia eraikitzeko.
SRAtik berreskuratutako datuak (n = 12) kontuan hartuta, klon konplexuaren identifikazioa dagokion argitalpenaren metadatu gisa erabil daiteke 30, 41, 43. Genoma osoa kontuan hartuta, Mycobacterium bovis AF2122/97 eta Mycobacterium bovis 3601 izan ezik, hauek Eu1 eta Eu3 klon konplexuko kide aitortuak baitira 25, 29, hurrenez hurren, Mycobacterium tuberculosis H37Rv-ren genoma osoaren berdina da (NCBI sarbide zenbakia NC_000962.3). Genomaren lerrokatzea MAFFT (aminoazidoen edo nukleotido sekuentzien lerrokatze anitzeko programa, 7.458 bertsioa) eta -addfragments48 parametroa erabiliz egiten da. Ondoren, klon konplexu desberdinen gabezia eta/edo SNP ezaugarrien presentzia bilatu.
Sekuentziazio berriko Mycobacterium bovis-ek (n = 42) eta muntatutako genomaren zirriborroaren jatorrizko irakurketek (n = 3) konplexua Mycobacterium tuberculosis H37Rv erreferentziazko genomarekin lerrokatzen dute vSNP kanalizazioaren bidez eta klon desberdinen ezabapenaren eta/edo SNP ezaugarrien presentziaren bidez. Bilaketa bat egin zen.
Bildu informazioa ezaugarrien faltatik eta/edo SNP eta spoligotyping profiletatik datu genomikoak dagokion konplexu klonalari esleitzeko. Lau zirriborro muntaketetarako, spoligotyping profila ezin da ondorioztatu, beraz, "konplexutasunik gabeko" taldean sartzen dira.
Lan honek jarraitzen duen bioinformatika-lan-fluxua de novo muntaketatik eta erreferentzia-estrategia batera mapatzetik hasten da, birkonbinazio-gertaerak eta genomaren polimorfismo espezifikoak aztertzeko helburuarekin. 1. irudiak jarraitutako urratsen fluxu-diagrama bat eskaintzen du. Birkonbinazio-analisirako, genoma guztiak erabiltzen dira inferentzien eta lotutako adierazleen sendotasuna handitzeko.
Genomaren adostasun-sekuentzien sorreran akatsak murrizteko, lehenik de novo muntaketa lortu genuen, eta ondoren nukleo anizkoitzen lerrokatzeak lortu genituen. Unicycler pipelinea une honetan https://github.com/rrwick/Unicycler49 helbidean dago eskuragarri eta 54 genoma sekuentziaturen de novo muntaketa egiteko erabiltzen da (42 sekuentziatu berri eta SRAtik berreskuratutako 12 fastq fitxategi). Laburbilduz, hutsetik muntatu aurretik, irakurketa-kalitatearen analisia FastQC 0.11.7 bertsioan egin zen (https://github.com/s-andrews/FastQC), eta Trimmomatic 0.36 bertsioan ("moztu egokitzaileak eta beste argiztapen-sekuentzia espezifiko batzuk irakurketetatik" eta "Moztu oinarriak irakurketaren amaieratik, 20ko atalase-kalitatetik beherakoa bada" aukerak aplikatzen badira) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Ondoren, SPAdes optimizer49 erabili zen genomaren muntaketarako, eta Pilon 1.1851 bertsioa muntaketa osteko optimizaziorako. Muntaketa okerra saihesteko zubi-modu kontserbadorea hautatu zen, eta k-mer tamaina irakurritako luzeraren % 20 eta % 95 artean bilatu eta hautatu zen. Jarraitu SPAdes jarraibideei eta kontuan hartu irakurketa-tamaina, ezabatu 300 bp baino txikiagoak diren kontigak eta ezarri 52ko 20ko irakurketa-sakonera estaldura-muga. De novo muntaketa-estrategian, ez ziren kendu eskualde genomikoak, hala nola prolina-glutamato (PE) eta prolina-prolina glutamato (PPE) paralogo oso errepikakorrak.
De novo muntaketaren kalitatea QUAST hodiaren bidez ebaluatzen da (http://quast.sourceforge.net/quast.html), eta horrek kontigaren berritzea eta M. bovis AF2122/97 erreferentziazko genomaren (NCBI sarbide zenbakia LT708304.1) mapatzea errazten du (ikus 1. taula osagarria kalitate parametroetarako).
vSNP pipelinearen laguntzaz (https://github.com/USDA-VS/vSNP), Illumina sekuentziaziotik sekuentziatu berri den M. bovis-en FASTQ fitxategia M. bovis AF2122/97 erreferentziazko genomarekin (LT708304.1) alderatzen da. Genome Analysis Toolkit-en (GATK) 53, 54, 55 gomendio egokien arabera, iragazki-parametro estandarrak edo aldaera-masaren puntuazioak aplikatu behar dira berriro kalibratzeko. Emaitzak SAMtools-en masa-puntuazio baxuena erabiliz iragazten dira, 150, eta AC = 2. Kraken ere erabili (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) irakurketak egiaztatzeko eta kutsadura baztertzeko. Gure lanean sekuentzia-estrategietara mapatzeko erabilitako vSNP pipelineak SNP eta jomuga definituen serie bat aztertzen du, eta infekzio mistoen eszenarioak ere baztertzen ditu. Irakurritako genomaren estaldura % 99 baino hobea da (1. taula osagarria).
Mapeatze-erroreak eta SNP okerrak saihesteko, iragazi aldaera bat kasu hauetan: (1) 20 irakurketa baino gutxiagok onartzen badute, (2) 0,9 baino gutxiagoko maiztasunarekin aurkitzen bada, (3) gutxienez andui batean badago, baina gutxienez beste andui batean hutsuneak baditu. Integrated genomics viewer (IGV) 2.4.19 bertsioa (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 erabili zen SNPak eta mapatze- edo lerrokatze-arazoak dituzten posizioak bisualki egiaztatzeko. Prolina-glutamato (PE) eta prolina-prolina glutamato (PPE) geneak oso bikoiztuta daudenez eta gene anitzeko familia baten parte direnez, erraz gaizki ulertzen ditu Illumina sekuentziazioak eta mapatze okerrak, beraz, nahiago dira. Mikobakterioen bioinformatika-lan-fluxuak tuberkulosi konplexuko kideak kendu zituen sekuentziara mapatzeko estrategia erabiltzean SNPak berresteko. Hori dela eta, PE/PPE geneak eta indelak analisietatik iragazi genituen.
Bovilist-en arabera (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), SNP guztiak kategoria funtzionaletan banatzen dira. SnpEff pipeline-a (https://pcingola.github.io/SnpEff/) erabiltzen da SNP-en ondorioak (sinonimoak edo ez-sinonimoak) ondorioztatzeko. Mycobacterium bovis AF2122/97 genomaren datu-base berri bat sortu da (LT708304.1).
Muin-genomaren lerrokatze anizkoitza Parsnp v1.2 erabiliz egin zen, gaur egun https://github.com/marbl/parsnp57 helbidean eskuragarri, 69 genoma/zirriborro-multzo oso erabiliz (-c aukerarekin) eta M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) erreferentzia gisa erabili zen. Lau muin-genomaren lerrokatze anizkoitz egin ziren: Eu2 klonazio-konplexuko kideak bakarrik (n = 37), Europako klonazio-konplexuko kide guztiak barne (n = 44), Europako eta Afrikako klonazio-konplexuaren lotura-puntua barne (n = 51), eta ikerketa honetan Mycobacterium bovis guztiak barne (n = 70).
Parsnp-ek sortutako nukleo-lerrokatzea erabiltzen da CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 erabiliz RAxML erabiliz, eta 1000 erreplikazio gidatu egiteko.
Hiru algoritmo eta bioinformatika tresna desberdin erabiltzen dira birkonbinazio gertaeren presentzia paraleloan egiaztatzeko: SplitsTree4 softwarea, Gubbins (nukleotido sekuentzietan birkonbinazioaren bidezko lerro inpartziala) pipelinea eta RDP4 (birkonbinazio detekzio programa, 4.101 beta bertsioa) softwarea.
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59-n inplementatutako zatiketa-deskonposizio metodoa erabiltzen da errorik gabeko sare filogenetikoa kalkulatzeko, Phi testa erabiliz egiaztapen estatistikorako, eta esangura-atalasea p = 0,05 da. Parsnp-ren nukleo anitzeko lerrokatze-analisia erabiltzen da sarrera gisa, eta zatiketa-deskonposizioa sare-estandar gisa gauzatzen da.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) parametro lehenetsiekin exekutatzen da, birkonbinazioak Mycobacterium bovis-en duen eragina ebaluatzeko beste modu bat bezala. Pipelinean inplementatutako algoritmoak klon lerro garrantzitsua berreraikitzen du. Gure datu multzoaren genoma/zirriborro muntaketa osoa eta erreferentziazko genoma (behi bobidoa AF2122/97, LT708304.1) elkarri lotuta daude; eta SNParen posizioa eskaneatzen dute zuhaitzaren adar bakoitzean birkonbinazio gertaera adierazten duen SNP multzoa detektatzeko. Adarraren zeroa Demagun ez dagoela birkonbinazio gertaerarik, hau da, adarrean gertatzen diren SNPak uniformeki banatuta egon behar direla. Parsnp-eko nukleo anizkoitzaren lerrokadura eta RAxML-eko puntuazio onena lortu duen ML zuhaitza erabiltzen dira sarrera fitxategi gisa.
Azkenik, Gubbins-en kanalizazioak iradokitako berrantolaketa gertaera berresteko, RDP467-n inplementatutako sei algoritmoak (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 eta SiScan66) Parsnp-ren nukleo anizkoitzaren lerrokatzeari aplikatu zaizkio lehenetsitako ezarpenekin. Zehaztu dugu RDP4-n inplementatutako gutxienez hiru algoritmok birkonbinazio gertaera bakoitza egiaztatzeko seinale garrantzitsu bat erakutsi behar dutela etengabe.
Kontuan hartuta bai Gubbinsek bai RDP softwareak birkonbinazio-seinaleak bilatzen dituztela 500 bp-ko leiho batean lerrokadura anizkoitzak egiaztatuz, eta PE/PPE geneak de novo muntaketan sartzeak aurkitutako birkonbinazio-seinaleetan eraginik ez duela baieztatuz, analisi gehiago egiten da homolinealtasun bidez. Birkonbinazio-gertaera identifikatzen duen genearen ingurua egiaztatuz. Genoma osoa erabiltzen duen mapa sinlineala MAUVE-multi-genome lerrokatzea (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) erabiliz eraiki zen, genomaren translokazio edo inbertsio lokalak baztertzeko. Horrez gain, genoma osoa erabili zen aminoazidoen sekuentziaren homolinealtasun-analisia egiteko SyntTax web zerbitzariaren bidez (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Portugalgo ostalari anitzeko tuberkulosi sistematik lortutako genomaren datu-multzoaren analisi sakonago bat literaturan aipatutako geneen polimorfismoa egiaztatzea da. Gene hauek 37,38 dira eta 3R kodetzen duen genea MTBC arbasoek HGT (DNA konponketa, erreplikazioa eta birkonbinazioa) sistemaren osagaien bidez lortutakoa 39. Erabili ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) eta DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) geneen dibertsitatea eta nukleotidoen dibertsitatea (π) eta Tajimaren D neutro proba parametroaren sarrera kalkulatzeko.
69 Mycoplasma bovis isolatu eta erreferentzia genometan oinarritutako gehienezko probabilitateko (ML) zuhaitz filogenetiko bat lortu zen (2A irudia). Gene bakarreko zuhaitzekin edo locus anitzeko zuhaitzekin alderatuta, estrategia honek genoma osoaren aldakortasuna jasotzen ez duten eta, beraz, espezieen artean bereizteko gaitasun txikiagoa duten zuhaitz indartsuagoak sortzea ahalbidetzen du 68,69. ML zuhaitzaren egitura topologikoa normalean klonen sailkapen konplexuarekin bat dator. Eu2-ren genoma adar batean multzokatuta dago, eta Af1-ren genoma ere elkarrekin multzokatuta dago (2A irudia). Emaitza Mycobacterium bovis-en eboluzio-harreman ezagunarekin ere bat dator, hau da, alde handia dago Eu1 kidearen eta gainerako konplexu eta genoma klonal guztiek osatzen duten taldearen artean, baina 30. konplexu klonala ez da zehaztu. Konplexu klonalaren eta zuhaitz filogenetikoan behatutako erlazioaren arteko inkoherentzia txikia azal daiteke konplexu klonal hori eskualde genomiko espezifikoetan oinarrituta deskribatzen delako, eta zuhaitz filogenetikoa, berriz, genoma osoa ordezkatzen duten genoma nagusien lerrokadura anitzetan oinarritzen delako.
Probabilitate maximoko zuhaitz filogenetikoa (GTR) Mycobacterium bovis genomaren muinaren lerrokaduran oinarrituta eraikitzen da, birkonbinazio gunea kendu aurretik (A) eta ondoren (B). Adarren koloreek Mycobacterium bovis klon konplexua adierazten dute: Europa 1 morea da, Europa 2 gorria da, Europa 3 urdina da, Afrika 1 laranja da eta Afrika 2 berdea da. Zuhaitzari sustraiak jarri eta eskalara marraztuta daude, eta adarren luzera neurtzen da gune bakoitzaren ordezko gisa.
Mycobacterium tuberculosis konplexua klonikoki eboluzionatu dela deskribatzen da, eta urteetan zehar pilatutako ebidentzia gehienek ideia hau babesten dute: etengabeko HGT eta birkonbinazio gertaerak ez direla MTBC-ren detektagarri den mailan gertatuko15,17,18.
Aurreko lanek erakutsi dute MTBC anduien arteko birkonbinazio mugatua egon daitekeela20,21, beste batzuek, berriz, ez dute lortu neur daitezkeen birkonbinazio gertaerak identifikatzea70,71. Berriro eztabaidatu gai hau Mycobacterium bovis-en arreta jarriz, aurreko lanetik desberdina baita, Mycobacterium tuberculosis bakarrik kontuan hartzen zuena 70,71; edo kontuan hartu MTBC osotasunean, ia M. bovis bat ere ez duelarik ordezkatzen 20; edo kontuan hartu behi-frakzio murriztaileak soilik. Mikobakterioen datu-multzoan, lan honetan, guztira 70 andui daude, konplexu kloniko guztiak ordezkatuz, birkonbinazioa bahetzeko erabiltzen direnak. Datu-multzoa lau maila metatutan eskalatzen da: (1) Eu2 kideak, (2) Europako klon konplexuko kide guztiak (hau da, Europa), (3) Europako eta Afrikako klon konplexua (Eu + Af) eta (4) datu-bilduma osoak (aurretik deskribatutako klonazio konplexuetan sartuta ez dauden genomak barne).
Hipotesi hau gehiago aztertzeko, deskonposizio-sare zatitu bat egin zen genomen arteko birkonbinazio gertaeren eza ebaluatzeko, metodo honek banakoen arteko arbasoen arteko harremana bistaratu eta seinale filogenetiko kontrajarriak erakutsi baititzake. Analisian parte hartu zuten lau datu-multzoek sarean begiztak zeudela baieztatu zuten (hau da, zuhaitz bakar batean bat egiten ez duten eremuak), baina Phi probak ez du euskarri estatistikorik (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; datu-multzo osoa p = 0,2451), eta horrek berrantolaketa gertaeren existentziaren ebidentzia eskasa eskaintzen du (3A-D irudia).
Europan 2 genoma (n = 37) (A), Europako genoma (n = 44) (B), Europako eta Afrikako genoma (n = 51) (C) eta datu multzo osoa (n = 70) (D).
Analisi honen ondoren, eta sare guztietako behaketa ziklikoak kontuan hartuta, Gubbins-en hodibidean inplementatutako berreraikuntza-algoritmoa aplikatu zen klon-lerroa berreraikitzeko eta birkonbinazioak M. bovis-en genoman duen eraginaren estimazioa osatzeko. Ondorioztatu birkonbinazio-gertaeren kopuru metatua, gehienak adarraren amaieran gertatu zirelarik (hau da, genoma bakarrean) (2. taula). Adierazle hauek datu-multzo osoaren koherentzia erakusten dute eta birkonbinazio-gertaeren maiztasuna mutazioena baino 200 eta 300 aldiz handiagoa dela adierazten dute. Behin adarreko birkonbinazio-tasa erlatiboak eta puntu-mutazioak adierazten dituen rho/theta parametroa 0,0037 eta 0,0056 artean dagoela dirudienean (3. taula). Duela gutxi, 38 M. bovis anduiaren argitaratutako lanak rho/theta balio handiagoa erakutsi zuen (rho/theta = 0.1) datu-multzo honetan lortutakoa baino, baina Patané eta lankideen lanak erreferentzian oinarritutako muntaketa erabili zuen birkonbinazio-parametroak ondorioztatzeko. Muntaketa-prozeduragatiko prozedura-xehetasun bat lotu da adarraren amaieran ustezko birkonbinazio-gertaeren ugaritasunarekin.
Ondoren, r/m parametroak birkonbinazioaren eta mutazioen sarreraren dibertsitate-erlazioa adierazten du, eta bere batez besteko balioa 0,025 eta 0,037 artean dago, eta horrek adierazten du mutazioekin alderatuta, birkonbinazioak eragin orokorra txikiagoa duela M. bovis-en dibertsitate genetikoan (3. taula). Konparazio zabalagoa egiteko, antzeko metodo bat erabili zen 23 genomez osatutako MTBC datu-multzoaren r/m parametroa kalkulatzeko, 0,48620ko batez besteko balioa erakutsiz, eta Patané eta lankideen 38 M. bovis datu-multzoarentzat, batez besteko balioa 0,98 dela frogatu zen. Lehenengo ikerketan, M. bovis-en lanean sartutako 23 genometatik bi bakarrik sartu ziren (M. bovis BCG eta erreferentziazko anduia), beraz, lortutako balioa alboratua egon daiteke M. tuberculosis genomaren gehiegizko adierazpenagatik. Bigarren txostenean, aztertutako Mycobacterium bovis populazioak batez ere Estatu Batuetatik eta abeltzaintzako ostalarietatik berreskuratu ziren. Aitzitik, gure datu-multzoan, kokapen geografiko eta ostalari-espezie gehiago ordezkatzen dira, eta populazio-ezaugarri genetiko desberdinak dituzten konplexu klonal desberdinetan taldekatutako genomak ere erabiltzen dira, horrela populazioaren ezagutza sakonago eta zabalagoa lortuz. Gure datu-multzoarekin lortutako r/m batez besteko balioaren aldea bat dator birkonbinazio-maila espezie taxonomiko berari esleitutako leinuen artean asko aldatzen den kontzeptuarekin, beraz, emaitza hauek adierazten dute M. bovis klon-konplexuak birkonbinazio-desberdintasunak erakuts ditzakeela. Eragina Didelot & Maiden-ek72 iradokitzen dutena da. Hala ere, datu-multzo hau nabarmen zabaltzeak M. bovis genoma kopuru handiagoa sartuz puntu hau gehiago argitzea ahalbidetuko du. Bai r/m bai rho/theta parametroek aldakortasuna erakusten dute adarren artean, eta emaitza hau bat dator beste bakterio-espezie batzuei buruzko txostenekin72,73.
Azkenik, Gubbins-en kanalizazioak identifikatutako berrantolaketa gertaerak berresteko, sei algoritmo desberdin erabili ziren RDP4 softwarean, hainbat nukleo-konparazio anitzeko proba independenteak egiteko. Mundu mailan, Gubbins-ek identifikatutako gertaeren erdia baino gutxiago baieztatu zituen RDP4-k (4. eta 5. taulak). Datu multzo osoa kontuan hartuta, hiru birkonbinazio gertaera baieztatu ziren, bi barne-nodoei buruzkoak eta bestea adar terminal bateko genoma bakar bati buruzkoa, zeinetarako konplexu klonalak ezin izan ziren esleitu (4. eta 5. taulak). Adarraren terminaletako gertaeren identifikazioak adieraz dezake birkonbinazioa oraindik martxan dagoela M. bovis andui garaikideetan edo emaitza gaizki kokatuta dagoela70. Birkonbinazio eskualde hipotetiko honetan, posizioen % 20 inguruk nukleotido definitu gabeak (N) dituzte, eta horrek birkonbinazio seinaleari eragiten dio (2. irudi osagarria). Gainera, eskualde honek rrs geneari eragiten dio, oso kontserbatuta egotea espero den 16S erribosoma RNA kodetzen duena, beraz, ustezko birkonbinazio seinale hau sekuentziazio-erroreen edo deslerrokatzeen ondorioa izan daiteke. Ondoren, Mb0003 eta Mycobacterium bovis AF2122/97 arteko genoma osoaren lerrokatzea egin zen, eta nukleotido eta SNP definitu gabeen existentzia baieztatu zen, beraz, lerrokatze okerraren ondoriozko arazo posibleak ez ziren lan honetan inplementatutako informazio biologikoaren ondorio. Programa ikasi ondoren agertu ziren.
Ez zen hutsunerik edo nukleotido zehaztugaberik aurkitu barneko nodoen birkonbinazio-eskualdeetan (4. eta 5. irudiak). Gertaera hauei dagokienez, batek Eu2 genoma bakarrik dauka eta pks12 geneari eragiten dio, poliketido sintasa posible bat kodetzen duena; bestea, berriz, Eu1 genoman erregistratuta dago eta nitrato erreduktasa posible bat kodetzen duen narX geneari eragiten dio (4. taula). Oro har, birkonbinazio-analisiak erakusten du euskarri estatistikoa duten birkonbinazio-zati kopuru mugatua dagoela, eta ondorioztatutako adierazleek adierazten dute birkonbinazioak eragin txikia duela M. bovis leinuan. Birkonbinazio-seinalea baxua izatea espero da, baina garrantzitsua da benetako eboluzio-seinalea atzeko plano-zaratatik bereiztea, eta hori zeregin zaila da. Erreferentzian oinarritutako muntaketa- eta desadostasun-arazoek 70, 71 eragindako zarata-seinalea murrizteko, genoma osoa izan ezik, gainerako guztiak hutsetik muntatu ziren, eta muntaketa-kalitatea QUAST hodi-analisi bidez egiaztatu eta bermatu zen (1. taula osagarria). Horrez gain, hainbat analisi osagarri egin ziren ikerketa orokorraren sendotasuna eta zehaztasuna bermatzeko. Beraz, narX eta pks12 geneen sekuentziazio kalitatea Mycobacterium bovis AF2122/97-ren aurkako irakurketa-mapak eginez ebaluatu zen. Errekonbinazio eskualdean gomendatutako SNP posizioa metodoaren atalean aipatutako irizpideak aplikatuz berretsi zen (gutxienez 20 irakurketa eta 0,9ko aldaketa-maiztasuna). NarX genearen polimorfismoa guztiz berretsi zen bi genometan (Mb1792361 eta Mb7240415; % 2,3) eta pks12 genomaren genometan: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 eta Mb12 geneak. Hala ere, Mb2043 genomarentzat, zortzi posizioetatik seik ez dute irakurketa-sakonera irizpidea betetzen, SNP gehienez 17 irakurketak onartzen baitu, hau da, ezarritako 20ko muga-balioaren azpitik. Beraz, sei genomen (% 8,6) birkonbinazioa baieztatu daiteke genoma-gune honetan (4. eta 5. irudiak).
Mycobacterium bovis datu-multzoaren birkonbinazio-eskualdearen lerrokaduraren bistaratze zehatzak nitrato-erreduktasa posible bat kodetzen duen narX genean eragiten du. Ez da hutsunerik edo nukleotido definitu gaberik aurkitu barne-nodoen birkonbinazio-eskualdean. Gertaera zehatz hau Eu1 genoman erregistratuta dago. NarX genearen sekuentziazioaren kalitatea ebaluatu zen Mycobacterium bovis AF2122/97-ren irakurketak irudikatuz. Berretsi gomendatutako SNP kokapena birkonbinazio-eremuan metodoaren atalean aipatutako irizpideak aplikatuz (gutxienez 20 irakurketa eta 0,9ko aldaketa-maiztasuna). NarX genearen polimorfismoa guztiz baieztatu zen Mb1792361 eta Mb7240415-en genometan (% 2,3).
pks12 geneari eragiten dion Mycoplasma bovis datu-multzoaren birkonbinazio-eskualdearen lerrokaduraren bistaratze zehatza. Ez da hutsunerik edo nukleotido definitu gaberik aurkitu barne-nodoen birkonbinazio-eskualdean. Poliketido sintasa posiblea kodetzen duen pks12 geneari eragiten dion gertaerari dagokionez, Eu2 genoma bakarrik dauka. pks12-ren sekuentziazio-kalitatea Mycobacterium bovis AF2122/97-ren irakurketa-maparen bidez ebaluatu zen. Berretsi gomendatutako SNP kokapena birkonbinazio-eremuan metodoaren atalean aipatutako irizpideak aplikatuz (gutxienez 20 irakurketa eta 0,9ko aldaketa-maiztasuna). Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 eta Mb1960 genomen polimorfismoak guztiz baieztatu dira.
PE eta PPE geneek Illumina sekuentziazioak eta mapatze okerrak erraz irakurtzen dituzten eskualde errepikakorrak dituzte, beraz, normalean M. tuberculosis kideen bioinformatika-fluxutik ezabatzen dira sekuentziarako mapatze estrategia erabiltzen denean bakarrik. Lan honetan aplikatutako birkonbinazio gertaeren inferentzia de novo muntaketan oinarritzen da, PE/PPE iragazi gabe. Uste dugu SplitsTree, Gubbins pipeline eta RDP4 softwarearen bidez hiru metodo eta algoritmo osagarri desberdin inplementatuz, aplikatutako estrategiak sendoak direla errore-seinaleek eragindako berrantolatutako eskualdeak prozesatzeko eta iragazteko. Hala ere, PE/PPE geneak SNP klusterrak identifikatzeko Gubbins eta RDP4 softwarean duen interferentzia baztertzeko, eta, beraz, narX eta pks12 geneei eragiten dieten birkonbinazio eskualdeen identifikazioa baztertzeko, gene hauen auzoa aztertu zen (3-5 irudi osagarria). M. bovis AF2122/97 genean, narX genea narK2 eta Mb1764c-k bereizten dute, eta pks12, berriz, Mb2075c eta Mb2073c-k inguratzen dute (3-5 irudi osagarria). Genoma osoaren MAUVE sinline mapa erabiliz sortutako mapak geneen sekuentziaren kontserbazioari eta berrantolaketari buruzko informazioa ematen du, lau bloke kolinear erakutsiz, eta genomaren translokazio edo inbertsio zantzurik gabe. Gainera, aminoazidoen sekuentziarekin egindako osagarri-analisiak genoma oso guztietan homologia frogatu zuen, eta ez zen PE/PPErik aurkitu narX edo pks12-ren ondoko eskualdeetan. NarX-entzat, genoma batek (Mb0030) sinonimia puntuazio baxuagoa du, narX genea bi zati gisa identifikatu zelako (1891 eta 1890 zatiak). pks12 genearentzat, antzekotasunak direla eta, Mb0030 eta Mb003 geneek sinlinealtasun puntuazio baxuagoak erakutsi zituzten, pks12, berriz, bi eta hiru zatitan identifikatu zen, hurrenez hurren, proteinaren domeinu desberdinak ordezkatuz (3-5 irudi osagarria). Informazio hau kontuan hartuta, eta Gubbins eta RDP4 softwareak biek analisiak egiten dituztela, leihoan gehienez 500 bp-ko nukleo anizkoitzaren lerrokatzea egiaztatzen dutela, baieztatu dugu PE/PPE geneak ez duela narX eta pks12-ri eragiten dion birkonbinazio seinalean eragingo.
Datu-multzo honetan detektatutako birkonbinazio-seinaleak hondartzat har daitezkeen arren, egia da M. bovis-en birkonbinazioa ezin dela baztertu, beraz, analisi gehiagoren gaia izaten jarraitu beharko luke, non eszenatoki epidemiologiko desberdinetako genoma osoak Garrantzitsu gisa sekuentziatuko diren.
Birkonbinazioaren zuzenketaren aurretik eta ondoren lortutako ML zuhaitz filogenetikoak alderatzeak (2A eta B irudiak) ez zuen aldaketa esanguratsurik eragin ondorioztatutako erlazio filogenetikoan, eta M. bovis anduiak talde berean multzokatu ziren.
42 M. bovis sekuentziatu berri M. bovis AF2122/97-ren erreferentziazko genomarekin mapatu ondoren, 1816 posizio polimorfiko dituen SNP lerrokatze bat lortu zen. SNP gehienak (% 87,1) kodetze eskualdean daude, eta eragindako geneak Bovilist-en erakusten diren kategoria funtzionalen arabera sailkatzen dira (6A, B irudia). Kategoria funtzional bakoitzeko gene kopuru osoa kontuan hartuta, "lipidoen metabolismoa" kategoriako geneek SNP gehiago erakutsi zituzten, ondoren "zelula horma eta zelula prozesuak" eta "tarteko metabolismoa eta arnasketa", M. bovis eboluzioan daudela agerian utziz.
Portugalgo M. bovis datu-multzoaren analisi hierarkikoa (n = 42). Kategoria funtzional bakoitzerako erregistratutako SNP eta gene kaltetuen kopuru osoa (A). Funtzio-kategoriaren arabera erregistratutako aldaketa sinonimo eta ez-sinonimoen kopuru osoa (B).
Mundu mailan, dN/dS batez besteko ratioa 1,5 baino hobea da, eta horrek adierazten du eboluzio-presio globala arbasoen egoera kentzeko dela eta arazketa-aukera positibo (dibertsifikatua edo zuzendua) eta/edo lasaia den eszenatoki bat adierazten duela. "Birulentzia, desintoxikazioa, egokitzapena", "txertatze-sekuentziak eta fagoak" eta "proteina erregulatzaileak" kategorietan, SNPen bi heren baino gehiago ez dira sinonimoak (6B irudia).
Kategoria guztietan, SNP anitz dituzten geneak daude, eta horren ondorioz, batez besteko mutazio-tasa (hau da, gene bakoitzeko batez besteko SNP) 1 baino handiagoa da (6A irudia). Pks12-k (Mb2074c) 15 SNPrekin eta fas-ek (Mb2553c) 8 SNPrekin mutazio-balio handiagoak dituzte. Bi gene hauek gantz-azidoen metabolismoan parte hartzen dute. pks geneak poliketido sintasa (PKS) kodetzen du, hau da, mikobakterioen zelula-hormaren lipidoen biosintesian parte hartzen duen entzima multifuntzionala74,75. Gene honek mikoketidoen sintesian parte hartzen duen polipeptido multifuntzionala kodetzen du74,76. fas genea azido mikolikoaren sintesian parte hartzen du. Bi gene hauek zeregin garrantzitsua dute ostalariaren kontaktuan dagoen zelula-hormaren biosintesian.
Mycobacterium bovis-en eboluzioa gehiago aztertzeko, bi gene multzo espezifiko aztertu ziren. Aurretik sekuentzia-konposizioa eta metodo filogenetikoak erabiliz argitaratutako lanek MTBC arbasoek HGT bidez dibertsifikazioaren aurretik eskuratutako geneak identifikatu zituzten37,38. Gene hauek 2. taula osagarrian zerrendatzen dira. HGTrekin erlazionatuta egon daitezkeen 77 geneen SNP banaketa aztertu zen, eta 26 gune polimorfiko identifikatu ziren, eta kasu gehienetan (% 78) sinonimoak ez diren (NS) aldaketak eragin zituzten (2. taula osagarria). MTBC genomari buruzko aurreko lanek erakutsi zuten ustezko HGT eskualdeak NS SNP ratio handiagoa duela genomaren gainerakoarekin alderatuta. Uste bada birkonbinazio eskualde hauek MTBC arbasoek eskuratu zituztela, eta, beraz, antzinako polimorfismoak gehiegi ordezkatzen dituztela, orduan sinonimoen aldaketa proportzioa handiagoa izatea espero da, NS ordezkapenak hautespen negatiboaren bidez ezabatzea espero baita, aminoazidoen aldaketek proteinen funtzioa alda dezaketelako. Beraz, gure emaitzek adierazten dute ondorio funtzionalak HGT antzeko geneen ordezkapenetik etor daitezkeela, eta horrek islatzen du haien garrantzia dibertsitate genetiko egokitzaile baliotsuarentzat.
Analisi honekin batera, 3R (DNAren konponketa, erreplikazioa eta birkonbinazioa) sistemaren osagaiak kodetzen dituzten geneak sakon aztertu ziren, dos Vultos eta kolaboratzaileek (2008)39 aurretik argitaratutako zerrendaren arabera. DNA zati berdinen trukea ezin da zuzenean behatu, nahiz eta prozesu ohikoa izan daitekeen bakterio estuki erlazionatuak daudenean, datu-multzo honen kasuan bezala; gainera, prozesu hau DNA konpontzeko metodoen gakoa izan daiteke72, beraz, zeregina dute birkonbinazio homologoan. Guztira 54 genek banatutako 26 posizio polimorfiko identifikatu ziren (3. taula osagarria). Gene multzo honetan, NS aldaketek ondorioen % 65 inguru izan ziren, eta hori bat dator Mycobacterium tuberculosis anduiei buruzko aurreko txostenekin.
Argitaratze data: 2021eko urriaren 21a