Terima kasih kerana melawat Alam. Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan terhad untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan versi penyemak imbas yang lebih baharu (atau matikan mod keserasian dalam Internet Explorer). Pada masa yang sama, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Penjujukan genom telah menghidupkan semula bidang penyelidikan penyakit berjangkit, mendedahkan epidemiologi penyakit, patogenesis, interaksi hos-patogen, dan proses evolusi yang dikenakan ke atas patogen. Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) menganggap Mycobacterium bovis sebagai salah satu ahli penyesuaian haiwannya yang menyebabkan tuberkulosis (TB) dalam mamalia darat, dan merupakan model tipikal evolusi bakteria. Seperti ahli MTBC yang lain, Mycobacterium bovis diandaikan sebagai patogen yang diklon ketat, perlahan-lahan berkembang, dan jelas tiada tanda penggabungan semula atau pemindahan gen mendatar. Dalam kerja ini, kami menggunakan genomik perbandingan pada keseluruhan set data jujukan genom (WGS) yang terdiri daripada 70 lembu M. daripada silsilah yang berbeza (Eropah dan Afrika) untuk mendapatkan pandangan tentang kepelbagaian genetik lembu M. Kuasa evolusi. Tiga kaedah berbeza digunakan untuk menganggarkan tanda-tanda penyusunan semula. Di peringkat global, sebilangan kecil peristiwa penggabungan semula telah dikenal pasti dan disahkan oleh dua kaedah bebas dengan sokongan padu. Namun begitu, berbanding dengan mutasi, penggabungan semula mempunyai kesan yang lebih lemah terhadap kepelbagaian M. bovis (keseluruhan r/m = 0.037). Perbezaan r/m purata yang diperolehi dalam kompleks klon Mycobacterium bovis dalam set data kami adalah konsisten dengan konsep umum bahawa tahap penggabungan semula mungkin sangat berbeza antara keturunan yang diberikan kepada spesies taksonomi yang sama. Berdasarkan kerja ini, penggabungan semula dalam Mycobacterium bovis tidak boleh diketepikan, jadi ia harus menjadi subjek usaha selanjutnya dalam penyelidikan genomik perbandingan masa depan, di mana WGS set data besar daripada senario epidemiologi yang berbeza di seluruh dunia adalah penting. Analisis tambahan kemudiannya dilakukan pada set data Mycobacterium bovis yang lebih kecil (n = 42) daripada prevalens TB berbilang hos, dan lebih daripada 1,800 lokus telah dikenal pasti, di mana sekurang-kurangnya satu strain menunjukkan polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) . Kebanyakan (87.1%) terletak di rantau pengekodan, dan nisbah global perubahan tidak sinonim (dN/dS) bagi perubahan sinonim melebihi 1.5, menunjukkan bahawa pemilihan positif ialah daya evolusi penting yang dikenakan pada M. bovis. Perkadaran SNP yang lebih tinggi dikesan dalam gen yang kaya dengan kategori fungsi "metabolisme lipid", "dinding sel dan proses selular", dan "metabolisme dan pernafasan perantaraan", mendedahkan potensinya dalam biologi dan evolusi kepentingan Mycobacterium bovis. Melihat lebih dekat pada gen dalam nenek moyang MTBC yang terdedah kepada pemindahan gen mendatar dan dimasukkan ke dalam sistem 3R (pembaikan DNA, replikasi, dan penggabungan semula) mendedahkan nilai negatif purata global ujian neutral D Taijima, yang menunjukkan pengimbasan terpilih yang lalu Kesesakan baru-baru ini selepas pengembangan populasi masih merupakan faktor pendorong evolusi utama bagi patogen mandatori Mycobacterium patogen bovis.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) adalah salah satu taksa patogen bakteria yang paling berjaya dan kes biasa evolusi bakteria. Ahlinya menunjukkan identiti nukleotida yang sangat tinggi pada tahap genomik (> 99%)1,2 . Ekotaip MTBC yang berbeza boleh menyebabkan tuberkulosis (TB), yang merupakan penyakit granulomatosa berjangkit, dalam pelbagai spesies perumah daripada mamalia mikro kepada manusia3,4,5. Pada masa ini, kompleks itu termasuk manusia [M. Tuberkulosis (Mtb), Mycobacterium africanum] dan patogen yang disesuaikan dengan haiwan (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter , Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surikampanzee.") , "Bacillus.") M. canettii (juga dikenali sebagai "Nodobacter glabrata") Purata identiti nukleotida dengan mikobakteria yang disebutkan di atas ialah 98%, dan kerja genomik perbandingan telah menunjukkan bahawa M. canettii dan seluruh MTBC baru-baru ini telah menyimpang daripada nenek moyang yang sama.7 Memandangkan konsep ini, sesetengah pengarang memanggil M. canettii8.
MTBC digambarkan secara sistematik sebagai kompleks klon yang ketat, dan struktur populasinya jelas dikawal oleh kepelbagaian yang dikurangkan, kesesakan, pengimbasan terpilih, dan hanyutan genetik9,10. Dengan mengandaikan evolusi klon ketat yang kompleks, seperti polimorfisme yang hilang tidak dapat dipulihkan dengan penggabungan semula. Berdasarkan premis ini, peristiwa berturut-turut penghapusan genomik rantau pembezaan (RD) dan TbD1 (rantau penghapusan khusus Mtb 1) telah dicadangkan sebagai penanda molekul evolusi MTBC2,5,11. Kerja genomik perbandingan dan penjujukan genom keseluruhan (WGS) menyokong pembahagian ahli yang disesuaikan dengan manusia kepada sembilan keturunan (Mycobacterium tuberculosis L1 hingga L4, L7, dan L8; dan Mycobacterium africanum L5, L6, dan L9), keturunan L2 hingga L4 berkongsi memadam TbD1, wilayah2,13. Di samping itu, ahli yang disesuaikan dengan haiwan dicadangkan untuk berkongsi nenek moyang yang sama, yang ditakrifkan oleh pemadaman khusus klad dalam RD7, RD8, RD9 dan RD102, 5, dan 14.
Pemindahan gen mendatar (HGT) dan peristiwa penggabungan semula dianggap jarang berlaku dan berlaku pada nenek moyang MTBC, dan bukannya sejarah berbeza bagi keseluruhan ahli MTBC15,16,17. Dua laporan awal oleh Hughes and collaborators (2002) dan Gutacker and collaborators (2006) mencadangkan bahawa peristiwa penggabungan semula boleh membantu membentuk polimorfisme yang menandakan lokus tertentu dalam strain M. tuberculosis18,19. Sebab-sebab kekurangan penggabungan semula yang jelas dalam MTBC ialah: (1) proses mekanikal dan kehilangan keupayaan HGT; (2) jarang berlaku peristiwa HGT; (3) tiada peluang acara penggabungan semula dalam niche MTBC14,17. Baru-baru ini, beberapa kajian penjujukan genom keseluruhan (WGS) yang digunakan untuk strain 20 MTBC dan Mycobacterium bovis 21 telah memberikan bukti penggabungan semula, yang pertama menunjukkan bahawa strain MTBC sering bertukar-tukar serpihan DNA kecil, tetapi disebabkan variasi jujukan nukleotida terhad, peristiwa ini Masih tidak disedari.
Mycobacterium bovis ialah ahli MTBC yang paling biasa dipulihkan daripada ternakan (terutamanya lembu), walaupun ia juga boleh diasingkan daripada haiwan liar jarak bebas dan berpagar4,22,23,24. M. bovis berkembang menjadi lima kompleks klon utama [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) dan Afrika 2 (Af2)], mengikut profil spoligotyping, penghapusan khusus Dan polimorfisme nukleotida tunggal (SNPs) 25, 27,26, spesifik dalam gen. Kompleks klon ini menunjukkan struktur pelbagai populasi Mycobacterium bovis dan perkaitannya dengan kawasan geografi. Di samping itu, kerja-kerja WGS baru-baru ini yang dijalankan oleh Zimpel dan rakan usaha sama (2020) mereka bentuk filogeni berdasarkan SNP Mycobacterium bovis, dengan lebih daripada 1,900 genom, menunjukkan bahawa terdapat sekurang-kurangnya empat garis keturunan yang berbeza (dinamakan Lb1 hingga Lb1 hingga Lb4), mereka tidak sepenuhnya konsisten dengan kompleks geografi yang telah disahkan sebelum ini, walaupun boleh ditakrifkan secara spesifik. Pengarang ini melakukan analisis pembezaan filogeni dan pentarikhan molekul, tetapi tidak mengkaji penggabungan semula30.
Kerja sebelumnya menggunakan teknik molekul yang berbeza, seperti spoligotaip, MIRU-VNTR (nombor ulangan tandem pembolehubah unit ulangan mycobacterial), dan penaipan SNP baru-baru ini mendedahkan tahap kepelbagaian genetik tertentu di kalangan strain M. bovis 31,32,33, 34,35. Pembezaan variasi genetik telah menjadi alat penting dalam kajian epidemiologi penyakit, yang membantu untuk pemahaman mendalam tentang patogenesis, virulensi dan penghantaran penyakit. Kemunculan kaedah WGS memberikan kemungkinan untuk mendedahkan faktor pemacu evolusi yang dikenakan oleh genom Mycobacterium bovis dalam proses penyesuaian dan kegigihan kepada tuan rumah yang berbeza dan senario epidemiologi.
Dalam kerja ini, kami menggunakan analisis genomik perbandingan pada pelbagai set data Mycoplasma bovis (n=70), termasuk pencilan daripada kompleks klon yang berbeza, untuk mendapatkan pandangan tentang proses evolusi Mycoplasma bovis, terutamanya untuk menyelesaikan hubungan filogenetik Dan peristiwa penggabungan semula. Sebagai tambahan kepada analisis ini, set sub-data bagi M. bovis terpencil (n = 42) yang diperolehi daripada kawasan tuberkulosis berbilang perumah yang dicirikan dengan baik di Portugal 31,36 telah diterokai lebih lanjut untuk membuat kesimpulan bukan identiti Keseimbangan antara nisbah relatif deria (dN) kepada sinonim (dS) nukleotida penggantian, serta sumbangan genomes tertentu yang disebut dalam kesusasteraan. 37,38 diperolehi oleh nenek moyang MTBC melalui HGT, dan mengekod komponen gen sistem 3R (pembaikan, replikasi, dan penggabungan semula DNA) 39. Pilih gen yang diperoleh melalui HGT kerana ia mungkin mewakili polimorfisme purba, jadi dijangkakan ia mungkin mengandungi bahagian yang lebih tinggi bagi perubahan sinonim. Gen yang termasuk dalam sistem 3R telah dipilih kerana kerja sebelumnya pada strain M. tuberkulosis menunjukkan pemilihan negatif/pemurnian umum yang berfungsi pada gen ini, dan mereka mungkin memainkan peranan penting dalam evolusi 39. Satu lagi matlamat kerja ini adalah untuk membuat kesimpulan kewujudan peristiwa penyusunan semula. Atas sebab ini, memandangkan set data kami dari Portugal hanya mengandungi genom kompleks klon Eropah 2 dan strain yang belum menetapkan kompleks klon, kami memutuskan untuk memasukkan data genom yang tersedia secara umum untuk akhirnya mendapatkan wakil semua kompleks klon, dan Meningkatkan keteguhan dan keluasan hasil.
42 genom Mycoplasma bovis yang baru dijujukan daripada adegan tuberkulosis berbilang perumah endemik Portugis (butiran di bawah), yang sebelum ini dicirikan daripada perspektif epidemiologi36, adalah pusat kerja ini. Memandangkan set data dari Portugal hanya mempunyai wakil kompleks dan strain klon Eropah 2 tanpa kompleks yang ditetapkan, data penjujukan genom keseluruhan yang tersedia secara terbuka telah ditambah untuk mengembangkan set data yang merangkumi semua wakil kompleks klon M. bovis. Oleh itu, tiga sumber data penjujukan genom keseluruhan telah digunakan dalam kerja ini: pemasangan genom lengkap/draf, sehingga 10 perancah disimpan dalam NCBI (Pusat Kebangsaan untuk Maklumat Bioteknologi) (n = 15 pencilan); disimpan dalam SRA ( Fail Illumina fastq bagi urutan yang dibaca arkib) mewakili kepelbagaian kompleks klon M. bovis (n = 12 pencilan)30; dan 42 genom urutan baru dari Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) telah dikecualikan daripada carian NCBI. M. bovis AF2122/97 biasanya digunakan sebagai genom rujukan untuk dimasukkan ke dalam set data. Oleh kerana ketiadaan awam bagi keseluruhan jujukan genom yang diwakili oleh kompleks pengklonan Afrika 1, dan bilangan kecil genom daripada strain wakil Af2 dan Eu1, data penjujukan asal yang disediakan oleh SRA digunakan dalam kes ini. Kerja Zimpel dan rakan usaha samanya (2020) membantu mengenal pasti genom daripada kompleks pengklonan yang disebutkan di atas dan membantu memilih Mycobacterium bovis untuk dimasukkan ke dalam set data. Untuk Eu3, hanya satu jenis genom yang diterangkan (Branger et al., 2020), jadi genom yang kami sertakan ialah wakil berasingan bagi kompleks Eu3.
Di peringkat global, set data ini merangkumi 70 lembu M. bovis yang diasingkan daripada 8 spesies perumah, diedarkan di 12 negara dari tahun 1985 hingga 2016. 36 spesies ditetapkan sebagai Eu2, 7 spesies adalah Eu1, 1 spesies adalah Eu3, 3 spesies adalah Af1, 4 spesies adalah Af2 dan 19 tidak boleh dikaitkan dengan kompleks klonal (disebabkan oleh mana-mana kompleks klonal). Maklumat terperinci (termasuk nombor penyertaan) Mycobacterium bovis yang digunakan dalam kajian ini ditunjukkan dalam Jadual 1 dan Jadual Tambahan 1.
42 keseluruhan genom Mycobacterium bovis yang baru dijujukan dari kawasan panas tuberkulosis haiwan Portugal dan diedarkan selama lebih daripada 12 tahun adalah pusat kajian ini, kerana potensi sistem penyakit hidupan liar-ternakan telah dipantau secara berkala 31,36 (Tambahan Rajah 1). Mengikut prosedur seterusnya, strain ini telah diasingkan daripada lembu (n = 14), rusa merah (n = 16) dan babi hutan (n = 12) dari tahun 2003 hingga 2015: mengumpul dan mengendalikan haiwan mengikut garis panduan protokol yang disyorkan Sampel tisu adalah dalam Buku Panduan Haiwan Terestrial OIE dan diinokulasi pada medium cecair Stonebrinsteinvank dan pepejal Löwensteink. Kultur diinkubasi pada suhu 37 °C dan pertumbuhan diperiksa sekali seminggu selama sekurang-kurangnya 12 minggu. Koloni disimpan terus dalam larutan gliserol pada -80ºC. Dalam medium terpilih Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), sampel asal yang diarkibkan telah diluluskan melalui satu petikan in vitro secara in vitro untuk mendapatkan DNA program WGS. Untuk ini, larutan stok kultur beku telah diperkaya dengan 5% natrium piruvat dan 10% ADS (50 g albumin, 20 g glukosa, 8.5 g natrium klorida dalam 1 L air) pada Middlebrook 7H9 pada 37°C Latih Semula. Selepas 4 minggu pertumbuhan, medium diperbaharui dan budaya dipantau secara berkala sehingga pertumbuhan diperhatikan. Sel-sel telah dituai dengan sentrifugasi, pelet digantung semula dalam 500 µL phosphate buffered saline (PBS), dipanaskan pada 99 °C selama 30 minit, disentrifugasi, dan supernatan disimpan pada -20 °C sehingga WGS. Semua prosedur dijalankan di kemudahan biokeselamatan tahap 3.
Pustaka genom berpasangan WGS disediakan menggunakan indeks unik setiap sampel DNA, dan menggunakan teknologi Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 sampel) dan HiSeq (2 × 150 pb) (dua pencilan) (Eurofins Genomics, Jerman) untuk penjujukan. Menurut arahan pengilang, gunakan Penganalisis Genom Illumina dengan lampiran modul dua hujung untuk menyusun DNA genom, dan gunakan Kit Persediaan Perpustakaan DNA Nextera XT daripada Illumina untuk membina perpustakaan.
Dengan mengambil kira data yang diperolehi daripada SRA (n = 12), pengenalpastian kompleks klon boleh digunakan sebagai metadata penerbitan yang sepadan 30, 41, 43. Apabila mempertimbangkan genom lengkap, kecuali Mycobacterium bovis AF2122/97 dan Mycobacterium bovis 3601, ahli-ahli Ekobakterium bovis 3601, yang dikenali sebagai cloud1nal 3601, Ecloud1 dan 3601 yang sepadan. 29, masing-masing, ia adalah sama dengan genom lengkap Mycobacterium tuberculosis H37Rv (nombor penyertaan NCBI NC_000962.3). Penjajaran genom dilakukan menggunakan MAFFT (program penjajaran berbilang asid amino atau jujukan nukleotida, versi 7.458) dan parameter -addfragments48. Kemudian, cari ketiadaan kompleks klon yang berbeza dan/atau kehadiran ciri SNP.
Mycobacterium bovis yang baru dijujukan (n = 42) dan bacaan asal draf genom yang dipasang (n = 3) menyelaraskan kompleks dengan genom rujukan Mycobacterium tuberculosis H37Rv melalui saluran paip vSNP dan kehadiran ciri pemadaman dan/atau SNP bagi klon yang berbeza Carian telah dijalankan.
Kumpul maklumat daripada kekurangan ciri dan/atau kehadiran/ketiadaan profil SNP dan spoligotaip untuk menetapkan data genomik kepada kompleks klon yang sepadan. Untuk empat perhimpunan draf, profil spoligotaip tidak boleh disimpulkan, jadi ia termasuk dalam kumpulan "tiada kerumitan".
Aliran kerja bioinformatik diikuti oleh kerja ini bermula daripada pemasangan dan pemetaan de novo kepada strategi rujukan, dengan matlamat untuk meneroka peristiwa penggabungan semula dan polimorfisme genom tertentu. Rajah 1 menyediakan carta alir bagi langkah-langkah yang diikuti. Untuk analisis penggabungan semula, semua genom digunakan untuk meningkatkan keteguhan inferens dan penunjuk yang berkaitan.
Untuk mengurangkan ralat dalam penjanaan jujukan konsensus genom, kami mula-mula memperoleh pemasangan de novo, dan kemudian memperoleh penjajaran berbilang teras. Saluran paip Unicycler kini tersedia di https://github.com/rrwick/Unicycler49 dan digunakan untuk melaksanakan pemasangan de novo 54 genom terjujukan (42 jujukan baru dan 12 fail fastq dipulihkan daripada SRA). Ringkasnya, sebelum memasang dari awal, analisis kualiti baca telah dilakukan dalam FastQC versi 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) dan versi Trimmomatic 0.36 (pilihan "Penyesuai pemotongan dan jujukan khusus pencahayaan lain daripada bacaan" dan "Potong asas dari hujung ambang 0" adalah lebih rendah daripada ambang yang digunakan, jika kualiti yang digunakan lebih rendah daripada ambang 2. (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Kemudian, pengoptimum SPAdes49 digunakan untuk pemasangan genom, dan versi Pilon 1.1851 digunakan untuk pengoptimuman pasca pemasangan. Mod penyambungan konservatif telah dipilih untuk mengelakkan pemasangan yang salah, dan saiz k-mer telah dicari dan dipilih antara 20% dan 95% daripada panjang bacaan. Ikut garis panduan SPAdes dan pertimbangkan saiz bacaan, padamkan contig yang lebih kecil daripada 300 bp dan wujudkan potongan liputan kedalaman bacaan 20 sebanyak 52. Dalam strategi pemasangan de novo, kawasan genomik seperti proline-glutamat (PE) dan proline-proline glutamat (PPE) paralog yang sangat berulang tidak dialih keluar.
Kualiti pemasangan de novo dinilai melalui saluran paip QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), yang memudahkan pembaharuan contig dan genom rujukan M. bovis AF2122/97 (nombor penyertaan NCBI LT708304.1) Pemetaan (lihat Jadual Tambahan 1 untuk parameter kualiti).
Dengan bantuan saluran paip vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), fail FASTQ bagi penjujukan M. bovis yang baru daripada penjujukan Illumina dibandingkan dengan genom rujukan M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Menurut cadangan amalan terbaik Kit Alat Analisis Genom (GATK) 53, 54, 55 gunakan parameter penapis standard atau skor jisim varian untuk penentukuran semula. Hasilnya ditapis menggunakan skor jisim SAMtools terendah iaitu 150 dan AC = 2. Juga gunakan Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) untuk menyemak bacaan bagi mengetepikan pencemaran. Saluran paip vSNP yang digunakan untuk memetakan strategi urutan dalam kerja kami meneliti satu siri SNP dan sasaran yang ditentukan, dan juga tidak termasuk senario jangkitan bercampur. Liputan genom yang dibaca adalah lebih baik daripada 99% (Jadual Tambahan 1).
Untuk mengelakkan ralat pemetaan dan SNP yang salah, tapis varian dalam kes berikut: (1) ia disokong oleh kurang daripada 20 bacaan, (2) ia didapati dengan frekuensi kurang daripada 0.9, (3) ia berada dalam sekurang-kurangnya satu Strain, tetapi sekurang-kurangnya terdapat jurang dalam ketegangan lain. Pemapar genomik bersepadu (IGV) versi 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 telah digunakan untuk mengesahkan SNP dan kedudukan secara visual dengan masalah pemetaan atau penjajaran. Memandangkan gen proline-glutamat (PE) dan proline-proline glutamat (PPE) sangat berganda dan merupakan sebahagian daripada keluarga berbilang gen, mereka mudah disalahertikan oleh penjujukan dan pemetaan salah Illumina, jadi mereka lebih disukai Aliran kerja bioinformatik mikobakteria mengeluarkan ahli kompleks tuberkulosis apabila menggunakan strategi pemetaan untuk penjujukan SNP. Oleh itu, kami menapis gen PE/PPE dan indel daripada analisis.
Menurut Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), semua SNP dibahagikan kepada kategori berfungsi. Saluran paip SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) digunakan untuk membuat kesimpulan akibat SNP (perubahan sinonim atau bukan sinonim). Mencipta pangkalan data baharu genom Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Penjajaran berbilang genom teras telah dilakukan menggunakan Parsnp v1.2, kini tersedia di https://github.com/marbl/parsnp57, menggunakan 69 genom lengkap/himpunan draf (dengan pilihan -c) dan M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) digunakan sebagai rujukan. Empat penjajaran berbilang teras telah dilakukan: hanya ahli kompleks pengklonan Eu2 (n = 37), termasuk semua ahli kompleks pengklonan Eropah (n = 44), termasuk titik persimpangan kompleks pengklonan Eropah dan Afrika (n = 51), dan masukkan semua Mycobacterium bovis dalam kajian ini (n = 70).
Penjajaran teras yang dijana oleh Parsnp digunakan untuk membuat kesimpulan pokok filogenetik kemungkinan maksimum (ML) menggunakan CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 menggunakan RAxML, dan melakukan 1000 replikasi berpandu.
Tiga alat algoritma dan bioinformatik berbeza digunakan untuk menyemak kehadiran peristiwa penggabungan semula secara selari: perisian SplitsTree4, Gubbins (keturunan tidak berat sebelah melalui penggabungan semula dalam jujukan nukleotida) dan perisian RDP4 (program pengesanan semula, versi beta 4.101).
Kaedah penguraian berpecah yang dilaksanakan dalam SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 digunakan untuk mengira rangkaian filogenetik tanpa akar, menggunakan ujian Phi untuk pengesahan statistik, dan ambang keertian ialah p = 0.05. Analisis berbilang penjajaran teras Parsnp digunakan sebagai input, dan penguraian pemisahan sebagai standard rangkaian direalisasikan.
Saluran paip Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 berjalan dengan parameter lalai sebagai cara lain untuk menilai kesan penggabungan semula pada Mycobacterium bovis. Algoritma yang dilaksanakan dalam saluran paip membina semula keturunan klon yang berkaitan. Pemasangan genom/draf lengkap set data kami dan genom rujukan/97 (bovine bovid2) LT708304.1) adalah bersama; dan imbas kedudukan SNP pada setiap cawangan pepohon untuk mengesan kelompok SNP yang mewakili peristiwa penggabungan semula Sifar cawangan Anggapkan bahawa tiada peristiwa penggabungan semula, yang bermaksud bahawa SNP yang berlaku pada cawangan hendaklah diedarkan secara sama rata Penjajaran berbilang teras daripada pepohon skor terbaik daripada Parsnp.
Akhir sekali, untuk mengesahkan acara penyusunan semula yang dicadangkan oleh saluran paip Gubbins, enam algoritma yang dilaksanakan dalam RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 dan SiScan66) digunakan pada penjajaran berbilang teras Parsnp di bawah tetapan lalai. Kami menentukan bahawa sekurang-kurangnya tiga daripada algoritma yang dilaksanakan dalam RDP4 mesti secara konsisten menunjukkan isyarat penting untuk mengesahkan setiap peristiwa penggabungan semula.
Memandangkan kedua-dua perisian Gubbins dan RDP mencari isyarat penggabungan semula dengan menyemak penjajaran berbilang teras dalam tetingkap sehingga 500 bp, dan mengesahkan bahawa kemasukan gen PE/PPE semasa pemasangan de novo tidak akan mengganggu isyarat penggabungan semula yang ditemui, analisis selanjutnya dilakukan oleh homolineariti Periksa persekitaran gen yang mengenal pasti peristiwa penggabungan semula. Peta synlinear menggunakan genom lengkap telah dibina menggunakan penjajaran MAUVE-multi-genome (//darlinglab.org/mauve/mauve.html) untuk mengecualikan translokasi atau penyongsangan genom tempatan. Di samping itu, keseluruhan genom digunakan untuk melakukan analisis homolinearity pada jujukan asid amino melalui pelayan web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Analisis yang lebih mendalam tentang set data genom yang diperoleh daripada sistem tuberkulosis berbilang tuan rumah Portugis adalah untuk memeriksa polimorfisme gen yang disebutkan dalam kesusasteraan. Gen ini ialah 37,38 dan pengekodan gen 3R yang diperolehi oleh nenek moyang MTBC melalui komponen sistem HGT (pembaikan, replikasi dan penggabungan semula DNA) 39. Gunakan ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) dan gunakan DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu (π) dan input parameter ujian neutral D Tajima.
Pokok filogenetik kemungkinan maksimum (ML) berdasarkan 69 pencilan Mycoplasma bovis dan genom rujukan diperolehi (Rajah 2A). Berbanding dengan pokok berasaskan gen tunggal atau pokok berasaskan berbilang lokus, strategi ini membolehkan penjanaan pokok yang lebih berkuasa yang tidak menangkap kebolehubahan keseluruhan genom dan oleh itu mempamerkan keupayaan yang lebih rendah untuk mendiskriminasi antara spesies 68,69. Struktur topologi pokok ML biasanya konsisten dengan klasifikasi klon yang kompleks. Genom Eu2 dikelompokkan dalam dahan, dan genom Af1 juga dikelompokkan bersama (Rajah 2A). Hasilnya juga konsisten dengan hubungan evolusi Mycobacterium bovis yang diketahui, iaitu, terdapat perbezaan besar antara ahli Eu1 dan kumpulan yang terdiri daripada semua kompleks dan genom klon lain, tetapi kompleks klon 30 tidak dinyatakan. Ketidakkonsistenan kecil antara kompleks klon dan hubungan yang diperhatikan pada pokok filogenetik boleh dijelaskan oleh fakta bahawa kompleks klon diterangkan berdasarkan kawasan genomik tertentu, manakala pokok filogenetik adalah berdasarkan pelbagai penjajaran genom teras yang mewakili keseluruhan genom.
Pokok filogenetik kemungkinan maksimum (GTR) dibina berdasarkan penjajaran genom teras genom Mycobacterium bovis sebelum (A) dan selepas (B) penyingkiran tapak penggabungan semula. Warna cawangan mewakili kompleks klon Mycobacterium bovis: Eropah 1 adalah ungu, Eropah 2 adalah merah, Eropah 3 adalah biru, Afrika 1 adalah oren, dan Afrika 2 adalah hijau. Pokok itu berakar dan dilukis mengikut skala, dan panjang cawangan diukur sebagai pengganti untuk setiap tapak.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis digambarkan sebagai evolusi klon, dan kebanyakan bukti yang terkumpul selama bertahun-tahun menyokong idea bahawa kejadian HGT dan penggabungan semula yang berterusan tidak akan berlaku pada tahap MTBC15,17,18 yang boleh dikesan.
Kerja terdahulu telah menunjukkan bahawa mungkin terdapat penggabungan semula terhad antara strain MTBC20,21, manakala yang lain telah gagal untuk mengenal pasti peristiwa penggabungan semula yang boleh diukur70,71. Bincangkan semula isu ini dengan fokus pada Mycobacterium bovis, yang berbeza daripada kerja sebelumnya yang hanya menganggap Mycobacterium tuberculosis 70,71; atau pertimbangkan MTBC secara keseluruhan, dengan hampir tiada M. bovis mewakili 20; atau hanya mempertimbangkan pecahan lembu yang terhad. Dataset mikobakteria, dalam kerja ini, terdapat sejumlah 70 strain, mewakili semua kompleks klon, digunakan untuk menyaring untuk penggabungan semula. Set data diskalakan mengikut empat tahap kumulatif: (1) ahli Eu2, (2) semua ahli kompleks klon Eropah (iaitu Eropah), (3) kompleks klon Eropah dan Afrika (Eu + Af) dan (4) keseluruhan Pengumpulan data (termasuk genom yang tidak termasuk dalam mana-mana kompleks klon yang telah diterangkan).
Untuk mengkaji lebih lanjut hipotesis ini, rangkaian penguraian berpecah telah dilakukan untuk menilai ketiadaan peristiwa penggabungan semula antara genom, kerana kaedah ini dapat menggambarkan hubungan nenek moyang antara individu dan memaparkan isyarat filogenetik yang bercanggah. Keempat-empat set data dalam analisis mengesahkan kewujudan gelung dalam rangkaian (iaitu, kawasan yang tidak bercantum menjadi satu pokok), tetapi ujian Phi tidak mempunyai sokongan statistik (Eu2, p = 0.0956; Eropah, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; keseluruhan set data p = 0.2451 bukti kewujudan semula) 3A-D).
Di Eropah 2 genom (n = 37) (A), genom Eropah (n = 44) (B), genom Eropah dan Afrika (n = 51) (C) dan keseluruhan set data (n = 70) (D).
Selepas analisis ini, dan mengambil kira pemerhatian kitaran dalam semua rangkaian, algoritma pembinaan semula yang dilaksanakan dalam saluran paip Gubbins telah digunakan untuk membina semula keturunan klon dan untuk menambah anggaran kesan penggabungan semula pada genom M. bovis. Buat kesimpulan bilangan kumulatif peristiwa penggabungan semula, yang kebanyakannya berlaku dalam cawangan terminal (iaitu, dalam genom tunggal) (Jadual 2). Penunjuk ini menunjukkan ketekalan keseluruhan set data dan menunjukkan bahawa kekerapan peristiwa penggabungan semula adalah 200 hingga 300 kali ganda daripada mutasi. Sebaik sahaja parameter rho/theta yang mewakili kadar relatif penggabungan semula dan mutasi titik pada cawangan kelihatan antara 0.0037 dan 0.0056 (Jadual 3). Baru-baru ini, karya terbitan 38 M. bovis strain menunjukkan nilai rho/theta yang lebih tinggi (rho/theta = 0.1) daripada yang diperolehi dalam dataset ini, tetapi kerja Patané dan rakan sekerja menggunakan perhimpunan berasaskan rujukan untuk membuat kesimpulan parameter penggabungan semula , Perincian prosedur, disebabkan oleh prosedur pemasangan, telah dikaitkan dengan kelimpahan cawangan. peristiwa terminal dalam putatif.
Seterusnya, parameter r/m mewakili nisbah kepelbagaian penggabungan semula dan pengenalan mutasi, dan nilai puratanya adalah antara 0.025 dan 0.037, menunjukkan bahawa berbanding dengan mutasi, penggabungan semula mempunyai kesan keseluruhan yang lebih rendah terhadap kepelbagaian genetik M. bovis (Jadual 3)). Untuk perbandingan yang meluas, kaedah yang sama digunakan untuk menganggar parameter r/m bagi dataset MTBC yang terdiri daripada 23 genom, menunjukkan nilai purata 0.48620, manakala bagi dataset 38 M. bovis Patané dan rakan sekerja, ia membuktikan nilai purata ialah 0.98. Dalam kajian pertama, hanya dua daripada 23 genom yang dimasukkan ke dalam kerja M. bovis (M. bovis BCG dan strain rujukan), jadi nilai yang diperoleh mungkin berat sebelah disebabkan oleh overexpression genom M. tuberculosis . Dalam laporan kedua, populasi Mycobacterium bovis yang dianalisis terutamanya ditemui dari Amerika Syarikat dan tuan rumah ternakan. Sebaliknya, dalam set data kami, lebih banyak lokasi geografi dan spesies tuan rumah diwakili, dan genom yang dikumpulkan ke dalam kompleks klon yang berbeza dengan ciri genetik populasi yang berbeza juga digunakan, sekali gus mencapai pengetahuan Populasi yang lebih mendalam dan lebih luas. Perbezaan nilai purata r/m yang diperoleh dengan set data kami adalah konsisten dengan konsep bahawa tahap penggabungan semula sangat berbeza antara garis keturunan yang diberikan kepada spesies taksonomi yang sama, jadi keputusan ini menunjukkan bahawa kompleks klon M. bovis mungkin menunjukkan perbezaan penggabungan semula Kesannya juga seperti yang dicadangkan oleh Didelot & Maiden72. Namun begitu, meluaskan set data ini dengan ketara dengan memasukkan bilangan genom M. bovis yang lebih besar akan membolehkan penjelasan lanjut mengenai perkara ini. Kedua-dua parameter r/m dan rho/theta menunjukkan kebolehubahan antara cawangan, dan keputusan ini konsisten dengan laporan mengenai spesies bakteria lain72,73.
Akhir sekali, untuk mengesahkan peristiwa penyusunan semula yang dikenal pasti oleh saluran paip Gubbins, enam algoritma berbeza telah digunakan dalam perisian RDP4 untuk secara bebas menguji pelbagai perbandingan teras yang berbeza. Di peringkat global, kurang daripada separuh daripada peristiwa yang dikenal pasti oleh Gubbins telah disahkan oleh RDP4 (Jadual 4 dan 5). Memandangkan keseluruhan set data, tiga peristiwa penggabungan semula telah disahkan, dua melibatkan nod dalaman dan satu lagi melibatkan genom tunggal dalam cawangan terminal, yang mana kompleks klon tidak dapat diberikan (Jadual 4 dan 5). Pengenalpastian kejadian di cawangan terminal mungkin menunjukkan bahawa penggabungan semula masih dalam proses dalam strain M. bovis kontemporari atau hasilnya salah letak70. Di rantau penggabungan semula hipotesis ini, kira-kira 20% daripada kedudukan mempunyai nukleotida yang tidak ditentukan (N), sekali gus menjejaskan isyarat penggabungan semula (Tambahan Rajah 2). Di samping itu, rantau ini menjejaskan gen rrs, mengekodkan RNA ribosom 16S yang dijangka sangat terpelihara, jadi isyarat penggabungan semula yang diduga ini mungkin hasil daripada ralat penjujukan atau salah jajaran. Kemudian keseluruhan penjajaran genom antara Mb0003 dan Mycobacterium bovis AF2122/97 telah dilakukan, dan kewujudan nukleotida dan SNP yang tidak ditentukan telah disahkan, jadi masalah yang mungkin berkaitan dengan penjajaran yang salah bukan disebabkan oleh maklumat biologi yang dilaksanakan dalam kerja ini Muncul selepas mempelajari program tersebut.
Tiada jurang atau nukleotida yang tidak ditentukan ditemui di kawasan penggabungan semula nod dalaman (Rajah 4 dan 5). Berkenaan peristiwa ini, satu hanya mengandungi genom Eu2 dan mempengaruhi gen pks12, yang mengekod kemungkinan sintase polyketide; manakala satu lagi didaftarkan dalam genom Eu1 dan menjejaskan gen narX yang mengekod kemungkinan reduktase nitrat (Jadual 4). Secara umum, analisis penggabungan semula menunjukkan bahawa terdapat bilangan serpihan penggabungan semula yang terhad dengan sokongan statistik, dan penunjuk yang disimpulkan menunjukkan bahawa penggabungan semula mempunyai kesan yang rendah pada keturunan M. bovis. Isyarat penggabungan semula dijangka rendah, tetapi penting untuk membezakan isyarat evolusi sebenar daripada bunyi latar belakang, yang merupakan tugas yang mencabar. Untuk mengurangkan isyarat hingar yang diperkenalkan oleh pemasangan berasaskan rujukan dan masalah ketidakpadanan 70, 71, semua yang lain kecuali genom lengkap telah dipasang dari awal, dan kualiti pemasangan telah diperiksa dan dipastikan oleh analisis saluran paip QUAST (Jadual Tambahan 1). Di samping itu, satu siri analisis tambahan telah dijalankan untuk memberikan keteguhan dan ketepatan tinjauan keseluruhan. Oleh itu, kualiti penjujukan gen narX dan pks12 dinilai dengan pemetaan baca terhadap Mycobacterium bovis AF2122/97. Kedudukan SNP yang disyorkan di kawasan penggabungan semula telah disahkan dengan menggunakan kriteria yang dinyatakan dalam bahagian kaedah (sekurang-kurangnya 20 bacaan dan 0.9 kekerapan perubahan). Polimorfisme gen narX telah disahkan sepenuhnya dalam dua genom (Mb1792361 dan Mb7240415; 2.3%) dan genom genom pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb17046, Mb. Walau bagaimanapun, bagi genom Mb2043, enam daripada lapan kedudukan tidak memenuhi kriteria kedalaman bacaan kerana SNP disokong oleh maksimum 17 bacaan, iaitu di bawah nilai cutoff yang ditetapkan iaitu 20. Oleh itu, penggabungan semula enam genom (8.6%) di tapak genom ini boleh disahkan (Rajah 4 dan 5).
Visualisasi terperinci penjajaran rantau penggabungan semula kumpulan data Mycobacterium bovis mempengaruhi gen narX yang mengekod kemungkinan reduktase nitrat. Tiada jurang atau nukleotida yang tidak ditentukan ditemui di kawasan penggabungan semula nod dalaman. Peristiwa khusus ini didaftarkan dalam genom Eu1. Kualiti penjujukan gen narX dinilai dengan memplot bacaan Mycobacterium bovis AF2122/97. Sahkan lokasi SNP yang disyorkan dalam kawasan penggabungan semula dengan menggunakan kriteria yang dinyatakan dalam bahagian kaedah (sekurang-kurangnya 20 bacaan dan 0.9 kekerapan perubahan). Polimorfisme gen narX telah disahkan sepenuhnya dalam genom Mb1792361 dan Mb7240415 (2.3%).
Visualisasi terperinci penjajaran rantau penggabungan semula kumpulan data Mycoplasma bovis yang mempengaruhi gen pks12. Tiada jurang atau nukleotida yang tidak ditentukan ditemui di kawasan penggabungan semula nod dalaman. Berkenaan peristiwa yang mempengaruhi pengekodan gen pks12 kemungkinan polyketide synthase, ia hanya mengandungi genom Eu2. Kualiti penjujukan pks12 dinilai dengan pemetaan baca Mycobacterium bovis AF2122/97. Sahkan lokasi SNP yang disyorkan dalam kawasan penggabungan semula dengan menggunakan kriteria yang dinyatakan dalam bahagian kaedah (sekurang-kurangnya 20 bacaan dan 0.9 kekerapan perubahan). Polimorfisme genom Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, dan Mb1960 telah disahkan sepenuhnya.
Gen PE dan PPE mempunyai kawasan berulang yang mudah disalah baca oleh penjujukan dan pemetaan Illumina, jadi ia biasanya dipadamkan daripada aliran kerja bioinformatik ahli M. tuberkulosis hanya apabila menggunakan strategi pemetaan-ke-jujukan. Inferens peristiwa penggabungan semula yang digunakan dalam kerja ini adalah berdasarkan pemasangan de novo tanpa menapis PE/PPE. Kami percaya bahawa dengan melaksanakan tiga kaedah dan algoritma pelengkap yang berbeza melalui SplitsTree, saluran paip Gubbins dan perisian RDP4, strategi yang digunakan adalah teguh untuk memproses dan menapis kawasan yang disusun semula yang disebabkan oleh isyarat ralat. Walau bagaimanapun, untuk mengecualikan gangguan gen PE / PPE pada perisian Gubbins dan RDP4 untuk mengenal pasti kelompok SNP, dan oleh itu pengenalpastian kawasan penggabungan semula yang dicadangkan untuk menjejaskan gen narX dan pks12, kejiranan gen ini telah diperiksa (Tambahan Rajah 3-5). Dalam M. bovis AF2122/97, gen narX dipisahkan oleh narK2 dan Mb1764c, manakala pks12 dikelilingi oleh Mb2075c e Mb2073c (Tambahan Rajah 3-5). Peta yang dijana menggunakan peta synline MAUVE bagi genom lengkap memberikan maklumat tentang pemuliharaan jujukan gen dan penyusunan semula, menunjukkan empat blok kolinear, dan tiada tanda-tanda translokasi atau penyongsangan genom. Di samping itu, analisis pelengkap dengan urutan asid amino membuktikan homologi dalam semua genom lengkap, dan tiada PE / PPE ditemui di kawasan bersebelahan narX atau pks12. Untuk narX, satu genom (Mb0030) mempunyai skor sinonim yang lebih rendah kerana gen narX dikenal pasti sebagai dua serpihan (serpihan 1891 dan 1890). Untuk pks12, disebabkan persamaan, Mb0030 dan Mb003 mempamerkan skor synlinearity yang lebih rendah, manakala pks12 dikenal pasti dalam dua dan tiga serpihan, masing-masing, mewakili domain protein yang berbeza (Tambahan Rajah 3-5). Dengan mengambil kira maklumat ini, dan perisian Gubbins dan RDP4 kedua-duanya melakukan analisis, semak penjajaran berbilang teras maksimum 500 bp dalam tetingkap, kami mengesahkan bahawa gen PE/PPE tidak akan mengganggu isyarat penggabungan semula yang mempengaruhi narX dan pks12.
Walaupun isyarat penggabungan semula yang dikesan dalam set data ini mungkin dianggap sisa, adalah benar bahawa penggabungan semula dalam M. bovis tidak boleh diketepikan, jadi ia harus terus menjadi subjek analisis lanjut, di mana keseluruhan genom daripada senario epidemiologi yang berbeza disusun kepada Penting.
Membandingkan pokok filogenetik ML yang diperoleh sebelum dan selepas pembetulan gabungan semula (Rajah 2A, B) tidak membawa kepada perubahan ketara dalam hubungan filogenetik yang disimpulkan, dan strain M. bovis dikelompokkan dalam kumpulan yang sama.
Selepas memetakan 42 jujukan M. bovis yang baru dibaca dengan genom rujukan M. bovis AF2122/97, penjajaran SNP yang mengandungi 1816 kedudukan polimorfik diperolehi. Kebanyakan SNP (87.1%) terletak di kawasan pengekodan, dan gen yang terjejas dicirikan mengikut kategori berfungsi yang ditunjukkan dalam Bovilist (Rajah 6A, B). Dengan mengambil kira jumlah bilangan gen dalam setiap kategori berfungsi, gen dalam kategori "metabolisme lipid" menunjukkan lebih banyak SNP, diikuti oleh "dinding sel dan proses sel" dan "metabolisme dan respirasi perantaraan", mendedahkan bahawa mereka berada dalam evolusi M. bovis.
Analisis hierarki kumpulan data M. bovis dari Portugal (n = 42). Jumlah bilangan SNP berdaftar dan gen yang terjejas untuk setiap kategori berfungsi (A). Jumlah bilangan perubahan sinonim dan bukan sinonim yang didaftarkan mengikut kategori fungsi (B).
Pada skala global, nisbah purata dN/dS adalah lebih baik daripada 1.5, yang menunjukkan bahawa tekanan evolusi global adalah untuk menyingkirkan keadaan nenek moyang dan mewakili senario pilihan penulenan yang positif (pelbagai atau terarah) dan/atau santai. Dalam kategori "virulensi, detoksifikasi, penyesuaian", "jujukan sisipan dan faj", dan "protein kawal selia", lebih daripada dua pertiga daripada SNP adalah tidak sinonim (Rajah 6B).
Dalam semua kategori, terdapat gen dengan berbilang SNP, menghasilkan kadar mutasi purata (iaitu purata SNP setiap gen) lebih besar daripada 1 (Rajah 6A). Pks12 (Mb2074c) dengan 15 SNP dan fas (Mb2553c) dengan 8 SNP mempunyai nilai mutasi yang lebih tinggi. Kedua-dua gen ini terlibat dalam metabolisme asid lemak. Gen pks mengekod polyketide synthase (PKS), iaitu enzim pelbagai fungsi yang terlibat dalam biosintesis lipid dinding sel mikobakteria74,75. Gen ini menyandikan polipeptida pelbagai fungsi yang terlibat dalam sintesis mikoketida74,76. Gen fas terlibat dalam sintesis asid mikolik. Kedua-dua gen ini memainkan peranan penting dalam biosintesis dinding sel yang bersentuhan dengan perumah.
Untuk mengkaji lebih lanjut evolusi Mycobacterium bovis, dua set gen tertentu telah dianalisis. Karya yang diterbitkan sebelum ini menggunakan komposisi jujukan dan kaedah filogenetik mengenal pasti gen yang diperoleh oleh nenek moyang MTBC melalui HGT sebelum kepelbagaian37, 38. Gen-gen ini disenaraikan dalam Jadual Tambahan 2. Taburan SNP daripada sejumlah 77 gen yang mungkin berkaitan dengan HGT telah dianalisis, dan 26 tapak polimorfik telah dikenal pasti, yang dalam kebanyakan kes (78%) mengakibatkan perubahan tidak sinonim (NS) (Jadual Tambahan 2). Kerja sebelumnya pada genom MTBC menunjukkan bahawa rantau HGT yang diduga menunjukkan nisbah NS SNP yang lebih tinggi berbanding dengan genom yang lain. Jika seseorang berpendapat bahawa kawasan penggabungan semula ini telah diperoleh oleh nenek moyang MTBC, dan oleh itu, ia mewakili polimorfisme purba, maka perkadaran perubahan sinonim dijangka lebih tinggi, kerana penggantian NS dijangka akan dihapuskan oleh pemilihan negatif kerana perubahan asid amino Mungkin mengubah fungsi protein. Oleh itu, keputusan kami menunjukkan bahawa akibat fungsi mungkin berpunca daripada penggantian gen seperti HGT, yang mencerminkan kepentingannya untuk kepelbagaian genetik penyesuaian yang berharga.
Selari dengan analisis ini, gen pengekodan komponen sistem 3R (pembaikan DNA, replikasi, dan penggabungan semula) telah diperiksa dengan teliti mengikut senarai yang diterbitkan sebelum ini oleh dos Vultos dan rakan usaha sama (2008)39. Pertukaran serpihan DNA yang sama tidak dapat diperhatikan secara langsung, walaupun ia mungkin merupakan proses yang kerap apabila bakteria yang berkait rapat terlibat, seperti dalam kes set data ini; di samping itu, proses ini mungkin menjadi kunci kepada kaedah pembaikan DNA72, jadi Main peranan dalam penggabungan semula homolog. Sebanyak 26 kedudukan polimorfik yang diedarkan oleh 54 gen telah dikenalpasti (Jadual Tambahan 3). Dalam set gen ini, perubahan NS menyumbang kira-kira 65% daripada akibat, yang konsisten dengan laporan sebelumnya mengenai strain Mycobacterium tuberculosis.
Masa siaran: 21-Okt-2021