नेचर भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा CSS को लागि सीमित समर्थन छ। उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई ब्राउजरको नयाँ संस्करण प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड बन्द गर्नुहोस्)। साथै, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैलीहरू र जाभास्क्रिप्ट बिना साइटहरू प्रदर्शन गर्नेछौं।
जीनोम अनुक्रमणले संक्रामक रोग अनुसन्धानको क्षेत्रलाई पुनर्जीवित गरेको छ, रोग महामारी विज्ञान, रोगजनन, होस्ट-रोगजनक अन्तरक्रिया, र रोगजनकहरूमा लगाइएको विकासवादी प्रक्रिया प्रकट गर्दै। माइकोब्याक्टेरियम ट्युबरकुलोसिस कम्प्लेक्स (MTBC) ले माइकोब्याक्टेरियम बोभिसलाई यसको पशु अनुकूली सदस्यहरू मध्ये एक मान्दछ जसले स्थलीय स्तनधारीहरूमा क्षयरोग (TB) निम्त्याउँछ, र ब्याक्टेरिया विकासको एक विशिष्ट मोडेल हो। अन्य MTBC सदस्यहरू जस्तै, माइकोब्याक्टेरियम बोभिसलाई कडा रूपमा क्लोन गरिएको, बिस्तारै विकसित हुने रोगजनक मानिन्छ, र स्पष्ट रूपमा पुनर्संयोजन वा तेर्सो जीन स्थानान्तरणको कुनै संकेत छैन। यस कार्यमा, हामी गाईवस्तु M. को आनुवंशिक विविधतामा अन्तर्दृष्टि प्राप्त गर्न विभिन्न वंशावली (युरोप र अफ्रिका) बाट ७० गाईवस्तु M. मिलेर बनेको सम्पूर्ण जीनोम अनुक्रम (WGS) डेटासेटमा तुलनात्मक जीनोमिक्स लागू गर्छौं। विकासवादी शक्ति। पुनर्गठनका संकेतहरू अनुमान गर्न तीन फरक विधिहरू प्रयोग गरिन्छ। विश्वव्यापी रूपमा, ठोस समर्थनको साथ दुई स्वतन्त्र विधिहरू द्वारा थोरै संख्यामा पुनर्संयोजन घटनाहरू पहिचान र पुष्टि गरिएको छ। तैपनि, उत्परिवर्तनको तुलनामा, पुनर्संयोजनले M. bovis को विविधतामा कमजोर प्रभाव पार्छ (समग्र r/m = ०.०३७)। हाम्रो डेटा सेटमा माइकोब्याक्टेरियम बोभिसको क्लोनल कम्प्लेक्समा प्राप्त r/m औसत भिन्नता सामान्य अवधारणासँग मेल खान्छ कि एउटै वर्गीकरण प्रजातिहरूलाई तोकिएको वंशहरू बीच पुनर्संयोजनको डिग्री धेरै फरक हुन सक्छ। यस कार्यको आधारमा, माइकोब्याक्टेरियम बोभिसमा पुनर्संयोजनलाई अस्वीकार गर्न सकिँदैन, त्यसैले यो भविष्यको तुलनात्मक जीनोमिक्स अनुसन्धानमा थप प्रयासहरूको विषय हुनुपर्छ, जसमा विश्वभरका विभिन्न महामारी विज्ञान परिदृश्यहरूबाट ठूला डेटा सेटहरूको WGS महत्त्वपूर्ण छ। त्यसपछि बहु-होस्ट TB प्रचलनबाट सानो माइकोब्याक्टेरियम बोभिस डेटा सेट (n = 42) मा थप विश्लेषण गरिएको थियो, र 1,800 भन्दा बढी लोकी पहिचान गरिएको थियो, जसमध्ये कम्तिमा एउटा स्ट्रेनले एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNP) देखायो। धेरैजसो (८७.१%) कोडिङ क्षेत्रमा अवस्थित छन्, र समानार्थी परिवर्तनहरूको गैर-समानार्थी परिवर्तनहरू (dN/dS) को विश्वव्यापी अनुपात १.५ भन्दा बढी छ, जसले सकारात्मक चयन M. bovis मा प्रयोग गरिएको एक महत्त्वपूर्ण विकासवादी शक्ति हो भनेर संकेत गर्दछ। "लिपिड मेटाबोलिज्म", "कोशिका भित्ता र कोशिका प्रक्रियाहरू", र "मध्यवर्ती चयापचय र श्वसन" को कार्यात्मक वर्गहरूमा धनी जीनहरूमा SNP हरूको उच्च अनुपात पत्ता लगाइएको थियो, जसले माइकोब्याक्टेरियम बोभिसको महत्त्वको जीवविज्ञान र विकासमा तिनीहरूको सम्भावना प्रकट गर्दछ। MTBC पुर्खाहरूमा जीनहरूलाई नजिकबाट हेर्दा जुन तेर्सो जीन स्थानान्तरणको लागि प्रवण छन् र 3R (DNA मर्मत, प्रतिकृति, र पुनर्संयोजन) प्रणालीमा समावेश छन्, ताइजिमाको D तटस्थ परीक्षणको विश्वव्यापी औसत नकारात्मक मान प्रकट गर्दछ, जसले विगतको चयनात्मक स्क्यानिङलाई संकेत गर्दछ। जनसंख्या विस्तार पछि हालैको अवरोध अझै पनि होस्टसँग लड्न अनिवार्य रोगजनक माइकोब्याक्टेरियम बोभिसको लागि मुख्य विकासवादी ड्राइभिङ कारक हो।
माइकोब्याक्टेरियम ट्युबरकुलोसिस कम्प्लेक्स (MTBC) ब्याक्टेरिया रोगजनकहरूको सबैभन्दा सफल ट्याक्सा मध्ये एक हो र ब्याक्टेरिया विकासको एक विशिष्ट केस हो। यसका सदस्यहरूले जीनोमिक स्तरमा आश्चर्यजनक रूपमा उच्च न्यूक्लियोटाइड पहिचान देखाउँछन् (> 99%)1,2। विभिन्न MTBC इकोटाइपहरूले सूक्ष्म-स्तनधारी प्राणीहरूदेखि मानिसहरूसम्मका विभिन्न होस्ट प्रजातिहरूमा क्षयरोग (TB), जुन एक संक्रामक ग्रानुलोमेटस रोग हो, निम्त्याउन सक्छ।3,4,5। हाल, यो कम्प्लेक्समा मानवहरू [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] र जनावर-अनुकूलित रोगजनकहरू (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanze" र "dassie") समावेश छन्। एम. क्यानेटी ("नोडोब्याक्टर ग्लाब्राटा" पनि भनिन्छ) माथि उल्लेखित माइकोब्याक्टेरियासँगको औसत न्यूक्लियोटाइड पहिचान ९८% छ, र तुलनात्मक जीनोमिक्स कार्यले देखाएको छ कि एम. क्यानेटी र बाँकी MTBC हालसालै साझा पूर्वजबाट अलग भएका छन्। ७ यस अवधारणालाई विचार गर्दा, केही लेखकहरूले एम. क्यानेटीलाई MTBC ८ का सदस्य भन्छन्।
MTBC लाई व्यवस्थित रूपमा एक सख्त क्लोनल जटिलको रूपमा वर्णन गरिएको छ, र यसको जनसंख्या संरचना स्पष्ट रूपमा कम विविधता, अवरोधहरू, चयनात्मक स्क्यानिङ, र आनुवंशिक बहाव द्वारा शासित छ9,10। जटिल सख्त क्लोनल विकास मान्दै, जस्तै हराएको बहुरूपताहरू पुनर्संयोजन द्वारा पुनर्स्थापित गर्न सकिँदैन। यस आधारको आधारमा, भिन्न क्षेत्र (RD) र TbD1 (Mtb विशिष्ट मेटाउने 1 क्षेत्र) को जीनोमिक मेटाउने क्रमिक घटनाहरूलाई MTBC विकास 2,5,11 को आणविक मार्करको रूपमा प्रस्ताव गरिएको छ। तुलनात्मक जीनोमिक्स र सम्पूर्ण जीनोम अनुक्रमण (WGS) कार्यले मानव-अनुकूलित सदस्यहरूलाई नौ वंशहरूमा विभाजन गर्न समर्थन गर्दछ (माइकोब्याक्टेरियम ट्यूबरकुलोसिस L1 देखि L4, L7, र L8; र माइकोब्याक्टेरियम अफ्रिकनम L5, L6, र L9), वंशहरू L2 देखि L4 साझा मेटाउने TbD1 क्षेत्र 2,11,12,13। यसको अतिरिक्त, जनावर अनुकूलित सदस्यहरूले एक साझा पूर्वज साझा गर्ने प्रस्ताव गरिएको छ, जुन RD7, RD8, RD9 र RD102, 5, र 14 मा क्लेड-विशिष्ट मेटाउनेहरू द्वारा परिभाषित गरिएको छ।
तेर्सो जीन स्थानान्तरण (HGT) र पुनर्संयोजन घटनाहरू दुर्लभ मानिन्छन् र सम्पूर्ण MTBC सदस्यको फरक इतिहासको सट्टा MTBC का पुर्खाहरूमा हुन्छन्15,16,17। ह्युजेस र सहयोगीहरू (2002) र गुटाकर र सहयोगीहरू (2006) द्वारा दुई प्रारम्भिक रिपोर्टहरूले सुझाव दिए कि पुनर्संयोजन घटनाहरूले M. tuberculosis strains18,19 मा विशिष्ट स्थान चिन्ह लगाउने बहुरूपताहरूलाई आकार दिन मद्दत गर्न सक्छ। MTBC मा पुनर्संयोजनको स्पष्ट अभावको कारणहरू हुन्: (1) HGT को यान्त्रिक प्रक्रिया र क्षमताको हानि; (2) HGT घटनाहरूको दुर्लभता; (3) MTBC niche14,17 मा पुनर्संयोजन घटनाहरूको कुनै सम्भावना छैन। हालै, MTBC स्ट्रेन 20 र माइकोब्याक्टेरियम बोभिस 21 मा लागू गरिएका केही पूर्ण-जीनोम अनुक्रमण (WGS) अध्ययनहरूले पुनर्संयोजनको प्रमाण प्रदान गरेका छन्, MTBC स्ट्रेनहरूले प्रायः साना DNA टुक्राहरू आदानप्रदान गर्छन् भनेर देखाउने पहिलो, तर सीमित न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम भिन्नताको कारण, यी घटनाहरू अझै पनि याद गरिएको छैन।
माइकोब्याक्टेरियम बोभिस पशुधन (मुख्यतया गाईवस्तु) बाट सबैभन्दा सामान्य रूपमा बरामद हुने MTBC सदस्य हो, यद्यपि यसलाई मुक्त-दायरा र बाड़िएका जंगली जनावरहरूबाट पनि अलग गर्न सकिन्छ4,22,23,24। स्पोलिगोटाइपिङ प्रोफाइल, विशिष्ट मेटाउने र विशिष्ट जीनहरूमा एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNPs) 25, 26, 27, 28, 29 अनुसार, M. बोभिस पाँच प्रमुख क्लोनल कम्प्लेक्सहरूमा विकसित भयो [युरोपियन 1 (Eu1), युरोपियन 2 (Eu2), युरोपियन 3 (Eu3), अफ्रिकी 1 (Af1) र अफ्रिका 2 (Af2)]। यी क्लोनल कम्प्लेक्सहरूले माइकोब्याक्टेरियम बोभिस जनसंख्याको विविध संरचना र भौगोलिक क्षेत्रहरूसँग यसको सम्बन्ध प्रदर्शन गर्छन्। थप रूपमा, जिम्पेल र सहयोगीहरू (२०२०) द्वारा गरिएको हालैको WGS कार्यले माइकोब्याक्टेरियम बोभिसको SNP मा आधारित फाइलोजेनी डिजाइन गर्यो, जसमा १,९०० भन्दा बढी जीनोमहरू थिए, जसले संकेत गर्दछ कि कम्तिमा चार फरक वंशहरू छन् (Lb1 देखि Lb1 देखि Lb4 नाम दिइएको), तिनीहरू पहिले परिभाषित क्लोनल जटिलसँग पूर्ण रूपमा एकरूप छैनन्, यद्यपि भौगोलिक विशिष्टता पनि पुष्टि गर्न सकिन्छ30। यी लेखकहरूले फाइलोजेनी र आणविक डेटिङको भिन्न विश्लेषण गरे, तर पुनर्संयोजन30 अध्ययन गरेनन्।
स्पोलिगोटाइपिङ, MIRU-VNTR (माइकोब्याक्टेरियल इन्टरस्पर्स्ड रिपीट युनिट-चर ट्यान्डम रिपीट नम्बर) जस्ता विभिन्न आणविक प्रविधिहरू प्रयोग गरेर गरिएको अघिल्लो काम, र हालैको SNP टाइपिङले M. बोभिस स्ट्रेनहरू 31,32,33, 34,35 बीच आनुवंशिक विविधताको निश्चित स्तर प्रकट गर्यो। आनुवंशिक भिन्नताको भिन्नता रोग महामारी विज्ञानको अध्ययनमा एक महत्त्वपूर्ण उपकरण बनेको छ, जुन रोगजनन, विषाणु र रोग प्रसारणको गहन बुझाइको लागि उपयोगी छ। WGS विधिको उदयले विभिन्न होस्टहरू र महामारी विज्ञान परिदृश्यहरूमा अनुकूलन र दृढताको प्रक्रियामा माइकोब्याक्टेरियम बोभिस जीनोमद्वारा लगाइएका विकासवादी ड्राइभिङ कारकहरू प्रकट गर्ने सम्भावना प्रदान गर्दछ।
यस कार्यमा, हामी विभिन्न माइकोप्लाज्मा बोभिस डेटासेटहरू (n=70) मा तुलनात्मक जीनोमिक विश्लेषण प्रयोग गर्छौं, जसमा विभिन्न क्लोनल कम्प्लेक्सहरूबाट आइसोलेटहरू समावेश छन्, माइकोप्लाज्मा बोभिसको विकास प्रक्रियामा अन्तर्दृष्टि प्राप्त गर्न, विशेष गरी फाइलोजेनेटिक सम्बन्धहरू र पुनर्संयोजन घटनाहरू समाधान गर्न। यस विश्लेषणको पूरकको रूपमा, पोर्चुगल 31,36 मा राम्रोसँग विशेषता गरिएको बहु-होस्ट क्षयरोग क्षेत्रबाट प्राप्त M. बोभिस आइसोलेटहरू (n = 42) को उप-डेटा सेटलाई गैर-पहिचान अनुमान गर्न थप अन्वेषण गरिएको थियो। समानार्थी (dS) न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापनहरूमा इन्द्रियको सापेक्ष अनुपात (dN) बीचको सन्तुलन, साथै साहित्यमा उल्लेख गरिएको विशिष्ट जीनोमहरूको विकासवादी योगदान, तिनीहरू HGT मार्फत MTBC पुर्खाहरू द्वारा प्राप्त 37,38 हुन्, र 3R (DNA मर्मत, प्रतिकृति, र पुनर्संयोजन) प्रणाली जीन घटकहरू 39 लाई एन्कोड गर्छन्। HGT मार्फत प्राप्त जीनहरू छनौट गर्नुहोस् किनभने तिनीहरूले प्राचीन बहुरूपताहरू प्रतिनिधित्व गर्न सक्छन्, त्यसैले यो अपेक्षा गरिएको छ कि तिनीहरूमा समानार्थी परिवर्तनहरूको उच्च अनुपात हुन सक्छ। ३आर प्रणालीमा समावेश गरिएका जीनहरू छनोट गरिएका थिए किनभने एम. ट्युबरकुलोसिस स्ट्रेनहरूमा अघिल्लो कामले यी जीनहरूमा काम गर्ने सामान्य नकारात्मक/शुद्धीकरण चयनहरूलाई संकेत गरेको थियो, र तिनीहरूले विकास ३९ मा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्न सक्छन्। यस कामको अर्को लक्ष्य पुनर्गठन घटनाहरूको अस्तित्व अनुमान गर्नु हो। यस कारणले गर्दा, पोर्चुगलबाट हाम्रो डेटासेटमा युरोपेली क्लोन जटिल २ को जीनोमहरू र क्लोन जटिल तोकिएका स्ट्रेनहरू मात्र समावेश छन् भन्ने कुरालाई विचार गर्दै, हामीले अन्ततः सबै क्लोन जटिलहरूको प्रतिनिधि प्राप्त गर्न सार्वजनिक रूपमा उपलब्ध जीनोम डेटा समावेश गर्ने निर्णय गर्यौं, र परिणामहरूको बलियोपन र चौडाइ सुधार गर्यौं।
पोर्चुगिज एन्डेमिक मल्टि-होस्ट क्षयरोग दृश्यबाट ४२ नयाँ अनुक्रमित माइकोप्लाज्मा बोभिस जीनोमहरू (तल विवरणहरू), पहिले महामारी विज्ञानको दृष्टिकोणबाट चित्रण गरिएको ३६, यस कामको केन्द्र हुन्। पोर्चुगलबाट डेटा सेटमा केवल युरोपेली २ क्लोन कम्प्लेक्स र तोकिएको कम्प्लेक्स बिना स्ट्रेनका प्रतिनिधिहरू छन् भन्ने कुरालाई ध्यानमा राख्दै, सार्वजनिक रूपमा उपलब्ध सम्पूर्ण-जीनोम अनुक्रमण डेटा M. बोभिस क्लोन कम्प्लेक्सका सबै प्रतिनिधिहरू समावेश गर्ने डेटा सेटलाई विस्तार गर्न थपिएको छ। त्यसकारण, यस काममा तीन पूर्ण-जीनोम अनुक्रमण डेटा स्रोतहरू प्रयोग गरिएको थियो: पूर्ण/ड्राफ्ट जीनोम एसेम्बली, NCBI (बायोटेक्नोलोजी सूचनाको लागि राष्ट्रिय केन्द्र) मा भण्डारण गरिएका १० स्क्याफोल्डहरू (n = १५ आइसोलेटहरू); SRA मा भण्डारण गरिएको (अनुक्रम पढ्ने अभिलेखको इलुमिना फास्टक्यू फाइल) ले M. बोभिस क्लोनको जटिल विविधतालाई प्रतिनिधित्व गर्दछ (n = १२ आइसोलेटहरू)३०; र पोर्चुगलबाट ४२ नयाँ अनुक्रमित जीनोमहरू। माइकोब्याक्टेरियम बोभिस BCG (Bacille Calmette-Guerin) NCBI खोजबाट बहिष्कृत गरिएको थियो। M. bovis AF2122/97 लाई सामान्यतया डेटासेटमा समावेश गर्न सन्दर्भ जीनोमको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। अफ्रिकी १ क्लोनिङ कम्प्लेक्सद्वारा प्रतिनिधित्व गरिएको सम्पूर्ण जीनोम अनुक्रमको सार्वजनिक अनुपलब्धता र Af2 र Eu1 को प्रतिनिधि स्ट्रेनहरूबाट जीनोमहरूको सानो संख्याको कारणले गर्दा, SRA द्वारा प्रदान गरिएको मूल अनुक्रम डेटा यी केसहरूमा प्रयोग गरिएको थियो। जिम्पेल र उनका सहयोगीहरूको काम (२०२०) ले माथि उल्लिखित क्लोनिङ कम्प्लेक्सबाट जीनोम पहिचान गर्न मद्दत गर्यो र डेटा सेटमा समावेश गर्न माइकोब्याक्टेरियम बोभिस चयन गर्न मद्दत गर्यो। Eu3 को लागि, केवल एक प्रकारको जीनोम वर्णन गरिएको छ (ब्रान्जर एट अल।, २०२०), त्यसैले हामीले समावेश गरेको जीनोम Eu3 कम्प्लेक्सको छुट्टै प्रतिनिधि हो।
विश्वव्यापी रूपमा, यस डेटा सेटमा १९८५ देखि २०१६ सम्म १२ देशहरूमा वितरण गरिएका ८ होस्ट प्रजातिहरूबाट अलग गरिएका ७० गाईवस्तु एम. बोभिस समावेश छन्। ३६ प्रजातिहरूलाई Eu2, ७ प्रजातिहरूलाई Eu1, १ प्रजातिलाई Eu3, ३ प्रजातिहरूलाई Af1, ४ प्रजातिहरूलाई Af2 र १९ कुनै पनि क्लोनल जटिलसँग सम्बन्धित छैनन् (तल विवरणहरू)। यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएको माइकोब्याक्टेरियम बोभिसको विस्तृत जानकारी (अक्सेसन नम्बर सहित) तालिका १ र पूरक तालिका १ मा देखाइएको छ।
पोर्चुगलको पशु क्षयरोग हटस्पटबाट १२ वर्षभन्दा बढी समयदेखि वितरण गरिएका माइकोब्याक्टेरियम बोभिसका ४२ नयाँ अनुक्रमित सम्पूर्ण जीनोमहरू यस अध्ययनको केन्द्र हुन्, किनकि सम्भावित वन्यजन्तु-पशुधन रोग प्रणालीहरूको नियमित रूपमा निगरानी गरिएको छ ३१,३६ (पूरक चित्र १)। पछिल्ला प्रक्रियाहरू अनुसार, यी प्रजातिहरूलाई २००३ देखि २०१५ सम्म गाईवस्तु (n = १४), रातो मृग (n = १६) र जंगली बँदेल (n = १२) बाट अलग गरिएको थियो: सिफारिस गरिएको प्रोटोकल दिशानिर्देशहरू अनुसार जनावरहरू सङ्कलन र ह्यान्डल गर्नुहोस्। तन्तु नमूनाहरू OIE स्थलीय पशु पुस्तिकामा छन् र स्टोनब्रिंक र लोवेनस्टाइन-जेन्सेन पाइरुभेट ठोस माध्यम र तरल माध्यममा खोप लगाइन्छ। संस्कृतिहरू ३७ डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेट गरिन्छन् र कम्तिमा १२ हप्ताको लागि हप्तामा एक पटक वृद्धि जाँच गरिन्छ। उपनिवेशहरू सिधै -८० डिग्री सेल्सियसमा ग्लिसरॉल घोलमा भण्डारण गरिन्छन्। माइकोब्याक्टेरियम सेलेक्टिभ माध्यम (मिडलब्रुक ७एच९, बीडी डायग्नोस्टिक्स) मा, WGS कार्यक्रमको DNA प्राप्त गर्न मूल अभिलेख गरिएका नमूनाहरूलाई भिट्रोमा एकल इन भिट्रो मार्गबाट पास गरिएको थियो। यसका लागि, फ्रोजन कल्चर स्टक घोललाई मिडलब्रुक ७एच९ मा ३७°C रिट्रेनमा ५% सोडियम पाइरुभेट र १०% ADS (५० ग्राम एल्बुमिन, २० ग्राम ग्लुकोज, १ लिटर पानीमा ८.५ ग्राम सोडियम क्लोराइड) ले समृद्ध गरिएको थियो। ४ हप्ताको वृद्धि पछि, माध्यमलाई नवीकरण गरिएको थियो र वृद्धि अवलोकन नभएसम्म कल्चरलाई नियमित रूपमा निगरानी गरिएको थियो। कोषहरू सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा काटिएका थिए, गोलीलाई ५०० µL फस्फेट बफर गरिएको सलाइन (PBS) मा पुन: निलम्बित गरिएको थियो, ९९°C मा ३० मिनेटको लागि तताइएको थियो, सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो, र सुपरनेटेन्टलाई WGS सम्म -२०°C मा भण्डारण गरिएको थियो। सबै प्रक्रियाहरू स्तर ३ बायोसेफ्टी सुविधाहरूमा गरिन्छ।
WGS पेयर-एन्ड जीनोम लाइब्रेरी प्रत्येक DNA नमूनाको अद्वितीय अनुक्रमणिका प्रयोग गरेर तयार पारिएको छ, र अनुक्रमणको लागि Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 नमूनाहरू) र HiSeq (2 × 150 pb) (दुई आइसोलेटहरू) प्रविधि (युरोफिन्स जेनोमिक्स, जर्मनी) प्रयोग गर्दछ। निर्माताको निर्देशन अनुसार, जीनोमिक DNA अनुक्रमण गर्न डबल-एन्डेड मोड्युल संलग्नकको साथ Illumina जीनोम विश्लेषक प्रयोग गर्नुहोस्, र पुस्तकालय निर्माण गर्न Illumina बाट Nextera XT DNA लाइब्रेरी प्रेप किट प्रयोग गर्नुहोस्।
SRA (n = 12) बाट प्राप्त गरिएको डेटालाई ध्यानमा राख्दै, क्लोन कम्प्लेक्सको पहिचानलाई सम्बन्धित प्रकाशन 30, 41, 43 को मेटाडेटाको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ। पूर्ण जीनोमलाई विचार गर्दा, माइकोब्याक्टेरियम बोभिस AF2122/97 र माइकोब्याक्टेरियम बोभिस 3601 बाहेक, जुन क्रमशः Eu1 र Eu3 क्लोनल कम्प्लेक्स 25, 29 का मान्यता प्राप्त सदस्यहरू हुन्, यो माइकोब्याक्टेरियम ट्युबरकुलोसिस H37Rv (NCBI एक्सेसियन नम्बर NC_000962.3) को पूर्ण जीनोम जस्तै हो। जीनोम पङ्क्तिबद्धता MAFFT (एमिनो एसिड वा न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमको बहु संरेखण कार्यक्रम, संस्करण 7.458) र प्यारामिटर -addfragments48 प्रयोग गरेर गरिन्छ। त्यसपछि, विभिन्न क्लोनल कम्प्लेक्सहरूको अनुपस्थिति र/वा SNP सुविधाहरूको उपस्थितिको लागि खोजी गर्नुहोस्।
नयाँ अनुक्रमित माइकोब्याक्टेरियम बोभिस (n = ४२) र भेला गरिएको जीनोम ड्राफ्ट (n = ३) को मूल पठनले vSNP पाइपलाइन मार्फत सन्दर्भ जीनोम माइकोब्याक्टेरियम ट्युबरकुलोसिस H37Rv सँग जटिललाई पङ्क्तिबद्ध गर्दछ र विभिन्न क्लोनको मेटाउने र/वा SNP सुविधाहरूको उपस्थिति पत्ता लगाउँछ।
सम्बन्धित क्लोनल कम्प्लेक्समा जीनोमिक डेटा तोक्न सुविधाहरूको अभाव र/वा SNP र स्पोलिगोटाइपिङ प्रोफाइलहरूको उपस्थिति/अनुपस्थितिबाट जानकारी सङ्कलन गर्नुहोस्। चार ड्राफ्ट एसेम्बलीहरूको लागि, स्पोलिगोटाइपिङ प्रोफाइल अनुमान गर्न सकिँदैन, त्यसैले तिनीहरूलाई "कुनै जटिलता छैन" समूहमा समावेश गरिएको छ।
यस कार्य पछिको बायोइन्फर्मेटिक्स कार्यप्रवाह डे नोभो एसेम्बली र म्यापिङबाट सुरु हुन्छ, जसको लक्ष्य पुनर्संयोजन घटनाहरू र विशिष्ट जीनोम बहुरूपताहरू अन्वेषण गर्नु हो। चित्र १ ले पछ्याइएका चरणहरूको फ्लोचार्ट प्रदान गर्दछ। पुनर्संयोजन विश्लेषणको लागि, सबै जीनोमहरू अनुमानहरू र सम्बन्धित सूचकहरूको बलियोपन बढाउन प्रयोग गरिन्छ।
जीनोम कन्सेन्सियस सिक्वेन्सको उत्पादनमा त्रुटिहरू कम गर्न, हामीले पहिले डे नोभो एसेम्बली प्राप्त गर्यौं, र त्यसपछि कोर मल्टिपल अलाइनमेन्टहरू प्राप्त गर्यौं। युनिसाइक्लर पाइपलाइन हाल https://github.com/rrwick/Unicycler49 मा उपलब्ध छ र ५४ सिक्वेन्स्ड जीनोमहरू (४२ नयाँ सिक्वेन्स्ड र SRA बाट १२ फास्टक्यू फाइलहरू पुन: प्राप्त) को डे नोभो एसेम्बली गर्न प्रयोग गरिन्छ। छोटकरीमा भन्नुपर्दा, स्क्र्याचबाट एसेम्बल गर्नुअघि, FastQC संस्करण ०.११.७ (https://github.com/s-andrews/FastQC), र Trimmomatic संस्करण ०.३६ ("रिडबाट एडेप्टरहरू र अन्य प्रकाश-विशिष्ट अनुक्रमहरू काट्ने" विकल्प र "२० को थ्रेसहोल्ड गुणस्तर भन्दा कम भएमा, पढाइको अन्त्यबाट आधारहरू काट्ने" लागू गरिएको छ) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) ५० मा पढ्ने गुणस्तर विश्लेषण गरिएको थियो। त्यसपछि, जीनोम एसेम्बलीको लागि SPAdes optimiser49 प्रयोग गरिएको थियो, र पोस्ट-एसेम्बली अप्टिमाइजेसनको लागि Pilon संस्करण १.१८५१ प्रयोग गरिएको थियो। गलत एसेम्बलीबाट बच्नको लागि एक रूढिवादी ब्रिजिङ मोड चयन गरिएको थियो, र k-mer आकार खोजिएको थियो र पढ्ने लम्बाइको २०% र ९५% बीचमा चयन गरिएको थियो। SPAdes दिशानिर्देशहरू पालना गर्नुहोस् र पढ्ने आकारलाई विचार गर्नुहोस्, ३०० bp भन्दा सानो कन्टिगहरू मेटाउनुहोस्, र ५२ को २० पढ्ने गहिराइ कभरेज कटअफ स्थापना गर्नुहोस्। डे नोभो एसेम्बली रणनीतिमा, अत्यधिक दोहोरिने प्रोलाइन-ग्लुटामेट (PE) र प्रोलाइन-प्रोलाइन ग्लुटामेट (PPE) प्यारालोगहरू जस्ता जीनोमिक क्षेत्रहरू हटाइएनन्।
डे नोभो एसेम्बलीको गुणस्तर QUAST पाइपलाइन (http://quast.sourceforge.net/quast.html) मार्फत मूल्याङ्कन गरिन्छ, जसले कन्टिग र M. bovis AF2122/97 सन्दर्भ जीनोम (NCBI एक्सेसियन नम्बर LT708304.1) म्यापिङको नवीकरणलाई सहज बनाउँछ (गुणस्तर प्यारामिटरहरूको लागि पूरक तालिका १ हेर्नुहोस्)।
vSNP पाइपलाइन (https://github.com/USDA-VS/vSNP) को सहयोगमा, इलुमिना सिक्वेन्सिङबाट नयाँ अनुक्रमित M. bovis को FASTQ फाइललाई M. bovis AF2122/97 सन्दर्भ जीनोम (LT708304.1)) सँग तुलना गरिएको छ। जीनोम विश्लेषण टूलकिट (GATK) 53, 54, 55 को उत्तम अभ्यास सिफारिसहरू अनुसार पुन: क्यालिब्रेसनको लागि मानक फिल्टर प्यारामिटरहरू वा भेरियन्ट मास स्कोरहरू लागू गर्नुहोस्। परिणामहरू सबैभन्दा कम SAMtools मास स्कोर 150 र AC = 2 प्रयोग गरेर फिल्टर गरिन्छ। प्रदूषणलाई अस्वीकार गर्न रिडिङहरू जाँच गर्न Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) पनि प्रयोग गर्नुहोस्। हाम्रो काममा अनुक्रम रणनीतिहरू नक्सा गर्न प्रयोग गरिएको vSNP पाइपलाइनले परिभाषित SNPs र लक्ष्यहरूको श्रृंखलाको जाँच गर्दछ, र मिश्रित संक्रमण परिदृश्यहरू पनि समावेश गर्दैन। पढ्ने जीनोम कभरेज 99% भन्दा राम्रो छ (पूरक तालिका 1)।
म्यापिङ त्रुटिहरू र गलत SNP हरूबाट बच्न, निम्न अवस्थाहरूमा भेरियन्ट फिल्टर गर्नुहोस्: (१) यो २० भन्दा कम रिडिङहरूद्वारा समर्थित छ, (२) यो ०.९ भन्दा कम फ्रिक्वेन्सीमा फेला परेको छ, (३) यो कम्तिमा एउटा स्ट्रेनमा छ, तर कम्तिमा अर्को स्ट्रेनमा खाली ठाउँहरू छन्। एकीकृत जीनोमिक्स भ्यूअर (IGV) संस्करण २.४.१९ (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)५६ म्यापिङ वा पङ्क्तिबद्धता समस्याहरू भएका SNP हरू र स्थितिहरू दृश्यात्मक रूपमा प्रमाणित गर्न प्रयोग गरिएको थियो। प्रोलाइन-ग्लुटामेट (PE) र प्रोलाइन-प्रोलाइन ग्लुटामेट (PPE) जीनहरू अत्यधिक डुप्लिकेट भएकाले र बहु-जीन परिवारको भाग भएकाले, तिनीहरू इलुमिना अनुक्रमण र गलत म्यापिङद्वारा सजिलै गलत बुझिन्छन्, त्यसैले तिनीहरूलाई प्राथमिकता दिइन्छ। SNP हरू पुष्टि गर्न म्यापिङ टु सेक्वेन्सको रणनीति प्रयोग गर्दा माइकोब्याक्टेरियल बायोइन्फर्मेटिक्स कार्यप्रवाहले क्षयरोग जटिलका सदस्यहरूलाई हटाएको छ। त्यसकारण, हामीले विश्लेषणबाट PE/PPE जीन र इन्डेलहरू फिल्टर गर्यौं।
बोभिलिस्ट (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) का अनुसार, सबै SNP हरूलाई कार्यात्मक कोटीहरूमा विभाजन गरिएको छ। SnpEff पाइपलाइन (https://pcingola.github.io/SnpEff/) SNP परिणामहरू (समानार्थी वा गैर-समानार्थी परिवर्तनहरू) अनुमान गर्न प्रयोग गरिन्छ। माइकोब्याक्टेरियम बोभिस AF2122/97 जीनोम (LT708304.1) को नयाँ डाटाबेस सिर्जना गरियो।
कोर जीनोम मल्टिपल अलाइनमेन्ट Parsnp v1.2 प्रयोग गरेर गरिएको थियो, जुन हाल https://github.com/marbl/parsnp57 मा उपलब्ध छ, जसमा ६९ वटा पूर्ण जीनोम/ड्राफ्ट एसेम्बलीहरू (विकल्प -c सहित) प्रयोग गरिएको छ र M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) लाई सन्दर्भको रूपमा प्रयोग गरिएको छ। चार कोर मल्टिपल अलाइनमेन्टहरू गरिएको थियो: Eu2 क्लोनिङ कम्प्लेक्सका सदस्यहरू मात्र (n = ३७), युरोपेली क्लोनिङ कम्प्लेक्सका सबै सदस्यहरू सहित (n = ४४), युरोपेली र अफ्रिकी क्लोनिङ कम्प्लेक्सको जंक्शन बिन्दु सहित (n = ५१), र यस अध्ययनमा सबै माइकोब्याक्टेरियम बोभिसहरू समावेश गर्नुहोस् (n = ७०)।
Parsnp द्वारा उत्पन्न गरिएको कोर पङ्क्तिबद्धता RAxML प्रयोग गरेर CIPRES विज्ञान गेटवे v3.3 (http://www.phylo.org/)58 प्रयोग गरेर अधिकतम सम्भावना (ML) फाइलोजेनेटिक रूख अनुमान गर्न र १००० निर्देशित प्रतिकृतिहरू प्रदर्शन गर्न प्रयोग गरिन्छ।
समानान्तर रूपमा पुनर्संयोजन घटनाहरूको उपस्थिति जाँच गर्न तीन फरक एल्गोरिदम र बायोइन्फर्मेटिक्स उपकरणहरू प्रयोग गरिन्छ: SplitsTree4 सफ्टवेयर, Gubbins (न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमहरूमा पुनर्संयोजन मार्फत निष्पक्ष वंश) पाइपलाइन, र RDP4 (पुनःसंयोजन पत्ता लगाउने कार्यक्रम, संस्करण बिटा ४.१०१) सफ्टवेयर।
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 मा लागू गरिएको विभाजन विघटन विधि तथ्याङ्कीय प्रमाणीकरणको लागि Phi परीक्षण प्रयोग गरेर, रूटलेस फाइलोजेनेटिक नेटवर्क गणना गर्न प्रयोग गरिन्छ, र महत्व थ्रेसहोल्ड p = 0.05 हो। Parsnp को कोर बहु-संरेखण विश्लेषण इनपुटको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, र नेटवर्क मानकको रूपमा विभाजन विघटन प्राप्त हुन्छ।
Gubbins पाइपलाइन v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 माइकोब्याक्टेरियम बोभिसमा पुनर्संयोजनको प्रभाव मूल्याङ्कन गर्ने अर्को तरिकाको रूपमा पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरूसँग चल्छ। पाइपलाइनमा लागू गरिएको एल्गोरिथ्मले सान्दर्भिक क्लोन वंशलाई पुनर्निर्माण गर्दछ। हाम्रो डेटा सेटको पूर्ण जीनोम/ड्राफ्ट असेंबली र सन्दर्भ जीनोम (बोवाइन बोभिड AF2122/97, LT708304.1) पारस्परिक रूपमा छन्; र पुनर्संयोजन घटनालाई प्रतिनिधित्व गर्ने SNP क्लस्टर पत्ता लगाउन रूखको प्रत्येक शाखामा SNP को स्थिति स्क्यान गर्नुहोस्। शाखाको शून्य मान्नुहोस् कि कुनै पुनर्संयोजन घटना छैन, जसको अर्थ शाखामा हुने SNP हरू समान रूपमा वितरित हुनुपर्छ। Parsnp बाट कोर बहु संरेखण र RAxML बाट उत्कृष्ट स्कोर गरिएको ML रूख इनपुट फाइलहरूको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।
अन्तमा, Gubbins पाइपलाइन द्वारा सुझाव गरिएको पुनर्गठन घटना पुष्टि गर्न, RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 र SiScan66) मा लागू गरिएका छ एल्गोरिदमहरू पूर्वनिर्धारित सेटिङहरू अन्तर्गत Parsnp को कोर मल्टिपल पङ्क्तिबद्धतामा लागू गरिन्छ। हामीले निर्धारण गर्यौं कि RDP4 मा लागू गरिएका कम्तिमा तीन एल्गोरिदमहरूले प्रत्येक पुनर्संयोजन घटना प्रमाणित गर्न निरन्तर रूपमा महत्त्वपूर्ण संकेत प्रदर्शन गर्नुपर्छ।
Gubbins र RDP सफ्टवेयर दुवैले ५०० bp सम्मको विन्डोमा कोर मल्टिपल अलाइनमेन्टहरू जाँच गरेर पुनर्संयोजन संकेतहरू खोज्छन् भन्ने कुरालाई ध्यानमा राख्दै, र de novo एसेम्बलीको समयमा PE/PPE जीनहरूको समावेशले फेला परेका पुनर्संयोजन संकेतहरूमा हस्तक्षेप गर्दैन भनेर पुष्टि गर्दै, थप विश्लेषण homolinearity द्वारा गरिन्छ। पुनर्संयोजन घटना पहिचान गर्ने जीनको वरपरको क्षेत्र जाँच गर्नुहोस्। स्थानीय जीनोम ट्रान्सलोकेशन वा इन्भर्सनहरू बहिष्कार गर्न MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) प्रयोग गरेर पूर्ण जीनोम प्रयोग गर्ने synlinear नक्सा निर्माण गरिएको थियो। थप रूपमा, SyntTax वेब सर्भर (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) मार्फत एमिनो एसिड अनुक्रममा homolinearity विश्लेषण गर्न सम्पूर्ण जीनोम प्रयोग गरिएको थियो।
पोर्चुगिज बहु-होस्ट क्षयरोग प्रणालीबाट प्राप्त जीनोम डेटा सेटको थप गहन विश्लेषण भनेको साहित्यमा उल्लेख गरिएका जीनहरूको बहुरूपता जाँच गर्नु हो। यी जीनहरू 37,38 हुन् र HGT (DNA मर्मत, प्रतिकृति र पुनर्संयोजन) प्रणाली घटकहरू 39 मार्फत MTBC पूर्वजहरूले प्राप्त गरेको जीन एन्कोडिङ 3R हो। जीन विविधता र न्यूक्लियोटाइड विविधता (π) र ताजिमाको D तटस्थ परीक्षण प्यारामिटर इनपुट गणना गर्न ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) प्रयोग गर्नुहोस् र DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) प्रयोग गर्नुहोस्।
६९ माइकोप्लाज्मा बोभिस आइसोलेट र सन्दर्भ जीनोमहरूमा आधारित अधिकतम सम्भावना (ML) फाइलोजेनेटिक रूख प्राप्त गरियो (चित्र २A)। एकल-जीन-आधारित रूखहरू वा बहु-लोकस-आधारित रूखहरूको तुलनामा, यो रणनीतिले थप शक्तिशाली रूखहरूको उत्पादनलाई अनुमति दिन्छ जसले सम्पूर्ण जीनोमको परिवर्तनशीलतालाई कब्जा गर्दैन र त्यसैले प्रजातिहरू ६८,६९ बीच भेदभाव गर्ने कम क्षमता प्रदर्शन गर्दछ। ML रूखको टोपोलोजिकल संरचना सामान्यतया क्लोनको जटिल वर्गीकरणसँग मिल्दोजुल्दो हुन्छ। Eu2 को जीनोम एक शाखामा क्लस्टर गरिएको छ, र Af1 को जीनोम पनि सँगै क्लस्टर गरिएको छ (चित्र २A)। परिणाम माइकोब्याक्टेरियम बोभिसको ज्ञात विकासवादी सम्बन्धसँग पनि मिल्दोजुल्दो छ, अर्थात्, Eu1 सदस्य र अन्य सबै क्लोनल कम्प्लेक्स र जीनोमहरू मिलेर बनेको समूह बीच ठूलो भिन्नता छ, तर क्लोनल कम्प्लेक्स ३० निर्दिष्ट गरिएको छैन। क्लोनल कम्प्लेक्स र फाइलोजेनेटिक ट्रीमा देखिएको सम्बन्ध बीचको सानो असंगतिलाई क्लोनल कम्प्लेक्स विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रहरूमा आधारित वर्णन गरिएको तथ्यले व्याख्या गर्न सकिन्छ, जबकि फाइलोजेनेटिक ट्री सम्पूर्ण जीनोमलाई प्रतिनिधित्व गर्ने कोर जीनोमहरूको बहु पङ्क्तिबद्धतामा आधारित हुन्छ।
अधिकतम सम्भावना फाइलोजेनेटिक रूख (GTR) पुनर्संयोजन साइट हटाउनु अघि (A) र (B) पछि माइकोब्याक्टेरियम बोभिस जीनोमको कोर जीनोम पङ्क्तिबद्धताको आधारमा निर्माण गरिएको छ। शाखा रङहरूले माइकोब्याक्टेरियम बोभिस क्लोन जटिललाई प्रतिनिधित्व गर्दछ: युरोप १ बैजनी हो, युरोप २ रातो हो, युरोप ३ नीलो हो, अफ्रिका १ सुन्तला हो, र अफ्रिका २ हरियो हो। रूख जरा गाडिएको छ र स्केलमा तानिएको छ, र शाखाको लम्बाइ प्रत्येक साइटको लागि प्रतिस्थापनको रूपमा मापन गरिएको छ।
माइकोब्याक्टेरियम ट्युबरकुलोसिस कम्प्लेक्सलाई क्लोनलली विकसित भनी वर्णन गरिएको छ, र वर्षौंदेखि जम्मा भएका धेरैजसो प्रमाणहरूले यो विचारलाई समर्थन गर्दछ कि चलिरहेको HGT र पुनर्संयोजन घटनाहरू MTBC15,17,18 को पत्ता लगाउन सकिने स्तरमा हुने छैनन्।
अघिल्लो कामले देखाएको छ कि MTBC स्ट्रेनहरू बीच सीमित पुनर्संयोजन हुन सक्छ20,21, जबकि अन्यले मापनयोग्य पुनर्संयोजन घटनाहरू पहिचान गर्न असफल भएका छन्70,71। माइकोब्याक्टेरियम बोभिसमा केन्द्रित भएर यस मुद्दालाई पुन: छलफल गर्नुहोस्, जुन माइकोब्याक्टेरियम ट्युबरकुलोसिस 70,71 मात्र मान्ने अघिल्लो काम भन्दा फरक छ; वा MTBC लाई समग्रमा विचार गर्नुहोस्, लगभग कुनै M. bovis ले 20 प्रतिनिधित्व गर्दैन; वा केवल प्रतिबन्धित गाईवस्तु अंशहरूलाई विचार गर्नुहोस्। माइकोब्याक्टेरिया डेटासेट, यस काममा, सबै क्लोनल कम्प्लेक्सहरूको प्रतिनिधित्व गर्ने कुल 70 स्ट्रेनहरू छन्, जुन पुनर्संयोजनको लागि स्क्रिन गर्न प्रयोग गरिन्छ। डेटा सेट चार संचयी स्तरहरू अनुसार मापन गरिएको छ: (1) Eu2 सदस्यहरू, (2) सबै युरोपेली क्लोन जटिल सदस्यहरू (अर्थात् युरोप), (3) युरोपेली र अफ्रिकी क्लोन जटिल (Eu + Af) र (4) सम्पूर्ण डेटा संग्रहहरू (पहिले नै वर्णन गरिएको कुनै पनि क्लोनिङ जटिलहरूमा समावेश नगरिएका जीनोमहरू सहित)।
यस परिकल्पनालाई थप अध्ययन गर्न, जीनोमहरू बीच पुनर्संयोजन घटनाहरूको अनुपस्थितिको मूल्याङ्कन गर्न विभाजन-विघटन नेटवर्क प्रदर्शन गरिएको थियो, किनभने यो विधिले व्यक्तिहरू बीचको पुर्खा सम्बन्धको कल्पना गर्न सक्छ र विरोधाभासी फाइलोजेनेटिक संकेतहरू प्रदर्शन गर्न सक्छ। विश्लेषणमा रहेका सबै चार डेटा सेटहरूले नेटवर्कमा लूपहरूको अस्तित्व पुष्टि गरे (अर्थात्, एउटै रूखमा नमिल्ने क्षेत्रहरू), तर Phi परीक्षणमा कुनै तथ्याङ्कीय समर्थन छैन (Eu2, p = 0.0956; युरोप, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; सम्पूर्ण डेटा सेट p = 0.2451), जसले पुनर्गठन घटनाहरूको अस्तित्वको लागि कमजोर प्रमाण प्रदान गर्दछ (चित्र 3A-D)।
युरोपमा २ जीनोमहरू (n = ३७) (A), युरोपेली जीनोमहरू (n = ४४) (B), युरोपेली र अफ्रिकी जीनोमहरू (n = ५१) (C) र सम्पूर्ण डेटा सेट (n = ७०) (D) छन्।
यस विश्लेषण पछि, र सबै नेटवर्कहरूमा चक्रीय अवलोकनहरूलाई ध्यानमा राख्दै, गुबिन्स पाइपलाइनमा लागू गरिएको पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म क्लोनल वंश पुनर्निर्माण गर्न र एम. बोभिस जीनोममा पुनर्संयोजनको प्रभावको अनुमानलाई पूरक बनाउन लागू गरिएको थियो। पुनर्संयोजन घटनाहरूको संचयी संख्या अनुमान गर्नुहोस्, जसमध्ये धेरैजसो टर्मिनल शाखाहरूमा (अर्थात्, एकल जीनोममा) भएको थियो (तालिका २)। यी सूचकहरूले सम्पूर्ण डेटा सेटको स्थिरता देखाउँछन् र पुनर्संयोजन घटनाहरूको आवृत्ति उत्परिवर्तनको भन्दा २०० देखि ३०० गुणा बढी भएको संकेत गर्छन्। एक पटक शाखामा पुनर्संयोजन र बिन्दु उत्परिवर्तनको सापेक्षिक दरहरू प्रतिनिधित्व गर्ने rho/theta प्यारामिटर ०.००३७ र ०.००५६ (तालिका ३) बीचमा देखिन्छ। हालै, ३८ एम. बोभिस स्ट्रेनको प्रकाशित कार्यले यस डेटासेटमा प्राप्त गरिएको भन्दा उच्च rho/theta मान (rho/theta = ०.१) प्रदर्शन गर्यो, तर पटाने र सहकर्मीहरूको कामले पुनर्संयोजन प्यारामिटरहरू अनुमान गर्न सन्दर्भ-आधारित असेंबली प्रयोग गर्यो, एसेम्बली प्रक्रियाको कारणले गर्दा प्रक्रियागत विवरण टर्मिनल शाखामा पुटेटिभ पुनर्संयोजन घटनाहरूको प्रशस्ततासँग सम्बन्धित छ।
अर्को, r/m प्यारामिटरले पुनर्संयोजन र उत्परिवर्तन परिचयको विविधता अनुपातलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, र यसको औसत मान ०.०२५ र ०.०३७ को बीचमा छ, जसले उत्परिवर्तनको तुलनामा, पुनर्संयोजनले M. bovis को आनुवंशिक विविधतामा कम समग्र प्रभाव पार्छ भनेर संकेत गर्दछ (तालिका ३)। विस्तृत तुलनाको लागि, २३ जीनोमहरू मिलेर बनेको MTBC डेटासेटको लागि r/m प्यारामिटर अनुमान गर्न समान विधि प्रयोग गरिएको थियो, जसले ०.४८६२० को औसत मान देखाउँछ, जबकि Patané र सहकर्मीहरूको ३८ M. bovis डेटासेटको लागि, यसले औसत मान ०.९८ प्रमाणित गर्यो। पहिलो अध्ययनमा, M. bovis (M. bovis BCG र सन्दर्भ स्ट्रेन) को काममा २३ जीनोमहरू मध्ये केवल दुई समावेश थिए, त्यसैले प्राप्त मान M. tuberculosis जीनोमको अत्यधिक अभिव्यक्तिको कारण पक्षपाती हुन सक्छ। दोस्रो रिपोर्टमा, विश्लेषण गरिएको माइकोब्याक्टेरियम बोविस जनसंख्या मुख्यतया संयुक्त राज्य अमेरिका र पशुधन होस्टहरूबाट पुन: प्राप्त गरिएको थियो। यसको विपरित, हाम्रो डेटा सेटमा, धेरै भौगोलिक स्थानहरू र होस्ट प्रजातिहरू प्रतिनिधित्व गरिएका छन्, र फरक जनसंख्या आनुवंशिक विशेषताहरू भएका विभिन्न क्लोनल कम्प्लेक्सहरूमा समूहबद्ध जीनोमहरू पनि प्रयोग गरिन्छ, जसले गर्दा गहिरो र फराकिलो जनसंख्या ज्ञान प्राप्त हुन्छ। हाम्रो डेटा सेटसँग प्राप्त भिन्नता r/m औसत मान एउटै वर्गीकरण प्रजातिहरूलाई तोकिएका वंशहरू बीच पुनर्संयोजनको डिग्री धेरै फरक हुन्छ भन्ने अवधारणासँग मेल खान्छ, त्यसैले यी परिणामहरूले संकेत गर्छन् कि M. bovis क्लोन कम्प्लेक्सले पुनर्संयोजन भिन्नताहरू प्रदर्शन गर्न सक्छ। प्रभाव Didelot र Maiden72 द्वारा सुझाव गरिएको पनि छ। तैपनि, M. bovis जीनोमहरूको ठूलो संख्या समावेश गरेर यो डेटा सेटलाई उल्लेखनीय रूपमा विस्तार गर्नाले यस बिन्दुको थप स्पष्टीकरणको लागि अनुमति दिनेछ। r/m र rho/theta दुवै प्यारामिटरहरूले शाखाहरू बीच परिवर्तनशीलता देखाउँछन्, र यो परिणाम अन्य ब्याक्टेरिया प्रजातिहरूको रिपोर्टहरूसँग मेल खान्छ72,73।
अन्तमा, गुबिन्स पाइपलाइनद्वारा पहिचान गरिएका पुनर्गठन घटनाहरू पुष्टि गर्न, RDP4 सफ्टवेयरमा छवटा फरक एल्गोरिदमहरू प्रयोग गरियो जसले स्वतन्त्र रूपमा विभिन्न कोर बहु-तुलनाहरू परीक्षण गर्दछ। विश्वव्यापी रूपमा, गुबिन्सद्वारा पहिचान गरिएका घटनाहरू मध्ये आधा भन्दा कम RDP4 द्वारा पुष्टि गरिएको थियो (तालिका ४ र ५)। सम्पूर्ण डेटा सेटलाई विचार गर्दा, तीन पुनर्गठन घटनाहरू पुष्टि भएका थिए, दुई आन्तरिक नोडहरू समावेश थिए र अर्को टर्मिनल शाखामा एकल जीनोम समावेश थिए, जसको लागि क्लोनल कम्प्लेक्सहरू तोक्न सकिएन (तालिका ४ र ५)। टर्मिनल शाखाहरूमा घटनाहरूको पहिचानले समकालीन M. bovis स्ट्रेनहरूमा पुनर्गठन अझै प्रगतिमा रहेको संकेत गर्न सक्छ वा परिणाम गलत ठाउँमा छ70। यस काल्पनिक पुनर्गठन क्षेत्रमा, लगभग २०% स्थानहरूमा अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइडहरू (N) छन्, जसले गर्दा पुनर्गठन संकेतलाई असर गर्छ (पूरक चित्र २)। थप रूपमा, यो क्षेत्रले rrs जीनलाई असर गर्छ, १६S राइबोसोमल आरएनएलाई एन्कोड गर्दै जुन अत्यधिक संरक्षित हुने अपेक्षा गरिएको छ, त्यसैले यो पुटेटिभ रिकोम्बिनेसन सिग्नल अनुक्रम त्रुटि वा गलत संरेखणको परिणाम हुन सक्छ। त्यसपछि Mb0003 र माइकोब्याक्टेरियम बोभिस AF2122/97 बीचको सम्पूर्ण जीनोम पङ्क्तिबद्धता गरिएको थियो, र अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइडहरू र SNPs को अस्तित्व पुष्टि गरिएको थियो, त्यसैले गलत संरेखणसँग सम्बन्धित सम्भावित समस्याहरू यस काममा लागू गरिएको जैविक जानकारीको कारणले थिएनन्। कार्यक्रम सिकेपछि देखा पर्यो।
आन्तरिक नोडहरूको पुनर्संयोजन क्षेत्रहरूमा कुनै पनि खाली ठाउँ वा अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइडहरू फेला परेनन् (चित्र ४ र ५)। यी घटनाहरूको सन्दर्भमा, एउटामा Eu2 जीनोम मात्र हुन्छ र pks12 जीनलाई असर गर्छ, जसले सम्भावित पोलिकेटाइड सिन्थेजलाई एन्कोड गर्छ; जबकि अर्को Eu1 जीनोममा दर्ता हुन्छ र सम्भावित नाइट्रेट रिडक्टेजलाई एन्कोड गर्ने narX जीनलाई असर गर्छ (तालिका ४)। सामान्यतया, पुनर्संयोजन विश्लेषणले देखाउँछ कि सांख्यिकीय समर्थनको साथ पुनर्संयोजन टुक्राहरूको सीमित संख्या छ, र अनुमानित सूचकहरूले संकेत गर्छन् कि पुनर्संयोजनले M. bovis वंशमा कम प्रभाव पार्छ। पुनर्संयोजन संकेत कम हुने अपेक्षा गरिएको छ, तर पृष्ठभूमि आवाजबाट वास्तविक विकास संकेत छुट्याउन महत्त्वपूर्ण छ, जुन एक चुनौतीपूर्ण कार्य हो। सन्दर्भ-आधारित एसेम्बली र बेमेल समस्याहरू 70, 71 द्वारा प्रस्तुत गरिएको आवाज संकेत कम गर्न, पूर्ण जीनोम बाहेक बाँकी सबैलाई स्क्र्याचबाट भेला गरिएको थियो, र QUAST पाइपलाइन विश्लेषण (पूरक तालिका १) द्वारा एसेम्बली गुणस्तर जाँच गरिएको थियो र सुनिश्चित गरिएको थियो। यसको अतिरिक्त, समग्र सर्वेक्षणको बलियोपन र शुद्धता प्रदान गर्न पूरक विश्लेषणहरूको एक श्रृंखला सञ्चालन गरिएको थियो। त्यसकारण, माइकोब्याक्टेरियम बोभिस AF2122/97 विरुद्ध पढ्ने म्यापिङद्वारा narX र pks12 जीनको अनुक्रमण गुणस्तर मूल्याङ्कन गरिएको थियो। विधि खण्डमा उल्लेख गरिएका मापदण्डहरू (कम्तिमा २० पठन र ०.९ परिवर्तन आवृत्ति) लागू गरेर पुनर्संयोजन क्षेत्रमा सिफारिस गरिएको SNP स्थिति पुष्टि गरिएको थियो। narX जीनको बहुरूपता दुई जीनोमहरू (Mb1792361 र Mb7240415; 2.3%) र pks12 जीनोमहरूको जीनोमहरूमा पूर्ण रूपमा पुष्टि गरिएको थियो: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, र Mb12 जीनहरू। यद्यपि, जीनोम Mb2043 को लागि, आठ स्थानहरू मध्ये छ वटाले पढ्ने गहिराइ मापदण्ड पूरा गर्दैनन् किनभने SNP अधिकतम १७ रीडहरू द्वारा समर्थित छ, जुन २० को स्थापित कटअफ मान भन्दा कम छ। त्यसैले, यस जीनोम साइटमा छ वटा जीनोमहरू (८.६%) को पुनर्संयोजन पुष्टि गर्न सकिन्छ (चित्र ४ र ५)।
माइकोब्याक्टेरियम बोभिस डेटासेटको पुनर्संयोजन क्षेत्र पङ्क्तिबद्धताको विस्तृत दृश्यावलोकनले सम्भावित नाइट्रेट रिडक्टेजलाई एन्कोड गर्ने narX जीनलाई असर गर्छ। आन्तरिक नोडहरूको पुनर्संयोजन क्षेत्रमा कुनै अन्तर वा अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइडहरू फेला परेनन्। यो विशेष घटना Eu1 जीनोममा दर्ता गरिएको छ। माइकोब्याक्टेरियम बोभिस AF2122/97 को पठनहरू प्लट गरेर narX जीनको अनुक्रमण गुणस्तर मूल्याङ्कन गरिएको थियो। विधि खण्डमा उल्लेख गरिएका मापदण्डहरू लागू गरेर पुनर्संयोजन क्षेत्रमा सिफारिस गरिएको SNP स्थान पुष्टि गर्नुहोस् (कम्तिमा २० पठनहरू र ०.९ परिवर्तन आवृत्ति)। Mb1792361 र Mb7240415 (२.३%) को जीनोमहरूमा narX जीनको बहुरूपता पूर्ण रूपमा पुष्टि भएको थियो।
pks12 जीनलाई असर गर्ने माइकोप्लाज्मा बोभिस डेटासेटको पुनर्संयोजन क्षेत्र पङ्क्तिबद्धताको विस्तृत दृश्यावलोकन। आन्तरिक नोडहरूको पुनर्संयोजन क्षेत्रमा कुनै खाली ठाउँ वा अपरिभाषित न्यूक्लियोटाइडहरू फेला परेनन्। सम्भावित पोलिकेटाइड सिन्थेजलाई एन्कोड गर्ने pks12 जीनलाई असर गर्ने घटनाको सन्दर्भमा, यसमा Eu2 जीनोम मात्र समावेश छ। pks12 को अनुक्रमण गुणस्तर माइकोब्याक्टेरियम बोभिस AF2122/97 को पठन म्यापिङद्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो। विधि खण्डमा उल्लेख गरिएका मापदण्डहरू लागू गरेर पुनर्संयोजन क्षेत्रमा सिफारिस गरिएको SNP स्थान पुष्टि गर्नुहोस् (कम्तिमा २० पठन र ०.९ परिवर्तन आवृत्ति)। Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, र Mb1960 जीनोमहरूको बहुरूपता पूर्ण रूपमा पुष्टि गरिएको छ।
PE र PPE जीनहरूमा दोहोरिने क्षेत्रहरू हुन्छन् जुन Illumina sequence र mismapping द्वारा सजिलै गलत पढ्न सकिन्छ, त्यसैले तिनीहरू सामान्यतया M. tuberculosis सदस्यहरूको बायोइन्फर्मेटिक्स कार्यप्रवाहबाट म्यापिङ-टु-सिक्वेन्स रणनीति प्रयोग गर्दा मात्र मेटाइन्छ। यस कार्यमा लागू गरिएका पुनर्संयोजन घटनाहरूको निष्कर्ष PE/PPE फिल्टर नगरी de novo असेंबलीमा आधारित छ। हामी विश्वास गर्छौं कि SplitsTree, Gubbins पाइपलाइन र RDP4 सफ्टवेयर मार्फत तीन फरक पूरक विधिहरू र एल्गोरिदमहरू लागू गरेर, लागू गरिएका रणनीतिहरू त्रुटि संकेतहरूको कारणले गर्दा पुनर्गठित क्षेत्रहरूलाई प्रशोधन र फिल्टर गर्न बलियो छन्। यद्यपि, SNP क्लस्टरहरू पहिचान गर्न Gubbins र RDP4 सफ्टवेयरमा PE/PPE जीनको हस्तक्षेपलाई बहिष्कार गर्न, र त्यसैले narX र pks12 जीनहरूलाई असर गर्न प्रस्तावित पुनर्संयोजन क्षेत्रहरूको पहिचान गर्न, यी जीनहरूको छिमेकको जाँच गरिएको थियो (पूरक चित्र 3-5)। M. bovis AF2122/97 मा, narX जीनलाई narK2 र Mb1764c ले छुट्याइएको छ, जबकि pks12 Mb2075c e Mb2073c ले घेरिएको छ (पूरक चित्र 3-5)। पूर्ण जीनोमको MAUVE सिङ्लाइन नक्सा प्रयोग गरेर उत्पन्न गरिएको नक्साले जीन अनुक्रम संरक्षण र पुनर्व्यवस्थितको बारेमा जानकारी प्रदान गर्दछ, चार कोलिनियर ब्लकहरू देखाउँदै, र जीनोम ट्रान्सलोकेशन वा उल्टोको कुनै संकेत छैन। थप रूपमा, एमिनो एसिड अनुक्रमको साथ पूरक विश्लेषणले सबै पूर्ण जीनोमहरूमा समरूपता प्रमाणित गर्यो, र narX वा pks12 को छेउछाउका क्षेत्रहरूमा कुनै PE/PPE फेला परेन। narX को लागि, एउटा जीनोम (Mb0030) को समानार्थी स्कोर कम छ किनभने narX जीनलाई दुई टुक्राहरू (टुक्राहरू 1891 र 1890) को रूपमा पहिचान गरिएको थियो। pks12 को लागि, समानताका कारण, Mb0030 र Mb003 ले कम समरेखीयता स्कोरहरू प्रदर्शन गरे, जबकि pks12 क्रमशः दुई र तीन टुक्राहरूमा पहिचान गरिएको थियो, जसले प्रोटीनको फरक डोमेनहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ (पूरक चित्र 3-5)। यो जानकारीलाई ध्यानमा राख्दै, र Gubbins र RDP4 सफ्टवेयर दुवैले विश्लेषण गर्छन्, विन्डोमा अधिकतम 500 bp को कोर बहु संरेखण जाँच गर्नुहोस्, हामीले पुष्टि गर्यौं कि PE/PPE जीनले narX र pks12 लाई असर गर्ने पुनर्संयोजन संकेतमा हस्तक्षेप गर्दैन।
यद्यपि यस डेटा सेटमा पत्ता लगाइएका पुनर्संयोजन संकेतहरूलाई अवशिष्ट मान्न सकिन्छ, यो सत्य हो कि एम. बोभिसमा पुनर्संयोजनलाई अस्वीकार गर्न सकिँदैन, त्यसैले यो थप विश्लेषणको विषय बनिरहनुपर्छ, जसमा विभिन्न महामारी विज्ञान परिदृश्यहरूबाट सम्पूर्ण जीनोमहरूलाई महत्त्वपूर्णमा क्रमबद्ध गरिन्छ।
पुनर्संयोजन सुधार अघि र पछि प्राप्त ML फाइलोजेनेटिक रूखहरूको तुलना गर्दा (चित्र 2A, B) अनुमानित फाइलोजेनेटिक सम्बन्धमा उल्लेखनीय परिवर्तनहरू भएनन्, र M. bovis स्ट्रेनहरू एउटै समूहमा क्लस्टर गरिएका थिए।
M. bovis AF2122/97 को सन्दर्भ जीनोमसँग ४२ नयाँ अनुक्रमित M. bovis रीडहरू म्याप गरेपछि, १८१६ बहुरूपी स्थितिहरू भएको SNP पङ्क्तिबद्धता प्राप्त भयो। धेरैजसो SNP हरू (८७.१%) कोडिङ क्षेत्रमा अवस्थित छन्, र प्रभावित जीनहरू बोभिलिस्ट (चित्र ६A, B) मा देखाइएका कार्यात्मक कोटीहरू अनुसार चित्रण गरिएका छन्। प्रत्येक कार्यात्मक श्रेणीमा जीनहरूको कुल संख्यालाई ध्यानमा राख्दै, "लिपिड मेटाबोलिज्म" श्रेणीमा रहेका जीनहरूले धेरै SNP हरू देखाए, त्यसपछि "कोशिका पर्खाल र कोशिका प्रक्रियाहरू" र "मध्यवर्ती चयापचय र श्वसन", जसले तिनीहरू M. bovis विकासमा रहेको प्रकट गर्दछ।
पोर्चुगलबाट एम. बोभिस डेटासेटको पदानुक्रमिक विश्लेषण (n = ४२)। प्रत्येक कार्यात्मक श्रेणी (A) को लागि दर्ता गरिएको SNP र प्रभावित जीनहरूको कुल संख्या। प्रकार्य श्रेणी (B) द्वारा दर्ता गरिएको पर्यायवाची र गैर-समानार्थी परिवर्तनहरूको कुल संख्या।
विश्वव्यापी स्तरमा, औसत dN/dS अनुपात १.५ भन्दा राम्रो छ, जसले विश्वव्यापी विकासवादी दबाब पुर्खाको अवस्थाबाट छुटकारा पाउनको लागि हो र सकारात्मक (विविध वा निर्देशित) र/वा आरामदायी शुद्धीकरण छनौट परिदृश्यलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ भन्ने संकेत गर्दछ। "भाइरुलेन्स, डिटोक्सिफिकेशन, अनुकूलन", "इन्सर्सन सिक्वेन्स र फेजहरू", र "नियामक प्रोटीन" को कोटीहरूमा, दुई तिहाइ भन्दा बढी SNP हरू समानार्थी छैनन् (चित्र ६B)।
सबै वर्गहरूमा, धेरै SNP भएका जीनहरू छन्, जसले गर्दा औसत उत्परिवर्तन दर (अर्थात्, प्रति जीनको औसत SNP) १ भन्दा बढी हुन्छ (चित्र ६A)। १५ SNP भएको Pks12 (Mb2074c) र ८ SNP भएको fas (Mb2553c) मा उच्च उत्परिवर्तन मानहरू छन्। यी दुवै जीनहरू फ्याटी एसिड मेटाबोलिज्ममा संलग्न छन्। pks जीनले पोलिकेटाइड सिन्थेज (PKS) लाई एन्कोड गर्दछ, जुन माइकोब्याक्टेरियल कोशिका भित्ता लिपिड बायोसिन्थेसिसमा संलग्न एक बहु-कार्यात्मक इन्जाइम हो74,75। यो जीनले माइकोकेटाइड्स74,76 को संश्लेषणमा संलग्न एक बहु-कार्यात्मक पोलिपेप्टाइडलाई एन्कोड गर्दछ। फास जीन माइकोलिक एसिडको संश्लेषणमा संलग्न छ। यी दुवै जीनहरूले होस्टसँग सम्पर्कमा रहेको कोशिका भित्ताको जैव-संश्लेषणमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन्।
माइकोब्याक्टेरियम बोभिसको विकासको थप अध्ययन गर्न, विशिष्ट जीनहरूको दुई सेटहरू विश्लेषण गरिएको थियो। अनुक्रम संरचना र फाइलोजेनेटिक विधिहरू प्रयोग गरेर पहिले प्रकाशित कार्यहरूले विविधीकरण अघि HGT मार्फत MTBC पुर्खाहरूले प्राप्त गरेका जीनहरू पहिचान गरे37,38। यी जीनहरू पूरक तालिका 2 मा सूचीबद्ध छन्। HGT सँग सम्बन्धित हुन सक्ने कुल 77 जीनहरूको SNP वितरणको विश्लेषण गरिएको थियो, र 26 बहुरूपी साइटहरू पहिचान गरिएको थियो, जुन धेरैजसो अवस्थामा (78%) गैर-समानार्थी (NS) परिवर्तनहरूमा परिणत भएको थियो (पूरक तालिका 2)। MTBC जीनोममा अघिल्लो कामले देखाएको छ कि पुटेटिभ HGT क्षेत्रले बाँकी जीनोमको तुलनामा उच्च NS SNP अनुपात प्रदर्शन गर्दछ। यदि कसैले सोच्दछ कि यी पुनर्संयोजन क्षेत्रहरू MTBC पुर्खाहरूले प्राप्त गरेका थिए, र त्यसैले, तिनीहरूले प्राचीन बहुरूपताहरूलाई बढी प्रतिनिधित्व गर्छन्, भने पर्यायवाची परिवर्तनहरूको अनुपात उच्च हुने अपेक्षा गरिएको छ, किनभने NS प्रतिस्थापनहरू नकारात्मक चयनद्वारा हटाइने अपेक्षा गरिएको छ किनभने एमिनो एसिड परिवर्तनहरूले प्रोटीनको कार्य परिवर्तन गर्न सक्छ। त्यसकारण, हाम्रा नतिजाहरूले संकेत गर्छन् कि कार्यात्मक परिणामहरू HGT-जस्तो जीनको प्रतिस्थापनबाट उत्पन्न हुन सक्छन्, जसले मूल्यवान अनुकूली आनुवंशिक विविधताको लागि तिनीहरूको महत्त्वलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ।
यस विश्लेषणको समानान्तरमा, 3R (DNA मर्मत, प्रतिकृति, र पुनर्संयोजन) प्रणालीका घटकहरूलाई एन्कोड गर्ने जीनहरूलाई dos Vultos र सहयोगीहरू (2008)39 द्वारा पहिले प्रकाशित सूची अनुसार राम्ररी जाँच गरिएको थियो। समान DNA टुक्राहरूको आदानप्रदान प्रत्यक्ष रूपमा अवलोकन गर्न सकिँदैन, यद्यपि यो बारम्बार प्रक्रिया हुन सक्छ जब नजिकबाट सम्बन्धित ब्याक्टेरियाहरू संलग्न हुन्छन्, जस्तै यो डेटा सेटको मामलामा; थप रूपमा, यो प्रक्रिया DNA मर्मत विधिहरूको कुञ्जी हुन सक्छ72, त्यसैले समरूप पुनर्संयोजनमा भूमिका खेल्नुहोस्। 54 जीनहरू द्वारा वितरित कुल 26 बहुरूपी स्थितिहरू पहिचान गरियो (पूरक तालिका 3)। जीनहरूको यस सेटमा, NS परिवर्तनहरूले परिणामहरूको लगभग 65% को लागि जिम्मेवार थियो, जुन माइकोब्याक्टेरियम ट्युबरकुलोसिस स्ट्रेनहरूमा अघिल्लो रिपोर्टहरूसँग मेल खान्छ।
पोस्ट समय: अक्टोबर-२१-२०२१