Hatur nuhun pikeun ngadatangan Alam. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan terbatas pikeun CSS. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo versi browser anu langkung énggal (atanapi mareuman modeu kasaluyuan dina Internet Explorer). Dina waktos anu sami, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal nampilkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Sequencing génom geus revitalized widang panalungtikan kasakit tepa, nembongkeun epidemiology kasakit, pathogenesis, interaksi host-patogén, sarta prosés évolusionér ditumpukeun dina patogén. Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) nganggap Mycobacterium bovis minangka salah sahiji anggota adaptif sato anu ngabalukarkeun tuberkulosis (TB) dina mamalia darat, sarta mangrupa modél has évolusi baktéri. Sapertos anggota MTBC anu sanés, Mycobacterium bovis dianggap patogén anu diklon sacara ketat, ngembang lalaunan, sareng écés henteu aya tanda-tanda rékombinasi atanapi transfer gen horizontal. Dina karya ieu, urang nerapkeun génomics komparatif ka sakabeh runtuyan génom (WGS) dataset diwangun ku 70 sapi M. ti silsilah béda (Éropa jeung Afrika) pikeun meunangkeun wawasan ngeunaan diversity genetik sapi M. Évolusionér kakuatan. Tilu métode anu béda digunakeun pikeun ngira-ngira tanda-tanda reorganisasi. Sacara global, sajumlah leutik kajadian rekombinasi parantos diidentifikasi sareng dikonfirmasi ku dua metode mandiri kalayan dukungan anu kuat. Sanajan kitu, dibandingkeun jeung mutations, rekombinasi boga pangaruh lemah dina diversity of M. bovis (sakabéh r / m = 0,037). Beda r / m rata-rata diala dina kompléks clonal of Mycobacterium bovis dina susunan data kami konsisten jeung konsép umum yén darajat rekombinasi bisa greatly rupa-rupa antara lineages ditugaskeun ka spésiés taksonomi sarua. Dumasar kana karya ieu, rekombinasi dina Mycobacterium bovis teu bisa maréntah kaluar, jadi kudu jadi subyek usaha salajengna dina panalungtikan génomics komparatif hareup, nu WGS susunan data badag tina skenario epidemiological béda sakuliah dunya krusial. Analisis tambahan lajeng dipigawé dina set data Mycobacterium bovis leutik (n = 42) ti Prévalénsi TB multi-host, sarta leuwih ti 1.800 loci dicirikeun, nu sahanteuna hiji galur némbongkeun hiji polymorphism nukléotida tunggal (SNP). Paling (87,1%) lokasina di wewengkon coding, sarta babandingan global parobahan non-sinonim (dN / dS) parobahan sinonim ngaleuwihan 1,5, nunjukkeun yen Pilihan positif mangrupa gaya évolusionér penting exerted on M. bovis. Proporsi SNP anu langkung luhur dideteksi dina gén anu beunghar ku kategori fungsional "metabolisme lipid", "dinding sél sareng prosés sélulér", sareng "métabolisme sareng réspirasi panengah", ngungkabkeun poténsina dina biologi sareng évolusi pentingna Mycobacterium bovis. A katingal ngadeukeutan dina gén dina karuhun MTBC anu rawan mindahkeun gén horizontal sarta kaasup dina 3R (perbaikan DNA, réplikasi, sarta rekombinasi) sistem nembongkeun nilai négatip rata global tina uji nétral D Taijima urang, nu nunjukkeun kaliwat scanning selektif.
Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) mangrupikeun salah sahiji takson anu paling suksés pikeun patogén baktéri sareng kasus évolusi baktéri. Anggotana nunjukkeun identitas nukléotida anu kacida luhurna dina tingkat génomik (> 99%)1,2. Ékotip MTBC anu béda-béda tiasa nyababkeun tuberkulosis (TB), anu mangrupikeun panyakit granulomatosa tepa, dina rupa-rupa spésiés inang ti mamalia mikro ka manusa3,4,5. Ayeuna, komplek kalebet manusa [M. Tuberkulosis (Mtb), Mycobacterium africanum] sareng patogén anu diadaptasi sato (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surikampanzee, "Bacillus", "Bacillus". M. canettii (ogé katelah "Nodobacter glabrata") Rata-rata identitas nukléotida jeung mycobacteria disebut tadi nyaeta 98%, jeung karya génomics komparatif geus ditémbongkeun yén M. canettii jeung sesa MTBC geus anyar diverged ti karuhun umum.7 Tempo konsép ieu, sababaraha pangarang nelepon M. canettii Anggota MT.
MTBC sacara sistematis didadarkeun salaku kompleks klonal anu ketat, sareng struktur populasina jelas diatur ku ngirangan karagaman, bottlenecks, scanning selektif, sareng drift genetik9,10. Anggap évolusi klonal ketat kompléks, kayaning polymorphisms leungit teu bisa dibalikeun ku rekombinasi. Dumasar kana premis ieu, acara padeukeut tina ngahapus génomik wewengkon diferensial (RD) jeung TbD1 (Mtb husus ngahapus 1 wewengkon) geus diajukeun salaku spidol molekular MTBC évolusi2,5,11. Genomics komparatif jeung sakabeh génom sequencing (WGS) karya ngarojong division anggota manusa-diadaptasi kana salapan lineages (Mycobacterium tuberculosis L1 mun L4, L7, jeung L8; sarta Mycobacterium africanum L5, L6, jeung L9), turunan L2 mun L4 dibagikeun ngahapus TbD1 region2,11. Salaku tambahan, anggota diadaptasi sato diusulkeun pikeun ngabagi karuhun anu sami, anu didefinisikeun ku penghapusan khusus clade dina RD7, RD8, RD9 sareng RD102, 5, sareng 14.
Mindahkeun gén horizontal (HGT) jeung acara rekombinasi dianggap langka tur lumangsung dina karuhun MTBC, tinimbang sajarah béda ti sakabéh anggota MTBC15,16,17. Dua laporan awal ku Hughes and collaborators (2002) jeung Gutacker and collaborators (2006) ngusulkeun yén acara rekombinasi bisa mantuan polymorphisms bentukna nu nandaan loci husus dina M. tuberkulosis galur18,19. Alesan pikeun kurangna rekombinasi anu jelas dina MTBC nyaéta: (1) prosés mékanis sareng leungitna kamampuan HGT; (2) jarang kajadian HGT; (3) euweuh kasempetan kajadian rekombinasi dina MTBC niche14,17. Nu anyar, sababaraha studi sequencing sakabeh-génome (WGS) dilarapkeun ka MTBC galur 20 jeung Mycobacterium bovis 21 geus disadiakeun bukti rekombinasi, kahiji pikeun mintonkeun yen galur MTBC mindeng tukeur fragmen DNA leutik, tapi alatan variasi runtuyan nukléotida kawates, kajadian ieu masih aya teu noticed.
Mycobacterium bovis nyaéta anggota MTBC anu paling sering pulih tina peternakan (utamana sapi), sanaos ogé tiasa diisolasi tina sato liar jarak bébas sareng dipager4,22,23,24. M. bovis mekar jadi lima kompléx klonal utama [Éropa 1 (Eu1), Éropa 2 (Eu2), Éropa 3 (Eu3), Afrika 1 (Af1) jeung Afrika 2 (Af2)], nurutkeun profil spoligotyping, ngahapus husus Jeung polymorphisms nukléotida tunggal (SNPs) 25, 27,26, spésifik 25, 26, 25, 92 Kompléks klonal ieu nunjukkeun rupa-rupa struktur populasi Mycobacterium bovis sareng pakaitna sareng daérah géografis. Sajaba ti éta, karya WGS panganyarna dilumangsungkeun ku Zimpel na collaborators (2020) dirancang hiji filogeni dumasar kana SNP of Mycobacterium bovis, kalawan leuwih ti 1.900 génom, nunjukkeun yen aya sahanteuna opat katurunan béda (ngaranna Lb1 mun Lb1 mun Lb4), aranjeunna henteu sagemblengna konsisten jeung kompléks géografis saméméhna bisa dikonfirmasi, sanajan clo30. Pangarang ieu ngalaksanakeun analisis diferensial filogéni sareng dating molekular, tapi henteu diajar rekombinasi30.
Karya saméméhna ngagunakeun téhnik molekular béda, kayaning spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed ulang Unit-variabel tandem angka ulangan), sarta ketikan SNP panganyarna wangsit tingkat nu tangtu diversity genetik diantara M. bovis galur 31,32,33, 34,35. Diferensiasi variasi genetik geus jadi alat penting dina ulikan ngeunaan epidemiology kasakit, nu mantuan pikeun pamahaman di-jero pathogenesis, virulensi jeung transmisi kasakit. Mecenghulna métode WGS nyadiakeun kamungkinan pikeun nembongkeun faktor nyetir évolusionér ditumpukeun ku génom Mycobacterium bovis dina prosés adaptasi jeung kegigihan ka host béda jeung skenario epidemiological.
Dina karya ieu, urang ngagunakeun analisis génomik komparatif dina rupa-rupa susunan data Mycoplasma bovis (n = 70), kaasup isolat ti kompléx klonal béda, mangtaun wawasan prosés évolusionér Mycoplasma bovis, utamana pikeun ngabéréskeun hubungan phylogenetic Jeung acara rekombinasi. Salaku suplement kana analisis ieu, a set sub-data M. bovis ngasingkeun (n = 42) dicandak ti well-dicirikeun wewengkon tuberkulosis multi-host di Portugal 31,36 ieu salajengna digali mun infer non-identitas Kasaimbangan antara babandingan relatif rasa (dN) kana sinonim (dS) substitusi nukléotida, kitu ogé kontribusina tina pustaka dina évolusi nukléotida husus. 37,38 diala ku karuhun MTBC ngaliwatan HGT, sarta encode 3R (perbaikan DNA, réplikasi, sarta rekombinasi) komponén gén sistem 39. Milih gén diala ngaliwatan HGT sabab bisa ngagambarkeun polymorphisms kuna, jadi diperkirakeun yén maranéhna bisa ngandung proporsi luhur parobahan sinonim. Gén nu kaasup dina sistem 3R dipilih sabab karya saméméhna dina M. tuberkulosis galur dituduhkeun umum négatip / selections purifikasi nu dianggo dina gén ieu, jeung maranéhna bisa maénkeun peran penting dina évolusi 39. Tujuan sejen karya ieu infer ayana kajadian reorganisasi. Ku sabab kitu, tempo yén dataset kami ti Portugal ngan ngandung génom of Éropa clone kompléks 2 jeung galur nu teu ditugaskeun kompléks clone, urang mutuskeun pikeun ngawengku data génom sadia masarakat awam pikeun tungtungna ménta wawakil sadaya kompléx clone, sarta Ngaronjatkeun ketahanan sarta breadth hasil.
42 Génom Mycoplasma bovis anu anyar diurutkeun tina pamandangan tuberkulosis multi-host endemik Portugis (detail di handap), anu saméméhna dicirikeun tina sudut pandang epidemiologis36, mangrupikeun pusat padamelan ieu. Tempo yén set data ti Portugal ngan boga wawakil Éropa 2 kompléx clone jeung galur tanpa kompléx ditunjuk, sadia masarakat awam data sequencing sakabeh génom geus ditambahkeun rék dilegakeun set data nu ngawengku sakabéh wawakil M. bovis clone kompléx. Ku alatan éta, tilu sumber data sequencing sakabeh génom dipaké dina karya ieu: lengkep / draf assembly génom, nepi ka 10 scaffolds disimpen di NCBI (Puseur Nasional pikeun Émbaran Biotéhnologi) (n = 15 isolat); disimpen dina SRA (The Illumina fastq file tina urutan maca arsip) ngagambarkeun diversity kompléks M. bovis clones (n = 12 isolates)30; jeung 42 génom anyar sequenced ti Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) teu kaasup ti pilarian NCBI. M. bovis AF2122/97 biasana dipaké salaku génom rujukan pikeun kaasup kana dataset nu. Kusabab henteu kasadiaan umum tina sakabeh sekuen génom anu diwakilan ku kompleks kloning Afrika 1, sareng sajumlah leutik génom tina galur wawakil Af2 sareng Eu1, data sequencing asli anu disayogikeun ku SRA dianggo dina kasus ieu. Karya Zimpel sareng kolaboratorna (2020) ngabantosan ngaidentipikasi génom tina kompleks kloning anu kasebat sareng ngabantosan milih Mycobacterium bovis pikeun dilebetkeun kana set data. Pikeun Eu3, ngan ukur hiji jinis génom anu dijelaskeun (Branger et al., 2020), ku kituna génom anu kami kalebet mangrupikeun perwakilan anu misah tina kompleks Eu3.
Sacara global, set data ieu ngawengku 70 sapi M. bovis diisolasi tina 8 spésiés inang, disebarkeun di 12 nagara ti 1985 nepi ka 2016. 36 spésiés nu ditunjuk salaku Eu2, 7 spésiés nu Eu1, 1 spésiés nu Eu3, 3 spésiés nu Af1, 4 spésiés nu Af2 jeung 19 nu teu disababkeun ku kompléks clonal mana wae. Inpormasi anu lengkep (kalebet nomer digentos) Mycobacterium bovis anu dianggo dina ulikan ieu dipidangkeun dina Tabél 1 sareng Tabél Tambahan 1.
42 karek sequenced sakabeh génom Mycobacterium bovis ti hotspot tuberkulosis sato Portugal sarta disebarkeun pikeun leuwih ti 12 taun mangrupakeun puseur ulikan ieu, salaku poténsi sistem kasakit satwa-peternakan geus rutin diawaskeun 31,36 (Suplemén Gbr. 1). Nurutkeun kana prosedur saterusna, galur ieu diisolasi tina sapi (n = 14), kijang beureum (n = 16) jeung babi hutan (n = 12) ti 2003 nepi ka 2015: ngumpulkeun jeung nanganan sato luyu jeung tungtunan protokol dianjurkeun. Kabudayaan diinkubasi dina suhu 37 °C sareng pertumbuhanna dipariksa saminggu sakali salami sahenteuna 12 minggu. Koloni disimpen langsung dina larutan gliserol dina suhu -80ºC. Dina médium selektif Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), sampel arsip aslina dialirkeun ngaliwatan petikan in vitro tunggal in vitro pikeun ménta DNA tina program WGS. Pikeun ieu, leyuran stock budaya beku ieu enriched kalawan 5% natrium piruvat jeung 10% ADS (50 g albumin, 20 g glukosa, 8,5 g natrium klorida dina 1 L cai) dina Middlebrook 7H9 dina 37 ° C Ngalatih deui. Sanggeus 4 minggu tumuwuh, sedeng ieu renewed jeung budaya ieu rutin diawaskeun nepi ka tumuwuhna dititénan. Sél-sél dipanen ku sentrifugasi, pélét disuspensi deui dina 500 µL phosphate buffered saline (PBS), dipanaskeun dina 99 °C salila 30 menit, disentrifugasi, sarta supernatan disimpen dina -20 °C nepi ka WGS. Sadaya prosedur dilaksanakeun di fasilitas biosafety tingkat 3.
Perpustakaan génom dipasangkeun-tungtung WGS disiapkeun ngagunakeun indéks unik unggal sampel DNA, sarta ngagunakeun Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 sampel) jeung HiSeq (2 × 150 pb) (dua isolat) téhnologi (Eurofins Genomics, Jérman) pikeun sequencing. Nurutkeun kana parentah produsén urang, ngagunakeun Illumina Génom Analyzer kalawan kantétan modul ganda-réngsé pikeun runtuyan DNA génomik, sarta ngagunakeun Nextera XT DNA Perpustakaan Prep Kit ti Illumina pikeun ngawangun perpustakaan.
Nyandak kana akun data pulih tina SRA (n = 12), idéntifikasi kompléks clone bisa dipaké salaku metadata tina publikasi pakait 30, 41, 43. Lamun tempo génom lengkep, iwal Mycobacterium bovis AF2122/97 jeung Mycobacterium bovis 3601 Mycobacterium bovis 3601, nu 3601 Ecloud1 jeung anggota kompléx Ecocloud1nal, nu ngakuan 3601 cloud1 jeung anggota kompléks. 29, masing-masing, éta sami sareng génom lengkep Mycobacterium tuberculosis H37Rv (nomer digentos NCBI NC_000962.3). alignment génom dipigawé maké MAFFT (multiple alignment program asam amino atawa runtuyan nukléotida, versi 7.458) jeung parameter -addfragments48. Teras, milarian henteuna kompléx klonal anu béda sareng / atanapi ayana fitur SNP.
The karek sequenced Mycobacterium bovis (n = 42) jeung maca aslina tina draf génom dirakit (n = 3) align kompléks jeung génom rujukan Mycobacterium tuberculosis H37Rv ngaliwatan pipa vSNP jeung ayana ngahapus jeung / atawa fitur SNP of clones béda A pilarian ieu dipigawé.
Kumpulkeun inpormasi tina kurangna fitur sareng / atanapi ayana / henteuna profil SNP sareng spoligotyping pikeun napelkeun data génomik kana kompleks klonal anu saluyu. Pikeun opat rakitan draf, profil spoligotyping teu tiasa disimpulkeun, janten aranjeunna kalebet kana grup "henteu pajeulitna".
Aliran kerja bioinformatika anu dituturkeun ku karya ieu dimimitian ti assembly de novo sareng pemetaan kana strategi rujukan, kalayan tujuan ngajalajah kajadian rekombinasi sareng polimorfisme génom khusus. Gambar 1 nyadiakeun flowchart tina léngkah-léngkah anu dilaksanakeun. Pikeun analisis rékombinasi, sakabéh génom dipaké pikeun ngaronjatkeun kateguhan inferensi jeung indikator patali.
Dina raraga ngurangan kasalahan dina generasi runtuyan konsensus génom, urang mimitina diala de novo assembly, lajeng diala inti sababaraha alignments. Pipa Unicycler ayeuna sayogi di https://github.com/rrwick/Unicycler49 sareng dianggo pikeun ngalakukeun rakitan de novo tina 54 séquence génom (42 énggal diurutkeun sareng 12 file fastq pulih tina SRA). Pondokna, saméméh assembling ti scratch, analisis kualitas baca dipigawé dina FastQC versi 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), sarta versi Trimmomatic 0.36 (pilihan "motong Adapters jeung runtuyan cahaya-spésifik séjén tina maca" jeung "Cut basa ti tungtung 2 nu dibaca, lamun kualitas diterapkeun leuwih handap ti 2 threshold, lamun kualitas diterapkeun". (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Lajeng, SPAdes optimiser49 dipaké pikeun assembly génom, sarta versi Pilon 1.1851 dipaké pikeun optimasi pos-assembly. A mode bridging konservatif dipilih ulah assembly lepat, sarta k-mer ukuranana ieu searched tur dipilih antara 20% jeung 95% tina panjang dibaca. Turutan tungtunan SPAdes sarta mertimbangkeun ukuran maca, ngahapus contigs leutik batan 300 bp, sarta ngadegkeun 20 maca jero sinyalna cutoff of 52. Dina strategi assembly de novo, wewengkon génomik kayaning kacida repetitive proline-glutamat (PE) jeung proline-proline glutamat (PPE) paralogs teu dipiceun.
Kualitas assembly de novo ditaksir ngaliwatan pipa QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), nu facilitates pembaharuan contig jeung génom rujukan M. bovis AF2122/97 (nomer digentos NCBI LT708304.1) pemetaan (tingali Table tambahan 1 pikeun parameter kualitas).
Kalayan bantuan pipa vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), file FASTQ tina M. bovis karek sequenced ti Illumina sequencing dibandingkeun jeung M. bovis AF2122/97 génom rujukan (LT708304.1)). Nurutkeun kana saran prakték pangalusna tina Génom Analisis Toolkit (GATK) 53, 54, 55 nerapkeun parameter filter baku atawa skor massa varian pikeun recalibration. Hasilna disaring ngagunakeun skor massa SAMtools panghandapna 150 sarta AC = 2. Ogé ngagunakeun Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) pikeun pariksa bacaan pikeun aturan kaluar kontaminasi. Pipa vSNP anu dianggo pikeun peta pikeun ngaruntuykeun strategi dina padamelan urang mariksa séri SNP sareng target anu ditetepkeun, sareng ogé henteu kalebet skenario inféksi anu dicampur. Sinyalna génom anu dibaca langkung saé tibatan 99% (Tabel Tambahan 1).
Pikeun ngahindarkeun kasalahan pemetaan sareng SNP anu salah, nyaring varian dina kasus di handap ieu: (1) dirojong ku bacaan kirang ti 20, (2) mendakan frekuensi kirang ti 0,9, (3) sahenteuna dina hiji Galur, tapi sahenteuna aya jurang dina galur anu sanés. The terpadu genomics viewer (IGV) versi 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 ieu dipaké pikeun visually pariksa SNPs jeung posisi jeung masalah pemetaan atawa alignment. Kusabab gén proline-glutamat (PE) jeung proline-proline glutamat (PPE) anu kacida duplikat sarta mangrupa bagian ti kulawarga multi-gén, aranjeunna gampang salah harti ku Illumina sequencing na mismapping, jadi aranjeunna pikaresep The mycobacterial bioinformatics workflow dipiceun anggota kompléks tuberkulosis nalika ngagunakeun strategi pemetaan SNP mun sequence. Ku alatan éta, kami disaring kaluar gén PE / PPE sarta indels tina analisis.
Numutkeun Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), sadaya SNP dibagi kana kategori fungsional. Pipa SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) dipaké pikeun nyimpulkeun konsékuansi SNP (parobahan sinonim atawa non-sinonim). Dijieun database anyar Mycobacterium bovis AF2122/97 génom (LT708304.1).
Génom inti sababaraha alignment ieu dipigawé maké Parsnp v1.2, ayeuna sadia dina HTTPS://github.com/marbl/parsnp57, ngagunakeun 69 génom lengkep / rakitan draft (kalawan pilihan -c) sarta M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) dipaké salaku rujukan. Opat inti sababaraha alignments dipigawé: ngan anggota kompléx kloning Eu2 (n = 37), kaasup sakabeh anggota kompléx kloning Éropa (n = 44), kaasup titik simpang kompléx kloning Éropa jeung Afrika (n = 51), sarta ngawengku sakabéh Mycobacterium bovis dina ulikan ieu (n = 70).
The alignment inti dihasilkeun Parsnp dipaké pikeun infer nu maksimum likelihood (ML) tangkal filogenetik maké CIPRES Élmu Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 maké RAxML, sarta ngalakukeun 1000 réplikasi dipandu.
Tilu algoritma béda jeung parabot bioinformatics dipaké pikeun mariksa ayana acara rekombinasi dina paralel: software SplitsTree4, Gubbins (nasab unbiased ngaliwatan rekombinasi dina runtuyan nukléotida) pipa, sarta RDP4 (program deteksi rekombinasi, versi béta 4.101) software.
Métode dékomposisi pamisah dilaksanakeun dina SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 dipaké pikeun ngitung jaringan filogenetik rootless, ngagunakeun uji Phi pikeun verifikasi statistik, sarta bangbarung significance nyaeta p = 0,05. Analisis multi-alignment inti Parsnp dianggo salaku input, sareng dékomposisi pamisahan salaku standar jaringan diwujudkeun.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 dijalankeun kalawan parameter standar salaku cara séjén pikeun evaluate dampak rekombinasi on Mycobacterium bovis. Algoritma nu dilaksanakeun dina pipa reconstructs nasab clone relevan The lengkep génom / draft assembly of set data urang jeung rujukan génom / 97 (bovine bovid2 / AF2). LT708304.1) anu saling; sarta nyeken posisi SNP dina unggal cabang tangkal pikeun ngadeteksi gugus SNP ngalambangkeun acara rekombinasi The enol tina cabang Anggap teu aya acara rekombinasi, nu hartina SNPs anu lumangsung dina cabang kudu merata alignment tina sababaraha alignment input ti alignment ML pangalusna.
Tungtungna, pikeun ngonfirmasi acara reorganisasi anu disarankeun ku pipa Gubbins, genep algoritma anu dilaksanakeun dina RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 sareng SiScan66) diterapkeun kana sababaraha alignment inti Parsnp dina setélan standar. Urang ditangtukeun yén sahenteuna tilu tina algoritma dilaksanakeun dina RDP4 kedah konsistén nunjukkeun sinyal penting pikeun pariksa unggal acara rekombinasi.
Tempo yén duanana software Gubbins jeung RDP néangan sinyal rekombinasi ku mariksa inti sababaraha alignments dina jandela nepi ka 500 bp, sarta confirming yén citakan gén PE / PPE salila assembly de novo moal ngaganggu sinyal rekombinasi kapanggih, analisis salajengna dilakukeun ku homolinearity Mariksa sabudeureun gén nu ngaidentipikasi acara rekombinasi nu. Peta synlinear ngagunakeun génom lengkep diwangun ngagunakeun MAUVE-multi-génome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) pikeun ngaluarkeun translocations génom lokal atawa inversions. Sajaba ti éta, sakabéh génom ieu dipaké pikeun ngalakukeun analisis homolinearity on runtuyan asam amino ngaliwatan SyntTax web server (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Analisis anu langkung jero ngeunaan set data génom anu dicandak tina sistem tuberkulosis multi-host Portugis nyaéta mariksa polimorfisme gén anu disebatkeun dina literatur. Ieu gén nyaéta 37,38 jeung gén encoding 3R diala ku karuhun MTBC ngaliwatan HGT (perbaikan DNA, réplikasi jeung rekombinasi) komponén sistem 39. Paké ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) jeung ngagunakeun DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/edu/d) nucleotide genetivers diversity. (π) sareng input parameter uji nétral D Tajima.
Tangkal filogenetik kamungkinan maksimum (ML) dumasar kana 69 isolat Mycoplasma bovis sareng génom rujukan dicandak (Gambar 2A). Dibandingkeun sareng tangkal dumasar-gén tunggal atawa tangkal multi-locus basis, strategi ieu ngamungkinkeun pikeun generasi tangkal leuwih kuat nu teu néwak variability sakabéh génom sahingga némbongkeun kamampuhan handap pikeun ngabedakeun antara spésiés 68,69. Struktur topologis tangkal ML biasana konsisten sareng klasifikasi kompleks klon. Génom Eu2 dikelompokeun dina dahan, sareng génom Af1 ogé dikelompokeun babarengan (Gambar 2A). Hasilna ogé konsisten sareng hubungan évolusionér Mycobacterium bovis anu dipikanyaho, nyaéta, aya bédana ageung antara anggota Eu1 sareng grup anu diwangun ku sadaya kompléx sareng génom klonal anu sanés, tapi kompleks klonal 30 henteu dieusian. The inconsistency leutik antara kompléks klonal jeung hubungan observasi dina tangkal filogenetik bisa dipedar ku kanyataan yén kompléx klonal digambarkeun dumasar kana wewengkon génomik husus, sedengkeun tangkal filogenetik dumasar kana sababaraha alignments génom inti ngalambangkeun sakabéh génom.
Tangkal phylogenetic likelihood maksimum (GTR) diwangun dumasar kana alignment génom inti Mycobacterium bovis génom saméméh (A) jeung sanggeus (B) ngaleupaskeun situs rekombinasi. Warna cabang ngagambarkeun kompleks klon Mycobacterium bovis: Éropa 1 nyaéta wungu, Éropa 2 nyaéta beureum, Éropa 3 nyaéta biru, Afrika 1 nyaéta oranyeu, jeung Afrika 2 nyaéta héjo. Tangkal ieu rooted tur digambar kana skala, sarta panjang cabang diukur salaku gaganti pikeun tiap situs.
The Mycobacterium tuberculosis kompléks digambarkeun salaku clonally évolusi, sarta lolobana bukti akumulasi leuwih taun ngarojong pamanggih yén lumangsung HGT sarta acara rekombinasi moal lumangsung dina tingkat bisa didéteksi of MTBC15,17,18.
Karya saméméhna geus ditémbongkeun yén meureun aya rekombinasi kawates antara MTBC galur20,21, bari batur geus gagal pikeun ngaidentipikasi acara rekombinasi ukuran70,71. Ngabahas deui masalah ieu kalawan fokus kana Mycobacterium bovis, nu béda ti karya saméméhna nu ukur dianggap Mycobacterium tuberculosis 70,71; atawa mertimbangkeun MTBC sakabéhna, kalawan ampir euweuh M. bovis ngagambarkeun 20; atawa ukur nganggap fraksi sapi restrictive. The mycobacteria dataset, dina karya ieu, aya jumlahna aya 70 galur, ngalambangkeun sakabéh kompléx klonal, dipaké pikeun layar pikeun rekombinasi. Set data diskalakeun dumasar kana opat tingkat kumulatif: (1) anggota Eu2, (2) sakabeh anggota kompleks klon Éropa (ie Éropa), (3) kompléks klon Éropa jeung Afrika (Eu + Af) jeung (4) sakabéh Koléksi data (kaasup génom nu teu kaasup dina sagala kompléx kloning geus digambarkeun).
Pikeun langkung ngulik hipotésis ieu, jaringan pamisah-dekomposisi dilakukeun pikeun meunteun henteuna kajadian rekombinasi antara génom, sabab metode ieu tiasa ngabayangkeun hubungan karuhun antara individu sareng nunjukkeun sinyal filogenetik anu bertentangan. Kabéh opat susunan data dina analisis dikonfirmasi ayana puteran dina jaringan (nyaéta, wewengkon nu teu konvergen kana tangkal tunggal), tapi uji Phi teu boga rojongan statistik (Eu2, p = 0,0956; Éropa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; sakabéh data set p = 0,2451 bukti ayana reorganization). 3A-D).
Di Éropa 2 génom (n = 37) (A), génom Éropa (n = 44) (B), génom Éropa jeung Afrika (n = 51) (C) jeung sakabéh set data (n = 70) (D).
Saatos analisa ieu, sareng tumut kana observasi siklik dina sadaya jaringan, algoritma rekonstruksi anu dilaksanakeun dina pipa Gubbins diterapkeun pikeun ngarekonstruksikeun turunan klonal sareng nambihan estimasi pangaruh rekombinasi dina génom M. bovis. Infer jumlah kumulatif kajadian rekombinasi, lolobana nu lumangsung dina cabang terminal (nyaéta, dina génom tunggal) (Tabel 2). Indikator ieu nunjukkeun konsistensi sadaya set data sareng nunjukkeun yén frékuénsi kajadian rekombinasi nyaéta 200 dugi ka 300 kali mutasi. Sakali parameter rho / theta ngalambangkeun ongkos relatif rekombinasi sarta mutasi titik dina cabang sigana antara 0,0037 jeung 0,0056 (Tabel 3). Anyar, karya diterbitkeun tina 38 M. bovis galur nunjukkeun nilai rho / theta luhur (rho / theta = 0,1) ti nu diala dina dataset ieu, tapi karya Patané sareng kolega Anjeun dipaké assembly basis rujukan pikeun infer parameter rekombinasi , A jéntré prosedural, alatan prosedur assembly, geus pakait jeung kaayaanana cabang tina kajadian di putative.
Salajengna, parameter r / m ngagambarkeun babandingan diversity of rekombinasi sarta bubuka mutasi, sarta nilai rata nyaeta antara 0,025 na 0,037, nunjukkeun yen dibandingkeun jeung mutations, rekombinasi boga dampak sakabéh handap dina diversity genetik M. bovis (Table 3)). Pikeun babandingan éksténsif, métode sarupa dipaké pikeun estimasi parameter r / m pikeun dataset MTBC diwangun ku 23 génom, némbongkeun hiji nilai rata-rata 0,48620, sedengkeun pikeun Patané sareng kolega '38 M. bovis dataset, éta dibuktikeun nilai rata Nyaeta 0,98. Dina ulikan munggaran, ngan dua ti 23 génom kaasup dina karya M. bovis (M. bovis BCG jeung galur rujukan), jadi nilai diala bisa jadi bias alatan overexpression tina M. tuberkulosis génom. Dina laporan kadua, populasi Mycobacterium bovis dianalisis utamana pulih ti Amérika Serikat jeung sarwa ternak. Sabalikna, dina set data urang, leuwih lokasi géografis jeung spésiés host digambarkeun, sarta génom dikelompokeun kana kompléx klonal béda jeung ciri genetik populasi béda ogé dipaké, sahingga achieving pangaweruh Populasi deeper tur lega. Beda r / m rata nilai diala ku set data kami konsisten jeung konsép yén darajat rekombinasi greatly rupa-rupa antara lineages ditugaskeun ka spésiés taksonomi sami, sahingga hasil ieu nunjukkeun yén M. bovis clone kompléks bisa némbongkeun béda rekombinasi Dampak ogé sakumaha ngusulkeun Didelot & Maiden72. Sanajan kitu, nyata dilegakeun set data ieu ku kaasup jumlah badag M. bovis génom bakal ngidinan pikeun klarifikasi salajengna ngeunaan titik ieu. Parameter r/m jeung rho/theta némbongkeun variabilitas antara dahan, sarta hasil ieu konsisten jeung laporan ngeunaan spésiés baktéri séjén72,73.
Tungtungna, pikeun ngonfirmasi acara reorganisasi anu diidentipikasi ku pipa Gubbins, genep algoritma anu béda-béda dianggo dina parangkat lunak RDP4 pikeun nguji sacara mandiri sababaraha perbandingan inti anu béda. Sacara global, kirang ti satengah kajadian anu diidentipikasi ku Gubbins dikonfirmasi ku RDP4 (Tabel 4 sareng 5). Mertimbangkeun sakabéh set data, tilu acara rekombinasi dikonfirmasi, dua ngalibatkeun titik internal sarta séjén ngalibetkeun hiji génom tunggal dina cabang terminal, nu kompléx klonal teu bisa ditugaskeun (Tabel 4 jeung 5). Idéntifikasi kajadian dina dahan terminal bisa nunjukkeun yén rekombinasi masih lumangsung dina galur M. bovis kontemporer atawa hasilna misplaced70. Di daérah rékombinasi hipotétis ieu, sakitar 20% tina posisi gaduh nukléotida anu teu ditangtukeun (N), sahingga mangaruhan sinyal rekombinasi (Gambar Tambahan 2). Sajaba ti éta, wewengkon ieu mangaruhan gén rrs, encoding RNA ribosom 16S nu diperkirakeun jadi kacida dilestarikan, jadi sinyal rekombinasi putative ieu bisa jadi hasil tina kasalahan urutan atawa misalignment. Lajeng sakabeh alignment génom antara Mb0003 na Mycobacterium bovis AF2122 / 97 dipigawé, sarta ayana nukléotida undefined na SNPs dikonfirmasi, jadi masalah mungkin patali alignment salah teu alatan informasi biologis dilaksanakeun dina karya ieu mucunghul sanggeus diajar program.
Teu aya celah atanapi nukléotida anu henteu katetepkeun dina daérah rékombinasi titik internal (Gambar 4 sareng 5). Ngeunaan kajadian ieu, hiji ngan ngandung génom Eu2 sarta mangaruhan gén pks12, nu encodes mungkin polyketide sintase; sedengkeun anu sanésna kadaptar dina génom Eu1 sareng mangaruhan gén narX anu ngodekeun kamungkinan réduktase nitrat (Tabel 4). Sacara umum, analisis rekombinasi nunjukeun yen aya sajumlah kawates fragmen rekombinasi kalayan rojongan statistik, sarta indikator disimpulkeun nunjukkeun yén rekombinasi boga dampak low on M. bovis nasab. Sinyal rekombinasi diperkirakeun jadi low, tapi hal anu penting pikeun ngabedakeun sinyal évolusi leres tina noise latar tukang, nu mangrupakeun tugas nangtang. Dina raraga ngurangan sinyal noise diwanohkeun ku assembly basis rujukan tur mismatch masalah 70, 71, sakabeh sésana iwal génom lengkep anu dirakit ti scratch, sarta kualitas assembly dipariksa sarta ensured ku analisis pipa QUAST (Tambahan Table 1). Sajaba ti éta, runtuyan analisa suplemén dilaksanakeun pikeun nyadiakeun kateguhan jeung akurasi survey sakabéh. Ku alatan éta, kualitas urutan gén narX na pks12 dievaluasi ku maca pemetaan ngalawan Mycobacterium bovis AF2122/97. Posisi SNP anu disarankeun di daérah rékombinasi dikonfirmasi ku nerapkeun kritéria anu disebatkeun dina bagian metode (sahenteuna 20 bacaan sareng 0,9 frékuénsi parobahan). Polimorfisme gén narX pinuh dikonfirmasi dina dua génom (Mb1792361 sareng Mb7240415; 2.3%) sareng génom génom pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb17046, Mb17046, Mb Najan kitu, pikeun génom Mb2043, genep tina dalapan posisi teu minuhan kriteria jero baca sabab SNP dirojong ku maksimum 17 dibaca, nu handap nilai cutoff ngadegkeun 20. Ku alatan éta, rekombinasi genep génom (8,6%) dina situs génom ieu bisa dikonfirmasi (Gambar 4 jeung 5).
Visualisasi detil ngeunaan alignment wilayah rekombinasi tina susunan data Mycobacterium bovis mangaruhan gén narX anu ngodekeun kamungkinan réduktase nitrat. Teu aya celah atanapi nukléotida anu teu ditangtukeun dina daérah rékombinasi titik internal. Kajadian khusus ieu kadaptar dina génom Eu1. Kualitas sequencing gén narX dievaluasi ku plot bacaan Mycobacterium bovis AF2122/97. Konfirmasi lokasi SNP anu disarankeun di daérah rekombinasi ku cara nerapkeun kritéria anu disebatkeun dina bagian metode (sahenteuna 20 bacaan sareng 0,9 frékuénsi parobahan). Polimorfisme gén narX pinuh dikonfirmasi dina génom Mb1792361 sareng Mb7240415 (2.3%).
Visualisasi rinci ngeunaan alignment wilayah rekombinasi tina dataset Mycoplasma bovis mangaruhan gén pks12. Teu aya celah atanapi nukléotida anu teu ditangtukeun dina daérah rékombinasi titik internal. Ngeunaan kajadian nu mangaruhan gén pks12 encoding mungkin polyketide sintase, éta ngan ngandung génom Eu2. Kualitas urutan pks12 dievaluasi ku maca pemetaan Mycobacterium bovis AF2122/97. Konfirmasi lokasi SNP anu disarankeun di daérah rekombinasi ku cara nerapkeun kritéria anu disebatkeun dina bagian metode (sahenteuna 20 bacaan sareng 0,9 frékuénsi parobahan). Polimorfisme génom Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, sareng Mb1960 parantos dikonfirmasi.
Gén PE jeung PPE boga wewengkon repetitive nu gampang misread ku Illumina sequencing na mismapping, jadi aranjeunna biasana dihapus tina workflow bioinformatics anggota M. tuberkulosis ngan lamun ngagunakeun strategi pemetaan-to-urutan. Inferensi kajadian rekombinasi dilarapkeun dina karya ieu dumasar kana assembly de novo tanpa nyaring kaluar PE / PPE. Kami yakin yén ku ngalaksanakeun tilu metode sareng algoritma pelengkap anu béda ngaliwatan SplitsTree, pipa Gubbins sareng parangkat lunak RDP4, strategi anu diterapkeun kuat pikeun ngolah sareng nyaring daérah anu dirombak disababkeun ku sinyal kasalahan. Nanging, pikeun ngaleungitkeun gangguan gén PE / PPE dina parangkat lunak Gubbins sareng RDP4 pikeun ngaidentipikasi klaster SNP, sareng ku kituna idéntifikasi daérah rékombinasi diusulkeun mangaruhan gén narX sareng pks12, lingkungan gén ieu ditaliti (Suplemén Gbr. 3-5). Dina M. bovis AF2122/97, gén narX dipisahkeun ku narK2 na Mb1764c, bari pks12 dikurilingan ku Mb2075c e Mb2073c (Suplemén Gambar 3-5). Peta dihasilkeun maké MAUVE synline peta génom lengkep nyadiakeun émbaran ngeunaan konservasi runtuyan gén jeung susunan ulang, némbongkeun opat blok collinear, sarta euweuh tanda translocation génom atawa inversion. Salaku tambahan, analisa komplementasi sareng sekuen asam amino ngabuktikeun homologi dina sadaya génom lengkep, sareng henteu aya PE / PPE anu kapendak di daérah padeukeut narX atanapi pks12. Pikeun narX, hiji génom (Mb0030) boga skor sinonim handap sabab gén narX diidentifikasi minangka dua fragmen (fragmén 1891 jeung 1890). Pikeun pks12, kusabab kamiripan, Mb0030 sareng Mb003 nunjukkeun skor synlinearity anu langkung handap, sedengkeun pks12 diidentifikasi dina dua sareng tilu fragmen masing-masing, ngalambangkeun domain anu béda tina protéin (Suplemén Gambar 3-5). Nyandak kana akun informasi ieu, sarta Gubbins na software RDP4 duanana ngalakukeun analisis, pariksa inti sababaraha alignment maksimum 500 bp dina jandela, kami dikonfirmasi yén gén pe / PPE moal ngaganggu sinyal rekombinasi nu mangaruhan narX na pks12.
Sanajan sinyal rekombinasi kauninga dina set data ieu bisa dianggap residual, éta leres yen rekombinasi dina M. bovis teu bisa maréntah kaluar, ku kituna kudu neruskeun jadi subyek analisis salajengna, nu sakabeh génom tina skenario epidemiological béda anu sequenced mun penting.
Ngabandingkeun tangkal phylogenetic ML diala saméméh jeung sanggeus koreksi rekombinasi (Gambar 2A, B) teu ngakibatkeun parobahan signifikan dina hubungan filogenetik disimpulkeun, sarta galur M. bovis ieu clustered dina grup sarua.
Saatos pemetaan 42 karek sequenced M. bovis maca kalawan génom rujukan M. bovis AF2122/97, a alignment SNP ngandung 1816 posisi polymorphic dicandak. Paling SNPs (87,1%) lokasina di wewengkon coding, sarta gén kapangaruhan dicirikeun nurutkeun kategori fungsi ditémbongkeun dina Bovilist (Gambar 6A, B). Nyandak kana akun jumlah total gén dina unggal kategori fungsional, gén dina kategori "metabolisme lipid" némbongkeun leuwih SNPs, dituturkeun ku "témbok sél jeung prosés sél" jeung "métabolisme panengah jeung réspirasi", nembongkeun yen aranjeunna dina M. bovis évolusi.
Analisis hirarki tina M. bovis dataset ti Portugal (n = 42). Jumlah total SNP kadaptar sareng gen anu kapangaruhan pikeun tiap kategori fungsional (A). Jumlah total parobahan sinonim jeung non-sinonim didaptarkeun ku kategori fungsi (B).
Dina skala global, rasio dN / dS rata-rata langkung saé tibatan 1,5, anu nunjukkeun yén tekanan évolusionér global nyaéta pikeun ngaleungitkeun kaayaan karuhun sareng ngagambarkeun skenario pilihan purifikasi anu positif (diversified atanapi diarahkeun) sareng / atanapi santai. Dina kategori "virulensi, detoksifikasi, adaptasi", "urutan sisipan sareng fag", sareng "protein pangaturan", langkung ti dua per tilu SNP henteu sinonim (Gambar 6B).
Dina sakabéh kategori, aya gén kalawan sababaraha SNPs, hasilna laju mutasi rata (nyaéta, rata SNP per gén) leuwih gede ti 1 (Gambar 6A). Pks12 (Mb2074c) sareng 15 SNP sareng fas (Mb2553c) sareng 8 SNP gaduh nilai mutasi anu langkung luhur. Duanana gén ieu aub dina métabolisme asam lemak. Gén pks ngodekeun polyketide synthase (PKS), nyaéta énzim multifungsi anu kalibet dina biosintésis lipid témbok sél mikobaktéri74,75. Gén ieu ngodekeun polipéptida multifungsi anu kalibet dina sintésis mycoketida74,76. Gén fas aub dina sintésis asam mikolat. Duanana gén ieu maénkeun peran penting dina biosintésis témbok sél dina kontak jeung host.
Dina raraga ngulik salajengna évolusi Mycobacterium bovis, dua sét gén husus dianalisis. Karya saméméhna diterbitkeun ngagunakeun komposisi runtuyan jeung métode filogenetik dicirikeun gén nu kaala ku karuhun MTBC ngaliwatan HGT saméméh diversification37,38. Gén ieu dibéréndélkeun dina Suplemén Table 2. Sebaran SNP tina total 77 gén nu bisa patali jeung HGT dianalisis, sarta 26 situs polymorphic anu dicirikeun, nu di hal nu ilahar (78%) nyababkeun non-sinonim (NS) parobahan (Tambahan Table 2). Karya saméméhna dina génom MTBC nunjukkeun yén daérah HGT putative nunjukkeun rasio NS SNP anu langkung luhur dibandingkeun sareng sésa génom. Lamun hiji nyangka yén wewengkon rékombinasi ieu kaala ku karuhun MTBC, sarta ku kituna, aranjeunna overrepresent polymorphisms kuna, proporsi parobahan sinonim diperkirakeun jadi leuwih luhur, sabab substitusi NS diharepkeun bakal ngaleungitkeun ku seléksi négatip kusabab parobahan asam amino Bisa ngarobah fungsi protéin. Ku alatan éta, hasil kami nunjukkeun yén konsékuansi fungsional bisa jadi batang tina ngagantian gén HGT-kawas, nu ngagambarkeun pentingna maranéhna pikeun diversity genetik adaptif berharga.
Sajajar jeung analisis ieu, gén encoding komponén tina 3R (perbaikan DNA, réplikasi, sarta rekombinasi) sistem anu tuntas nalungtik luyu jeung daptar saméméhna diterbitkeun ku dos Vultos and collaborators (2008)39. Tukeran fragmén DNA anu idéntik teu tiasa ditingali sacara langsung, sanaos tiasa janten prosés anu sering nalika aya baktéri anu raket, sapertos dina kasus set data ieu; Sajaba ti éta, prosés ieu bisa jadi konci pikeun métode perbaikan DNA72, jadi Muterkeun peran dina rekombinasi homolog. Jumlahna aya 26 posisi polimorfik anu disebarkeun ku 54 gén diidentifikasi (Tabel Tambahan 3). Dina set gén ieu, parobahan NS accounted pikeun ngeunaan 65% tina konsékuansi, nu konsisten jeung laporan saméméhna on galur Mycobacterium tuberculosis.
waktos pos: Oct-21-2021