Hvala vam što ste posjetili Nature. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite noviju verziju preglednika (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Istovremeno, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranice bez stilova i JavaScripta.
Sekvenciranje genoma revitaliziralo je područje istraživanja zaraznih bolesti, otkrivajući epidemiologiju bolesti, patogenezu, interakcije domaćina i patogena te evolucijski proces nametnut patogenima. Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) smatra Mycobacterium bovis jednim od svojih adaptivnih članova za životinje koji uzrokuju tuberkulozu (TB) kod kopnenih sisavaca i tipičan je model bakterijske evolucije. Poput drugih članova MTBC-a, pretpostavlja se da je Mycobacterium bovis strogo klonirani, sporo evoluirajući patogen i očito nema znakova rekombinacije ili horizontalnog prijenosa gena. U ovom radu primjenjujemo komparativnu genomiku na skup podataka o cijeloj sekvenci genoma (WGS) sastavljen od 70 goveda M. iz različitih rodovnica (Europa i Afrika) kako bismo dobili uvid u genetsku raznolikost goveda M. Evolucijska moć. Koriste se tri različite metode za procjenu znakova reorganizacije. Globalno, mali broj događaja rekombinacije identificiran je i potvrđen dvjema neovisnim metodama s čvrstom potporom. Ipak, u usporedbi s mutacijama, rekombinacija ima slabiji učinak na raznolikost M. bovis (ukupni r/m = 0,037). Razlika r/m prosjeka dobivena u klonskom kompleksu Mycobacterium bovis u našem skupu podataka u skladu je s općim konceptom da se stupanj rekombinacije može uvelike razlikovati između loza dodijeljenih istoj taksonomskoj vrsti. Na temelju ovog rada, rekombinacija u Mycobacterium bovis ne može se isključiti, stoga bi trebala biti predmet daljnjih napora u budućim istraživanjima komparativne genomike, u kojima je WGS velikih skupova podataka iz različitih epidemioloških scenarija diljem svijeta ključan. Zatim je provedena dodatna analiza na manjem skupu podataka Mycobacterium bovis (n = 42) iz prevalencije tuberkuloze s više domaćina, a identificirano je više od 1800 lokusa, od kojih je barem jedan soj pokazao polimorfizam jednog nukleotida (SNP). Većina (87,1%) nalazi se u kodirajućoj regiji, a globalni omjer nesinonimnih promjena (dN/dS) sinonimnih promjena prelazi 1,5, što ukazuje na to da je pozitivna selekcija važna evolucijska sila koja djeluje na M. bovis. Veći udio SNP-ova otkriven je u genima bogatim funkcionalnim kategorijama "metabolizma lipida", "stanične stijenke i staničnih procesa" te "međumetabolizma i disanja", što otkriva njihov potencijal u biologiji i evoluciji važnosti Mycobacterium bovis. Detaljniji pogled na gene u predacima MTBC-a koji su skloni horizontalnom prijenosu gena i uključeni u 3R (popravak, replikacija i rekombinacija DNA) sustav otkriva globalnu prosječnu negativnu vrijednost Taijiminog D neutralnog testa, što ukazuje na prošlo selektivno skeniranje. Nedavno usko grlo nakon širenja populacije i dalje je glavni evolucijski pokretački faktor za obvezni patogen Mycobacterium bovis u borbi protiv domaćina.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) jedan je od najuspješnijih taksona bakterijskih patogena i tipičan slučaj bakterijske evolucije. Njegovi članovi pokazuju iznenađujuće visok identitet nukleotida na genomskoj razini (> 99%)1,2. Različiti ekotipovi MTBC-a mogu uzrokovati tuberkulozu (TB), koja je zarazna granulomatozna bolest, u širokom rasponu vrsta domaćina, od mikrosisavaca do ljudi3,4,5. Trenutno kompleks uključuje ljude [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] i patogene prilagođene životinjama (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" i "dassie") 5,6. M. canettii (također poznat kao "Nodobacter glabrata") Prosječna identičnost nukleotida s prethodno spomenutim mikobakterijama je 98%, a komparativni genomski rad pokazao je da su se M. canettii i ostatak MTBC-a nedavno odvojili od zajedničkog pretka.7 Uzimajući u obzir ovaj koncept, neki autori nazivaju M. canettii članom MTBC-a 8.
MTBC se sustavno opisuje kao strogi klonski kompleks, a njegova populacijska struktura je jasno određena smanjenom raznolikošću, uskim grlima, selektivnim skeniranjem i genetičkim driftom9,10. Pod pretpostavkom da se složena stroga klonska evolucija, poput nedostajućih polimorfizama, ne može obnoviti rekombinacijom. Na temelju ove pretpostavke, uzastopni događaji genomske delecije diferencijalne regije (RD) i TbD1 (Mtb specifična regija delecije 1) predloženi su kao molekularni markeri evolucije MTBC-a2,5,11. Rad na komparativnoj genomici i sekvenciranju cijelog genoma (WGS) podržava podjelu članova prilagođenih čovjeku u devet loza (Mycobacterium tuberculosis L1 do L4, L7 i L8; te Mycobacterium africanum L5, L6 i L9), loze L2 do L4 dijele regiju delecije TbD12,11,12,13. Osim toga, pretpostavlja se da članovi prilagođeni životinjama dijele zajedničkog pretka, što je definirano kladu-specifičnim delecijama u RD7, RD8, RD9 i RD102, 5 i 14.
Horizontalni prijenos gena (HGT) i događaji rekombinacije smatraju se rijetkima i javljaju se kod predaka MTBC-a, a ne zbog različite povijesti cijelog člana MTBC-a15,16,17. Dva rana izvješća Hughesa i suradnika (2002.) te Gutackera i suradnika (2006.) sugerirala su da događaji rekombinacije mogu pomoći u oblikovanju polimorfizama koji označavaju specifične lokuse u sojevima M. tuberculosis18,19. Razlozi za očiti nedostatak rekombinacije u MTBC-u su: (1) mehanički proces i gubitak sposobnosti HGT-a; (2) rijetkost događaja HGT-a; (3) nema šanse za događaje rekombinacije u niši MTBC-a14,17. Nedavno su neke studije sekvenciranja cijelog genoma (WGS) primijenjene na soj MTBC-a 20 i Mycobacterium bovis 21 pružile dokaze o rekombinaciji, prve koje su pokazale da sojevi MTBC-a često izmjenjuju male fragmente DNA, ali zbog ograničene varijacije u nukleotidnoj sekvenci, ovi događaji još uvijek nisu uočeni.
Mycobacterium bovis je najčešće izolirani član MTBC-a iz stoke (uglavnom goveda), iako se može izolirati i iz divljih životinja slobodnog uzgoja i ograđenih divljih životinja4,22,23,24. M. bovis se razvio u pet glavnih klonskih kompleksa [europski 1 (Eu1), europski 2 (Eu2), europski 3 (Eu3), afrički 1 (Af1) i afrički 2 (Af2)], prema profilu spolignotipizacije, specifičnim delecijama i polimorfizmima jednog nukleotida (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 u specifičnim genima. Ovi klonski kompleksi pokazuju raznoliku strukturu populacije Mycobacterium bovis i njezinu povezanost s geografskim regijama. Osim toga, nedavni rad WGS-a koji su proveli Zimpel i suradnici (2020.) osmislio je filogeniju temeljenu na SNP-u Mycobacterium bovis, s više od 1900 genoma, što ukazuje na to da postoje najmanje četiri različite loze (nazvane Lb1 do Lb1 do Lb4), one nisu u potpunosti konzistentne s prethodno definiranim klonskim kompleksom, iako se može potvrditi i geografska specifičnost30. Ovi autori proveli su diferencijalnu analizu filogenije i molekularno datiranje, ali nisu proučavali rekombinaciju30.
Prethodni radovi korištenjem različitih molekularnih tehnika, poput spoligotipizacije, MIRU-VNTR (mikobakterijska interspersirana repetitivna jedinica - varijabilni tandemski broj repeticija) i nedavna SNP tipizacija otkrili su određenu razinu genetske raznolikosti među sojevima M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Diferencijacija genetske varijacije postala je važan alat u proučavanju epidemiologije bolesti, što je korisno za dublje razumijevanje patogeneze, virulencije i prijenosa bolesti. Pojava WGS metode pruža mogućnost otkrivanja evolucijskih pokretačkih čimbenika koje nameće genom Mycobacterium bovis u procesu prilagodbe i perzistencije na različite domaćine i epidemiološke scenarije.
U ovom radu koristimo komparativnu genomsku analizu na različitim skupovima podataka Mycoplasma bovis (n = 70), uključujući izolate iz različitih klonskih kompleksa, kako bismo dobili uvid u evolucijski proces Mycoplasma bovis, posebno kako bismo razriješili filogenetske odnose i događaje rekombinacije. Kao dodatak ovoj analizi, dalje je istražen podskup podataka izolata M. bovis (n = 42) dobivenih iz dobro karakteriziranog područja tuberkuloze s više domaćina u Portugalu 31,36 kako bi se zaključilo o neidentitetu. Ravnoteža između relativnog omjera smislenih (dN) i sinonimnih (dS) nukleotidnih zamjena, kao i evolucijski doprinos specifičnih genoma spomenutih u literaturi, oni su 37,38 dobiveni od MTBC predaka putem HGT-a i kodiraju komponente gena 3R (popravak, replikacija i rekombinacija DNA) sustava 39. Odaberite gene dobivene putem HGT-a jer mogu predstavljati drevne polimorfizme, pa se očekuje da mogu sadržavati veći udio sinonimnih promjena. Geni uključeni u 3R sustav odabrani su jer je prethodni rad na sojevima M. tuberculosis ukazao na opće negativne/purifikacijske selekcije koje djeluju na te gene, a oni mogu igrati važnu ulogu u evoluciji 39. Drugi cilj ovog rada je zaključiti o postojanju događaja reorganizacije. Iz tog razloga, s obzirom na to da naš skup podataka iz Portugala sadrži samo genome europskog klonskog kompleksa 2 i sojeva kojima nije dodijeljen klonski kompleks, odlučili smo uključiti javno dostupne podatke o genomu kako bismo konačno dobili reprezentativni prikaz svih klonskih kompleksa i poboljšali robusnost i širinu rezultata.
42 novosekvencirana genoma Mycoplasma bovis s portugalske endemske scene tuberkuloze s više domaćina (detalji u nastavku), prethodno karakterizirana iz epidemiološke perspektive36, središnja su tema ovog rada. S obzirom na to da skup podataka iz Portugala sadrži samo predstavnike europskih 2 klonskih kompleksa i sojeva bez označenih kompleksa, dodani su javno dostupni podaci sekvenciranja cijelog genoma kako bi se proširio skup podataka koji uključuje sve predstavnike klonskih kompleksa M. bovis. Stoga su u ovom radu korištena tri izvora podataka sekvenciranja cijelog genoma: potpuni/nacrt sklopa genoma, do 10 nosača pohranjenih u NCBI-ju (Nacionalni centar za biotehnološke informacije) (n = 15 izolata); pohranjen u SRA (Illumina fastq datoteka arhive pročitanih sekvenci) predstavlja kompleksnu raznolikost klonova M. bovis (n = 12 izolata)30; i 42 novosekvencirana genoma iz Portugala. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) isključen je iz NCBI pretrage. M. bovis AF2122/97 se obično koristi kao referentni genom koji se uključuje u skup podataka. Zbog javne nedostupnosti cijelog slijeda genoma predstavljenog klonirajućim kompleksom African 1 i malog broja genoma iz reprezentativnih sojeva Af2 i Eu1, u tim su slučajevima korišteni originalni podaci sekvenciranja koje je pružio SRA. Rad Zimpela i njegovih suradnika (2020.) pomogao je u identifikaciji genoma iz spomenutog klonirajućeg kompleksa i pomogao u odabiru Mycobacterium bovis za uključivanje u skup podataka. Za Eu3 opisan je samo jedan tip genoma (Branger i sur., 2020.), tako da je genom koji uključujemo zaseban predstavnik Eu3 kompleksa.
Globalno, ovaj skup podataka uključuje 70 vrsta Mycobacterium bovis izoliranih iz 8 vrsta domaćina, rasprostranjenih u 12 zemalja od 1985. do 2016. 36 vrsta je označeno kao Eu2, 7 vrsta je Eu1, 1 vrsta je Eu3, 3 vrste su Af1, 4 vrste su Af2, a 19 se ne može pripisati nijednom klonskom kompleksu (detalji u nastavku). Detaljne informacije (uključujući pristupni broj) o Mycobacterium bovis korištenoj u ovoj studiji prikazane su u Tablici 1 i Dodatnoj tablici 1.
42 novosekvencirana cijela genoma Mycobacterium bovis iz portugalskih žarišta tuberkuloze životinja, distribuirana više od 12 godina, središte su ove studije, budući da se redovito prate potencijalni sustavi bolesti divljih životinja i stoke 31,36 (Dodatna slika 1). Prema naknadnim postupcima, ovi sojevi izolirani su od goveda (n = 14), jelena (n = 16) i divlje svinje (n = 12) od 2003. do 2015.: prikupljanje i rukovanje životinjama u skladu s preporučenim smjernicama protokola. Uzorci tkiva nalaze se u Priručniku za kopnene životinje OIE-a i inokulirani su na čvrstom i tekućem mediju Stonebrink i Löwenstein-Jensen piruvata. Kulture se inkubiraju na 37 °C, a rast se provjerava jednom tjedno tijekom najmanje 12 tjedana. Kolonije se pohranjuju izravno u otopini glicerola na -80 °C. U selektivnom mediju za Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), originalni arhivirani uzorci propušteni su kroz jedan in vitro prolaz in vitro kako bi se dobila DNK WGS programa. Za to je smrznuta osnovna otopina kulture obogaćena s 5% natrijevog piruvata i 10% ADS-a (50 g albumina, 20 g glukoze, 8,5 g natrijevog klorida u 1 L vode) na Middlebrook 7H9 mediju na 37°C Retrain. Nakon 4 tjedna rasta, medij je obnovljen, a kultura je redovito praćena dok se nije uočio rast. Stanice su sakupljene centrifugiranjem, talog je resuspendiran u 500 µL fosfatno puferirane otopine soli (PBS), zagrijavan na 99°C tijekom 30 minuta, centrifugiran, a supernatant pohranjen na -20°C do WGS-a. Svi postupci provode se u biosigurnosnim objektima razine 3.
WGS genomska biblioteka sparenih krajeva pripremljena je korištenjem jedinstvenog indeksa svakog uzorka DNA, a za sekvenciranje se koristi Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 uzoraka) i HiSeq (2 × 150 pb) (dva izolata) tehnologija (Eurofins Genomics, Njemačka). Prema uputama proizvođača, koristite Illumina Genome Analyzer s modulom s dvostrukim krajem za sekvenciranje genomske DNA i koristite Nextera XT DNA Library Prep Kit tvrtke Illumina za konstrukciju biblioteke.
Uzimajući u obzir podatke dobivene iz SRA (n = 12), identifikacija klonskog kompleksa može se koristiti kao metapodaci odgovarajuće publikacije 30, 41, 43. Kada se razmatra kompletan genom, osim Mycobacterium bovis AF2122/97 i Mycobacterium bovis 3601, koji su prepoznati članovi klonskog kompleksa Eu1 i Eu3 25, 29, isti je kao i kompletan genom Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI pristupni broj NC_000962.3). Poravnanje genoma provodi se pomoću MAFFT-a (program višestrukog poravnanja aminokiselinske ili nukleotidne sekvence, verzija 7.458) i parametra -addfragments48. Zatim se traži odsutnost različitih klonskih kompleksa i/ili prisutnost SNP značajki.
Novosekvencirani Mycobacterium bovis (n = 42) i originalni očitanja sastavljenog nacrta genoma (n = 3) poravnavaju kompleks s referentnim genomom Mycobacterium tuberculosis H37Rv putem vSNP cjevovoda i prisutnosti delecijskih i/ili SNP značajki različitih klonova. Provedena je pretraga.
Prikupite informacije iz nedostatka značajki i/ili prisutnosti/odsutnosti SNP-a i profila spoligotipizacije kako biste dodijelili genomske podatke odgovarajućem klonskom kompleksu. Za četiri nacrta sklopa, profil spoligotipizacije ne može se zaključiti, pa su uključeni u skupinu "bez složenosti".
Bioinformatički tijek rada koji slijedi ovaj rad započinje de novo sastavljanjem i mapiranjem u referentnu strategiju, s ciljem istraživanja rekombinacijskih događaja i specifičnih polimorfizama genoma. Slika 1 prikazuje dijagram toka sljedećih koraka. Za analizu rekombinacije koriste se svi genomi kako bi se povećala robusnost zaključaka i povezanih pokazatelja.
Kako bismo smanjili pogreške u generiranju konsenzusnih sekvenci genoma, prvo smo dobili de novo sastavljanje, a zatim i višestruka poravnanja jezgre. Unicycler cjevovod trenutno je dostupan na https://github.com/rrwick/Unicycler49 i koristi se za de novo sastavljanje 54 sekvencirana genoma (42 novo sekvencirana i 12 fastq datoteka oporavljenih iz SRA). Ukratko, prije sastavljanja od nule, analiza kvalitete očitavanja provedena je u FastQC verziji 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) i Trimmomatic verziji 0.36 (primjenjuju se opcije "rezanje adaptera i drugih sekvenci specifičnih za osvjetljenje iz očitavanja" i "Izreži baze s kraja očitavanja, ako je niže od praga kvalitete od 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Zatim je za sastavljanje genoma korišten SPAdes optimiser49, a za optimizaciju nakon sastavljanja korištena je Pilon verzija 1.1851. Odabran je konzervativni način premošćivanja kako bi se izbjeglo netočno sastavljanje, a veličina k-mera je pretražena i odabrana između 20% i 95% duljine očitavanja. Slijedite smjernice SPAdes i uzmite u obzir veličinu očitavanja, izbrišite kontige manje od 300 bp i uspostavite graničnu vrijednost pokrivenosti dubine od 20 očitavanja od 52. U strategiji de novo sastavljanja, genomske regije poput visoko repetitivnih paraloga prolin-glutamata (PE) i prolin-prolin glutamata (PPE) nisu uklonjene.
Kvaliteta de novo sastavljanja procjenjuje se putem QUAST cjevovoda (http://quast.sourceforge.net/quast.html), koji olakšava obnovu kontiga i mapiranje referentnog genoma M. bovis AF2122/97 (NCBI pristupni broj LT708304.1) (vidi Dodatnu tablicu 1 za parametre kvalitete).
Uz pomoć vSNP cjevovoda (https://github.com/USDA-VS/vSNP), FASTQ datoteka novo sekvenciranog M. bovis iz Illumina sekvenciranja uspoređuje se s referentnim genomom M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Prema preporukama najbolje prakse Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, primjenjuju se standardni parametri filtera ili varijantni rezultati mase za ponovnu kalibraciju. Rezultati se filtriraju korištenjem najnižeg SAMtools rezultata mase od 150 i AC = 2. Također koristite Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) za provjeru očitanja kako biste isključili kontaminaciju. vSNP cjevovod korišten za mapiranje strategija sekvenciranja u našem radu ispituje niz definiranih SNP-ova i ciljeva, a također isključuje scenarije miješane infekcije. Pokrivenost očitanog genoma je bolja od 99% (Dodatna tablica 1).
Kako biste izbjegli pogreške u mapiranju i pogrešne SNP-ove, filtrirajte varijantu u sljedećim slučajevima: (1) podržana je s manje od 20 očitanja, (2) pronađena je s učestalošću manjom od 0,9, (3) nalazi se u barem jednom soju, ali barem postoje praznine u drugom soju. Integrirani preglednik genomike (IGV) verzije 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 korišten je za vizualnu provjeru SNP-ova i položaja s problemima mapiranja ili poravnanja. Budući da su geni prolin-glutamata (PE) i prolin-prolin glutamata (PPE) visoko duplicirani i dio su višegenske obitelji, lako ih je pogrešno shvatiti sekvenciranjem i pogrešnim mapiranjem Illumine, pa su oni poželjniji. Tijek rada mikobakterijske bioinformatike uklonio je članove tuberkuloznog kompleksa pri korištenju strategije mapiranja u sekvencu za potvrdu SNP-ova. Stoga smo iz analize filtrirali gene PE/PPE i indele.
Prema Bovilistu (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), svi SNP-ovi su podijeljeni u funkcionalne kategorije. SnpEff cjevovod (https://pcingola.github.io/SnpEff/) koristi se za zaključivanje o posljedicama SNP-ova (sinonimne ili nesinonimne promjene). Izrađena je nova baza podataka genoma Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Višestruko poravnanje jezgrenog genoma provedeno je pomoću Parsnp v1.2, trenutno dostupnog na https://github.com/marbl/parsnp57, korištenjem 69 kompletnih genoma/nacrta sklopova (s opcijom -c), a M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) korišten je kao referenca. Izvršena su četiri višestruka poravnanja jezgre: samo članovi klonirajućeg kompleksa Eu2 (n = 37), uključujući sve članove europskog klonirajućeg kompleksa (n = 44), uključujući točku spoja europskog i afričkog klonirajućeg kompleksa (n = 51), te uključujući sve Mycobacterium bovis u ovoj studiji (n = 70).
Poravnanje jezgre koje generira Parsnp koristi se za zaključivanje filogenetskog stabla maksimalne vjerojatnosti (ML) pomoću CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 uz korištenje RAxML-a i izvođenje 1000 vođenih replikacija.
Za paralelnu provjeru prisutnosti rekombinacijskih događaja koriste se tri različita algoritma i bioinformatička alata: SplitsTree4 softver, Gubbins (nepristrana loza kroz rekombinaciju u nukleotidnim sekvencama) pipeline i RDP4 (program za detekciju rekombinacije, verzija beta 4.101) softver.
Metoda podijeljene dekompozicije implementirana u SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 koristi se za izračun filogenetske mreže bez korijena, korištenjem Phi testa za statističku provjeru, a prag značajnosti je p = 0,05. Analiza višestrukog poravnanja jezgre Parsnp-a koristi se kao ulaz, a dekompozicija podjele je ostvarena kao mrežni standard.
Gubbinsov cjevovod v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) radi s zadanim parametrima kao još jedan način za procjenu utjecaja rekombinacije na Mycobacterium bovis. Algoritam implementiran u cjevovodu rekonstruira relevantnu lozu klonova. Potpuni sklop genoma/nacrta našeg skupa podataka i referentni genom (goveđi bovid AF2122/97, LT708304.1) međusobno su usklađeni; i skeniraju položaj SNP-a na svakoj grani stabla kako bi se otkrio SNP klaster koji predstavlja događaj rekombinacije. Nula grane Pretpostavimo da nema događaja rekombinacije, što znači da SNP-ovi koji se pojavljuju na grani trebaju biti ravnomjerno raspoređeni. Višestruko poravnanje jezgre iz Parsnp-a i najbolje ocijenjeno ML stablo iz RAxML-a koriste se kao ulazne datoteke.
Konačno, kako bi se potvrdio događaj reorganizacije koji je predložio Gubbinsov cjevovod, šest algoritama implementiranih u RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 i SiScan66) primijenjeno je na Parsnpovo višestruko poravnanje jezgre pod zadanim postavkama. Utvrdili smo da barem tri algoritma implementirana u RDP4 moraju dosljedno pokazivati važan signal za provjeru svakog događaja rekombinacije.
Uzimajući u obzir da i Gubbins i RDP softver traže rekombinacijske signale provjerom višestrukih poravnanja jezgre u prozoru do 500 bp i potvrdom da uključivanje PE/PPE gena tijekom de novo sastavljanja neće ometati pronađene rekombinacijske signale, daljnja analiza se provodi provjerom homolinearnosti blizine gena koji identificira događaj rekombinacije. Sinlinearna karta korištenjem kompletnog genoma konstruirana je korištenjem MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) kako bi se isključile lokalne translokacije ili inverzije genoma. Osim toga, cijeli genom je korišten za izvođenje analize homolinearnosti na aminokiselinskoj sekvenci putem SyntTax web poslužitelja (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Dublja analiza skupa podataka genoma dobivenih iz portugalskog sustava za tuberkulozu s više domaćina ima za cilj provjeriti polimorfizam gena spomenutih u literaturi. To su geni 37, 38 i gen koji kodira 3R, a dobiveni su od MTBC predaka putem komponenti HGT (popravak, replikacija i rekombinacija DNA) sustava 39. Koristite ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) i DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) za izračun genske raznolikosti i nukleotidne raznolikosti (π) te ulaznih parametara Tajima's D neutralnog testa.
Dobiveno je filogenetsko stablo maksimalne vjerojatnosti (ML) temeljeno na 69 izolata Mycoplasma bovis i referentnih genoma (Slika 2A). U usporedbi sa stablima temeljenim na jednom genu ili stablima temeljenim na više lokusa, ova strategija omogućuje generiranje snažnijih stabala koja ne obuhvaćaju varijabilnost cijelog genoma i stoga pokazuju nižu sposobnost razlikovanja između vrsta 68,69. Topološka struktura ML stabla obično je u skladu sa složenom klasifikacijom klonova. Genom Eu2 je grupiran u grani, a genom Af1 je također grupiran zajedno (Slika 2A). Rezultat je također u skladu s poznatim evolucijskim odnosom Mycobacterium bovis, odnosno postoji velika razlika između člana Eu1 i skupine koja se sastoji od svih ostalih klonskih kompleksa i genoma, ali klonski kompleks 30 nije određen. Mala nekonzistentnost između klonskog kompleksa i odnosa uočenog na filogenetskom stablu može se objasniti činjenicom da je klonski kompleks opisan na temelju specifičnih genomskih regija, dok se filogenetsko stablo temelji na višestrukim poravnanjima jezgrenih genoma koji predstavljaju cijeli genom.
Filogenetsko stablo maksimalne vjerojatnosti (GTR) konstruirano je na temelju poravnanja jezgre genoma Mycobacterium bovis prije (A) i nakon (B) uklanjanja mjesta rekombinacije. Boje grana predstavljaju klonski kompleks Mycobacterium bovis: Europa 1 je ljubičasta, Europa 2 je crvena, Europa 3 je plava, Afrika 1 je narančasta, a Afrika 2 je zelena. Stablo je ukorijenjeno i nacrtano u mjerilu, a duljina grane mjeri se kao zamjena za svako mjesto.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis opisan je kao klonski evoluiran, a većina dokaza prikupljenih tijekom godina podupire ideju da se tekući HGT i rekombinacijski događaji neće dogoditi na detektabilnoj razini MTBC-a15,17,18.
Prethodni rad pokazao je da može postojati ograničena rekombinacija između sojeva MTBC-a20,21, dok drugi nisu uspjeli identificirati mjerljive događaje rekombinacije70,71. Ponovno raspravite ovo pitanje s fokusom na Mycobacterium bovis, što se razlikuje od prethodnog rada koji je razmatrao samo Mycobacterium tuberculosis70,71; ili razmotrite MTBC kao cjelinu, gotovo bez M. bovisa koji predstavlja 20; ili razmotrite samo restriktivne frakcije goveda. Skup podataka o mikobakterijama, u ovom radu, ima ukupno 70 sojeva, koji predstavljaju sve klonske komplekse, korištene za probir rekombinacije. Skup podataka skaliran je prema četiri kumulativne razine: (1) članovi Eu2, (2) svi članovi europskog klonskog kompleksa (tj. Europa), (3) europski i afrički klonski kompleks (Eu + Af) i (4) cijele zbirke podataka (uključujući genome koji nisu uključeni ni u jedan već opisani klonski kompleks).
Za daljnje proučavanje ove hipoteze, provedena je mreža split-dekompozicije kako bi se procijenila odsutnost događaja rekombinacije između genoma, jer ova metoda može vizualizirati predački odnos između jedinki i prikazati konfliktne filogenetske signale. Sva četiri skupa podataka u analizi potvrdila su postojanje petlji u mreži (tj. područja koja se ne konvergiraju u jedno stablo), ali Phi test nema statističku podršku (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; cijeli skup podataka p = 0,2451), što pruža slabe dokaze za postojanje događaja reorganizacije (Slika 3A-D).
U Europi 2 genoma (n = 37) (A), europski genomi (n = 44) (B), europski i afrički genomi (n = 51) (C) i cijeli skup podataka (n = 70) (D).
Nakon ove analize, uzimajući u obzir ciklička opažanja u svim mrežama, primijenjen je algoritam rekonstrukcije implementiran u Gubbinsovom cjevovodu za rekonstrukciju klonske loze i za dopunu procjene učinka rekombinacije na genom M. bovis. Zaključite kumulativni broj događaja rekombinacije, od kojih se većina dogodila u terminalnim granama (tj. u jednom genomu) (Tablica 2). Ovi pokazatelji pokazuju konzistentnost cijelog skupa podataka i ukazuju na to da je učestalost događaja rekombinacije 200 do 300 puta veća od učestalosti mutacija. Nakon što se parametar rho/theta koji predstavlja relativne stope rekombinacije i točkastih mutacija na grani čini između 0,0037 i 0,0056 (Tablica 3). Nedavno je objavljeni rad soja 38 M. bovis pokazao višu vrijednost rho/theta (rho/theta = 0,1) od one dobivene u ovom skupu podataka, ali rad Patanéa i kolega koristio je sastavljanje temeljeno na referencama za zaključivanje parametara rekombinacije. Proceduralni detalj, zbog postupka sastavljanja, povezan je s obiljem pretpostavljenih događaja rekombinacije u terminalnoj grani.
Zatim, parametar r/m predstavlja omjer raznolikosti rekombinacije i uvođenja mutacija, a njegova prosječna vrijednost je između 0,025 i 0,037, što ukazuje na to da u usporedbi s mutacijama, rekombinacija ima manji ukupni utjecaj na genetsku raznolikost M. bovis (Tablica 3). Za opsežnu usporedbu, slična metoda je korištena za procjenu parametra r/m za skup podataka MTBC sastavljen od 23 genoma, pokazujući prosječnu vrijednost od 0,48620, dok je za skup podataka Patanéa i kolega od 38 genoma M. bovis dokazana prosječna vrijednost od 0,98. U prvoj studiji, samo dva od 23 genoma uključena u rad M. bovis (M. bovis BCG i referentni soj), tako da dobivena vrijednost može biti pristrana zbog prekomjerne ekspresije genoma M. tuberculosis. U drugom izvješću, analizirane populacije Mycobacterium bovis uglavnom su dobivene iz Sjedinjenih Država i od stoke domaćina. Nasuprot tome, u našem skupu podataka zastupljeno je više geografskih lokacija i vrsta domaćina, a korišteni su i genomi grupirani u različite klonske komplekse s različitim populacijskim genetskim karakteristikama, čime se postiže dublje i šire poznavanje populacije. Razlika prosječne vrijednosti r/m dobivena s našim skupom podataka u skladu je s konceptom da stupanj rekombinacije uvelike varira između loza dodijeljenih istoj taksonomskoj vrsti, tako da ovi rezultati ukazuju na to da klonski kompleks M. bovis može pokazivati razlike u rekombinaciji. Utjecaj je također onakav kakav sugeriraju Didelot i Maiden72. Ipak, značajno proširenje ovog skupa podataka uključivanjem većeg broja genoma M. bovis omogućit će daljnje pojašnjenje ove točke. I parametri r/m i rho/theta pokazuju varijabilnost između grana, a ovaj rezultat je u skladu s izvješćima o drugim bakterijskim vrstama72,73.
Konačno, kako bi se potvrdili događaji reorganizacije identificirani Gubbinsovim cjevovodom, u RDP4 softveru korišteno je šest različitih algoritama za neovisno testiranje različitih višestrukih usporedbi jezgre. Globalno, manje od polovice događaja identificiranih Gubbinsom potvrđeno je RDP4-om (Tablice 4 i 5). Uzimajući u obzir cijeli skup podataka, potvrđena su tri događaja rekombinacije, dva koja uključuju unutarnje čvorove, a drugi koji uključuje jedan genom u terminalnoj grani, za koju se klonski kompleksi nisu mogli dodijeliti (Tablice 4 i 5). Identifikacija događaja u terminalnim granama može ukazivati na to da je rekombinacija još uvijek u tijeku u suvremenim sojevima M. bovis ili da je rezultat pogrešan70. U ovoj hipotetskoj regiji rekombinacije, približno 20% pozicija ima nedefinirane nukleotide (N), što utječe na signal rekombinacije (Dodatna slika 2). Osim toga, ova regija utječe na gen rrs, koji kodira 16S ribosomsku RNA za koju se očekuje da je visoko konzervirana, tako da ovaj pretpostavljeni signal rekombinacije može biti rezultat pogrešaka u sekvenciranju ili pogrešnog poravnanja. Zatim je provedeno poravnanje cijelog genoma između Mb0003 i Mycobacterium bovis AF2122/97, te je potvrđeno postojanje nedefiniranih nukleotida i SNP-ova, tako da mogući problemi povezani s pogrešnim poravnanjem nisu bili posljedica bioloških informacija implementiranih u ovom radu. Pojavili su se nakon učenja programa.
U rekombinacijskim regijama unutarnjih čvorova nisu pronađene praznine ili nedefinirani nukleotidi (slike 4 i 5). Što se tiče ovih događaja, jedan sadrži samo genom Eu2 i utječe na gen pks12, koji kodira moguću poliketid sintazu; dok je drugi registriran u genomu Eu1 i utječe na gen narX koji kodira moguću nitrat reduktazu (Tablica 4). Općenito, analiza rekombinacije pokazuje da postoji ograničen broj rekombinacijskih fragmenata sa statističkom podrškom, a izvedeni pokazatelji ukazuju na to da rekombinacija ima mali utjecaj na lozu M. bovis. Očekuje se da će signal rekombinacije biti nizak, ali važno je razlikovati pravi signal evolucije od pozadinske buke, što je izazovan zadatak. Kako bi se smanjio signal buke koji unosi sastavljanje na temelju referenci i problemi neusklađenosti 70, 71, sav ostali osim kompletnog genoma sastavljen je od nule, a kvaliteta sastavljanja provjerena je i osigurana QUAST analizom cjevovoda (Dodatna tablica 1). Osim toga, proveden je niz dodatnih analiza kako bi se osigurala robusnost i točnost cjelokupnog istraživanja. Stoga je kvaliteta sekvenciranja gena narX i pks12 procijenjena mapiranjem očitavanja prema Mycobacterium bovis AF2122/97. Preporučena pozicija SNP-a u rekombinacijskoj regiji potvrđena je primjenom kriterija spomenutih u odjeljku o metodi (najmanje 20 očitavanja i učestalost promjena od 0,9). Polimorfizam gena narX u potpunosti je potvrđen u dva genoma (Mb1792361 i Mb7240415; 2,3%) i genomima genoma pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 i Mb12. Međutim, za genom Mb2043, šest od osam pozicija ne zadovoljava kriterij dubine čitanja jer SNP podržava maksimalno 17 čitanja, što je ispod utvrđene granične vrijednosti od 20. Stoga se može potvrditi rekombinacija šest genoma (8,6%) na ovom mjestu genoma (slike 4 i 5).
Detaljna vizualizacija poravnanja rekombinacijske regije skupa podataka Mycobacterium bovis utječe na gen narX koji kodira moguću nitrat reduktazu. U rekombinacijskoj regiji unutarnjih čvorova nisu pronađene praznine ili nedefinirani nukleotidi. Ovaj određeni događaj registriran je u genomu Eu1. Kvaliteta sekvenciranja gena narX procijenjena je crtanjem očitanja Mycobacterium bovis AF2122/97. Potvrdite preporučenu lokaciju SNP-a u području rekombinacije primjenom kriterija navedenih u odjeljku o metodi (najmanje 20 očitanja i učestalost promjena od 0,9). Polimorfizam gena narX u potpunosti je potvrđen u genomima Mb1792361 i Mb7240415 (2,3%).
Detaljna vizualizacija poravnanja rekombinacijske regije skupa podataka Mycoplasma bovis koji utječe na gen pks12. U rekombinacijskoj regiji unutarnjih čvorova nisu pronađene praznine ili nedefinirani nukleotidi. Što se tiče događaja koji utječe na gen pks12 koji kodira moguću poliketid sintazu, on sadrži samo genom Eu2. Kvaliteta sekvenciranja pks12 procijenjena je mapiranjem očitavanja Mycobacterium bovis AF2122/97. Potvrdite preporučenu lokaciju SNP-a u području rekombinacije primjenom kriterija navedenih u odjeljku o metodi (najmanje 20 očitavanja i učestalost promjena od 0,9). Polimorfizmi genoma Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 i Mb1960 su u potpunosti potvrđeni.
Geni PE i PPE imaju ponavljajuće regije koje se lako pogrešno očitavaju sekvenciranjem i pogrešnim mapiranjem pomoću Illumina, pa se obično brišu iz bioinformatičkog tijeka rada članova M. tuberculosis samo kada se koristi strategija mapiranja u sekvencu. Zaključivanje o događajima rekombinacije primijenjeno u ovom radu temelji se na de novo sastavljanju bez filtriranja PE/PPE. Vjerujemo da su implementacijom tri različite komplementarne metode i algoritma putem SplitsTree, Gubbins pipeline i RDP4 softvera, primijenjene strategije robusne za obradu i filtriranje reorganiziranih regija uzrokovanih signalima pogreške. Međutim, kako bi se isključila interferencija gena PE/PPE na Gubbins i RDP4 softveru za identifikaciju SNP klastera, a time i identifikacija rekombinacijskih regija za koje se predlaže da utječu na gene narX i pks12, ispitano je susjedstvo tih gena (Dodatna slika 3–5). Kod M. bovis AF2122/97, gen narX je odvojen s narK2 i Mb1764c, dok je pks12 okružen s Mb2075c i Mb2073c (Dodatna slika 3-5). Mapa generirana korištenjem MAUVE sinlinijske karte kompletnog genoma pruža informacije o očuvanosti i preuređenju genske sekvence, prikazujući četiri kolinearna bloka i bez znakova translokacije ili inverzije genoma. Osim toga, analiza komplementacije s aminokiselinskom sekvencom dokazala je homologiju u svim kompletnim genomima, a PE/PPE nije pronađen u susjednim regijama narX ili pks12. Za narX, jedan genom (Mb0030) ima niži rezultat sinonimije jer je gen narX identificiran kao dva fragmenta (fragmenti 1891 i 1890). Za pks12, zbog sličnosti, Mb0030 i Mb003 pokazali su niže rezultate silinearnosti, dok je pks12 identificiran u dva, odnosno tri fragmenta, koji predstavljaju različite domene proteina (Dodatna slika 3-5). Uzimajući u obzir ove informacije, a Gubbins i RDP4 softver provode analizu, provjeravaju višestruko poravnanje jezgre od maksimalnih 500 bp u prozoru, potvrdili smo da gen PE/PPE neće ometati signal rekombinacije koji utječe na narX i pks12.
Iako se rekombinacijski signali otkriveni u ovom skupu podataka mogu smatrati rezidualnima, istina je da se rekombinacija u M. bovis ne može isključiti, stoga bi trebala i dalje biti predmetom daljnje analize, u kojoj se cijeli genomi iz različitih epidemioloških scenarija sekvenciraju do važnosti.
Usporedba ML filogenetskih stabala dobivenih prije i nakon korekcije rekombinacije (slika 2A, B) nije dovela do značajnih promjena u utvrđenom filogenetskom odnosu, a sojevi M. bovis su grupirani u istu skupinu.
Nakon mapiranja 42 novosekvencirana očitanja M. bovis s referentnim genomom M. bovis AF2122/97, dobiveno je poravnanje SNP-ova koje sadrži 1816 polimorfnih pozicija. Većina SNP-ova (87,1%) nalazi se u kodirajućoj regiji, a zahvaćeni geni karakterizirani su prema funkcionalnim kategorijama prikazanim u Bovilistu (slika 6A, B). Uzimajući u obzir ukupan broj gena u svakoj funkcionalnoj kategoriji, geni u kategoriji "metabolizam lipida" pokazali su više SNP-ova, a slijede ih "stanična stijenka i stanični procesi" te "međumetabolizam i disanje", što otkriva da se nalaze u evoluciji M. bovis.
Hijerarhijska analiza skupa podataka M. bovis iz Portugala (n = 42). Ukupan broj registriranih SNP-ova i zahvaćenih gena za svaku funkcionalnu kategoriju (A). Ukupan broj sinonimnih i nesinonimnih promjena registriranih prema funkcionalnoj kategoriji (B).
Na globalnoj razini, prosječni omjer dN/dS je bolji od 1,5, što ukazuje na to da je globalni evolucijski pritisak uklanjanje predačkog stanja i predstavlja pozitivan (diverzificirani ili usmjereni) i/ili opušten scenarij izbora pročišćavanja. U kategorijama "virulencija, detoksikacija, adaptacija", "insercijske sekvence i fagi" te "regulatorni proteini", više od dvije trećine SNP-ova nije sinonimno (slika 6B).
U svim kategorijama postoje geni s više SNP-ova, što rezultira prosječnom stopom mutacije (tj. prosječnim SNP-om po genu) većom od 1 (Slika 6A). Pks12 (Mb2074c) s 15 SNP-ova i fas (Mb2553c) s 8 SNP-ova imaju veće vrijednosti mutacije. Oba ova gena uključena su u metabolizam masnih kiselina. Gen pks kodira poliketid sintazu (PKS), koja je multifunkcionalni enzim uključen u biosintezu lipida stanične stijenke mikobakterija74,75. Ovaj gen kodira multifunkcionalni polipeptid koji je uključen u sintezu mikoketida74,76. Gen fas uključen je u sintezu mikolne kiseline. Oba ova gena igraju važnu ulogu u biosintezi stanične stijenke u kontaktu s domaćinom.
Kako bi se dalje proučila evolucija bakterije Mycobacterium bovis, analizirana su dva seta specifičnih gena. Prethodno objavljeni radovi koji koriste metode sastava sekvenci i filogenetske metode identificirali su gene koje su preci MTBC-a stekli putem HGT-a prije diversifikacije37,38. Ovi geni navedeni su u Dodatnoj tablici 2. Analizirana je SNP distribucija ukupno 77 gena koji mogu biti povezani s HGT-om, a identificirano je 26 polimorfnih mjesta, što je u većini slučajeva (78%) rezultiralo nesinonimnim (NS) promjenama (Dodatna tablica 2). Prethodni rad na genomu MTBC-a pokazao je da pretpostavljena HGT regija pokazuje veći omjer NS SNP-a u usporedbi s ostatkom genoma. Ako se smatra da su te rekombinacijske regije stekli preci MTBC-a i stoga previše predstavljaju drevne polimorfizme, tada se očekuje da će udio sinonimnih promjena biti veći, jer se očekuje da će se NS supstitucije eliminirati negativnom selekcijom zbog promjena aminokiselina koje mogu promijeniti funkciju proteina. Stoga naši rezultati ukazuju na to da funkcionalne posljedice mogu proizaći iz zamjene gena sličnih HGT-u, što odražava njihovu važnost za vrijednu adaptivnu genetsku raznolikost.
Paralelno s ovom analizom, geni koji kodiraju komponente 3R (popravak, replikacija i rekombinacija DNA) sustava temeljito su ispitani u skladu s popisom koji su prethodno objavili dos Vultos i suradnici (2008.)39. Izmjena identičnih fragmenata DNA ne može se izravno promatrati, iako može biti čest proces kada su uključene blisko povezane bakterije, kao u slučaju ovog skupa podataka; osim toga, ovaj proces može biti ključan za metode popravka DNA72, pa igraju ulogu u homolognoj rekombinaciji. Identificirano je ukupno 26 polimorfnih pozicija raspoređenih po 54 gena (Dodatna tablica 3). U ovom skupu gena, promjene NS činile su oko 65% posljedica, što je u skladu s prethodnim izvješćima o sojevima Mycobacterium tuberculosis.
Vrijeme objave: 21. listopada 2021.