Merci fir Äre Besuch bei Nature. D'Browserversioun, déi Dir benotzt, ënnerstëtzt CSS limitéiert. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech, eng méi nei Versioun vum Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). Gläichzäiteg, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir Säiten ouni Stiler a JavaScript uweisen.
D'Genomsequenzéierung huet d'Fuerschung iwwer infektiéis Krankheeten nei beliefert, andeems se d'Epidemiologie vun de Krankheeten, d'Pathogenese, d'Interaktioune tëscht Wirt a Pathogen an den evolutive Prozess, deen op Pathogenen optrieden, opgedeckt huet. De Mycobacterium tuberculosis Komplex (MTBC) betruecht Mycobacterium bovis als ee vu senge Memberen, déi sech un Déieren upassen a Tuberkulos (TB) bei terrestresche Säugetieren verursaachen, an ass e typescht Modell vun der bakterieller Evolutioun. Wéi aner MTBC-Memberen gëtt ugeholl, datt Mycobacterium bovis e strikt geklonten, lues evoluéierende Pathogen ass, an et gëtt offensichtlech kee Zeeche vu Rekombinatioun oder horizontalem Gentransfer. An dëser Aarbecht applizéieren mir komparativ Genomik op en Datesaz vum ganze Genomsequenz (WGS), deen aus 70 Ranner M. aus verschiddene Stammbam (Europa an Afrika) besteet, fir Abléck an d'genetesch Diversitéit vun der Evolutiounskraaft vu Ranner M. ze kréien. Dräi verschidde Methode gi benotzt fir d'Zeeche vun der Reorganisatioun ze schätzen. Weltwäit gouf eng kleng Zuel vu Rekombinatiounsereignisser identifizéiert a mat zwou onofhängege Methoden mat solider Ënnerstëtzung bestätegt. Trotzdem huet d'Rekombinatioun am Verglach mat Mutatiounen e méi schwaachen Effekt op d'Diversitéit vun M. bovis (Gesamt-r/m = 0,037). Den Ënnerscheed am r/m-Duerchschnëtt, deen am klonalen Komplex vu Mycobacterium bovis an eisem Datesaz kritt gouf, entsprécht dem allgemenge Konzept, datt de Grad vun der Rekombinatioun tëscht de Linnen, déi der selwechter taxonomescher Aart zougeuerdnet sinn, staark variéiere kann. Baséierend op dëser Aarbecht kann d'Rekombinatioun a Mycobacterium bovis net ausgeschloss ginn, dofir sollt se Objet vu weideren Efforten an zukünfteger komparativer Genomikfuerschung sinn, bei där d'WGS vu grousse Datensätz aus verschiddenen epidemiologesche Szenarien weltwäit entscheedend ass. Eng zousätzlech Analyse gouf duerno um méi klenge Mycobacterium bovis Datesaz (n = 42) aus der Multi-Host-TB-Prävalenz duerchgefouert, a méi wéi 1.800 Loci goufen identifizéiert, vun deenen op d'mannst ee Stamm e Single Nucleotid-Polymorphismus (SNP) gewisen huet. Déi meescht (87,1%) leien an der kodéierender Regioun, an de globale Verhältnis vun net-synonyme Verännerungen (dN/dS) vu synonyme Verännerungen iwwerschreit 1,5, wat drop hiweist, datt eng positiv Selektioun eng wichteg evolutiv Kraaft ass, déi op M. bovis ausgeübt gëtt. En héiere Prozentsaz vun SNPs gouf a Genen nogewisen, déi räich u funktionelle Kategorien "Lipidmetabolismus", "Zellwand a Zellprozesser" a "Intermediärmetabolismus an Atmung" sinn, wat hiert Potenzial an der Biologie an der Evolutioun vu Mycobacterium bovis senger Wichtegkeet weist. E méi geneeë Bléck op d'Genen an den MTBC-Virfahren, déi ufälleg fir horizontalen Gentransfer sinn an am 3R-System (DNA-Reparatur, Replikatioun a Rekombinatioun) abegraff sinn, weist de weltwäit duerchschnëttleche negativen Wäert vum Taijima sengem D-Neutraltest, deen op e selektivt Scan an der Vergaangenheet hiweist. De rezenten Engpässe no der Populatiounsexpansioun ass ëmmer nach den Haaptfaktor an der Evolutioun, deen de Pathogen Mycobacterium bovis obligatoresch mécht, fir géint de Wirt ze kämpfen.
De Mycobacterium tuberculosis Komplex (MTBC) ass ee vun den erfollegräichste Taxa vu bakterielle Pathogenen an en typesche Fall vun der bakterieller Evolutioun. Seng Memberen weisen eng iwwerraschend héich Nukleotididentitéit op genomischem Niveau (> 99%)1,2. Verschidde MTBC-Ökotypen kënnen Tuberkulos (TB), eng infektiéis granulomatös Krankheet, bei enger breeder Palette vun Wirtsarten, vu Mikromamendéieren bis zum Mënsch3,4,5, verursaachen. Aktuell ëmfaasst de Komplex de Mënsch [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] an un Déieren ugepasst Pathogenen (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" an "dassie")5,6. M. canettii (och bekannt als "Nodobacter glabrata") Déi duerchschnëttlech Nukleotididentitéit mat den uewe genannten Mykobakterien ass 98%, a vergläichend Genomik huet gewisen, datt M. canettii an de Rescht vun MTBC sech viru kuerzem vum gemeinsame Virfahre getrennt hunn.7 Ënner Berécksiichtegung vun dësem Konzept nennen e puer Autoren M. canettii als Member vun MTBC 8.
MTBC gëtt systematesch als e strikte klonale Komplex beschriwwen, a seng Populatiounsstruktur gëtt kloer duerch reduzéiert Diversitéit, Engpässe, selektivt Scannen a genetesch Drift geregelt9,10. Ënner der Viraussetzung vun enger komplexer strikter klonaler Evolutioun, wéi z. B. fehlend Polymorphismen, kënnen net duerch Rekombinatioun restauréiert ginn. Baséierend op dëser Viraussetzung goufen déi hannereneen Eventer vun der genomescher Deletioun vun der differentieller Regioun (RD) an TbD1 (Mtb-spezifescher Deletioun 1 Regioun) als molekulare Marker vun der MTBC-Evolutioun proposéiert2,5,11. Vergläichend Genomik a Vollgenomsequenzéierung (WGS) Aarbechte ënnerstëtzen d'Opdeelung vun dem Mënsch adaptéierte Memberen an néng Linnen (Mycobacterium tuberculosis L1 bis L4, L7 an L8; a Mycobacterium africanum L5, L6 an L9), Linnen L2 bis L4 hunn eng gemeinsam TbD1-Deletiounsregioun2,11,12,13. Zousätzlech gëtt ugeholl, datt un Déieren ugepasst Memberen e gemeinsame Virfahre deelen, deen duerch kladespezifesch Deletiounen an RD7, RD8, RD9 an RD102, 5 an 14 definéiert ass.
Horizontalen Gentransfer (HGT) an Rekombinatiounsereignisser gëllen als rar a kommen an den Vorfahren vun MTBC vir, anstatt an der anerer Geschicht vum gesamte MTBC-Member15,16,17. Zwee fréi Rapporte vum Hughes a Mataarbechter (2002) a Gutacker a Mataarbechter (2006) hunn drop higewisen, datt Rekombinatiounsereignisser hëllefe kéinten, Polymorphismen ze formen, déi spezifesch Loci an M. tuberculosis-Stämme markéieren18,19. D'Grënn fir de offensichtleche Manktem u Rekombinatioun an MTBC sinn: (1) de mechanesche Prozess an de Verloscht vun der Fäegkeet vun HGT; (2) d'Raritéit vun HGT-Evenementer; (3) et gëtt keng Chance op Rekombinatiounsereignisser an der MTBC-Nisch14,17. Viru kuerzem hunn e puer Studien iwwer d'Genomsequenzéierung (WGS), déi op MTBC-Stamm 20 a Mycobacterium bovis 21 ugewannt goufen, Beweiser fir Rekombinatioun geliwwert, déi éischt déi weisen, datt MTBC-Stämm dacks kleng DNA-Fragmenter austauschen, awer wéinst limitéierter Variatioun vun der Nukleotidsequenz ginn dës Evenementer nach ëmmer net bemierkt.
Mycobacterium bovis ass dat am heefegsten fonnt MTBC-Member vu Véi (haaptsächlech Ranner), obwuel et och vu fräihaltege an agezaunte wëllen Déieren isoléiert ka ginn4,22,23,24. M. bovis huet sech zu fënnef groussen klonalen Komplexer entwéckelt [Europäesch 1 (Eu1), Europäesch 2 (Eu2), Europäesch 3 (Eu3), Afrikanesch 1 (Af1) an Afrika 2 (Af2)], laut dem Spoligotyping-Profil, spezifeschen Deletiounen an eenzelnen Nukleotidpolymorphismen (SNPs)25, 26, 27, 28, 29 a spezifesche Genen. Dës klonal Komplexer demonstréieren déi divers Struktur vun der Mycobacterium bovis Populatioun a seng Associatioun mat geografesche Regiounen. Zousätzlech huet déi rezent WGS-Aarbecht vum Zimpel a Mataarbechter (2020) eng Phylogenie baséiert op der SNP vu Mycobacterium bovis entwéckelt, mat méi wéi 1.900 Genomer, wat drop hiweist, datt et op d'mannst véier verschidde Linnen (genannt Lb1 bis Lb1 bis Lb4) gëtt, déi net komplett mam virdru definéierte klonale Komplex iwwereneestëmmen, obwuel d'geographesch Spezifizitéit och bestätegt ka ginn30. Dës Autoren hunn eng Differenzialanalyse vun der Phylogenie an der molekularer Datéierung duerchgefouert, awer keng Rekombinatioun ënnersicht30.
Fréier Aarbechten mat verschiddene molekulare Techniken, wéi Spoligotyping, MIRU-VNTR (Mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), a rezenten SNP-Typing hunn e gewësse Grad u genetescher Diversitéit tëscht M. bovis-Stämme opgedeckt 31,32,33, 34,35. D'Differenzéierung vun der genetescher Variatioun ass zu engem wichtegen Instrument an der Studie vun der Krankheetsepidemiologie ginn, wat hëllefräich ass fir e grëndlecht Verständnis vun der Pathogenese, der Virulenz an der Krankheetsiwwerdroung. D'Entstoe vun der WGS-Method bitt d'Méiglechkeet, déi evolutiv treiwend Faktoren ze weisen, déi vum Mycobacterium bovis-Genom am Prozess vun der Adaptatioun a Persistenz un ënnerschiddlech Wirten an epidemiologesch Szenarie beaflosst ginn.
An dëser Aarbecht benotze mir komparativ genomesch Analysen op verschiddene Mycoplasma bovis Datensätz (n=70), dorënner Isolate vu verschiddene klonalen Komplexen, fir Abléck an den evolutiven Prozess vu Mycoplasma bovis ze kréien, besonnesch fir phylogenetesch Bezéiungen a Rekombinatiounsereignisser ze léisen. Als Ergänzung zu dëser Analyse gouf en Ënnerdatensaz vun M. bovis Isolate (n = 42), déi aus engem gutt charakteriséierte Multi-Host-Tuberkulosgebitt a Portugal gewonnen goufen, weider ënnersicht, fir d'Net-Identitéit ze schléissen. D'Gläichgewiicht tëscht dem relative Verhältnis vu Sense (dN) zu synonyme (dS) Nukleotidsubstitutiounen, souwéi dem evolutiven Bäitrag vu spezifesche Genomer, déi an der Literatur ernimmt ginn, si ginn, vun MTBC-Virfahren duerch HGT kritt, a kodéieren 3R (DNA Reparatur, Replikatioun a Rekombinatioun) System Genkomponenten, déi duerch HGT gewonnen goufen. Wielt Genen, déi duerch HGT gewonnen goufen, well se al Polymorphismen duerstelle kënnen, sou datt et erwaart gëtt, datt se e méi héije Prozentsaz vu synonyme Verännerungen enthalen kënnen. D'Genen, déi am 3R-System abegraff sinn, goufen ausgewielt, well fréier Aarbechten iwwer M. tuberculosis-Stämm op allgemeng negativ/Reinigungs-Selektiounen higewisen hunn, déi op dës Genen funktionéieren, an si kéinten eng wichteg Roll an der Evolutioun spillen 39. En anert Zil vun dëser Aarbecht ass et, d'Existenz vu Reorganisatiounsereignisser ofzeschléissen. Aus dësem Grond, well eisen Datesaz aus Portugal nëmmen d'Genomer vum europäesche Klonkomplex 2 an de Stämm enthält, deenen de Klonkomplex net zougewisen ass, hu mir decidéiert, ëffentlech verfügbar Genomdaten anzebannen, fir endlech e Vertrieder vun alle Klonkomplexer ze kréien, an d'Robustheet an d'Breet vun de Resultater ze verbesseren.
42 nei sequenzéiert Mycoplasma bovis-Genomer aus der portugisescher endemescher Multi-Host-Tuberkulos-Szen (Detailer ënnen), déi virdru aus enger epidemiologescher Perspektiv charakteriséiert goufen36, stinn am Zentrum vun dëser Aarbecht. Well den Datesaz aus Portugal nëmme Vertrieder vun den europäeschen 2-Klon-Komplexer a Stämm ouni designéiert Komplexer enthält, goufen ëffentlech verfügbar Ganzgenom-Sequenzéierungsdaten bäigefüügt, fir den Datesaz ze erweideren, deen all Vertrieder vun den M. bovis-Klon-Komplexer enthält. Dofir goufen dräi Ganzgenom-Sequenzéierungsdatenquellen an dëser Aarbecht benotzt: komplett/Entworf-Genom-Assembléierung, bis zu 10 Gerüster, déi am NCBI (National Center for Biotechnology Information) gespäichert sinn (n = 15 Isolate); am SRA (The Illumina fastq File of the Sequence Read Archive) gespäichert, representéiert déi komplex Diversitéit vun M. bovis-Klonen (n = 12 Isolate)30; a 42 nei sequenzéiert Genomer aus Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) gouf vun der NCBI-Sich ausgeschloss. M. bovis AF2122/97 gëtt normalerweis als Referenzgenom benotzt, dat an den Datesaz agebonne soll ginn. Well déi ganz Genomsequenz, déi vum African 1 Klonungskomplex representéiert gëtt, net ëffentlech verfügbar ass, an well déi kleng Zuel vu Genomer aus representativen Stämm vun Af2 an Eu1 geréng ass, goufen an dëse Fäll déi originell Sequenzéierungsdaten, déi vun der SRA geliwwert goufen, benotzt. D'Aarbecht vum Zimpel a senge Mataarbechter (2020) huet gehollef, de Genom aus dem uewe genannten Klonungskomplex z'identifizéieren an huet gehollef, Mycobacterium bovis fir d'Aféierung an den Datesaz ze wielen. Fir Eu3 gëtt nëmmen een Typ vu Genom beschriwwen (Branger et al., 2020), sou datt de Genom, deen mir agebonnen hunn, e separate Vertrieder vum Eu3-Komplex ass.
Weltwäit enthält dësen Datesaz 70 Aarte vu M. bovis bei Ranner, déi vun 8 Wirtsaarten isoléiert goufen, déi tëscht 1985 an 2016 an 12 Länner verdeelt waren. 36 Aarte sinn als Eu2 bezeechent, 7 Aarte sinn Eu1, 1 Aart ass Eu3, 3 Aarte sinn Af1, 4 Aarte sinn Af2 an 19 kënnen net op e klonale Komplex zréckgefouert ginn (Detailer ënnen). Déi detailléiert Informatiounen (inklusiv der Zougangsnummer) vu Mycobacterium bovis, déi an dëser Studie benotzt goufen, sinn an der Tabell 1 an der Ergänzungstabell 1 gewisen.
42 nei sequenzéiert Ganzgenomer vu Mycobacterium bovis aus de portugiseschen Déiertuberkulos-Hotspots a méi wéi 12 Joer verdeelt, stinn am Zentrum vun dëser Studie, well potenziell Krankheetssystemer tëscht Wildlife a Véi reegelméisseg iwwerwaacht goufen 31,36 (Ergänzungsfigur 1). No spéideren Prozedure goufen dës Stämm vun 2003 bis 2015 aus Ranner (n = 14), Routhirschen (n = 16) a Wëllschwäin (n = 12) isoléiert: Déieren ginn am Aklang mat de recommandéierte Protokollrichtlinne gesammelt a behandelt. D'Gewebeprouwen sinn am OIE Terrestrial Animal Handbook a ginn op Stonebrink a Löwenstein-Jensen Pyruvat-Festmedium a flëssege Medium geimpft. D'Kulture ginn bei 37 °C inkubéiert an de Wuesstum gëtt eemol d'Woch fir op d'mannst 12 Wochen iwwerpréift. D'Kolonien ginn direkt an enger Glycerinléisung bei -80 °C gelagert. Am Mycobacterium-selektive Medium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) goufen déi ursprénglech archivéiert Prouwe duerch eng eenzeg In-vitro-Passage in-vitro geleet, fir d'DNA vum WGS-Programm ze kréien. Dofir gouf déi gefruer Kulturstammléisung mat 5% Natriumpyruvat an 10% ADS (50 g Albumin, 20 g Glukos, 8,5 g Natriumchlorid an 1 L Waasser) op Middlebrook 7H9 bei 37°C Retrain beräichert. No 4 Woche Wuesstum gouf de Medium erneiert an d'Kultur reegelméisseg iwwerwaacht, bis Wuesstum observéiert gouf. D'Zellen goufen duerch Zentrifugatioun geernt, de Pellet gouf a 500 µL Phosphatgepufferter Salzléisung (PBS) resuspendéiert, 30 Minutten op 99 °C erhëtzt, zentrifugéiert, an den Iwwerstand gouf bei -20 °C bis WGS gelagert. All Prozedure ginn a Biosécherheetsanlagen vum Niveau 3 duerchgefouert.
D'WGS Paired-End Genombibliothéik gëtt mat dem eenzegaartegen Index vun all DNA-Prouf virbereet a benotzt d'Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 Proben) an d'HiSeq (2 × 150 pb) (zwee Isolate) Technologie (Eurofins Genomics, Däitschland) fir d'Sequenzéierung. Geméiss den Instruktioune vum Hiersteller, benotzt den Illumina Genome Analyzer mat Duebel-Enn Modul Uschloss fir d'genomesch DNA ze sequenzéieren, an den Nextera XT DNA Library Prep Kit vun Illumina fir d'Bibliothéik opzebauen.
Ënner Berécksiichtegung vun den Donnéeën, déi aus der SRA (n = 12) gewonnen goufen, kann d'Identifikatioun vum Klonkomplex als Metadaten vun der entspriechender Publikatioun 30, 41, 43 benotzt ginn. Wann een de komplette Genom betruecht, ausser Mycobacterium bovis AF2122/97 a Mycobacterium bovis 3601, déi unerkannt Memberen vum Eu1- respektiv Eu3-Klonalkomplex 25, 29 sinn, ass et datselwecht wéi de komplette Genom vum Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI-Zougangsnummer NC_000962.3). D'Genomausriichtung gëtt mat MAFFT (Multiple Alignment Program of Amino Acid or Nucleotide Sequence, Versioun 7.458) an dem Parameter -addfragments48 duerchgefouert. Dann gëtt no der Absenz vun ënnerschiddleche klonalen Komplexen an/oder der Präsenz vun SNP-Charakteristiken gesicht.
De nei sequenzéierte Mycobacterium bovis (n = 42) an déi originell Liesungen vum zesummegesate Genomentworf (n = 3) stëmmen de Komplex mam Referenzgenom Mycobacterium tuberculosis H37Rv iwwer d'vSNP-Pipeline an d'Präsenz vun der Deletioun an/oder SNP-Charakteristike vun ënnerschiddleche Klonen of. Eng Sich gouf duerchgefouert.
Sammelt Informatiounen aus dem Manktem u Charakteristiken an/oder der Präsenz/Absenz vun SNP a Spoligotypingprofiler, fir genomesch Donnéeën dem entspriechende klonalen Komplex zouzeweisen. Fir déi véier Entworf-Assembléierungen kann de Spoligotypingprofil net ofgeleet ginn, dofir sinn se an der Grupp "keng Komplexitéit" abegraff.
De bioinformatesche Workflow, deen dës Aarbecht verfollegt, fänkt mat der de novo Assembléierung a Mapping op eng Referenzstrategie un, mat dem Zil, Rekombinatiounsereignisser a spezifesch Genompolymorphismen z'ënnersichen. Figur 1 weist e Flossdiagramm vun de verfollegte Schrëtt. Fir d'Rekombinatiounsanalyse ginn all Genomer benotzt fir d'Robustheet vun den Inferenzen an den zougehéieregen Indikatoren ze erhéijen.
Fir Feeler bei der Generatioun vu Genomkonsensussequenzen ze reduzéieren, hu mir als éischt eng de novo Assembléierung an duerno eng Core Multiple Alignments kritt. D'Unicycler Pipeline ass de Moment verfügbar op https://github.com/rrwick/Unicycler49 a gëtt benotzt fir eng de novo Assembléierung vu 54 sequenzéierte Genomer (42 nei sequenzéiert an 12 Fastq-Dateien, déi aus SRA gewonnen goufen) duerchzeféieren. Kuerz gesot, ier d'Assembléierung vun Null un ugefaangen huet, gouf eng Liesqualitéitsanalyse an der FastQC Versioun 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) an der Trimmomatic Versioun 0.36 (Optioun "Adapteren an aner beliichtungsspezifesch Sequenzen aus Liesungen schneiden" an "Basen aus dem Enn vum Liesen schneiden, wann d'Qualitéit manner ass wéi d'Schwellwäertegkeet vun 20" ginn ugewannt) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50 duerchgefouert. Duerno gouf SPAdes optimizer49 fir d'Genomassemblage an d'Pilon Versioun 1.1851 fir d'Optimiséierung no der Assembléierung benotzt. E konservative Bréckemodus gouf gewielt fir falsch Assembléierung ze vermeiden, an d'K-Mer-Gréisst gouf gesicht an tëscht 20% an 95% vun der Lieslängt ausgewielt. Follegt d'SPAdes-Richtlinnen a berücksichtegt d'Liesgréisst, läscht Contigs, déi méi kleng wéi 300 bp sinn, a etabléiert eng Ofdeckungsdéift vun 20 Liesungen vun 52. An der de novo Assembléierungsstrategie goufen genomesch Regiounen, wéi déi héich repetitiv Prolin-Glutamat (PE) a Prolin-Prolin-Glutamat (PPE) Paralogen, net ewechgeholl.
D'Qualitéit vun der de novo Assembléierung gëtt iwwer d'QUAST Pipeline (http://quast.sourceforge.net/quast.html) bewäert, déi d'Erneierung vum Contig an d'Mapping vum M. bovis AF2122/97 Referenzgenom (NCBI Accessiounsnummer LT708304.1) erliichtert (kuckt d'Ergänzungstabell 1 fir Qualitéitsparameter).
Mat Hëllef vun der vSNP-Pipeline (https://github.com/USDA-VS/vSNP) gëtt d'FASTQ-Datei vum nei sequenzéierten M. bovis aus der Illumina-Sequenzéierung mam M. bovis AF2122/97 Referenzgenom (LT708304.1) verglach. Geméiss de Best-Practice-Empfehlungen vum Genome Analysis Toolkit (GATK) [53], [54], [55] ginn Standardfilterparameter oder Variant-Mass-Scores fir d'Rekalibrierung ugewannt. D'Resultater ginn no dem niddregsten SAMtools-Mass-Score vun 150 an AC = 2 gefiltert. Benotzt och Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) fir d'Miessungen ze kontrolléieren an eng Kontaminatioun auszeschléissen. D'vSNP-Pipeline, déi an eiser Aarbecht benotzt gëtt fir Sequenzstrategien ofzebilden, ënnersicht eng Serie vun definéierten SNPs an Ziler a schléisst och gemëschte Infektiounsszenarien aus. D'Ofdeckung vum geliesene Genom ass besser wéi 99% (Ergänzungstabell 1).
Fir Mapping-Feeler a falsch SNPs ze vermeiden, filtert eng Variant an de folgende Fäll eraus: (1) si gëtt vu manner wéi 20 Liesungen ënnerstëtzt, (2) si gëtt mat enger Frequenz vu manner wéi 0,9 fonnt, (3) si ass an op d'mannst engem Stamm, awer op d'mannst gëtt et Lücken an engem anere Stamm. Den integréierte Genomics Viewer (IGV) Versioun 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 gouf benotzt fir SNPs a Positiounen mat Mapping- oder Ausriichtungsproblemer visuell ze verifizéieren. Well d'Prolin-Glutamat (PE) a Prolin-Prolin-Glutamat (PPE) Genen staark duplizéiert sinn a Deel vun enger Multi-Gen-Famill sinn, gi se liicht duerch Illumina Sequenzéierung a Fehlmapping falsch verstanen, sou datt se bevorzugt ginn. De mykobakterielle Bioinformatik-Workflow huet Memberen vum Tuberkuloskomplex ewechgeholl wann d'Strategie vun der Mapping op Sequenzéierung benotzt gouf fir SNPs ze bestätegen. Dofir hu mir PE/PPE Genen an Indels aus der Analyse erausgefiltert.
Laut Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) sinn all SNPs a funktionell Kategorien agedeelt. D'SnpEff Pipeline (https://pcingola.github.io/SnpEff/) gëtt benotzt fir SNP-Konsequenzen (synonym oder net-synonym Ännerungen) ofzeleeden. Eng nei Datebank vum Mycobacterium bovis AF2122/97 Genom (LT708304.1) gouf erstallt.
D'Multiple-Alignment vum Kärgenom gouf mat Parsnp v1.2 duerchgefouert, deen de Moment ënner https://github.com/marbl/parsnp57 verfügbar ass, mat 69 komplette Genomer/Draft-Assemblië (mat der Optioun -c) an M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) gëtt als Referenz benotzt. Véier Multiple-Alignemente vum Kär goufen duerchgefouert: nëmmen d'Membere vum Eu2-Klonéierungskomplex (n = 37), inklusiv all d'Membere vum europäesche Kloéierungskomplex (n = 44), inklusiv de Verbindungspunkt vum europäeschen an afrikanesche Kloéierungskomplex (n = 51), an all Mycobacterium bovis an dëser Studie (n = 70).
D'Kärausrichtung, déi vu Parsnp generéiert gëtt, gëtt benotzt fir de phylogenetesche Bam vun der maximaler Likelihood (ML) mat Hëllef vu CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 mat RAxML ofzeleeden an 1000 guidéiert Replikatiounen duerchzeféieren.
Dräi verschidden Algorithmen an Bioinformatik-Tools gi benotzt fir d'Präsenz vu parallele Rekombinatiouns-Evenementer ze kontrolléieren: d'SplitsTree4 Software, d'Gubbins Pipeline (unbiased lineage through recombination in nucleotide sequences), an d'RDP4 Software (Rekombinatiounsdetektiounsprogramm, Versioun Beta 4.101).
D'Split-Decompositionsmethod, déi am SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 implementéiert ass, gëtt benotzt fir dat rootless phylogenetescht Netzwierk ze berechnen, andeems de Phi-Test fir statistesch Verifizéierung benotzt gëtt, an de Signifikanzschwellwäert ass p = 0,05. Déi core Multi-Alignment-Analyse vu Parsnp gëtt als Input benotzt, an d'Splitsing-Decomposition als Netzwierkstandard gëtt realiséiert.
D'Gubbins Pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) leeft mat Standardparameteren als eng aner Méiglechkeet fir den Impakt vun der Rekombinatioun op Mycobacterium bovis ze evaluéieren. Den Algorithmus, deen an der Pipeline implementéiert ass, rekonstruéiert déi relevant Klonlinn. De komplette Genom/Entworf-Assembléierung vun eisem Datesaz an de Referenzgenom (Rinder AF2122/97, LT708304.1) sinn géigesäiteg; a scannen d'Positioun vum SNP op all Aascht vum Bam fir den SNP-Cluster z'entdecken, deen de Rekombinatiouns-Event representéiert. Den Nullpunkt vum Aascht. Mir huelen un, datt et kee Rekombinatiouns-Event gëtt, dat heescht, datt d'SNPs, déi um Aascht optrieden, gläichméisseg verdeelt solle sinn. Déi core multiple Alignment vu Parsnp an de bescht bewäertte ML-Bam vu RAxML ginn als Inputdateie benotzt.
Schlussendlech, fir den Reorganisatiouns-Event ze bestätegen, deen duerch d'Gubbins-Pipeline virgeschloe gouf, ginn déi sechs Algorithmen, déi am RDP467 implementéiert sinn (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 a SiScan66), op d'Multiple-Alignment-Kären vum Parsnp ënner Standardastellungen ugewannt. Mir hunn festgestallt, datt mindestens dräi vun den Algorithmen, déi am RDP4 implementéiert sinn, konsequent e wichtegt Signal demonstréiere mussen, fir all Rekombinatiouns-Event ze verifizéieren.
Well souwuel Gubbins wéi och RDP Software no Rekombinatiounssignaler sichen, andeems se déi verschidde Kär-Alignéierungen an engem Fënster vu bis zu 500 bp iwwerpréiwen, a bestätegen, datt d'Inklusioun vu PE/PPE-Genen während der de novo Assembléierung d'Rekombinatiounssignaler net stéiert, gëtt eng weider Analyse duerch Homolinearitéitskontroll vun der Géigend vum Gen duerchgefouert, dat de Rekombinatiouns-Event identifizéiert. Déi synlinear Kaart, déi de komplette Genom benotzt, gouf mat der MAUVE-Multi-Genome-Alignéierung (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) konstruéiert, fir lokal Genomtranslokatiounen oder Inversiounen auszeschléissen. Zousätzlech gouf de ganze Genom benotzt, fir eng Homolinearitéitsanalyse vun der Aminosaiersequenz iwwer de SyntTax Webserver (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) duerchzeféieren.
Eng méi detailléiert Analyse vum Genomdatensatz, deen aus dem portugisesche Multi-Host-Tuberkulos-System kritt gouf, besteet doran, de Polymorphismus vun de Genen, déi an der Literatur ernimmt ginn, ze kontrolléieren. Dës Genen sinn 37, 38 an de Gen, deen 3R kodéiert, deen vun den MTBC-Virfahren duerch HGT-Systemkomponenten (DNA-Reparatur, Replikatioun a Rekombinatioun) kritt gouf 39. Benotzt ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) a benotzt DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) fir d'Gendivitéit an d'Nukleotidivitéit (π) an den Input vum Tajima sengem D-Neutral-Testparameter ze berechnen.
E phylogenetesche Bam mat maximaler Likelihood (ML) baséiert op 69 Mycoplasma bovis Isolaten a Referenzgenomer gouf kritt (Figur 2A). Am Verglach mat Beem op Basis vun engem eenzege Gen oder Beem op Basis vu verschiddene Locusen erlaabt dës Strategie d'Generatioun vu méi staarke Beem, déi net d'Variabilitéit vum ganze Genom erfassen an dofir eng méi niddreg Fäegkeet weisen, tëscht Aarten z'ënnerscheeden 68,69. Déi topologesch Struktur vum ML-Bam entsprécht normalerweis der komplexer Klassifikatioun vu Klonen. De Genom vun Eu2 ass an engem Branche geclustert, an de Genom vun Af1 ass och zesummegeclustert (Figur 2A). D'Resultat entsprécht och der bekannter evolutiver Bezéiung vu Mycobacterium bovis, dat heescht, et gëtt en groussen Ënnerscheed tëscht dem Eu1-Member an der Grupp, déi aus all anere klonalen Komplexen a Genomer besteet, awer de klonalen Komplex 30 ass net spezifizéiert. Déi kleng Inkonsistenz tëscht dem klonalen Komplex an der Bezéiung, déi um phylogenetesche Bam observéiert gouf, kann duerch d'Tatsaach erkläert ginn, datt de klonale Komplex op Basis vu spezifesche genomesche Regiounen beschriwwe gëtt, während de phylogenetesche Bam op multiple Alignementer vu Kärgenomen baséiert ass, déi dat ganzt Genom representéieren.
De phylogenetesche Bam mat maximaler Likelihood (GTR) gëtt op Basis vun der Ausriichtung vum Kärgenom vum Mycobacterium bovis Genom virun (A) an no (B) der Entfernung vun der Rekombinatiounsplaz konstruéiert. D'Faarwe vun de Branchen representéieren de Mycobacterium bovis Klonkomplex: Europa 1 ass violett, Europa 2 ass rout, Europa 3 ass blo, Afrika 1 ass orange an Afrika 2 ass gréng. De Bam ass verwuerzelt a moossstablech gezeechent, an d'Längt vun de Branchen gëtt als Ersatz fir all Plaz gemooss.
De Mycobacterium tuberculosis Komplex gëtt als klonal evoluéiert beschriwwen, an déi meescht Beweiser, déi sech iwwer d'Jore gesammelt hunn, ënnerstëtzen d'Iddi, datt weider HGT- a Rekombinatiounsereignisser net um noweisbare Niveau vun MTBC optrieden15,17,18.
Fréier Aarbechten hunn gewisen, datt et eng limitéiert Rekombinatioun tëscht MTBC-Stämme ka ginn20,21, während aner net fäeg waren, moosbar Rekombinatiounsereignisser70,71 z'identifizéieren. Diskutéiert dëst Thema nei mat dem Fokus op Mycobacterium bovis, wat sech vun der viregter Aarbecht ënnerscheet, déi nëmmen Mycobacterium tuberculosis 70,71 berücksichtegt huet; oder betruecht MTBC als Ganzt, mat bal kengem M. bovis, deen 20 representéiert; oder betruecht nëmme restriktiv Rannerfraktiounen. De Mykobakterie-Datasaz, an dëser Aarbecht, gëtt et insgesamt 70 Stämm, déi all klonal Komplexe representéieren, déi benotzt gi fir op Rekombinatioun ze screenen. Den Datesaz ass no véier kumulative Niveauen skaléiert: (1) Eu2-Memberen, (2) all europäesch Klonkomplexmemberen (dh Europa), (3) europäeschen an afrikanesche Klonkomplex (Eu + Af) an (4) déi ganz Datensammlung (inklusiv Genomer, déi net an iergendenger scho beschriwwener Klonkomplexe abegraff sinn).
Fir dës Hypothese weider ze studéieren, gouf e Split-Decomposition-Netzwierk duerchgefouert fir d'Feele vu Rekombinatiounsereignisser tëscht Genomer ze bewäerten, well dës Method d'Virfahrenverhältnis tëscht Individuen visualiséiere kann a widderspréchlech phylogenetesch Signaler uweise kann. All véier Datensätz an der Analyse hunn d'Existenz vu Schleifen am Netzwierk bestätegt (d.h. Beräicher, déi net zu engem eenzege Bam konvergéieren), awer de Phi-Test huet keng statistesch Ënnerstëtzung (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; de ganze Datensaz p = 0,2451), wat schlecht Beweiser fir d'Existenz vu Reorganisatiounsereignisser liwwert (Figur 3A-D).
An Europa 2 Genomer (n = 37) (A), europäesch Genomer (n = 44) (B), europäesch an afrikanesch Genomer (n = 51) (C) an de ganze Datesaz (n = 70) (D).
No dëser Analyse, a mat Berécksiichtegung vun de zyklischen Observatiounen an allen Netzwierker, gouf den Rekonstruktiounsalgorithmus, deen an der Gubbins-Pipeline implementéiert gouf, ugewannt fir d'klonal Linn ze rekonstruéieren an d'Schätzung vum Effekt vun der Rekombinatioun um M. bovis Genom ze ergänzen. Schreift déi kumulativ Zuel vu Rekombinatiounsereignisser of, vun deenen déi meescht an den terminalen Äscht (d.h. an engem eenzege Genom) opgetruede sinn (Tabell 2). Dës Indikatoren weisen d'Konsistenz vum gesamte Datesaz a weisen drop hin, datt d'Frequenz vu Rekombinatiounsereignisser 200 bis 300 Mol sou héich ass wéi déi vu Mutatiounen. Soubal de Rho/Theta-Parameter, deen déi relativ Raten vu Rekombinatioun a Punktmutatiounen um Äscht representéiert, tëscht 0,0037 an 0,0056 läit (Tabell 3). Viru kuerzem huet déi publizéiert Aarbecht vum 38 M. bovis-Stamm e méi héije Rho/Theta-Wäert (rho/theta = 0,1) gewisen wéi dee vun dësem Datesaz, awer d'Aarbecht vum Patané a Kollegen huet referenzbaséiert Assembléierung benotzt fir Rekombinatiounsparameter ofzeleeden. En prozeduralen Detail, wéinst der Assembléierungsprozedur, gouf mat der Heefegkeet vu vermutleche Rekombinatiounsereignisser am terminalen Branche a Verbindung bruecht.
Duerno representéiert den r/m-Parameter d'Diversitéitsverhältnis vun der Rekombinatioun an der Mutatiounsaféierung, a säin Duerchschnëttswäert läit tëscht 0,025 an 0,037, wat beweist, datt am Verglach mat Mutatiounen d'Rekombinatioun en méi niddregen Gesamtimpakt op d'genetesch Diversitéit vun M. bovis huet (Tabell 3). Fir e grëndleche Verglach gouf eng ähnlech Method benotzt fir den r/m-Parameter fir den MTBC-Datasaz ze schätzen, deen aus 23 Genomer besteet, wat en Duerchschnëttswäert vun 0,48620 weist, während et fir den 38 M. bovis-Datasaz vu Patané a Kollegen bewisen huet, datt den Duerchschnëttswäert 0,98 ass. An der éischter Studie goufen nëmmen zwee vun den 23 Genomer, déi an der Aarbecht vun M. bovis abegraff waren (M. bovis BCG an de Referenzstamm), sou datt de kritt Wäert wéinst der Iwwerexpressioun vum M. tuberculosis-Genom verzerrt ka sinn. Am zweete Bericht goufen déi analyséiert Mycobacterium bovis-Populatiounen haaptsächlech aus den USA a vun Hausdéieren gewonnen. Am Géigesaz dozou sinn an eisem Datesaz méi geografesch Plazen an Wirtsaarten vertrueden, an et gi Genomer benotzt, déi a verschidde klonal Komplexer mat verschiddene Populatiounsgenetik-Charakteristiken gruppéiert sinn, fir doduerch e méi déift a méi breet Populatiounswëssen z'erreechen. Den Ënnerscheed r/m Duerchschnëttswäert, deen mat eisem Datesaz kritt gëtt, entsprécht dem Konzept, datt de Grad vun der Rekombinatioun staark tëscht de Linnen, déi der selwechter taxonomescher Aart zougewisen sinn, variéiert, sou datt dës Resultater drop hiweisen, datt de M. bovis Klonkomplex Rekombinatiounsënnerscheeder opweise kann. Den Impakt ass och wéi vum Didelot & Maiden72 virgeschloen. Trotzdem erlaabt eng bedeitend Erweiderung vun dësem Datesaz andeems eng méi grouss Zuel vun M. bovis Genomer abegraff sinn, eng weider Klärung vun dësem Punkt. Souwuel d'r/m wéi och d'rho/theta Parameter weisen Variabilitéit tëscht de Branchen, an dëst Resultat entsprécht Berichter iwwer aner Bakterienaarten72,73.
Schlussendlech, fir d'Reorganisatiounsereignisser ze bestätegen, déi vun der Gubbins-Pipeline identifizéiert goufen, goufen sechs verschidden Algorithmen an der RDP4-Software benotzt, fir onofhängeg verschidde Kär-Multi-Vergläicher ze testen. Weltwäit goufen manner wéi d'Halschent vun den Ereignisser, déi vum Gubbins identifizéiert goufen, vum RDP4 bestätegt (Tabellen 4 an 5). Wann een de ganze Datesaz berécksiichtegt, goufen dräi Rekombinatiounsereignisser bestätegt, zwee mat internen Noden an deen aneren mat engem eenzege Genom an enger terminaler Branche, fir déi klonal Komplexe net zougewise konnte ginn (Tabellen 4 an 5). D'Identifikatioun vun Ereignisser an den terminale Branchen kéint drop hiweisen, datt d'Rekombinatioun nach ëmmer amgaang ass a modernen M. bovis-Stämme oder datt d'Resultat falsch placéiert ass70. An dëser hypothetescher Rekombinatiounsregioun hunn ongeféier 20% vun de Positiounen ondefinéiert Nukleotiden (N), wat de Rekombinatiounssignal beaflosst (Ergänzungsfigur 2). Zousätzlech beaflosst dës Regioun den rrs-Gen, deen d'16S ribosomal RNA kodéiert, vun där erwaart gëtt, datt se héich konservéiert ass, sou datt dëst mutmasslecht Rekombinatiounssignal d'Resultat vu Sequenzéierungsfeeler oder Fehlausriichtung kéint sinn. Duerno gouf d'Gesamtgenomausriichtung tëscht Mb0003 a Mycobacterium bovis AF2122/97 duerchgefouert, an d'Existenz vun ondefinéierten Nukleotiden an SNPs gouf bestätegt, sou datt déi méiglech Problemer am Zesummenhang mat der falscher Ausriichtung net op déi biologesch Informatiounen zréckzeféieren waren, déi an dëser Aarbecht implementéiert goufen. Dësen ass no der Léiere vum Programm opgetrueden.
Et goufen keng Lücken oder ondefinéiert Nukleotiden an de Rekombinatiounsregiounen vun den internen Knuet fonnt (Figuren 4 an 5). Wat dës Evenementer ugeet, enthält een nëmmen den Eu2-Genom an beaflosst de pks12-Gen, deen eng méiglech Polyketid-Synthase kodéiert; während deen aneren am Eu1-Genom registréiert ass an den narX-Gen beaflosst, deen eng méiglech Nitratreduktase kodéiert (Tabell 4). Am Allgemengen weist d'Rekombinatiounsanalyse, datt et eng limitéiert Zuel vu Rekombinatiounsfragmenter mat statistescher Ënnerstëtzung gëtt, an déi ofgeleet Indikatoren weisen drop hin, datt d'Rekombinatioun e klengen Impakt op d'M. bovis-Linn huet. Et gëtt erwaart, datt de Rekombinatiounssignal niddreg ass, awer et ass wichteg, den tatsächlechen Evolutiounssignal vum Hannergrondrauschen z'ënnerscheeden, wat eng usprochsvoll Aufgab ass. Fir de Rauschensignal ze reduzéieren, deen duerch referenzbaséiert Assembléierung a Mismatch-Problemer 70, 71 agefouert gëtt, goufen all déi aner ausser dem komplette Genom vun Null un zesummegesat, an d'Assembléierungsqualitéit gouf duerch d'QUAST-Pipeline-Analyse iwwerpréift a garantéiert (Ergänzungstabell 1). Zousätzlech gouf eng Serie vun zousätzlechen Analysen duerchgefouert, fir d'Robustheet an d'Genauegkeet vun der Gesamtstudie ze garantéieren. Dofir gouf d'Sequenzéierungsqualitéit vun den narX- a pks12-Genen duerch Liesmapping géint Mycobacterium bovis AF2122/97 evaluéiert. Déi recommandéiert SNP-Positioun an der Rekombinatiounsregioun gouf bestätegt andeems d'Kriterien, déi an der Methodsektioun genannt goufen, ugewannt goufen (op d'mannst 20 Liesungen an eng Ännerungsfrequenz vun 0,9). De Polymorphismus vum narX-Gen gouf vollstänneg an den zwou Genomer (Mb1792361 an Mb7240415; 2,3%) an de Genomer vum pks12-Genom: Mb0891-, Mb1711-, Mb1789-, Mb1870-, Mb17046-, Mb1756- an Mb12-Gener bestätegt. Wéi och ëmmer, fir de Genom Mb2043 erfëllen sechs vun den aacht Positiounen net de Kriterium vun der Liesdéift, well den SNP vun maximal 17 Liesungen ënnerstëtzt gëtt, wat ënner dem festgeluechte Grenzwäert vun 20 läit. Dofir kann d'Rekombinatioun vu sechs Genomer (8,6%) op dëser Genomplaz bestätegt ginn (Figuren 4 an 5).
Déi detailléiert Visualiséierung vun der Ausriichtung vun der Rekombinatiounsregioun vum Mycobacterium bovis Datesaz beaflosst den narX-Gen, deen eng méiglech Nitratreduktase kodéiert. Keng Lücken oder ondefinéiert Nukleotiden goufen an der Rekombinatiounsregioun vun den internen Noden fonnt. Dëst spezifescht Evenement ass am Eu1-Genom registréiert. D'Sequenzéierungsqualitéit vum narX-Gen gouf evaluéiert andeems d'Liesungen vum Mycobacterium bovis AF2122/97 opgezeechent goufen. Bestätegt déi recommandéiert SNP-Lag am Rekombinatiounsberäich andeems Dir d'Kriterien uwendt, déi an der Methodsektioun genannt sinn (op d'mannst 20 Liesungen an 0,9 Ännerungsfrequenz). De Polymorphismus vum narX-Gen gouf vollstänneg an de Genomer vum Mb1792361 an Mb7240415 (2,3%) bestätegt.
Detailéiert Visualiséierung vun der Ausriichtung vun der Rekombinatiounsregioun vum Mycoplasma bovis Datesaz, deen de pks12 Gen beaflosst. Keng Lücken oder ondefinéiert Nukleotiden goufen an der Rekombinatiounsregioun vun den internen Noden fonnt. Wat den Event ugeet, deen de pks12 Gen beaflosst, deen eng méiglech Polyketid Synthase kodéiert, enthält en nëmmen den Eu2 Genom. D'Sequenzéierungsqualitéit vu pks12 gouf duerch d'Liesmapping vu Mycobacterium bovis AF2122/97 evaluéiert. Bestätegt déi recommandéiert SNP-Lag am Rekombinatiounsberäich andeems Dir d'Kriterien uwendt, déi an der Methodsektioun genannt sinn (op d'mannst 20 Liesungen an 0,9 Ännerungsfrequenz). D'Polymorphismen vun de Genomer Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 an Mb1960 goufen vollstänneg bestätegt.
PE- a PPE-Genen hunn repetitiv Regiounen, déi liicht duerch Illumina-Sequenzéierung a Fehlmapping gelies kënne ginn, sou datt se normalerweis nëmmen aus dem Bioinformatik-Workflow vun M. tuberculosis-Memberen geläscht ginn, wann d'Mapping-to-Sequence-Strategie benotzt gëtt. D'Inferenz vu Rekombinatiounsereignisser, déi an dëser Aarbecht ugewannt ginn, baséiert op der de novo Assembléierung ouni PE/PPE erauszefilteren. Mir gleewen, datt duerch d'Ëmsetzung vun dräi verschiddene komplementäre Methoden an Algorithmen iwwer SplitsTree, Gubbins Pipeline an RDP4 Software, déi ugewannt Strategien robust sinn fir d'Veraarbechtung an d'Filterung vun de reorganiséierte Regiounen, déi duerch Feelersignaler verursaacht ginn. Fir awer d'Interferenz vum PE/PPE-Gen op d'Gubbins- an RDP4-Software auszeschléissen, fir SNP-Cluster z'identifizéieren, an dofir d'Identifikatioun vun de Rekombinatiounsregiounen, déi virgeschloe ginn, d'narX- a pks12-Genen ze beaflossen, gouf d'Noperschaft vun dëse Genen ënnersicht (Ergänzungsfigur 3-5). Bei M. bovis AF2122/97 ass den narX-Gen duerch narK2 an Mb1764c getrennt, während pks12 duerch Mb2075c an Mb2073c ëmginn ass (Ergänzungsfigur 3-5). D'Kaart, déi mat der MAUVE Synline-Kaart vum komplette Genom generéiert gouf, liwwert Informatiounen iwwer d'Konservéierung an d'Ëmorganiséierung vun der Gensequenz a weist véier kollinear Blöcken a keng Zeeche vun enger Genomtranslokatioun oder Inversioun. Zousätzlech huet d'Komplementatiounsanalyse mat der Aminosaiersequenz d'Homologie an all de komplette Genomer bewisen, a kee PE/PPE gouf an den Nopeschregiounen vun narX oder pks12 fonnt. Fir narX huet ee Genom (Mb0030) e méi niddrege Synonymie-Score, well den narX-Gen als zwee Fragmenter identifizéiert gouf (Fragmenter 1891 an 1890). Fir pks12, wéinst Ähnlechkeeten, hunn Mb0030 an Mb003 méi niddreg Synlinearitéitswäerter gewisen, während pks12 an zwee respektiv dräi Fragmenter identifizéiert gouf, déi verschidden Domänen vum Protein representéieren (Ergänzungsfigur 3-5). Ënner Berécksiichtegung vun dëser Informatioun, an andeems d'Software Gubbins an RDP4 béid Analysen duerchféieren, fir d'Multiple-Ausriichtung vum Kär vun de maximalen 500 bp am Fënster ze kontrolléieren, hu mir bestätegt, datt de PE/PPE-Gen net mam Rekombinatiounssignal stéiert, dat narX a pks12 beaflosst.
Och wann d'Rekombinatiounssignaler, déi an dësem Datesaz detektéiert goufen, als Reschter ugesi kënne ginn, ass et wouer, datt d'Rekombinatioun bei M. bovis net ausgeschloss ka ginn, dofir sollt se weiderhin Objet vu weiderer Analyse sinn, bei där ganz Genomer aus verschiddenen epidemiologesche Szenarie bis zu Wichteg sequenzéiert ginn.
De Verglach vun de phylogenetesche Beem vun der ML, déi virun an no der Rekombinatiounskorrektur kritt goufen (Figur 2A, B), huet net zu bedeitende Verännerungen an der ofgeleeter phylogenetescher Bezéiung gefouert, an d'M. bovis-Stämme goufen an der selwechter Grupp geclustert.
Nodeems 42 nei sequenzéiert M. bovis-Liesungen mam Referenzgenom vum M. bovis AF2122/97 kartéiert goufen, gouf eng SNP-Ausriichtung mat 1816 polymorphe Positiounen kritt. Déi meescht SNPs (87,1%) sinn an der kodéierender Regioun lokaliséiert, an déi betraffe Genen sinn no de funktionelle Kategorien charakteriséiert, déi am Bovilist gewisen sinn (Figur 6A, B). Ënner Berécksiichtegung vun der Gesamtzuel vun de Genen an all funktioneller Kategorie hunn d'Genen an der Kategorie "Lipidmetabolismus" méi SNPs gewisen, gefollegt vun "Zellwand a Zellprozesser" an "Intermediärmetabolismus an Atmung", wat weist, datt si sech an der Evolutioun vum M. bovis befannen.
Hierarchesch Analyse vum M. bovis Datesaz aus Portugal (n = 42). Déi total Zuel vun registréierten SNPs a betraffene Genen fir all funktionell Kategorie (A). Déi total Zuel vun synonymen an net-synonymen Ännerungen, déi no Funktiounskategorie registréiert goufen (B).
Op globaler Skala ass dat duerchschnëttlecht dN/dS-Verhältnis besser wéi 1,5, wat drop hiweist, datt den globale evolutiven Drock doran besteet, den ancestralen Zoustand lass ze ginn, an e positivt (diversifizéiert oder geriicht) an/oder entspannt Purifikatiounswahlszenario duerstellt. An de Kategorien "Virulenz, Entgiftung, Adaptatioun", "Insertionssequenzen a Phagen" a "Reguléierungsproteinen" si méi wéi zwee Drëttel vun den SNPs net-synonym (Figur 6B).
An alle Kategorien gëtt et Genen mat multiple SNPs, wat zu enger duerchschnëttlecher Mutatiounsquote (dat heescht den duerchschnëttlechen SNP pro Gen) vu méi wéi 1 féiert (Figur 6A). Pks12 (Mb2074c) mat 15 SNPs a fas (Mb2553c) mat 8 SNPs hunn méi héich Mutatiounswäerter. Béid Genen sinn am Fettsäuremetabolismus involvéiert. De pks-Gen kodéiert d'Polyketidsynthase (PKS), e multifunktionellt Enzym, dat an der Lipidbiosynthese vun der mykobakterieller Zellwand involvéiert ass74,75. Dëst Gen kodéiert e multifunktionellt Polypeptid, dat an der Synthese vu Mykoketiden involvéiert ass74,76. De fas-Gen ass an der Synthese vu Mycolsäure involvéiert. Béid Genen spillen eng wichteg Roll an der Biosynthese vun der Zellwand a Kontakt mam Wirt.
Fir d'Evolutioun vu Mycobacterium bovis weider ze studéieren, goufen zwou Sätz vu spezifesche Genen analyséiert. Fréier publizéiert Aarbechten, déi Sequenzkompositioun a phylogenetesche Methoden benotzt hunn, hunn Genen identifizéiert, déi vun MTBC-Virfahren duerch HGT virun der Diversifikatioun iwwerholl goufen37,38. Dës Genen sinn an der Ergänzungstabell 2 opgezielt. D'SNP-Verdeelung vun insgesamt 77 Genen, déi mat HGT a Verbindung stinn, gouf analyséiert, an 26 polymorph Plazen goufen identifizéiert, déi an de meeschte Fäll (78%) zu net-synonymen (NS) Ännerungen gefouert hunn (Ergänzungstabell 2). Fréier Aarbechten iwwer den MTBC-Genom hunn gewisen, datt déi potenziell HGT-Regioun e méi héijen NS-SNP-Verhältnis am Verglach zum Rescht vum Genom weist. Wann een mengt, datt dës Rekombinatiounsregiounen vun MTBC-Virfahren iwwerholl goufen, an dofir antike Polymorphismen iwwerrepresentéieren, da gëtt erwaart, datt den Undeel vu synonyme Ännerungen méi héich ass, well NS-Substitutiounen erwaart ginn, duerch negativ Selektioun eliminéiert ze ginn, well Aminosäureännerungen d'Funktioun vum Protein änneren kënnen. Dofir weisen eis Resultater drop hin, datt déi funktionell Konsequenze vum Ersatz vun HGT-ähnlechen Genen entstinn kënnen, wat hir Wichtegkeet fir wäertvoll adaptiv genetesch Diversitéit reflektéiert.
Parallel zu dëser Analyse goufen d'Genen, déi d'Komponente vum 3R-System (DNA-Reparatur, Replikatioun a Rekombinatioun) kodéieren, grëndlech ënnersicht, am Aklang mat der Lëscht, déi virdru vum dos Vultos a Mataarbechter (2008)39 publizéiert gouf. Den Austausch vun identeschen DNA-Fragmenter kann net direkt observéiert ginn, obwuel et e reegelméissege Prozess ka sinn, wann enk verwandte Bakterien involvéiert sinn, wéi am Fall vun dësem Datesaz; zousätzlech kéint dëse Prozess de Schlëssel zu DNA-Reparaturmethoden72 sinn, sou datt se eng Roll bei homologer Rekombinatioun spillen. Insgesamt goufen 26 polymorph Positiounen, déi iwwer 54 Genen verdeelt sinn, identifizéiert (Ergänzungstabell 3). An dësem Set vu Genen hunn NS-Ännerungen ongeféier 65% vun de Konsequenze verantwortlech gemaach, wat mat fréiere Berichter iwwer Mycobacterium tuberculosis-Stämme konsequent ass.
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 21. Oktober 2021