Takk for at du besøker Nature. Nettleserversjonen du bruker har begrenset støtte for CSS. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en nyere versjon av nettleseren (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). Samtidig, for å sikre fortsatt støtte, vil vi vise nettsteder uten stiler og JavaScript.
Genomsekvensering har revitalisert feltet for forskning på infeksjonssykdommer, og avdekket sykdomsepidemiologi, patogenese, vert-patogen-interaksjoner og den evolusjonære prosessen som påføres patogener. Mycobacterium tuberculosis-komplekset (MTBC) anser Mycobacterium bovis som et av sine dyriske adaptive medlemmer som forårsaker tuberkulose (TB) hos landlevende pattedyr, og er en typisk modell for bakteriell evolusjon. I likhet med andre MTBC-medlemmer antas Mycobacterium bovis å være et strengt klonet, sakte utviklende patogen, og det er åpenbart ingen tegn til rekombinasjon eller horisontal genoverføring. I dette arbeidet anvender vi komparativ genomikk på et helgenomsekvensdatasett (WGS) bestående av 70 storfe M. fra forskjellige stamtavler (Europa og Afrika) for å få innsikt i det genetiske mangfoldet til storfe M. Evolusjonær kraft. Tre forskjellige metoder brukes til å estimere tegnene på reorganisering. Globalt har et lite antall rekombinasjonshendelser blitt identifisert og bekreftet av to uavhengige metoder med solid støtte. Likevel, sammenlignet med mutasjoner, har rekombinasjon en svakere effekt på mangfoldet til M. bovis (total r/m = 0,037). Forskjellen i r/m-gjennomsnitt som ble oppnådd i det klonale komplekset av Mycobacterium bovis i vårt datasett, er i samsvar med det generelle konseptet om at graden av rekombinasjon kan variere sterkt mellom avstamningene som er tilordnet den samme taksonomiske arten. Basert på dette arbeidet kan ikke rekombinasjon i Mycobacterium bovis utelukkes, så det bør være gjenstand for videre innsats i fremtidig komparativ genomforskning, der WGS av store datasett fra forskjellige epidemiologiske scenarier rundt om i verden er avgjørende. En ytterligere analyse ble deretter utført på det mindre Mycobacterium bovis-datasettet (n = 42) fra multi-vert TB-prevalensen, og mer enn 1800 loci ble identifisert, hvorav minst én stamme viste en enkelt nukleotidpolymorfisme (SNP). De fleste (87,1 %) er lokalisert i kodingsregionen, og det globale forholdet mellom ikke-synonyme endringer (dN/dS) av synonyme endringer overstiger 1,5, noe som indikerer at positiv seleksjon er en viktig evolusjonær kraft som utøves på M. bovis. En høyere andel SNP-er ble oppdaget i gener rike i funksjonelle kategorier som "lipidmetabolisme", "cellevegg og cellulære prosesser" og "mellommetabolisme og respirasjon", noe som avslører deres potensial i biologien og evolusjonen av Mycobacterium bovis' betydning. En nærmere titt på genene i MTBC-forfedrene som er utsatt for horisontal genoverføring og inkludert i 3R-systemet (DNA-reparasjon, replikasjon og rekombinasjon), avslører den globale gjennomsnittlige negative verdien av Taijimas D-nøytrale test, som indikerer tidligere selektiv skanning. Den nylige flaskehalsen etter populasjonsutvidelse er fortsatt den viktigste evolusjonære drivfaktoren for at det obligatoriske patogenet Mycobacterium bovis skal bekjempe verten.
Mycobacterium tuberculosis-komplekset (MTBC) er en av de mest vellykkede taxaene av bakterielle patogener og et typisk tilfelle av bakteriell evolusjon. Medlemmene viser overraskende høy nukleotididentitet på genomisk nivå (> 99 %)1,2. Ulike MTBC-økotyper kan forårsake tuberkulose (TB), som er en smittsom granulomatøs sykdom, hos et bredt spekter av vertsarter fra mikropattedyr til mennesker3,4,5. For tiden inkluderer komplekset mennesker [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] og dyretilpassede patogener (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, «Bacillus chimpanzee» og «dassie»)5,6. M. canettii (også kjent som «Nodobacter glabrata») Gjennomsnittlig nukleotididentitet med de nevnte mykobakteriene er 98 %, og sammenlignende genomisk arbeid har vist at M. canettii og resten av MTBC nylig har avviket fra den felles stamfaren.7 Med tanke på dette konseptet kaller noen forfattere M. canettii for medlem av MTBC 8.
MTBC beskrives systematisk som et strengt klonalt kompleks, og populasjonsstrukturen styres tydelig av redusert mangfold, flaskehalser, selektiv skanning og genetisk drift9,10. Forutsatt at kompleks streng klonal evolusjon, som manglende polymorfismer, ikke kan gjenopprettes ved rekombinasjon. Basert på denne forutsetningen har de påfølgende hendelsene med genomisk delesjon av differensialregionen (RD) og TbD1 (Mtb-spesifikk delesjon 1-region) blitt foreslått som molekylære markører for MTBC-evolusjon2,5,11. Komparativ genomikk og helgenomsekvenseringsarbeid (WGS) støtter inndelingen av mennesketilpassede medlemmer i ni avstamninger (Mycobacterium tuberculosis L1 til L4, L7 og L8; og Mycobacterium africanum L5, L6 og L9), avstamningene L2 til L4 delte delesjon av TbD1-regionen2,11,12,13. I tillegg foreslås det at dyretilpassede medlemmer deler en felles forfader, som er definert av kladespesifikke delesjoner i RD7, RD8, RD9 og RD102, 5 og 14.
Horisontal genoverføring (HGT) og rekombinasjonshendelser anses som sjeldne og forekommer i forfedrene til MTBC, snarere enn den forskjellige historien til hele MTBC-medlemmet15,16,17. To tidlige rapporter fra Hughes og samarbeidspartnere (2002) og Gutacker og samarbeidspartnere (2006) antydet at rekombinasjonshendelser kan bidra til å forme polymorfismer som markerer spesifikke loci i M. tuberculosis-stammer18,19. Årsakene til den åpenbare mangelen på rekombinasjon i MTBC er: (1) den mekaniske prosessen og tapet av HGTs evne; (2) sjeldenheten av HGT-hendelser; (3) det er ingen sjanse for rekombinasjonshendelser i MTBC-nisjen14,17. Nylig har noen helgenomsekvenseringsstudier (WGS) anvendt på MTBC-stamme 20 og Mycobacterium bovis 21 gitt bevis på rekombinasjon, den første som viser at MTBC-stammer ofte utveksler små DNA-fragmenter, men på grunn av begrenset variasjon i nukleotidsekvens, blir disse hendelsene fortsatt ikke lagt merke til.
Mycobacterium bovis er det vanligste MTBC-medlemmet som gjenfinnes fra husdyr (hovedsakelig storfe), selv om det også kan isoleres fra frittgående og inngjerdede ville dyr4,22,23,24. M. bovis utviklet seg til fem store klonale komplekser [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) og Africa 2 (Af2)], i henhold til spoligotypingprofilen, spesifikke delesjoner og enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP-er)25, 26, 27, 28, 29 i spesifikke gener. Disse klonale kompleksene demonstrerer den mangfoldige strukturen til Mycobacterium bovis-populasjonen og dens assosiasjon med geografiske regioner. I tillegg utviklet det nylige WGS-arbeidet utført av Zimpel og samarbeidspartnere (2020) en fylogeni basert på SNP-en til Mycobacterium bovis, med mer enn 1900 genomer, noe som indikerer at det finnes minst fire forskjellige avstamninger (kalt Lb1 til Lb1 til Lb4). Disse er ikke helt konsistente med det tidligere definerte klonale komplekset, selv om geografisk spesifisitet også kan bekreftes30. Disse forfatterne utførte differensialanalyse av fylogeni og molekylær datering, men studerte ikke rekombinasjon30.
Tidligere arbeid med bruk av forskjellige molekylære teknikker, som spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), og nyere SNP-typing avdekket et visst nivå av genetisk mangfold blant M. bovis-stammer 31, 32, 33, 34, 35. Differensiering av genetisk variasjon har blitt et viktig verktøy i studiet av sykdomsepidemiologi, noe som er nyttig for en grundig forståelse av patogenese, virulens og sykdomsoverføring. Fremveksten av WGS-metoden gir muligheten til å avdekke de evolusjonære drivfaktorene som pålegges av Mycobacterium bovis-genomet i prosessen med tilpasning og persistens til forskjellige verter og epidemiologiske scenarier.
I dette arbeidet bruker vi komparativ genomisk analyse på ulike Mycoplasma bovis-datasett (n = 70), inkludert isolater fra forskjellige klonale komplekser, for å få innsikt i den evolusjonære prosessen til Mycoplasma bovis, spesielt for å løse fylogenetiske relasjoner og rekombinasjonshendelser. Som et supplement til denne analysen ble et deldatasett av M. bovis-isolater (n = 42) hentet fra et godt karakterisert område med flere verter i Portugal 31,36 videre utforsket for å utlede manglende identitet. Balansen mellom det relative forholdet mellom sense (dN) og synonyme (dS) nukleotidsubstitusjoner, samt det evolusjonære bidraget fra spesifikke genomer nevnt i litteraturen, er 37,38 oppnådd av MTBC-forfedre gjennom HGT, og koder for 3R (DNA-reparasjon, replikasjon og rekombinasjon) systemgenkomponenter 39. Velg gener oppnådd gjennom HGT fordi de kan representere gamle polymorfismer, så det forventes at de kan inneholde en høyere andel synonyme endringer. Genene som er inkludert i 3R-systemet ble valgt fordi tidligere arbeid med M. tuberculosis-stammer indikerte generelle negative/rensingsseleksjoner som virker på disse genene, og de kan spille en viktig rolle i evolusjonen 39. Et annet mål med dette arbeidet er å utlede eksistensen av reorganiseringshendelser. Av denne grunn, med tanke på at datasettet vårt fra Portugal bare inneholder genomene til europeisk klonkompleks 2 og stammene som ikke har tilordnet klonkomplekset, bestemte vi oss for å inkludere offentlig tilgjengelige genomdata for endelig å få en representasjon av alle klonkomplekser, og forbedre robustheten og bredden av resultatene.
42 nylig sekvenserte Mycoplasma bovis-genomer fra den portugisiske endemiske multivert-tuberkulose-scenen (detaljer nedenfor), tidligere karakterisert fra et epidemiologisk perspektiv36, er sentrum for dette arbeidet. Med tanke på at datasettet fra Portugal kun har representanter for de europeiske 2 klonkompleksene og stammer uten angitte komplekser, er offentlig tilgjengelige helgenomsekvenseringsdata lagt til for å utvide datasettet som inkluderer alle representanter for M. bovis-klonkompleksene. Derfor ble tre helgenomsekvenseringsdatakilder brukt i dette arbeidet: komplett/utkast-genomsamling, opptil 10 stillaser lagret i NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 isolater); lagret i SRA (Illumina fastq-filen i sekvenslesingsarkivet) representerer det komplekse mangfoldet av M. bovis-kloner (n = 12 isolater)30; og 42 nylig sekvenserte genomer fra Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ble ekskludert fra NCBI-søket. M. bovis AF2122/97 brukes vanligvis som et referansegenom som skal inkluderes i datasettet. På grunn av den offentlige utilgjengeligheten av hele genomsekvensen representert av African 1-kloningskomplekset, og det lille antallet genomer fra representative stammer av Af2 og Eu1, ble de originale sekvenseringsdataene levert av SRA brukt i disse tilfellene. Arbeidet til Zimpel og hans samarbeidspartnere (2020) bidro til å identifisere genomet fra det nevnte kloningskomplekset og bidro til å velge Mycobacterium bovis for inkludering i datasettet. For Eu3 er bare én type genom beskrevet (Branger et al., 2020), så genomet vi inkluderer er en separat representant for Eu3-komplekset.
Globalt inkluderer dette datasettet 70 arter av M. bovis fra storfe isolert fra 8 vertsarter, fordelt på 12 land fra 1985 til 2016. 36 arter er betegnet som Eu2, 7 arter er Eu1, 1 art er Eu3, 3 arter er Af1, 4 arter er Af2 og 19 kan ikke tilskrives noe klonalt kompleks (detaljer nedenfor). Den detaljerte informasjonen (inkludert tiltredelsesnummeret) om Mycobacterium bovis som ble brukt i denne studien, vises i tabell 1 og tilleggstabell 1.
42 nylig sekvenserte hele genomer av Mycobacterium bovis fra Portugals hotspots for dyretuberkulose og distribuert i mer enn 12 år er sentrum for denne studien, ettersom potensielle sykdomssystemer mellom vilt og husdyr har blitt regelmessig overvåket 31,36 (Tilleggsfigur 1). I henhold til påfølgende prosedyrer ble disse stammene isolert fra storfe (n = 14), hjort (n = 16) og villsvin (n = 12) fra 2003 til 2015: samle inn og håndter dyr i samsvar med de anbefalte protokollretningslinjene. Vevsprøvene finnes i OIEs Terrestrial Animal Handbook og er inokulert på Stonebrink og Löwenstein-Jensen pyruvat fast medium og flytende medium. Kulturene inkuberes ved 37 °C og veksten kontrolleres én gang i uken i minst 12 uker. Koloniene lagres direkte i en glyserolløsning ved -80 ºC. I det Mycobacterium-selektive mediet (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) ble de originale arkiverte prøvene ført gjennom en enkelt in vitro-passasje in vitro for å oppnå DNA fra WGS-programmet. For dette ble den frosne kulturstamløsningen beriket med 5 % natriumpyruvat og 10 % ADS (50 g albumin, 20 g glukose, 8,5 g natriumklorid i 1 liter vann) på Middlebrook 7H9 ved 37 °C Retrain. Etter 4 ukers vekst ble mediet fornyet, og kulturen ble regelmessig overvåket inntil vekst ble observert. Cellene ble høstet ved sentrifugering, pelleten ble resuspendert i 500 µL fosfatbufret saltvann (PBS), varmet opp ved 99 °C i 30 minutter, sentrifugert, og supernatanten ble lagret ved -20 °C inntil WGS. Alle prosedyrer utføres i nivå 3 biosikkerhetsfasiliteter.
WGS-biblioteket med parede ender fremstilles ved hjelp av den unike indeksen til hver DNA-prøve, og bruker Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 prøver) og HiSeq (2 × 150 pb) (to isolater)-teknologi (Eurofins Genomics, Tyskland) for sekvensering. I henhold til produsentens instruksjoner, bruk Illumina Genome Analyzer med dobbelt-endet modulfeste for å sekvensere det genomiske DNA-et, og bruk Nextera XT DNA Library Prep Kit fra Illumina for å konstruere biblioteket.
Med tanke på dataene som er hentet fra SRA (n = 12), kan identifikasjonen av klonkomplekset brukes som metadata for den tilsvarende publikasjonen 30, 41, 43. Når man vurderer det komplette genomet, med unntak av Mycobacterium bovis AF2122/97 og Mycobacterium bovis 3601, som er anerkjente medlemmer av henholdsvis Eu1- og Eu3-klonale komplekset 25, 29, er det det samme som det komplette genomet til Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI-tiltredelsesnummer NC_000962.3). Genomjustering utføres ved hjelp av MAFFT (multiple alignment program of amino acid or nucleotide sequence, versjon 7.458) og parameter -addfragments48. Deretter søkes det etter fravær av forskjellige klonale komplekser og/eller tilstedeværelse av SNP-funksjoner.
Den nylig sekvenserte Mycobacterium bovis (n = 42) og de originale avlesningene av det samlede genomutkastet (n = 3) justerer komplekset med referansegenomet Mycobacterium tuberculosis H37Rv gjennom vSNP-pipelinen og tilstedeværelsen av delesjons- og/eller SNP-trekk fra forskjellige kloner. Et søk ble utført.
Samle inn informasjon fra mangelen på funksjoner og/eller tilstedeværelsen/fraværet av SNP og spoligotypingprofiler for å tilordne genomiske data til det tilsvarende klonale komplekset. For de fire utkastsamlingene kan ikke spoligotypingprofilen utledes, så de er inkludert i gruppen "ingen kompleksitet".
Den bioinformatiske arbeidsflyten som følges av dette arbeidet starter med de novo-montering og kartlegging til en referansestrategi, med mål om å utforske rekombinasjonshendelser og spesifikke genompolymorfismer. Figur 1 viser et flytskjema over trinnene som følges. For rekombinasjonsanalyse brukes alle genomer for å øke robustheten til slutninger og relaterte indikatorer.
For å redusere feil i genereringen av genomkonsensussekvenser, oppnådde vi først de novo-assembling, og deretter kjernemultiple alignementer. Unicycler-pipelinen er for øyeblikket tilgjengelig på https://github.com/rrwick/Unicycler49 og brukes til å utføre de novo-assembling av 54 sekvenserte genomer (42 nylig sekvenserte og 12 fastq-filer gjenopprettet fra SRA). Kort sagt, før montering fra bunnen av, ble det utført en lesekvalitetsanalyse i FastQC versjon 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) og Trimmomatic versjon 0.36 (alternativet "cutting Adapters and other lighting-specific sequences from reads" og "Cut bases from the end of the read, if lower than the threshold quality of 20" er brukt) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Deretter ble SPAdes optimizer49 brukt til genomassembling, og Pilon versjon 1.1851 ble brukt til optimalisering etter montering. En konservativ brobyggingsmodus ble valgt for å unngå feil montering, og k-mer-størrelsen ble søkt og valgt mellom 20 % og 95 % av leselengden. Følg SPAdes-retningslinjene og vurder lesestørrelsen, slett contigs mindre enn 300 bp, og etabler en dybdedekningsgrense på 20 lesninger på 52. I de novo-monteringsstrategien ble genomiske regioner som de svært repeterende prolin-glutamat (PE) og prolin-prolin-glutamat (PPE) paralogene ikke fjernet.
Kvaliteten på de novo-samlingen vurderes gjennom QUAST-pipelinen (http://quast.sourceforge.net/quast.html), som letter fornyelsen av contigen og kartleggingen av M. bovis AF2122/97-referansegenomet (NCBI-tiltredelsesnummer LT708304.1) (se tilleggstabell 1 for kvalitetsparametere).
Ved hjelp av vSNP-pipelinen (https://github.com/USDA-VS/vSNP) sammenlignes FASTQ-filen til den nylig sekvenserte M. bovis fra Illumina-sekvensering med M. bovis AF2122/97-referansegenomet (LT708304.1)). I henhold til anbefalingene for beste praksis fra Genome Analysis Toolkit (GATK) [53, 54, 55] brukes standard filterparametere eller variantmassescore for rekalibrering. Resultatene filtreres ved hjelp av den laveste SAMtools-massescoren på 150 og AC = 2. Bruk også Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) for å sjekke avlesningene for å utelukke kontaminering. vSNP-pipelinen som brukes til å kartlegge sekvenseringsstrategier i vårt arbeid, undersøker en serie definerte SNP-er og mål, og ekskluderer også blandede infeksjonsscenarier. Den avleste genomdekningen er bedre enn 99 % (tilleggstabell 1).
For å unngå kartleggingsfeil og feil SNP-er, filtrer ut en variant i følgende tilfeller: (1) den støttes av færre enn 20 avlesninger, (2) den finnes med en frekvens på mindre enn 0,9, (3) den er i minst én stamme, men det er i det minste hull i en annen stamme. Integrated Genomics Viewer (IGV) versjon 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 ble brukt til å visuelt verifisere SNP-er og posisjoner med kartleggings- eller justeringsproblemer. Siden prolin-glutamat (PE) og prolin-prolin-glutamat (PPE)-genene er svært dupliserte og er en del av en multigenfamilie, blir de lett misforstått av Illumina-sekvensering og feilkartlegging, så de foretrekkes. Den mykobakterielle bioinformatikk-arbeidsflyten fjernet medlemmer av tuberkulosekomplekset når strategien med kartlegging til sekvensering ble brukt for å bekrefte SNP-er. Derfor filtrerte vi ut PE/PPE-gener og indels fra analysen.
I følge Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) er alle SNP-er delt inn i funksjonelle kategorier. SnpEff-pipelinen (https://pcingola.github.io/SnpEff/) brukes til å utlede SNP-konsekvenser (synonyme eller ikke-synonyme endringer). Opprettet en ny database over Mycobacterium bovis AF2122/97-genomet (LT708304.1).
Kjernegenommultiplejusteringen ble utført ved bruk av Parsnp v1.2, som for øyeblikket er tilgjengelig på https://github.com/marbl/parsnp57, med 69 komplette genomer/utkast-assembleringer (med alternativ -c), og M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) brukes som referanse. Fire kjernemultiple justeringer ble utført: kun medlemmene av Eu2-kloningskomplekset (n = 37), inkludert alle medlemmene av det europeiske kloningskomplekset (n = 44), inkludert knutepunktet mellom det europeiske og afrikanske kloningskomplekset (n = 51), og inkluderer alle Mycobacterium bovis i denne studien (n = 70).
Kjernejusteringen generert av Parsnp brukes til å utlede det fylogenetiske treet med maksimal sannsynlighet (ML) ved hjelp av CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 med RAxML, og utføre 1000 guidede replikasjoner.
Tre forskjellige algoritmer og bioinformatiske verktøy brukes til å sjekke for tilstedeværelsen av rekombinasjonshendelser parallelt: SplitsTree4-programvare, Gubbins-pipelinen (objektiv avstamning gjennom rekombinasjon i nukleotidsekvenser) og RDP4-programvare (rekombinasjonsdeteksjonsprogram, versjon beta 4.101).
Splittdekomponeringsmetoden implementert i SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 brukes til å beregne det rotløse fylogenetiske nettverket, ved bruk av Phi-test for statistisk verifisering, og signifikansterskelen er p = 0,05. Kjerneanalysen av Parsnp med flere justeringer brukes som input, og splittdekomponeringen som en nettverksstandard realiseres.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) kjører med standardparametere som en annen måte å evaluere effekten av rekombinasjon på Mycobacterium bovis. Algoritmen som er implementert i pipelinen rekonstruerer den relevante klonlinjen. Den komplette genom-/utkast-samlingen av datasettet vårt og referansegenomet (bovint bovid AF2122/97, LT708304.1) er gjensidig tilpasset; og skanner posisjonen til SNP-en på hver gren av treet for å oppdage SNP-klyngen som representerer rekombinasjonshendelsen. Nullpunktet for grenen Anta at det ikke er noen rekombinasjonshendelse, noe som betyr at SNP-ene som oppstår på grenen, skal være jevnt fordelt. Kjernemultiple-justeringen fra Parsnp og det best scorede ML-treet fra RAxML brukes som inputfiler.
Til slutt, for å bekrefte reorganiseringshendelsen som foreslås av Gubbins-pipelinen, brukes de seks algoritmene implementert i RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 og SiScan66) på Parsnps kjernemultiple justering under standardinnstillinger. Vi bestemte at minst tre av algoritmene implementert i RDP4 konsekvent må demonstrere et viktig signal for å verifisere hver rekombinasjonshendelse.
Tatt i betraktning at både Gubbins- og RDP-programvaren ser etter rekombinasjonssignaler ved å sjekke kjernemultiple justeringer i et vindu på opptil 500 bp, og bekrefte at inkluderingen av PE/PPE-gener under de novo-assemblage ikke vil forstyrre rekombinasjonssignalene som finnes, utføres videre analyse ved hjelp av homolinearitetssjekk av nærheten til genet som identifiserer rekombinasjonshendelsen. Det synlineære kartet som bruker hele genomet ble konstruert ved hjelp av MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) for å ekskludere lokale genom-translokasjoner eller inversjoner. I tillegg ble hele genomet brukt til å utføre homolinearitetsanalyse på aminosyresekvensen gjennom SyntTax-webserveren (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
En mer grundig analyse av genomdatasettet hentet fra det portugisiske multivert-tuberkulosesystemet er å sjekke polymorfismen til genene nevnt i litteraturen. Disse genene er 37, 38 og genet som koder for 3R, oppnådd av MTBC-forfedrene gjennom HGT-systemkomponenter (DNA-reparasjon, replikasjon og rekombinasjon) 39. Bruk ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) og bruk DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) for å beregne genmangfold og nukleotidmangfold (π) og Tajimas D-nøytrale testparameterinndata.
Et fylogenetisk tre med maksimal sannsynlighet (ML) basert på 69 Mycoplasma bovis-isolater og referansegenomer ble oppnådd (figur 2A). Sammenlignet med trær basert på ett gen eller flere lokus, tillater denne strategien generering av kraftigere trær som ikke fanger opp variasjonen i hele genomet og derfor viser en lavere evne til å skille mellom arter 68,69. Den topologiske strukturen til ML-treet er vanligvis i samsvar med den komplekse klassifiseringen av kloner. Genomet til Eu2 er gruppert i en gren, og genomet til Af1 er også gruppert sammen (figur 2A). Resultatet er også i samsvar med det kjente evolusjonære forholdet til Mycobacterium bovis, det vil si at det er en stor forskjell mellom Eu1-medlemmet og gruppen som består av alle andre klonale komplekser og genomer, men det klonale komplekset 30 er ikke spesifisert. Den lille inkonsistensen mellom det klonale komplekset og forholdet observert på det fylogenetiske treet kan forklares med det faktum at det klonale komplekset er beskrevet basert på spesifikke genomiske regioner, mens det fylogenetiske treet er basert på flere justeringer av kjernegenomer som representerer hele genomet.
Det fylogenetiske treet med maksimal sannsynlighet (GTR) er konstruert basert på kjernegenomjusteringen av Mycobacterium bovis-genomet før (A) og etter (B) fjerning av rekombinasjonssetet. Grenfargene representerer Mycobacterium bovis-klonkomplekset: Europa 1 er lilla, Europa 2 er rød, Europa 3 er blå, Afrika 1 er oransje og Afrika 2 er grønt. Treet er rotfestet og tegnet i målestokk, og grenlengden måles som en erstatning for hvert sted.
Mycobacterium tuberculosis-komplekset beskrives som klonalt utviklet, og det meste av bevisene som er samlet opp gjennom årene støtter ideen om at pågående HGT- og rekombinasjonshendelser ikke vil forekomme på det detekterbare nivået av MTBC15,17,18.
Tidligere arbeid har vist at det kan være begrenset rekombinasjon mellom MTBC-stammer20,21, mens andre ikke har klart å identifisere målbare rekombinasjonshendelser70,71. Diskuter dette problemet på nytt med fokus på Mycobacterium bovis, som er forskjellig fra det tidligere arbeidet som bare vurderte Mycobacterium tuberculosis70,71; eller vurder MTBC som helhet, med nesten ingen M. bovis som representerer20; eller vurder kun restriktive storfefraksjoner. Mykobakteriedatasettet, i dette arbeidet, er det totalt 70 stammer, som representerer alle klonale komplekser, som brukes til å screene for rekombinasjon. Datasettet er skalert i henhold til fire kumulative nivåer: (1) Eu2-medlemmer, (2) alle europeiske klonkompleksmedlemmer (dvs. Europa), (3) europeisk og afrikansk klonkompleks (Eu + Af) og (4) hele datasamlingen (inkludert genomer som ikke er inkludert i noen kloningskomplekser som allerede er beskrevet).
For å studere denne hypotesen videre ble det utført et splitt-dekomposisjonsnettverk for å vurdere fraværet av rekombinasjonshendelser mellom genomer, fordi denne metoden kan visualisere det forfedrelige forholdet mellom individer og vise motstridende fylogenetiske signaler. Alle fire datasettene i analysen bekreftet eksistensen av løkker i nettverket (det vil si områder som ikke konvergerer til et enkelt tre), men Phi-testen har ingen statistisk støtte (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; hele datasettet p = 0,2451), noe som gir dårlig bevis for eksistensen av reorganiseringshendelser (figur 3A-D).
I Europa 2 genomer (n = 37) (A), europeiske genomer (n = 44) (B), europeiske og afrikanske genomer (n = 51) (C) og hele datasettet (n = 70) (D).
Etter denne analysen, og med tanke på de sykliske observasjonene i alle nettverk, ble rekonstruksjonsalgoritmen implementert i Gubbins-pipelinen brukt til å rekonstruere den klonale avstamningen og for å supplere estimeringen av effekten av rekombinasjonen på M. bovis-genomet. Utled det kumulative antallet rekombinasjonshendelser, hvorav de fleste skjedde i terminale grener (det vil si i et enkelt genom) (tabell 2). Disse indikatorene viser konsistensen av hele datasettet og indikerer at frekvensen av rekombinasjonshendelser er 200 til 300 ganger hyppigheten av mutasjoner. Når rho/theta-parameteren som representerer de relative ratene av rekombinasjon og punktmutasjoner på grenen, ser det ut til å være mellom 0,0037 og 0,0056 (tabell 3). Nylig publiserte arbeider med 38 M. bovis-stammen viste en høyere rho/theta-verdi (rho/theta = 0,1) enn den som ble oppnådd i dette datasettet, men arbeidet til Patané og kolleger brukte referansebasert montering for å utlede rekombinasjonsparametere. En prosedyremessig detalj, på grunn av monteringsprosedyren, har blitt assosiert med forekomsten av antatte rekombinasjonshendelser i den terminale grenen.
Deretter representerer r/m-parameteren mangfoldsforholdet mellom rekombinasjon og mutasjonsintroduksjon, og gjennomsnittsverdien er mellom 0,025 og 0,037, noe som indikerer at rekombinasjon har en lavere total innvirkning på det genetiske mangfoldet til M. bovis, sammenlignet med mutasjoner (tabell 3). For omfattende sammenligning ble en lignende metode brukt til å estimere r/m-parameteren for MTBC-datasettet bestående av 23 genomer, som viser en gjennomsnittsverdi på 0,48620, mens det for Patané og kollegers 38 M. bovis-datasett viste seg at gjennomsnittsverdien er 0,98. I den første studien var bare to av de 23 genomene inkludert i arbeidet med M. bovis (M. bovis BCG og referansestammen), så den oppnådde verdien kan være skjev på grunn av overekspresjon av M. tuberculosis-genomet. I den andre rapporten ble de analyserte Mycobacterium bovis-populasjonene hovedsakelig gjenvunnet fra USA og husdyrverter. I motsetning til dette er flere geografiske steder og vertsarter representert i datasettet vårt, og genomer gruppert i forskjellige klonale komplekser med forskjellige populasjonsgenetiske egenskaper brukes også, noe som oppnår en dypere og bredere populasjonskunnskap. Forskjellen i r/m-gjennomsnittsverdien som er oppnådd med datasettet vårt, er i samsvar med konseptet om at graden av rekombinasjon varierer sterkt mellom avstamningene som er tilordnet den samme taksonomiske arten, så disse resultatene indikerer at M. bovis-klonkomplekset kan vise rekombinasjonsforskjeller. Virkningen er også som antydet av Didelot & Maiden72. Likevel vil en betydelig utvidelse av dette datasettet ved å inkludere et større antall M. bovis-genomer gi mulighet for ytterligere avklaring av dette punktet. Både r/m- og rho/theta-parametrene viser variasjon mellom grener, og dette resultatet er i samsvar med rapporter om andre bakteriearter72,73.
Til slutt, for å bekrefte reorganiseringshendelsene identifisert av Gubbins-pipelinen, ble seks forskjellige algoritmer brukt i RDP4-programvaren for å uavhengig teste forskjellige kjerne-multisammenligninger. Globalt ble mindre enn halvparten av hendelsene identifisert av Gubbins bekreftet av RDP4 (tabell 4 og 5). Med tanke på hele datasettet ble tre rekombinasjonshendelser bekreftet, to som involverte interne noder og den andre som involverte et enkelt genom i en terminal gren, som klonale komplekser ikke kunne tilordnes for (tabell 4 og 5). Identifiseringen av hendelser i terminale grener kan indikere at rekombinasjonen fortsatt pågår i samtidige M. bovis-stammer eller at resultatet er feilplassert70. I denne hypotetiske rekombinasjonsregionen har omtrent 20 % av posisjonene udefinerte nukleotider (N), noe som påvirker rekombinasjonssignalet (tilleggsfigur 2). I tillegg påvirker denne regionen rrs-genet, som koder for 16S ribosomalt RNA som forventes å være svært konservert, så dette antatte rekombinasjonssignalet kan være et resultat av sekvenseringsfeil eller feiljustering. Deretter ble hele genomjusteringen mellom Mb0003 og Mycobacterium bovis AF2122/97 utført, og eksistensen av udefinerte nukleotider og SNP-er ble bekreftet. De mulige problemene knyttet til feil justering skyldtes derfor ikke den biologiske informasjonen som ble implementert i dette arbeidet. Det dukket opp etter at man lærte seg programmet.
Ingen hull eller udefinerte nukleotider ble funnet i rekombinasjonsregionene til de interne nodene (figur 4 og 5). Når det gjelder disse hendelsene, inneholder den ene kun Eu2-genomet og påvirker pks12-genet, som koder for en mulig polyketidsyntase; mens den andre er registrert i Eu1-genomet og påvirker narX-genet som koder for en mulig nitratreduktase (tabell 4). Generelt viser rekombinasjonsanalysen at det er et begrenset antall rekombinasjonsfragmenter med statistisk støtte, og de utledede indikatorene indikerer at rekombinasjonen har lav innvirkning på M. bovis-avstamningen. Rekombinasjonssignalet forventes å være lavt, men det er viktig å skille det sanne evolusjonssignalet fra bakgrunnsstøyen, noe som er en utfordrende oppgave. For å redusere støysignalet introdusert av referansebasert montering og mismatch-problemer 70, 71, ble alle de andre unntatt hele genomet satt sammen fra bunnen av, og monteringskvaliteten ble kontrollert og sikret ved QUAST-pipelineanalyse (tilleggstabell 1). I tillegg ble det utført en rekke supplerende analyser for å sikre robusthet og nøyaktighet i den samlede undersøkelsen. Derfor ble sekvenseringskvaliteten til narX- og pks12-genene evaluert ved avlesningskartlegging mot Mycobacterium bovis AF2122/97. Den anbefalte SNP-posisjonen i rekombinasjonsregionen ble bekreftet ved å anvende kriteriene nevnt i metodedelen (minst 20 avlesninger og 0,9 endringsfrekvens). Polymorfismen til narX-genet ble fullstendig bekreftet i de to genomene (Mb1792361 og Mb7240415; 2,3 %) og genomene til pks12-genomet: Mb0891-, Mb1711-, Mb1789-, Mb1870-, Mb17046-, Mb1756- og Mb12-genene. For genomet Mb2043 oppfyller imidlertid ikke seks av de åtte posisjonene kriteriet for lesedybde fordi SNP støttes av maksimalt 17 lesninger, som er under den etablerte grenseverdien på 20. Derfor kan rekombinasjonen av seks genomer (8,6 %) på dette genomstedet bekreftes (figur 4 og 5).
Den detaljerte visualiseringen av rekombinasjonsregionjusteringen i Mycobacterium bovis-datasettet påvirker narX-genet som koder for en mulig nitratreduktase. Ingen hull eller udefinerte nukleotider ble funnet i rekombinasjonsregionen til de interne nodene. Denne spesifikke hendelsen er registrert i Eu1-genomet. Sekvenseringskvaliteten til narX-genet ble evaluert ved å plotte avlesningene av Mycobacterium bovis AF2122/97. Bekreft den anbefalte SNP-plasseringen i rekombinasjonsområdet ved å anvende kriteriene nevnt i metodedelen (minst 20 avlesninger og 0,9 endringsfrekvens). Polymorfismen til narX-genet ble fullstendig bekreftet i genomene til Mb1792361 og Mb7240415 (2,3 %).
Detaljert visualisering av rekombinasjonsregionjusteringen til Mycoplasma bovis-datasettet som påvirker pks12-genet. Ingen hull eller udefinerte nukleotider ble funnet i rekombinasjonsregionen til de interne nodene. Når det gjelder hendelsen som påvirker pks12-genet som koder for mulig polyketidsyntase, inneholder det kun Eu2-genomet. Sekvenseringskvaliteten til pks12 ble evaluert ved avlesningskartlegging av Mycobacterium bovis AF2122/97. Bekreft den anbefalte SNP-plasseringen i rekombinasjonsområdet ved å bruke kriteriene nevnt i metodedelen (minst 20 avlesninger og 0,9 endringsfrekvens). Polymorfismene til genomene Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 og Mb1960 er fullstendig bekreftet.
PE- og PPE-gener har repeterende regioner som lett kan feilleses av Illumina-sekvensering og feilkartlegging, så de slettes vanligvis bare fra bioinformatikk-arbeidsflyten til M. tuberculosis-medlemmer når kartlegging-til-sekvens-strategien brukes. Slutningen av rekombinasjonshendelser som brukes i dette arbeidet er basert på de novo-assembling uten å filtrere ut PE/PPE. Vi tror at ved å implementere tre forskjellige komplementære metoder og algoritmer gjennom SplitsTree, Gubbins pipeline og RDP4-programvare, er strategiene som brukes robuste for å behandle og filtrere de omorganiserte regionene forårsaket av feilsignaler. For å utelukke interferens fra PE/PPE-genet på Gubbins- og RDP4-programvaren for å identifisere SNP-klynger, og dermed identifiseringen av rekombinasjonsregionene som foreslås å påvirke narX- og pks12-genene, ble imidlertid nabolaget til disse genene undersøkt (tilleggsfigur 3–5). I M. bovis AF2122/97 er narX-genet atskilt av narK2 og Mb1764c, mens pks12 er omgitt av Mb2075c og Mb2073c (tilleggsfigur 3-5). Kartet generert ved hjelp av MAUVE synlinekartet av det komplette genomet gir informasjon om bevaring og omorganisering av gensekvens, og viser fire kollineære blokker, og ingen tegn til genomtranslokasjon eller inversjon. I tillegg beviste komplementeringsanalysen med aminosyresekvensen homologien i alle de komplette genomene, og ingen PE/PPE ble funnet i de tilstøtende regionene av narX eller pks12. For narX har ett genom (Mb0030) en lavere synonymiskåre fordi narX-genet ble identifisert som to fragmenter (fragment 1891 og 1890). For pks12, på grunn av likheter, viste Mb0030 og Mb003 lavere synlinearitetspoeng, mens pks12 ble identifisert i henholdsvis to og tre fragmenter, som representerte forskjellige domener av proteinet (tilleggsfigur 3-5). Med tanke på denne informasjonen, og Gubbins og RDP4-programvaren utfører begge analyser, kontrollerer vi kjernens multippeljustering av de maksimale 500 bp i vinduet, og bekreftet at PE/PPE-genet ikke vil forstyrre rekombinasjonssignalet som påvirker narX og pks12.
Selv om rekombinasjonssignalene som er oppdaget i dette datasettet kan anses som residualer, er det sant at rekombinasjon i M. bovis ikke kan utelukkes, så det bør fortsatt være gjenstand for videre analyse, der hele genomer fra forskjellige epidemiologiske scenarier sekvenseres til viktige.
Sammenligning av de fylogenetiske ML-trærne som ble oppnådd før og etter rekombinasjonskorreksjon (figur 2A, B) førte ikke til signifikante endringer i det utledede fylogenetiske forholdet, og M. bovis-stammene var gruppert i samme gruppe.
Etter å ha kartlagt 42 nylig sekvenserte M. bovis-avlesninger med referansegenomet til M. bovis AF2122/97, ble det oppnådd en SNP-justering som inneholdt 1816 polymorfe posisjoner. De fleste SNP-ene (87,1 %) er lokalisert i kodingsregionen, og de berørte genene er karakterisert i henhold til de funksjonelle kategoriene vist i Bovilist (figur 6A, B). Når man tar hensyn til det totale antallet gener i hver funksjonelle kategori, viste genene i kategorien "lipidmetabolisme" flere SNP-er, etterfulgt av "cellevegg og celleprosesser" og "mellomliggende metabolisme og respirasjon", noe som avslører at de er i M. bovis-evolusjonen.
Hierarkisk analyse av M. bovis-datasettet fra Portugal (n = 42). Totalt antall registrerte SNP-er og berørte gener for hver funksjonskategori (A). Totalt antall synonyme og ikke-synonyme endringer registrert etter funksjonskategori (B).
På global skala er det gjennomsnittlige dN/dS-forholdet bedre enn 1,5, noe som indikerer at det globale evolusjonære presset er å kvitte seg med den opprinnelige tilstanden og representerer et positivt (diversifisert eller rettet) og/eller avslappet rensingsvalgscenario. I kategoriene «virulens, avgiftning, tilpasning», «innsettingssekvenser og fager» og «regulatoriske proteiner» er mer enn to tredjedeler av SNP-ene ikke-synonyme (figur 6B).
I alle kategorier finnes det gener med flere SNP-er, noe som resulterer i en gjennomsnittlig mutasjonsrate (det vil si gjennomsnittlig SNP per gen) større enn 1 (figur 6A). Pks12 (Mb2074c) med 15 SNP-er og fas (Mb2553c) med 8 SNP-er har høyere mutasjonsverdier. Begge disse genene er involvert i fettsyremetabolismen. pks-genet koder for polyketidsyntase (PKS), som er et multifunksjonelt enzym involvert i lipidbiosyntese i mykobakterielle cellevegger74,75. Dette genet koder for et multifunksjonelt polypeptid som er involvert i syntesen av mykoketider74,76. fas-genet er involvert i syntesen av mykolsyre. Begge disse genene spiller en viktig rolle i biosyntesen av celleveggen i kontakt med verten.
For å studere utviklingen av Mycobacterium bovis videre ble to sett med spesifikke gener analysert. Tidligere publiserte arbeider som bruker sekvenssammensetning og fylogenetiske metoder identifiserte gener som ble ervervet av MTBC-forfedre gjennom HGT før diversifisering37,38. Disse genene er listet opp i tilleggstabell 2. SNP-fordelingen av totalt 77 gener som kan være relatert til HGT ble analysert, og 26 polymorfe steder ble identifisert, som i de fleste tilfeller (78 %) resulterte i ikke-synonyme (NS) endringer (tilleggstabell 2). Tidligere arbeid med MTBC-genomet viste at den antatte HGT-regionen viser et høyere NS SNP-forhold sammenlignet med resten av genomet. Hvis man tror at disse rekombinasjonsregionene ble ervervet av MTBC-forfedre, og derfor overrepresenterer de gamle polymorfismer, forventes andelen synonyme endringer å være høyere, fordi NS-substitusjoner forventes å bli eliminert ved negativ seleksjon på grunn av aminosyreendringer som kan endre proteinets funksjon. Resultatene våre indikerer derfor at de funksjonelle konsekvensene kan stamme fra erstatningen av HGT-lignende gener, noe som gjenspeiler deres betydning for verdifullt adaptivt genetisk mangfold.
Parallelt med denne analysen ble genene som koder for komponentene i 3R-systemet (DNA-reparasjon, replikasjon og rekombinasjon) grundig undersøkt i samsvar med listen som tidligere ble publisert av dos Vultos og samarbeidspartnere (2008)39. Utveksling av identiske DNA-fragmenter kan ikke observeres direkte, selv om det kan være en hyppig prosess når nært beslektede bakterier er involvert, slik som i tilfellet med dette datasettet. I tillegg kan denne prosessen være nøkkelen til DNA-reparasjonsmetoder72, så spille en rolle i homolog rekombinasjon. Totalt 26 polymorfe posisjoner fordelt på 54 gener ble identifisert (tilleggstabell 3). I dette settet med gener sto NS-endringer for omtrent 65 % av konsekvensene, noe som er i samsvar med tidligere rapporter om Mycobacterium tuberculosis-stammer.
Publisert: 21. oktober 2021