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O sequenciamento genômico revitalizou o campo da pesquisa em doenças infecciosas, revelando a epidemiologia, a patogênese, as interações hospedeiro-patógeno e o processo evolutivo imposto aos patógenos. O complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) considera o Mycobacterium bovis um de seus membros adaptativos animais que causam tuberculose (TB) em mamíferos terrestres e é um modelo típico de evolução bacteriana. Como outros membros do MTBC, presume-se que o Mycobacterium bovis seja um patógeno estritamente clonado e de evolução lenta, e não há, obviamente, sinais de recombinação ou transferência horizontal de genes. Neste trabalho, aplicamos a genômica comparativa a um conjunto de dados de sequência completa do genoma (WGS) composto por 70 M. bovinos de diferentes linhagens (Europa e África) para obter insights sobre a diversidade genética do M. bovino. Poder evolutivo. Três métodos diferentes são usados para estimar os sinais de reorganização. Globalmente, um pequeno número de eventos de recombinação foi identificado e confirmado por dois métodos independentes com suporte sólido. No entanto, em comparação com mutações, a recombinação tem um efeito mais fraco na diversidade de M. bovis (r/m geral = 0,037). A diferença média r/m obtida no complexo clonal de Mycobacterium bovis em nosso conjunto de dados é consistente com o conceito geral de que o grau de recombinação pode variar muito entre as linhagens atribuídas à mesma espécie taxonômica. Com base neste trabalho, a recombinação em Mycobacterium bovis não pode ser descartada, portanto, deve ser objeto de esforços adicionais em futuras pesquisas genômicas comparativas, nas quais WGS de grandes conjuntos de dados de diferentes cenários epidemiológicos ao redor do mundo é crucial. Uma análise adicional foi então realizada no conjunto menor de dados de Mycobacterium bovis (n = 42) da prevalência de TB multi-hospedeiro, e mais de 1.800 loci foram identificados, dos quais pelo menos uma cepa apresentou um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). A maioria (87,1%) está localizada na região codificadora, e a razão global de alterações não sinônimas (dN/dS) de alterações sinônimas excede 1,5, indicando que a seleção positiva é uma importante força evolutiva exercida sobre M. bovis. Uma proporção maior de SNPs foi detectada em genes ricos em categorias funcionais de "metabolismo lipídico", "parede celular e processos celulares" e "metabolismo intermediário e respiração", revelando seu potencial na biologia e na evolução da importância de Mycobacterium bovis. Um olhar mais atento aos genes nos ancestrais do MTBC que são propensos à transferência horizontal de genes e incluídos no sistema 3R (reparo, replicação e recombinação de DNA) revela o valor negativo médio global do teste neutro D de Taijima, que indica varredura seletiva anterior. O recente gargalo após a expansão populacional ainda é o principal fator evolutivo que impulsiona o patógeno obrigatório Mycobacterium bovis a combater o hospedeiro.
O complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) é um dos táxons de patógenos bacterianos mais bem-sucedidos e um caso típico de evolução bacteriana. Seus membros apresentam identidade de nucleotídeos surpreendentemente alta no nível genômico (> 99%)1,2. Diferentes ecótipos de MTBC podem causar tuberculose (TB), uma doença granulomatosa infecciosa, em uma ampla gama de espécies hospedeiras, desde micromamíferos até humanos3,4,5. Atualmente, o complexo inclui humanos [M. tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] e patógenos adaptados a animais (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" e "dassie")5,6. M. canettii (também conhecido como "Nodobacter glabrata") A identidade média de nucleotídeos com as micobactérias mencionadas é de 98%, e o trabalho de genômica comparativa mostrou que M. canettii e o restante do MTBC divergiram recentemente do ancestral comum.7 Considerando esse conceito, alguns autores chamam M. canettii de Membro do MTBC 8.
O MTBC é sistematicamente descrito como um complexo clonal estrito, e sua estrutura populacional é claramente governada por diversidade reduzida, gargalos, varredura seletiva e deriva genética9,10. Assumindo uma evolução clonal estrita complexa, como polimorfismos ausentes, não pode ser restaurada por recombinação. Com base nessa premissa, os eventos consecutivos da deleção genômica da região diferencial (RD) e TbD1 (região de deleção 1 específica de Mtb) foram propostos como marcadores moleculares da evolução do MTBC2,5,11. O trabalho de genômica comparativa e sequenciamento do genoma completo (WGS) apoia a divisão de membros adaptados ao homem em nove linhagens (Mycobacterium tuberculosis L1 a L4, L7 e L8; e Mycobacterium africanum L5, L6 e L9), as linhagens L2 a L4 compartilham a região TbD12,11,12,13. Além disso, propõe-se que os membros adaptados aos animais compartilhem um ancestral comum, que é definido por deleções específicas do clado em RD7, RD8, RD9 e RD102, 5 e 14.
Transferência horizontal de genes (HGT) e eventos de recombinação são considerados raros e ocorrem nos ancestrais do MTBC, em vez de na história diferente de todo o membro do MTBC15,16,17. Dois relatórios iniciais de Hughes e colaboradores (2002) e Gutacker e colaboradores (2006) sugeriram que eventos de recombinação podem ajudar a moldar polimorfismos que marcam loci específicos em cepas de M. tuberculosis18,19. As razões para a óbvia ausência de recombinação no MTBC são: (1) o processo mecânico e a perda da capacidade do HGT; (2) a raridade dos eventos de HGT; (3) não há chance de eventos de recombinação no nicho do MTBC14,17. Recentemente, alguns estudos de sequenciamento do genoma completo (WGS) aplicados à cepa 20 de MTBC e Mycobacterium bovis 21 forneceram evidências de recombinação, os primeiros a mostrar que as cepas de MTBC frequentemente trocam pequenos fragmentos de DNA, mas devido à variação limitada da sequência de nucleotídeos, esses eventos ainda não foram notados.
Mycobacterium bovis é o membro do MTBC mais comumente recuperado de animais de criação (principalmente bovinos), embora também possa ser isolado de animais selvagens criados soltos e cercados4,22,23,24. M. bovis evoluiu em cinco complexos clonais principais [Europeu 1 (Eu1), Europeu 2 (Eu2), Europeu 3 (Eu3), Africano 1 (Af1) e África 2 (Af2)], de acordo com o perfil de spoligotipagem, deleções específicas e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) 25, 26, 27, 28, 29 em genes específicos. Esses complexos clonais demonstram a estrutura diversa da população de Mycobacterium bovis e sua associação com regiões geográficas. Além disso, o recente trabalho do WGS realizado por Zimpel e colaboradores (2020) projetou uma filogenia baseada no SNP de Mycobacterium bovis, com mais de 1.900 genomas, indicando que há pelo menos quatro linhagens diferentes (denominadas Lb1 a Lb1 a Lb4), elas não são completamente consistentes com o complexo clonal previamente definido, embora a especificidade geográfica também possa ser confirmada30. Esses autores realizaram análise diferencial de filogenia e datação molecular, mas não estudaram recombinação30.
Trabalhos anteriores utilizando diferentes técnicas moleculares, como spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) e tipagem recente de SNPs revelaram um certo nível de diversidade genética entre cepas de M. bovis 31,32,33, 34,35. A diferenciação da variação genética tornou-se uma ferramenta importante no estudo da epidemiologia de doenças, sendo útil para a compreensão aprofundada da patogênese, virulência e transmissão de doenças. O surgimento do método WGS oferece a possibilidade de revelar os fatores evolutivos que impulsionam o genoma do Mycobacterium bovis no processo de adaptação e persistência a diferentes hospedeiros e cenários epidemiológicos.
Neste trabalho, usamos análise genômica comparativa em vários conjuntos de dados de Mycoplasma bovis (n = 70), incluindo isolados de diferentes complexos clonais, para obter insights sobre o processo evolutivo de Mycoplasma bovis, especialmente para resolver relações filogenéticas e eventos de recombinação. Como um suplemento a esta análise, um subconjunto de dados de isolados de M. bovis (n = 42) obtidos de uma área de tuberculose multi-hospedeiro bem caracterizada em Portugal 31,36 foi explorado para inferir não identidade O equilíbrio entre a proporção relativa de substituições de nucleotídeos de sentido (dN) para sinônimos (dS), bem como a contribuição evolutiva de genomas específicos mencionados na literatura, eles são 37,38 obtidos por ancestrais MTBC através de HGT e codificam componentes de genes do sistema 3R (reparo, replicação e recombinação de DNA) 39. Escolha genes obtidos através de HGT porque eles podem representar polimorfismos antigos, então é esperado que eles possam conter uma proporção maior de mudanças sinônimas. Os genes incluídos no sistema 3R foram selecionados porque trabalhos anteriores com cepas de M. tuberculosis indicaram seleções negativas/de purificação gerais que atuam nesses genes, e eles podem desempenhar um papel importante na evolução 39. Outro objetivo deste trabalho é inferir a existência de eventos de reorganização. Por esse motivo, considerando que nosso conjunto de dados de Portugal contém apenas os genomas do complexo clonal europeu 2 e as cepas que não possuem o complexo clonal atribuído, decidimos incluir dados genômicos disponíveis publicamente para finalmente obter uma representação de todos os complexos clonais e melhorar a robustez e a amplitude dos resultados.
42 genomas de Mycoplasma bovis recentemente sequenciados da cena endêmica portuguesa de tuberculose multi-hospedeiro (detalhes abaixo), previamente caracterizados de uma perspectiva epidemiológica36, são o centro deste trabalho. Considerando que o conjunto de dados de Portugal possui apenas representantes dos complexos de clones europeus 2 e cepas sem complexos designados, dados de sequenciamento do genoma completo disponíveis publicamente foram adicionados para expandir o conjunto de dados que inclui todos os representantes dos complexos de clones de M. bovis. Portanto, três fontes de dados de sequenciamento do genoma completo foram usadas neste trabalho: montagem completa/rascunho do genoma, até 10 scaffolds armazenados no NCBI (Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia) (n = 15 isolados); armazenados em SRA (o arquivo fastq da Illumina do arquivo de leitura de sequência) representa a complexa diversidade de clones de M. bovis (n = 12 isolados)30; e 42 genomas recentemente sequenciados de Portugal. O Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) foi excluído da busca no NCBI. M. bovis AF2122/97 é geralmente usado como genoma de referência a ser incluído no conjunto de dados. Devido à indisponibilidade pública da sequência completa do genoma representada pelo complexo de clonagem Africano 1 e ao pequeno número de genomas de cepas representativas de Af2 e Eu1, os dados de sequenciamento originais fornecidos pela SRA foram utilizados nesses casos. O trabalho de Zimpel e seus colaboradores (2020) ajudou a identificar o genoma do complexo de clonagem mencionado e a selecionar Mycobacterium bovis para inclusão no conjunto de dados. Para Eu3, apenas um tipo de genoma é descrito (Branger et al., 2020), portanto, o genoma que incluímos é um representante separado do complexo Eu3.
Globalmente, este conjunto de dados inclui 70 M. bovis bovinos isolados de 8 espécies hospedeiras, distribuídos em 12 países entre 1985 e 2016. 36 espécies são designadas como Eu2, 7 espécies são Eu1, 1 espécie é Eu3, 3 espécies são Af1, 4 espécies são Af2 e 19 não são atribuíveis a nenhum complexo clonal (detalhes abaixo). As informações detalhadas (incluindo o número de acesso) do Mycobacterium bovis utilizadas neste estudo são apresentadas na Tabela 1 e na Tabela Suplementar 1.
42 genomas inteiros recentemente sequenciados de Mycobacterium bovis dos hotspots de tuberculose animal de Portugal e distribuídos por mais de 12 anos são o centro deste estudo, uma vez que potenciais sistemas de doenças da vida selvagem-gado têm sido monitorados regularmente 31,36 (Fig. Suplementar 1). De acordo com procedimentos subsequentes, essas cepas foram isoladas de bovinos (n = 14), veados vermelhos (n = 16) e javalis (n = 12) de 2003 a 2015: coletar e manusear os animais de acordo com as diretrizes do protocolo recomendadas As amostras de tecido estão no Manual de Animais Terrestres da OIE e são inoculadas em meio sólido e líquido de piruvato de Stonebrink e Löwenstein-Jensen. As culturas são incubadas a 37 °C e o crescimento é verificado uma vez por semana por pelo menos 12 semanas. As colônias são armazenadas diretamente em uma solução de glicerol a -80 °C. No meio seletivo Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), as amostras originais arquivadas foram passadas por uma única passagem in vitro para obter o DNA do programa WGS. Para isso, a solução estoque de cultura congelada foi enriquecida com 5% de piruvato de sódio e 10% de ADS (50 g de albumina, 20 g de glicose, 8,5 g de cloreto de sódio em 1 L de água) em Middlebrook 7H9 a 37 °C Retrain. Após 4 semanas de crescimento, o meio foi renovado e a cultura foi monitorada regularmente até que o crescimento fosse observado. As células foram colhidas por centrifugação, o pellet foi ressuspenso em 500 µL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), aquecido a 99 °C por 30 minutos, centrifugado e o sobrenadante foi armazenado a -20 °C até WGS. Todos os procedimentos são realizados em instalações de biossegurança nível 3.
A biblioteca genômica WGS de extremidades pareadas é preparada utilizando o índice único de cada amostra de DNA e utiliza as tecnologias Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 amostras) e HiSeq (2 × 150 pb) (dois isolados) (Eurofins Genomics, Alemanha) para sequenciamento. De acordo com as instruções do fabricante, utilize o Analisador de Genoma Illumina com módulo de extremidade dupla para sequenciar o DNA genômico e o Kit de Preparação de Biblioteca de DNA Nextera XT da Illumina para construir a biblioteca.
Considerando os dados recuperados da SRA (n = 12), a identificação do complexo clonal pode ser usada como metadados da publicação correspondente 30, 41, 43. Ao considerar o genoma completo, exceto para Mycobacterium bovis AF2122/97 e Mycobacterium bovis 3601, que são membros reconhecidos do complexo clonal Eu1 e Eu3 25, 29, respectivamente, é o mesmo que o genoma completo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (número de acesso NCBI NC_000962.3). O alinhamento do genoma é realizado usando MAFFT (programa de alinhamento múltiplo de sequência de aminoácidos ou nucleotídeos, versão 7.458) e o parâmetro -addfragments48. Em seguida, procure pela ausência de diferentes complexos clonais e/ou pela presença de características de SNP.
O Mycobacterium bovis recém-sequenciado (n = 42) e as leituras originais do rascunho do genoma montado (n = 3) alinham o complexo com o genoma de referência Mycobacterium tuberculosis H37Rv por meio do pipeline vSNP e da presença de deleção e/ou características de SNP de diferentes clones. Uma busca foi conduzida.
Coletar informações sobre a ausência de características e/ou a presença/ausência de SNPs e perfis de spoligotipagem para atribuir dados genômicos ao complexo clonal correspondente. Para os quatro conjuntos de rascunho, o perfil de spoligotipagem não pode ser inferido, portanto, eles são incluídos no grupo "sem complexidade".
O fluxo de trabalho de bioinformática seguido por este trabalho parte da montagem e mapeamento de novo para uma estratégia de referência, com o objetivo de explorar eventos de recombinação e polimorfismos genômicos específicos. A Figura 1 apresenta um fluxograma das etapas seguidas. Para a análise de recombinação, todos os genomas são utilizados para aumentar a robustez das inferências e indicadores relacionados.
Para reduzir erros na geração de sequências de consenso do genoma, primeiro obtivemos a montagem de novo e, em seguida, obtivemos alinhamentos múltiplos do núcleo. O pipeline do Unicycler está atualmente disponível em https://github.com/rrwick/Unicycler49 e é usado para realizar a montagem de novo de 54 genomas sequenciados (42 recém-sequenciados e 12 arquivos fastq recuperados do SRA). Em resumo, antes da montagem do zero, a análise da qualidade de leitura foi realizada no FastQC versão 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) e no Trimmomatic versão 0.36 (opções como "Recortar adaptadores e outras sequências específicas de iluminação das leituras" e "Recortar bases do final da leitura, se a qualidade for inferior à do limite de 20" foram aplicadas) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Em seguida, o otimizador SPAdes 49 foi utilizado para a montagem do genoma, e o Pilon versão 1.1851 foi utilizado para a otimização pós-montagem. Um modo de ponte conservador foi selecionado para evitar a montagem incorreta, e o tamanho do k-mer foi pesquisado e selecionado entre 20% e 95% do comprimento da leitura. Siga as diretrizes do SPAdes e considere o tamanho da leitura, exclua contigs menores que 300 pb e estabeleça um limite de cobertura de profundidade de leitura de 20 de 52. Na estratégia de montagem de novo, regiões genômicas como os parálogos altamente repetitivos prolina-glutamato (PE) e prolina-prolina glutamato (PPE) não foram removidos.
A qualidade da montagem de novo é avaliada por meio do pipeline QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), que facilita a renovação do contig e o mapeamento do genoma de referência M. bovis AF2122/97 (número de acesso NCBI LT708304.1) (consulte a Tabela Suplementar 1 para parâmetros de qualidade).
Com a ajuda do pipeline vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), o arquivo FASTQ do M. bovis recém-sequenciado do sequenciamento Illumina é comparado com o genoma de referência AF2122/97 do M. bovis (LT708304.1). De acordo com as recomendações de melhores práticas do Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54 e 55, aplicam-se parâmetros de filtro padrão ou pontuações de massa variantes para recalibração. Os resultados são filtrados usando a menor pontuação de massa do SAMtools de 150 e CA = 2. Use também o Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) para verificar as leituras e descartar contaminação. O pipeline vSNP usado para mapear as estratégias de sequência em nosso trabalho examina uma série de SNPs e alvos definidos e também exclui cenários de infecção mista. A cobertura do genoma lido é superior a 99% (Tabela Suplementar 1).
Para evitar erros de mapeamento e SNPs errados, filtre uma variante nos seguintes casos: (1) é suportada por menos de 20 leituras, (2) é encontrada com uma frequência menor que 0,9, (3) está em pelo menos uma cepa, mas pelo menos há lacunas em outra cepa. O visualizador genômico integrado (IGV) versão 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 foi usado para verificar visualmente SNPs e posições com problemas de mapeamento ou alinhamento. Como os genes prolina-glutamato (PE) e prolina-prolina glutamato (PPE) são altamente duplicados e fazem parte de uma família multigênica, eles são facilmente mal interpretados pelo sequenciamento e mapeamento incorreto da Illumina, então eles são preferidos O fluxo de trabalho de bioinformática micobacteriana removeu membros do complexo da tuberculose ao usar a estratégia de mapeamento para sequenciamento para confirmar SNPs. Portanto, filtramos os genes PE/PPE e indels da análise.
De acordo com Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), todos os SNPs são divididos em categorias funcionais. O pipeline SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) é usado para inferir consequências de SNPs (alterações sinônimas ou não sinônimas). Criou um novo banco de dados do genoma do Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
O alinhamento múltiplo do genoma central foi realizado utilizando o Parsnp v1.2, atualmente disponível em https://github.com/marbl/parsnp57, utilizando 69 genomas completos/montagens de rascunho (com a opção -c) e M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) como referência. Quatro alinhamentos múltiplos do genoma central foram realizados: apenas os membros do complexo de clonagem Eu2 (n = 37), incluindo todos os membros do complexo de clonagem europeu (n = 44), incluindo o ponto de junção do complexo de clonagem europeu e africano (n = 51), e incluindo todos os Mycobacterium bovis neste estudo (n = 70).
O alinhamento central gerado pelo Parsnp é usado para inferir a árvore filogenética de máxima verossimilhança (ML) usando o CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 usando RAxML e realizar 1000 replicações guiadas.
Três algoritmos e ferramentas de bioinformática diferentes são usados para verificar a presença de eventos de recombinação em paralelo: software SplitsTree4, pipeline Gubbins (linhagem imparcial por meio de recombinação em sequências de nucleotídeos) e software RDP4 (programa de detecção de recombinação, versão beta 4.101).
O método de decomposição dividida implementado no SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 é usado para calcular a rede filogenética sem raízes, utilizando o teste Phi para verificação estatística, e o limite de significância é p = 0,05. A análise de alinhamento múltiplo do núcleo do Parsnp é usada como entrada, e a decomposição dividida é realizada como um padrão de rede.
O pipeline Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 é executado com parâmetros padrão como outra maneira de avaliar o impacto da recombinação no Mycobacterium bovis. O algoritmo implementado no pipeline reconstrói a linhagem de clones relevante. O conjunto completo de genoma/rascunho do nosso conjunto de dados e o genoma de referência (bovino AF2122/97, LT708304.1) são mutuamente; e escaneiam a posição do SNP em cada ramo da árvore para detectar o cluster de SNP que representa o evento de recombinação. O zero do ramo Assuma que não há evento de recombinação, o que significa que os SNPs que ocorrem no ramo devem ser distribuídos uniformemente. O alinhamento múltiplo do núcleo do Parsnp e a árvore ML com melhor pontuação do RAxML são usados como arquivos de entrada.
Por fim, para confirmar o evento de reorganização sugerido pelo pipeline de Gubbins, os seis algoritmos implementados no RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 e SiScan66) são aplicados ao alinhamento múltiplo do núcleo do Parsnp sob as configurações padrão. Determinamos que pelo menos três dos algoritmos implementados no RDP4 devem demonstrar consistentemente um sinal importante para verificar cada evento de recombinação.
Considerando que tanto o software Gubbins quanto o RDP buscam sinais de recombinação verificando os alinhamentos múltiplos do núcleo em uma janela de até 500 pb e confirmando que a inclusão de genes PE/PPE durante a montagem de novo não interferirá nos sinais de recombinação encontrados, análises adicionais são feitas por homolinearidade. Verifique a vizinhança do gene que identifica o evento de recombinação. O mapa sinlinear usando o genoma completo foi construído usando o alinhamento multigenoma MAUVE (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) para excluir translocações ou inversões locais do genoma. Além disso, todo o genoma foi usado para realizar a análise de homolinearidade na sequência de aminoácidos por meio do servidor web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Uma análise mais aprofundada do conjunto de dados genômicos obtidos do sistema português de tuberculose multi-hospedeiro visa verificar o polimorfismo dos genes mencionados na literatura. Esses genes são 37,38 e o gene que codifica 3R, obtido pelos ancestrais do MTBC por meio de componentes do sistema HGT (reparo, replicação e recombinação de DNA). 39. Utilize o ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) e o DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) para calcular a diversidade genética e a diversidade de nucleotídeos (π) e a entrada de parâmetros do teste neutro D de Tajima.
Uma árvore filogenética de máxima verossimilhança (ML) baseada em 69 isolados de Mycoplasma bovis e genomas de referência foi obtida (Figura 2A). Comparada com árvores baseadas em gene único ou árvores baseadas em múltiplos locos, essa estratégia permite a geração de árvores mais poderosas que não capturam a variabilidade de todo o genoma e, portanto, exibem uma menor capacidade de discriminar entre espécies 68,69. A estrutura topológica da árvore ML é geralmente consistente com a classificação complexa de clones. O genoma de Eu2 é agrupado em um ramo, e o genoma de Af1 também é agrupado (Figura 2A). O resultado também é consistente com a relação evolutiva conhecida de Mycobacterium bovis, ou seja, há uma grande diferença entre o membro Eu1 e o grupo que consiste em todos os outros complexos clonais e genomas, mas o complexo clonal 30 não é especificado. A pequena inconsistência entre o complexo clonal e a relação observada na árvore filogenética pode ser explicada pelo fato de que o complexo clonal é descrito com base em regiões genômicas específicas, enquanto a árvore filogenética é baseada em múltiplos alinhamentos de genomas centrais que representam todo o genoma.
A árvore filogenética de máxima verossimilhança (GTR) é construída com base no alinhamento do genoma central do Mycobacterium bovis antes (A) e depois (B) da remoção do sítio de recombinação. As cores dos ramos representam o complexo de clones do Mycobacterium bovis: Europa 1 é roxo, Europa 2 é vermelho, Europa 3 é azul, África 1 é laranja e África 2 é verde. A árvore é enraizada e desenhada em escala, e o comprimento do ramo é medido como uma substituição para cada sítio.
O complexo Mycobacterium tuberculosis é descrito como evoluído clonalmente, e a maioria das evidências acumuladas ao longo dos anos apoia a ideia de que eventos contínuos de HGT e recombinação não ocorrerão no nível detectável de MTBC15,17,18.
Trabalhos anteriores mostraram que pode haver recombinação limitada entre cepas de MTBC20,21, enquanto outros falharam em identificar eventos de recombinação mensuráveis70,71. Rediscuta esta questão com o foco em Mycobacterium bovis, que é diferente do trabalho anterior que considerou apenas Mycobacterium tuberculosis70,71; ou considere o MTBC como um todo, com quase nenhum M. bovis representando 20; ou considere apenas frações restritivas de gado. O conjunto de dados de micobactérias, neste trabalho, tem um total de 70 cepas, representando todos os complexos clonais, usados para rastrear a recombinação. O conjunto de dados é dimensionado de acordo com quatro níveis cumulativos: (1) membros Eu2, (2) todos os membros do complexo de clones europeus (ou seja, Europa), (3) complexo de clones europeus e africanos (Eu + Af) e (4) todas as coleções de dados (incluindo genomas que não estão incluídos em nenhum complexo de clonagem já descrito).
Para aprofundar o estudo dessa hipótese, uma rede de decomposição dividida foi realizada para avaliar a ausência de eventos de recombinação entre genomas, pois esse método permite visualizar a relação ancestral entre indivíduos e exibir sinais filogenéticos conflitantes. Todos os quatro conjuntos de dados analisados confirmaram a existência de loops na rede (ou seja, áreas que não convergem em uma única árvore), mas o teste Phi não tem suporte estatístico (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; todo o conjunto de dados p = 0,2451), o que fornece evidências insuficientes da existência de eventos de reorganização (Figura 3A-D).
Na Europa, 2 genomas (n = 37) (A), genomas europeus (n = 44) (B), genomas europeus e africanos (n = 51) (C) e todo o conjunto de dados (n = 70) (D).
Após essa análise, e levando em consideração as observações cíclicas em todas as redes, o algoritmo de reconstrução implementado no pipeline de Gubbins foi aplicado para reconstruir a linhagem clonal e complementar a estimativa do efeito da recombinação no genoma de M. bovis. Inferir o número cumulativo de eventos de recombinação, a maioria dos quais ocorreu em ramos terminais (ou seja, em um único genoma) (Tabela 2). Esses indicadores mostram a consistência de todo o conjunto de dados e indicam que a frequência de eventos de recombinação é de 200 a 300 vezes maior que a de mutações. Uma vez que o parâmetro rho/theta que representa as taxas relativas de recombinação e mutações pontuais no ramo parece estar entre 0,0037 e 0,0056 (Tabela 3). Recentemente, o trabalho publicado da cepa 38 M. bovis demonstrou um valor rho/theta maior (rho/theta = 0,1) do que o obtido neste conjunto de dados, mas o trabalho de Patané e colegas usou montagem baseada em referência para inferir parâmetros de recombinação. Um detalhe processual, devido ao procedimento de montagem, foi associado à abundância de eventos putativos de recombinação no ramo terminal.
Em seguida, o parâmetro r/m representa a razão de diversidade da recombinação e introdução de mutação, e seu valor médio está entre 0,025 e 0,037, indicando que, em comparação com as mutações, a recombinação tem um impacto geral menor na diversidade genética de M. bovis (Tabela 3). Para comparação extensiva, um método semelhante foi usado para estimar o parâmetro r/m para o conjunto de dados MTBC composto por 23 genomas, mostrando um valor médio de 0,48620, enquanto para o conjunto de dados 38 M. bovis de Patané e colegas, provou-se que o valor médio é 0,98. No primeiro estudo, apenas dois dos 23 genomas incluídos no trabalho de M. bovis (M. bovis BCG e a cepa de referência), então o valor obtido pode ser tendencioso devido à superexpressão do genoma M. tuberculosis. No segundo relatório, as populações de Mycobacterium bovis analisadas foram recuperadas principalmente dos Estados Unidos e hospedeiros de gado. Em contraste, em nosso conjunto de dados, mais localizações geográficas e espécies hospedeiras são representadas, e genomas agrupados em diferentes complexos clonais com diferentes características genéticas populacionais também são usados, alcançando assim um conhecimento populacional mais profundo e amplo. O valor médio da diferença r/m obtido com nosso conjunto de dados é consistente com o conceito de que o grau de recombinação varia muito entre as linhagens atribuídas à mesma espécie taxonômica, então esses resultados indicam que o complexo clone M. bovis pode exibir diferenças de recombinação. O impacto também é como sugerido por Didelot & Maiden72. No entanto, expandir significativamente esse conjunto de dados incluindo um número maior de genomas de M. bovis permitirá um esclarecimento adicional deste ponto. Ambos os parâmetros r/m e rho/theta mostram variabilidade entre os ramos, e esse resultado é consistente com relatos sobre outras espécies bacterianas72,73.
Finalmente, para confirmar os eventos de reorganização identificados pelo pipeline de Gubbins, seis algoritmos diferentes foram usados no software RDP4 para testar independentemente diferentes multicomparações de núcleo. Globalmente, menos da metade dos eventos identificados por Gubbins foram confirmados pelo RDP4 (Tabelas 4 e 5). Considerando todo o conjunto de dados, três eventos de recombinação foram confirmados, dois envolvendo nós internos e o outro envolvendo um único genoma em um ramo terminal, para o qual complexos clonais não puderam ser atribuídos (Tabelas 4 e 5). A identificação de eventos em ramos terminais pode indicar que a recombinação ainda está em andamento em cepas contemporâneas de M. bovis ou que o resultado está mal posicionado70. Nessa região de recombinação hipotética, aproximadamente 20% das posições têm nucleotídeos indefinidos (N), afetando assim o sinal de recombinação (Figura Suplementar 2). Além disso, essa região afeta o gene rrs, que codifica o RNA ribossômico 16S, que se espera ser altamente conservado, de modo que esse suposto sinal de recombinação pode ser resultado de erros de sequenciamento ou desalinhamento. Em seguida, o alinhamento completo do genoma entre Mb0003 e Mycobacterium bovis AF2122/97 foi realizado, e a existência de nucleotídeos e SNPs indefinidos foi confirmada, de modo que os possíveis problemas relacionados ao alinhamento incorreto não se devem às informações biológicas implementadas neste trabalho, que surgiram após o aprendizado do programa.
Não foram encontradas lacunas ou nucleotídeos indefinidos nas regiões de recombinação dos nós internos (Figuras 4 e 5). Em relação a esses eventos, um contém apenas o genoma Eu2 e afeta o gene pks12, que codifica uma possível policetídeo sintase; enquanto o outro é registrado no genoma Eu1 e afeta o gene narX, que codifica uma possível nitrato redutase (Tabela 4). Em geral, a análise de recombinação mostra que há um número limitado de fragmentos de recombinação com suporte estatístico, e os indicadores inferidos indicam que a recombinação tem um baixo impacto na linhagem M. bovis. Espera-se que o sinal de recombinação seja baixo, mas é importante distinguir o verdadeiro sinal de evolução do ruído de fundo, o que é uma tarefa desafiadora. A fim de reduzir o sinal de ruído introduzido pelos problemas de montagem e incompatibilidade baseados em referência 70, 71, todo o resto, exceto o genoma completo, foi montado do zero, e a qualidade da montagem foi verificada e garantida pela análise de pipeline QUAST (Tabela Suplementar 1). Além disso, uma série de análises suplementares foi conduzida para garantir a robustez e a precisão do estudo geral. Portanto, a qualidade do sequenciamento dos genes narX e pks12 foi avaliada por mapeamento de leitura contra Mycobacterium bovis AF2122/97. A posição recomendada do SNP na região de recombinação foi confirmada pela aplicação dos critérios mencionados na seção de métodos (pelo menos 20 leituras e frequência de alteração de 0,9). O polimorfismo do gene narX foi totalmente confirmado nos dois genomas (Mb1792361 e Mb7240415; 2,3%) e nos genomas do genoma pks12: genes Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 e Mb12. Entretanto, para o genoma Mb2043, seis das oito posições não atendem ao critério de profundidade de leitura porque o SNP é suportado por um máximo de 17 leituras, o que está abaixo do valor de corte estabelecido de 20. Portanto, a recombinação de seis genomas (8,6%) neste local do genoma pode ser confirmada (Figuras 4 e 5).
A visualização detalhada do alinhamento da região de recombinação do conjunto de dados Mycobacterium bovis afeta o gene narX, que codifica uma possível redutase de nitrato. Não foram encontradas lacunas ou nucleotídeos indefinidos na região de recombinação dos nós internos. Este evento específico é registrado no genoma Eu1. A qualidade do sequenciamento do gene narX foi avaliada plotando as leituras de Mycobacterium bovis AF2122/97. Confirme a localização recomendada do SNP na área de recombinação aplicando os critérios mencionados na seção de métodos (pelo menos 20 leituras e frequência de alteração de 0,9). O polimorfismo do gene narX foi totalmente confirmado nos genomas de Mb1792361 e Mb7240415 (2,3%).
Visualização detalhada do alinhamento da região de recombinação do conjunto de dados Mycoplasma bovis afetando o gene pks12. Não foram encontradas lacunas ou nucleotídeos indefinidos na região de recombinação dos nós internos. Em relação ao evento que afeta o gene pks12 que codifica a possível policetídeo sintase, ele contém apenas o genoma Eu2. A qualidade do sequenciamento de pks12 foi avaliada pelo mapeamento de leitura de Mycobacterium bovis AF2122/97. Confirme a localização recomendada do SNP na área de recombinação aplicando os critérios mencionados na seção de métodos (pelo menos 20 leituras e frequência de alteração de 0,9). Os polimorfismos dos genomas Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 e Mb1960 foram totalmente confirmados.
Os genes PE e PPE possuem regiões repetitivas que são facilmente mal interpretadas pelo sequenciamento e mapeamento Illumina, de modo que geralmente são excluídos do fluxo de trabalho de bioinformática de membros de M. tuberculosis somente quando se utiliza a estratégia de mapeamento para sequência. A inferência de eventos de recombinação aplicada neste trabalho baseia-se na montagem de novo sem filtragem de PE/PPE. Acreditamos que, ao implementar três métodos e algoritmos complementares diferentes por meio do SplitsTree, do pipeline Gubbins e do software RDP4, as estratégias aplicadas são robustas para processar e filtrar as regiões reorganizadas causadas por sinais de erro. No entanto, a fim de excluir a interferência do gene PE/PPE nos softwares Gubbins e RDP4 para identificar clusters de SNP e, portanto, a identificação das regiões de recombinação que se propõe afetar os genes narX e pks12, a vizinhança desses genes foi examinada (Fig. Suplementar 3–5). Em M. bovis AF2122/97, o gene narX é separado por narK2 e Mb1764c, enquanto pks12 é circundado por Mb2075c e Mb2073c (Figura Suplementar 3-5). O mapa gerado usando o mapa sinlinear MAUVE do genoma completo fornece informações sobre a conservação e o rearranjo da sequência gênica, mostrando quatro blocos colineares e nenhum sinal de translocação ou inversão genômica. Além disso, a análise de complementação com a sequência de aminoácidos comprovou a homologia em todos os genomas completos, e nenhuma PE/PPE foi encontrada nas regiões adjacentes de narX ou pks12. Para narX, um genoma (Mb0030) tem uma pontuação de sinonímia menor porque o gene narX foi identificado como dois fragmentos (fragmentos 1891 e 1890). Para pks12, devido às similaridades, Mb0030 e Mb003 exibiram pontuações de sinlinearidade mais baixas, enquanto pks12 foi identificado em dois e três fragmentos, respectivamente, representando diferentes domínios da proteína (Figura Suplementar 3-5). Levando em consideração essas informações, e considerando que tanto o software Gubbins quanto o RDP4 realizam análises, verificamos o alinhamento múltiplo do núcleo do máximo de 500 pb na janela, confirmando que o gene PE/PPE não interferirá no sinal de recombinação que afeta narX e pks12.
Embora os sinais de recombinação detectados neste conjunto de dados possam ser considerados residuais, é verdade que a recombinação em M. bovis não pode ser descartada, portanto, ela deve continuar a ser objeto de análises mais aprofundadas, nas quais genomas inteiros de diferentes cenários epidemiológicos são sequenciados para Importante.
A comparação das árvores filogenéticas ML obtidas antes e depois da correção de recombinação (Figura 2A, B) não levou a mudanças significativas na relação filogenética inferida, e as cepas de M. bovis foram agrupadas no mesmo grupo.
Após o mapeamento de 42 leituras de M. bovis recém-sequenciadas com o genoma de referência de M. bovis AF2122/97, foi obtido um alinhamento de SNP contendo 1.816 posições polimórficas. A maioria dos SNPs (87,1%) está localizada na região codificadora, e os genes afetados são caracterizados de acordo com as categorias funcionais mostradas no Bovilist (Figura 6A, B). Considerando o número total de genes em cada categoria funcional, os genes na categoria "metabolismo lipídico" apresentaram mais SNPs, seguidos por "parede celular e processos celulares" e "metabolismo intermediário e respiração", revelando que estão na evolução de M. bovis.
Análise hierárquica do conjunto de dados de M. bovis de Portugal (n = 42). Número total de SNPs registrados e genes afetados para cada categoria funcional (A). Número total de alterações sinônimas e não sinônimas registradas por categoria funcional (B).
Em escala global, a razão dN/dS média é superior a 1,5, o que indica que a pressão evolutiva global é para se livrar do estado ancestral e representa um cenário de escolha de purificação positivo (diversificado ou direcionado) e/ou flexível. Nas categorias de "virulência, desintoxicação, adaptação", "sequências de inserção e fagos" e "proteínas reguladoras", mais de dois terços dos SNPs são não sinônimos (Figura 6B).
Em todas as categorias, há genes com múltiplos SNPs, resultando em uma taxa média de mutação (ou seja, o SNP médio por gene) maior que 1 (Figura 6A). Pks12 (Mb2074c) com 15 SNPs e fas (Mb2553c) com 8 SNPs têm valores de mutação mais altos. Ambos os genes estão envolvidos no metabolismo de ácidos graxos. O gene pks codifica a policetídeo sintase (PKS), que é uma enzima multifuncional envolvida na biossíntese de lipídios da parede celular micobacteriana74,75. Este gene codifica um polipeptídeo multifuncional que está envolvido na síntese de micoquetídeos74,76. O gene fas está envolvido na síntese de ácido micólico. Ambos os genes desempenham um papel importante na biossíntese da parede celular em contato com o hospedeiro.
Para estudar mais a fundo a evolução do Mycobacterium bovis, dois conjuntos de genes específicos foram analisados. Trabalhos publicados anteriormente usando composição de sequência e métodos filogenéticos identificaram genes que foram adquiridos por ancestrais do MTBC por meio de HGT antes da diversificação37,38. Esses genes estão listados na Tabela Suplementar 2. A distribuição de SNP de um total de 77 genes que podem estar relacionados ao HGT foi analisada, e 26 sítios polimórficos foram identificados, os quais na maioria dos casos (78%) resultaram em alterações não sinônimas (NS) (Tabela Suplementar 2). Trabalhos anteriores sobre o genoma do MTBC demonstraram que a região HGT putativa exibe uma proporção maior de SNP NS em comparação com o restante do genoma. Se alguém pensa que essas regiões de recombinação foram adquiridas por ancestrais do MTBC e, portanto, super-representam polimorfismos antigos, então a proporção de alterações sinônimas é esperada ser maior, porque as substituições de NS são esperadas para serem eliminadas pela seleção negativa devido a alterações de aminoácidos que podem alterar a função da proteína. Portanto, nossos resultados indicam que as consequências funcionais podem advir da substituição de genes semelhantes a HGT, o que reflete sua importância para a valiosa diversidade genética adaptativa.
Paralelamente a esta análise, os genes que codificam os componentes do sistema 3R (reparo, replicação e recombinação de DNA) foram examinados minuciosamente de acordo com a lista publicada anteriormente por dos Vultos e colaboradores (2008)39. A troca de fragmentos de DNA idênticos não pode ser observada diretamente, embora possa ser um processo frequente quando bactérias intimamente relacionadas estão envolvidas, como no caso deste conjunto de dados; além disso, este processo pode ser a chave para os métodos de reparo de DNA72, desempenhando um papel na recombinação homóloga. Um total de 26 posições polimórficas distribuídas por 54 genes foram identificadas (Tabela Suplementar 3). Neste conjunto de genes, as alterações no NS foram responsáveis por cerca de 65% das consequências, o que é consistente com relatos anteriores sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis.
Horário da postagem: 21 de outubro de 2021