Благодарим ви, че посетихте Nature. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате по-нова версия на браузъра (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Същевременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще показваме сайтове без стилове и JavaScript.
Геномното секвениране съживи областта на изследванията на инфекциозните болести, разкривайки епидемиологията на заболяванията, патогенезата, взаимодействията гостоприемник-патоген и еволюционния процес, наложен на патогените. Комплексът Mycobacterium tuberculosis (MTBC) разглежда Mycobacterium bovis като един от своите животински адаптивни членове, които причиняват туберкулоза (ТБ) при сухоземните бозайници, и е типичен модел на бактериална еволюция. Подобно на други членове на MTBC, Mycobacterium bovis се приема за строго клониран, бавно еволюиращ патоген и очевидно няма признаци на рекомбинация или хоризонтален трансфер на гени. В тази работа ние прилагаме сравнителна геномика към набор от данни за цялата геномна последователност (WGS), съставен от 70 говеда M. от различни родословия (Европа и Африка), за да получим представа за генетичното разнообразие на говеда M. Еволюционна сила. Използват се три различни метода за оценка на признаците на реорганизация. В световен мащаб малък брой рекомбинационни събития са идентифицирани и потвърдени от два независими метода със солидна подкрепа. Въпреки това, в сравнение с мутациите, рекомбинацията има по-слаб ефект върху разнообразието на M. bovis (общо r/m = 0,037). Разликата r/m средна, получена в клоналния комплекс на Mycobacterium bovis в нашия набор от данни, е в съответствие с общата концепция, че степента на рекомбинация може да варира значително между линиите, присвоени на един и същ таксономичен вид. Въз основа на тази работа, рекомбинацията в Mycobacterium bovis не може да бъде изключена, така че тя трябва да бъде предмет на по-нататъшни усилия в бъдещи сравнителни геномни изследвания, в които WGS на големи набори от данни от различни епидемиологични сценарии по света е от решаващо значение. След това беше извършен допълнителен анализ на по-малкия набор от данни за Mycobacterium bovis (n = 42) от разпространението на туберкулоза при множество гостоприемници и бяха идентифицирани повече от 1800 локуса, от които поне един щам показа еднонуклеотиден полиморфизъм (SNP). Повечето (87,1%) са разположени в кодиращия регион, а глобалното съотношение на несинонимните промени (dN/dS) на синонимните промени надвишава 1,5, което показва, че положителната селекция е важна еволюционна сила, упражнявана върху M. bovis. По-висок дял на SNPs (нуклеотидни полиморфизми) е открит в гени, богати на функционални категории „липиден метаболизъм“, „клетъчна стена и клетъчни процеси“ и „междинен метаболизъм и дишане“, което разкрива техния потенциал в биологията и еволюцията на Mycobacterium bovis. По-внимателно разглеждане на гените в предците на MTBC, които са склонни към хоризонтален генен трансфер и са включени в системата 3R (репарация, репликация и рекомбинация на ДНК), разкрива средната глобална отрицателна стойност на D неутралния тест на Taijima, което показва минало селективно сканиране. Неотдавнашното затруднение след разширяването на популацията все още е основният еволюционен движещ фактор за борбата на задължителния патоген Mycobacterium bovis с гостоприемника.
Комплексът Mycobacterium tuberculosis (MTBC) е един от най-успешните таксони бактериални патогени и типичен случай на бактериална еволюция. Неговите членове показват изненадващо висока нуклеотидна идентичност на геномно ниво (> 99%)1,2. Различните екотипове на MTBC могат да причинят туберкулоза (TB), която е инфекциозно грануломатозно заболяване, при широк спектър от видове гостоприемници - от микробозайници до хора3,4,5. Понастоящем комплексът включва хора [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] и адаптирани към животни патогени (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" и "dassie")5,6. M. canettii (известен също като „Nodobacter glabrata“) Средната нуклеотидна идентичност с гореспоменатите микобактерии е 98%, а сравнителната геномна работа показва, че M. canettii и останалата част от MTBC наскоро са се отклонили от общия си предшественик.7 Имайки предвид тази концепция, някои автори наричат M. canettii член на MTBC 8.
МТБК е систематично описан като строг клонален комплекс, а популационната му структура е ясно регулирана от намалено разнообразие, пречки, селективно сканиране и генетичен дрейф9,10. Ако приемем, че сложната строга клонална еволюция, като липсващи полиморфизми, не може да бъде възстановена чрез рекомбинация. Въз основа на тази предпоставка, последователните събития на геномната делеция на диференциалния регион (RD) и TbD1 (Mtb специфичен регион на делеция 1) са предложени като молекулярни маркери на еволюцията на МТБК2,5,11. Работата по сравнителна геномика и секвениране на целия геном (WGS) подкрепя разделянето на адаптираните към човека членове на девет линии (Mycobacterium tuberculosis L1 до L4, L7 и L8; и Mycobacterium africanum L5, L6 и L9), линии L2 до L4 споделено делетира TbD1 регион2,11,12,13. Освен това се предполага, че адаптираните към животните членове споделят общ прародител, който се определя от специфични за клада делеции в RD7, RD8, RD9 и RD102, 5 и 14.
Събитията на хоризонтален генен трансфер (HGT) и рекомбинация се считат за редки и се срещат при предците на MTBC, а не различната история на целия член на MTBC15,16,17. Два ранни доклада на Hughes и сътрудници (2002) и Gutacker и сътрудници (2006) предполагат, че рекомбинационните събития могат да помогнат за оформянето на полиморфизми, които маркират специфични локуси в щамовете на M. tuberculosis18,19. Причините за очевидната липса на рекомбинация в MTBC са: (1) механичният процес и загубата на способност за HGT; (2) рядкостта на HGT събитията; (3) няма вероятност за рекомбинационни събития в нишата на MTBC14,17. Наскоро някои проучвания за секвениране на целия геном (WGS), приложени към щам 20 на MTBC и Mycobacterium bovis 21, предоставиха доказателства за рекомбинация, първите, които показват, че щамовете на MTBC често обменят малки ДНК фрагменти, но поради ограничените вариации в нуклеотидните последователности, тези събития все още не са забелязани.
Mycobacterium bovis е най-често откриваният член на MTBC от добитък (предимно говеда), въпреки че може да бъде изолиран и от свободно отглеждани и оградени диви животни4,22,23,24. M. bovis еволюира в пет основни клонални комплекса [Европейски 1 (Eu1), Европейски 2 (Eu2), Европейски 3 (Eu3), Африкански 1 (Af1) и Африка 2 (Af2)], според профила на сполиготипизиране, специфични делеции и еднонуклеотидни полиморфизми (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 в специфични гени. Тези клонални комплекси демонстрират разнообразната структура на популацията на Mycobacterium bovis и нейната връзка с географските региони. В допълнение, неотдавнашната работа на WGS, извършена от Zimpel и сътрудници (2020), проектира филогения, базирана на SNP на Mycobacterium bovis, с повече от 1900 генома, което показва, че има поне четири различни линии (наречени Lb1 до Lb1 до Lb4), те не са напълно съвместими с предварително дефинирания клонов комплекс, въпреки че географската специфичност също може да бъде потвърдена30. Тези автори са извършили диференциален анализ на филогенията и молекулярното датиране, но не са изследвали рекомбинацията30.
Предишни изследвания, използващи различни молекулярни техники, като сполиготипизиране, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number - променлив брой тандемни повторения на микобактериите) и скорошно SNP типизиране, разкриха определено ниво на генетично разнообразие сред щамовете на M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Диференциацията на генетичните вариации се превърна във важен инструмент в изучаването на епидемиологията на заболяванията, което е полезно за задълбочено разбиране на патогенезата, вирулентността и предаването на болестите. Появата на метода WGS предоставя възможност за разкриване на еволюционните движещи фактори, наложени от генома на Mycobacterium bovis в процеса на адаптация и персистентност към различни гостоприемници и епидемиологични сценарии.
В тази работа използваме сравнителен геномен анализ на различни набори от данни за Mycoplasma bovis (n=70), включително изолати от различни клонални комплекси, за да получим представа за еволюционния процес на Mycoplasma bovis, особено за да разрешим филогенетичните връзки и рекомбинационните събития. Като допълнение към този анализ, под-набор от данни за изолати на M. bovis (n = 42), получени от добре характеризиран район с многогостоприемна туберкулоза в Португалия31,36 беше допълнително изследван, за да се заключи за неидентичност. Балансът между относителното съотношение на смисловите (dN) към синонимните (dS) нуклеотидни замествания, както и еволюционният принос на специфични геноми, споменати в литературата, са37,38 получени от предци на MTBC чрез HGT и кодират генни компоненти на 3R (DNA repair, replication, and recombination) системата39. Избираме гени, получени чрез HGT, защото те могат да представляват древни полиморфизми, така че се очаква те да съдържат по-висок дял синонимни промени. Гените, включени в 3R системата, бяха избрани, защото предишна работа върху щамове на M. tuberculosis показа общи негативни/пречистващи селекции, които работят върху тези гени и те може да играят важна роля в еволюцията 39. Друга цел на тази работа е да се направи заключение за съществуването на събития на реорганизация. Поради тази причина, като се има предвид, че нашият набор от данни от Португалия съдържа само геномите на европейския клонов комплекс 2 и щамовете, които не са присвоили клоновия комплекс, решихме да включим публично достъпни геномни данни, за да получим най-накрая представителна информация за всички клонови комплекси и да подобрим надеждността и обхвата на резултатите.
42 новосеквенирани генома на Mycoplasma bovis от португалската ендемична сцена на многогостоприемна туберкулоза (подробности по-долу), предварително характеризирани от епидемиологична гледна точка36, са в центъра на тази работа. Като се има предвид, че наборът от данни от Португалия съдържа само представители на европейските 2 клонови комплекса и щамове без обозначени комплекси, бяха добавени публично достъпни данни за секвениране на целия геном, за да се разшири наборът от данни, който включва всички представители на клоновите комплекси на M. bovis. Поради това в тази работа бяха използвани три източника на данни за секвениране на целия геном: пълно/черново сглобяване на генома, до 10 скелета, съхранявани в NCBI (Национален център за биотехнологична информация) (n = 15 изолати); съхраняван в SRA (файлът на Illumina fastq на архива за прочетени секвенции), представляващ комплексното разнообразие на клоновете на M. bovis (n = 12 изолати)30; и 42 новосеквенирани генома от Португалия. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) беше изключен от търсенето в NCBI. M. bovis AF2122/97 обикновено се използва като референтен геном, който да бъде включен в набора от данни. Поради публичната недостъпност на цялата геномна последователност, представена от клониращия комплекс African 1, и малкия брой геноми от представителни щамове на Af2 и Eu1, в тези случаи бяха използвани оригиналните данни за секвениране, предоставени от SRA. Работата на Зимпел и неговите сътрудници (2020) помогна за идентифицирането на генома от гореспоменатия клониращ комплекс и помогна за избора на Mycobacterium bovis за включване в набора от данни. За Eu3 е описан само един тип геном (Branger et al., 2020), така че геномът, който включваме, е отделен представител на Eu3 комплекса.
В световен мащаб този набор от данни включва 70 вида M. bovis при говедата, изолирани от 8 вида гостоприемници, разпространени в 12 страни от 1985 до 2016 г. 36 вида са обозначени като Eu2, 7 вида са Eu1, 1 вид е Eu3, 3 вида са Af1, 4 вида са Af2 и 19 не се приписват на никой клонов комплекс (подробности по-долу). Подробната информация (включително номера на достъпа) за Mycobacterium bovis, използвана в това проучване, е показана в Таблица 1 и Допълнителна Таблица 1.
42 новосеквенирани цели генома на Mycobacterium bovis от горещи точки на животинска туберкулоза в Португалия и разпространени в продължение на повече от 12 години са в центъра на това проучване, тъй като потенциалните системи за болести по дивите животни и добитъка са били редовно наблюдавани 31,36 (Допълнителна фигура 1). Съгласно последващите процедури, тези щамове са били изолирани от говеда (n = 14), благородни елени (n = 16) и диви свине (n = 12) от 2003 до 2015 г.: събиране и обработка на животните в съответствие с препоръчителните протоколни насоки. Тъканните проби са в Наръчника за сухоземни животни на OIE и са инокулирани върху твърда и течна среда с пируват Stonebrink и Löwenstein-Jensen. Културите се инкубират при 37°C и растежът се проверява веднъж седмично в продължение на поне 12 седмици. Колониите се съхраняват директно в глицеролов разтвор при -80ºC. В селективната среда Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), оригиналните архивирани проби бяха прекарани през еднократно in vitro пасажиране, за да се получи ДНК от програмата WGS. За тази цел, замразеният разтвор на културата беше обогатен с 5% натриев пируват и 10% ADS (50 g албумин, 20 g глюкоза, 8,5 g натриев хлорид в 1 L вода) върху Middlebrook 7H9 при 37°C Retrain. След 4 седмици растеж, средата беше подновена и културата беше редовно наблюдавана, докато се наблюдава растеж. Клетките бяха събрани чрез центрофугиране, утайката беше ресуспендирана в 500 µL фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), загрята при 99°C за 30 минути, центрофугирана и супернатантата беше съхранявана при -20°C до WGS. Всички процедури се извършват в съоръжения за биологична безопасност ниво 3.
Геномната библиотека с двойни краища на WGS се приготвя с помощта на уникалния индекс на всяка ДНК проба и използва технологиите Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 проби) и HiSeq (2 × 150 pb) (два изолата) (Eurofins Genomics, Германия) за секвениране. Съгласно инструкциите на производителя, използвайте Illumina Genome Analyzer с двустранно закрепен модул за секвениране на геномната ДНК и използвайте Nextera XT DNA Library Prep Kit от Illumina за конструиране на библиотеката.
Като се вземат предвид данните, възстановени от SRA (n = 12), идентификацията на клоновия комплекс може да се използва като метаданни на съответната публикация 30, 41, 43. Когато се разглежда пълният геном, с изключение на Mycobacterium bovis AF2122/97 и Mycobacterium bovis 3601, които са разпознати членове на клоновия комплекс Eu1 и Eu3 съответно 25, 29, той е същият като пълния геном на Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI номер за достъп NC_000962.3). Подравняването на генома се извършва с помощта на MAFFT (програма за множествено подравняване на аминокиселинна или нуклеотидна последователност, версия 7.458) и параметър -addfragments48. След това се търси липса на различни клонови комплекси и/или наличие на SNP характеристики.
Новосеквенираният Mycobacterium bovis (n = 42) и оригиналните прочитания на сглобения чернова на генома (n = 3) подравняват комплекса с референтния геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv чрез vSNP конвейера и е проведено търсене за наличие на делеционни и/или SNP характеристики на различни клонове.
Събиране на информация от липсата на характеристики и/или наличието/липсата на SNP и профили на сполиготипизиране, за да се присвоят геномни данни на съответния клонов комплекс. За четирите чернови на сборките профилът на сполиготипизиране не може да бъде изведен, така че те са включени в групата „без сложност“.
Биоинформатичният работен процес, следван от тази работа, започва от de novo сглобяване и картографиране към референтна стратегия, с цел изследване на рекомбинационни събития и специфични геномни полиморфизми. Фигура 1 предоставя блок-схема на следваните стъпки. За рекомбинационен анализ се използват всички геноми, за да се увеличи устойчивостта на изводите и свързаните с тях индикатори.
За да намалим грешките при генерирането на консенсусни последователности на генома, първо получихме de novo асемблиране, а след това получихме множество подравнявания на ядрото. Конвейерът Unicycler е достъпен на https://github.com/rrwick/Unicycler49 и се използва за извършване на de novo асемблиране на 54 секвенирани генома (42 ново секвенирани и 12 fastq файла, възстановени от SRA). Накратко, преди асемблирането от нулата, беше извършен анализ на качеството на четене във FastQC версия 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) и Trimmomatic версия 0.36 (прилагат се опциите „cutting Adapters and other lighting-specific sequences from reads“ и „Cut bases from the end of the read, if lower than the threshold quality of 20“) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic)50. След това за асемблиране на генома беше използван SPAdes optimiser49, а за оптимизация след асемблиране - Pilon версия 1.1851. Избран е консервативен режим на мостово свързване, за да се избегне неправилно сглобяване, а размерът на k-mer е търсен и избран между 20% и 95% от дължината на четене. Следвайте указанията на SPAdes и вземете предвид размера на четене, изтрийте контиги по-малки от 300 bp и установете гранична стойност за покритие на дълбочината на четене от 52 при 20 четения. При стратегията за de novo сглобяване, геномни региони, като например силно повтарящите се паралози на пролин-глутамат (PE) и пролин-пролин глутамат (PPE), не са премахнати.
Качеството на de novo сглобката се оценява чрез QUAST тръбопровода (http://quast.sourceforge.net/quast.html), който улеснява обновяването на контига и картографирането на референтния геном M. bovis AF2122/97 (номер за достъп на NCBI LT708304.1) (вижте Допълнителна таблица 1 за параметри на качеството).
С помощта на vSNP конвейера (https://github.com/USDA-VS/vSNP), FASTQ файлът на новосеквенирания M. bovis от секвенирането на Illumina се сравнява с референтния геном на M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Съгласно препоръките за най-добри практики на Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, се прилагат стандартни параметри на филтъра или вариантни масови оценки за повторно калибриране. Резултатите се филтрират, като се използва най-ниската масова оценка на SAMtools от 150 и AC = 2. Използвайте също Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/), за да проверите показанията, за да изключите замърсяване. vSNP конвейерът, използван за картографиране към стратегии за секвениране в нашата работа, изследва серия от дефинирани SNP и мишени, а също така изключва сценарии със смесена инфекция. Покритието на прочетения геном е по-добро от 99% (Допълнителна таблица 1).
За да се избегнат грешки при картографиране и грешни SNP, филтрирайте вариант в следните случаи: (1) той се поддържа от по-малко от 20 отчитания, (2) той се открива с честота по-малка от 0,9, (3) той се намира в поне един щам, но поне има пропуски в друг щам. Интегрираният геномен преглед (IGV) версия 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 беше използван за визуална проверка на SNP и позиции с проблеми с картографирането или подравняването. Тъй като гените за пролин-глутамат (PE) и пролин-пролин глутамат (PPE) са силно дублирани и са част от многогенно семейство, те лесно се разбират погрешно от секвенирането и неправилното картографиране на Illumina, така че са предпочитани. Работният процес на микобактериална биоинформатика премахна членовете на туберкулозния комплекс, когато използва стратегията за картографиране към секвенция за потвърждаване на SNP. Следователно, ние филтрирахме PE/PPE гените и инделите от анализа.
Според Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), всички SNP са разделени на функционални категории. SnpEff конвейерът (https://pcingola.github.io/SnpEff/) се използва за извеждане на SNP последствия (синонимни или несинонимни промени). Създадена е нова база данни за генома на Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Множественото подравняване на основния геном беше извършено с помощта на Parsnp v1.2, достъпен понастоящем на https://github.com/marbl/parsnp57, използвайки 69 пълни генома/чернови (с опция -c), а M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) е използван като референция. Бяха извършени четири множествени подравнявания на основния геном: само членовете на клониращия комплекс Eu2 (n = 37), включително всички членове на европейския клониращ комплекс (n = 44), включително точката на свързване на европейския и африканския клониращ комплекс (n = 51), и включване на всички Mycobacterium bovis в това проучване (n = 70).
Генерираното от Parsnp основно подравняване се използва за извеждане на филогенетичното дърво с максимална вероятност (ML), използвайки CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58, използвайки RAxML, и извършвайки 1000 насочени репликации.
За паралелна проверка за наличие на рекомбинационни събития се използват три различни алгоритъма и биоинформатични инструмента: софтуерът SplitsTree4, конвейерът Gubbins (unbiased lineage through recombination in nucleotide sequences) и софтуерът RDP4 (recombination detection program, версия бета 4.101).
Методът на разделяне на декомпозицията, реализиран в SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59, се използва за изчисляване на филогенетичната мрежа без корени, като се използва Phi тест за статистическа проверка, а прагът на значимост е p = 0.05. Основният многоподравнен анализ на Parsnp се използва като входни данни и се реализира разделянето на декомпозицията като мрежов стандарт.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) работи с параметри по подразбиране като друг начин за оценка на въздействието на рекомбинацията върху Mycobacterium bovis. Алгоритъмът, реализиран в конвейера, реконструира съответния клонингов род. Пълният геном/чернова на нашия набор от данни и референтният геном (говежди бовид AF2122/97, LT708304.1) са взаимно; и сканира позицията на SNP на всеки клон на дървото, за да открие SNP клъстера, представляващ рекомбинационното събитие. Нулата на клона. Да приемем, че няма рекомбинационно събитие, което означава, че SNP, които се срещат на клона, трябва да бъдат равномерно разпределени. Ядрото на множественото подравняване от Parsnp и най-добре оцененото ML дърво от RAxML се използват като входни файлове.
Накрая, за да се потвърди събитието за реорганизация, предложено от конвейера на Gubbins, шестте алгоритъма, внедрени в RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 и SiScan66), са приложени към основното множествено подравняване на Parsnp при настройки по подразбиране. Установихме, че поне три от алгоритмите, внедрени в RDP4, трябва последователно да демонстрират важен сигнал за проверка на всяко събитие за рекомбинация.
Като се има предвид, че както софтуерът Gubbins, така и RDP търсят рекомбинационни сигнали, като проверяват множествените подравнявания в ядрото в прозорец до 500 bp и потвърждават, че включването на PE/PPE гени по време на de novo сглобяване няма да повлияе на откритите рекомбинационни сигнали, се извършва допълнителен анализ чрез проверка на хомолинеарността в близост до гена, идентифициращ събитието на рекомбинация. Синлинейната карта, използваща пълния геном, е конструирана с помощта на MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html), за да се изключат локални геномни транслокации или инверсии. Освен това, целият геном е използван за извършване на хомолинеарен анализ на аминокиселинната последователност чрез уеб сървъра SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
По-задълбочен анализ на набора от геномни данни, получени от португалската система за многохостовна туберкулоза, е за проверка на полиморфизма на гените, споменати в литературата. Тези гени са 37, 38 и генът, кодиращ 3R, получени от предците на MTBC чрез компоненти на системата HGT (репарация, репликация и рекомбинация на ДНК) 39. Използвайте ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) и DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/), за да изчислите генното разнообразие и нуклеотидното разнообразие (π) и входния параметър на D неутралния тест на Таджима.
Получено е филогенетично дърво с максимална вероятност (ML), базирано на 69 изолата на Mycoplasma bovis и референтни геноми (Фигура 2А). В сравнение с дърветата, базирани на един ген, или дърветата, базирани на множество локуси, тази стратегия позволява генерирането на по-мощни дървета, които не обхващат вариабилността на целия геном и следователно показват по-ниска способност за разграничаване между видове 68,69. Топологичната структура на ML дървото обикновено е в съответствие със сложната класификация на клонингите. Геномът на Eu2 е групиран в клон, а геномът на Af1 също е групиран заедно (Фигура 2А). Резултатът е в съответствие и с известната еволюционна връзка на Mycobacterium bovis, т.е. има голяма разлика между члена Eu1 и групата, състояща се от всички други клонални комплекси и геноми, но клоналният комплекс 30 не е уточнен. Малкото несъответствие между клоналния комплекс и наблюдаваната връзка върху филогенетичното дърво може да се обясни с факта, че клоналният комплекс е описан въз основа на специфични геномни региони, докато филогенетичното дърво се основава на множество подравнявания на основни геноми, представляващи целия геном.
Филогенетичното дърво с максимална вероятност (GTR) е конструирано въз основа на подравняването на основния геном на Mycobacterium bovis преди (A) и след (B) отстраняване на мястото на рекомбинация. Цветовете на клоновете представляват клонинг комплекса на Mycobacterium bovis: Европа 1 е лилава, Европа 2 е червена, Европа 3 е синя, Африка 1 е оранжева и Африка 2 е зелена. Дървото е вкоренено и е начертано в мащаб, а дължината на клона е измерена като заместител за всяко място.
Комплексът Mycobacterium tuberculosis е описан като клонално еволюирал и повечето от натрупаните през годините доказателства подкрепят идеята, че текущите HGT и рекомбинационни събития няма да се случат на откриваемо ниво на MTBC15,17,18.
Предишни изследвания показват, че може да има ограничена рекомбинация между щамове на MTBC20,21, докато други не са успели да идентифицират измерими събития на рекомбинация70,71. Преразгледайте този въпрос с фокус върху Mycobacterium bovis, което е различно от предишната работа, която разглеждаше само Mycobacterium tuberculosis70,71; или разглеждайте MTBC като цяло, почти без M. bovis, представляващ 20; или разглеждайте само рестриктивни фракции от говеда. Наборът от данни за микобактерии в тази работа съдържа общо 70 щама, представляващи всички клонални комплекси, използвани за скрининг за рекомбинация. Наборът от данни е мащабиран според четири кумулативни нива: (1) членове на Eu2, (2) всички членове на европейския клонов комплекс (т.е. Европа), (3) европейски и африкански клонов комплекс (Eu + Af) и (4) цялата колекция от данни (включително геноми, които не са включени в вече описаните клониращи комплекси).
За по-нататъшно проучване на тази хипотеза беше извършена мрежа с разделено разлагане, за да се оцени липсата на рекомбинационни събития между геномите, тъй като този метод може да визуализира родовата връзка между индивидите и да покаже противоречиви филогенетични сигнали. И четирите набора от данни в анализа потвърдиха съществуването на бримки в мрежата (т.е. области, които не се сливат в едно дърво), но Phi тестът няма статистическа подкрепа (Eu2, p = 0.0956; Европа, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; целият набор от данни p = 0.2451), което предоставя слаби доказателства за съществуването на реорганизационни събития (Фигура 3A-D).
В Европа 2 генома (n = 37) (A), европейски геноми (n = 44) (B), европейски и африкански геноми (n = 51) (C) и целият набор от данни (n = 70) (D).
След този анализ и като се вземат предвид цикличните наблюдения във всички мрежи, алгоритъмът за реконструкция, реализиран в конвейера на Gubbins, беше приложен за реконструкция на клоналната линия и за допълване на оценката на ефекта от рекомбинацията върху генома на M. bovis. Направете извод за кумулативния брой рекомбинационни събития, повечето от които са се случили в терминални разклонения (т.е. в един геном) (Таблица 2). Тези индикатори показват съгласуваността на целия набор от данни и показват, че честотата на рекомбинационните събития е от 200 до 300 пъти по-голяма от тази на мутациите. След като параметърът rho/theta, представляващ относителните скорости на рекомбинация и точкови мутации в разклонението, изглежда е между 0,0037 и 0,0056 (Таблица 3). Наскоро публикуваната работа на щама 38 M. bovis демонстрира по-висока стойност на rho/theta (rho/theta = 0.1) от получената в този набор от данни, но работата на Patané и колеги използва базирано на референции сглобяване, за да изведе параметрите на рекомбинация. Процедурен детайл, дължащ се на процедурата на сглобяване, е свързан с изобилието от предполагаеми рекомбинационни събития в терминалния клон.
След това, параметърът r/m представлява съотношението на разнообразие на рекомбинацията и въвеждането на мутации, а средната му стойност е между 0,025 и 0,037, което показва, че в сравнение с мутациите, рекомбинацията има по-малко общо въздействие върху генетичното разнообразие на M. bovis (Таблица 3). За обширно сравнение е използван подобен метод за оценка на параметъра r/m за набора от данни MTBC, съставен от 23 генома, показващ средна стойност от 0,48620, докато за набора от данни от 38 M. bovis на Patané и колеги е доказано, че средната стойност е 0,98. В първото проучване са включени само два от 23-те генома на M. bovis (M. bovis BCG и референтният щам), така че получената стойност може да е изместена поради свръхекспресията на генома на M. tuberculosis. Във втория доклад анализираните популации на Mycobacterium bovis са възстановени главно от Съединените щати и от добитък гостоприемници. За разлика от това, в нашия набор от данни са представени повече географски местоположения и видове гостоприемници, а също така се използват геноми, групирани в различни клонови комплекси с различни генетични характеристики на популацията, като по този начин се постига по-задълбочено и по-широко познание за популацията. Средната стойност на разликата r/m, получена с нашия набор от данни, е в съответствие с концепцията, че степента на рекомбинация варира значително между линиите, присвоени на един и същ таксономичен вид, така че тези резултати показват, че клоновият комплекс на M. bovis може да показва разлики в рекомбинацията. Въздействието е също така, както е предложено от Didelot & Maiden72. Въпреки това, значителното разширяване на този набор от данни чрез включване на по-голям брой геноми на M. bovis ще позволи по-нататъшно изясняване на този въпрос. Както параметрите r/m, така и rho/theta показват вариабилност между клоновете и този резултат е в съответствие с доклади за други бактериални видове72,73.
Накрая, за да се потвърдят събитията на реорганизация, идентифицирани от конвейера на Gubbins, в софтуера RDP4 бяха използвани шест различни алгоритъма за независимо тестване на различни основни мулти-сравнения. В световен мащаб, по-малко от половината от събитията, идентифицирани от Gubbins, бяха потвърдени от RDP4 (Таблици 4 и 5). Като се има предвид целият набор от данни, бяха потвърдени три събития на рекомбинация, две от които включваха вътрешни възли, а другото включваше един геном в терминален клон, за който не можаха да бъдат определени клонални комплекси (Таблици 4 и 5). Идентифицирането на събития в терминалните клонове може да показва, че рекомбинацията все още е в ход в съвременните щамове на M. bovis или резултатът е неправилно разположен70. В този хипотетичен регион на рекомбинация приблизително 20% от позициите имат неопределени нуклеотиди (N), като по този начин влияят на рекомбинационния сигнал (Допълнителна фигура 2). Освен това, този регион засяга гена rrs, кодиращ 16S рибозомната РНК, за която се очаква да е силно консервативна, така че този предполагаем сигнал за рекомбинация може да е резултат от грешки в секвенирането или неправилно подравняване. След това беше извършено цялостно подравняване на генома между Mb0003 и Mycobacterium bovis AF2122/97 и беше потвърдено съществуването на неопределени нуклеотиди и SNPs, така че възможните проблеми, свързани с неправилното подравняване, не се дължат на биологичната информация, внедрена в тази работа. Появиха се след изучаване на програмата.
Не са открити празнини или неопределени нуклеотиди в рекомбинационните региони на вътрешните възли (Фигури 4 и 5). Що се отнася до тези събития, едното съдържа само генома Eu2 и засяга гена pks12, който кодира възможна поликетидна синтаза; докато другото е регистрирано в генома Eu1 и засяга гена narX, който кодира възможна нитрат редуктаза (Таблица 4). Като цяло, анализът на рекомбинацията показва, че има ограничен брой рекомбинационни фрагменти със статистическа подкрепа, а изведените индикатори показват, че рекомбинацията има слабо въздействие върху линията на M. bovis. Очаква се сигналът за рекомбинация да е нисък, но е важно да се разграничи истинският еволюционен сигнал от фоновия шум, което е трудна задача. За да се намали шумовият сигнал, въведен от проблеми с референтно сглобяване и несъответствия 70, 71, всички останали, с изключение на пълния геном, бяха сглобени от нулата, а качеството на сглобяване беше проверено и гарантирано чрез QUAST конвейерен анализ (Допълнителна Таблица 1). Освен това беше проведена серия от допълнителни анализи, за да се осигури надеждността и точността на цялостното проучване. Следователно, качеството на секвениране на гените narX и pks12 беше оценено чрез картографиране на отчитания спрямо Mycobacterium bovis AF2122/97. Препоръчителната позиция на SNP в рекомбинационната област беше потвърдена чрез прилагане на критериите, посочени в раздела за метода (поне 20 отчитания и честота на промяна 0,9). Полиморфизмът на гена narX беше напълно потвърден в двата генома (Mb1792361 и Mb7240415; 2,3%) и геномите на генома pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 и Mb12. Въпреки това, за генома Mb2043, шест от осемте позиции не отговарят на критерия за дълбочина на четене, тъй като SNP се поддържа от максимум 17 четения, което е под установената гранична стойност от 20. Следователно, рекомбинацията на шест генома (8,6%) на това място на генома може да бъде потвърдена (Фигури 4 и 5).
Детайлната визуализация на подравняването на рекомбинационната област на набора от данни за Mycobacterium bovis засяга гена narX, който кодира възможна нитрат редуктаза. Не са открити празнини или неопределени нуклеотиди в рекомбинационната област на вътрешните възли. Това конкретно събитие е регистрирано в генома Eu1. Качеството на секвениране на гена narX беше оценено чрез нанасяне на показанията на Mycobacterium bovis AF2122/97. Потвърдете препоръчителното местоположение на SNP в рекомбинационната област, като приложите критериите, посочени в раздела за метода (поне 20 показания и честота на промяна 0,9). Полиморфизмът на гена narX беше напълно потвърден в геномите на Mb1792361 и Mb7240415 (2,3%).
Детайлна визуализация на подравняването на рекомбинационната област на набора от данни за Mycoplasma bovis, засягащ гена pks12. Не са открити празнини или неопределени нуклеотиди в рекомбинационната област на вътрешните възли. Що се отнася до събитието, засягащо гена pks12, кодиращ възможна поликетидна синтаза, той съдържа само генома Eu2. Качеството на секвениране на pks12 беше оценено чрез картографиране на четене на Mycobacterium bovis AF2122/97. Потвърдете препоръчителното местоположение на SNP в рекомбинационната област, като приложите критериите, посочени в раздела за метода (поне 20 отчитания и честота на промяна 0,9). Полиморфизмите на геномите Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 и Mb1960 са напълно потвърдени.
Гените PE и PPE имат повтарящи се региони, които лесно се разчитат погрешно от секвенирането и картографирането на Illumina, така че те обикновено се изтриват от биоинформатичния работен процес на членовете на M. tuberculosis само когато се използва стратегията за картографиране към последователност. Изводът за рекомбинационни събития, приложен в тази работа, се основава на de novo сглобяване без филтриране на PE/PPE. Вярваме, че чрез прилагане на три различни допълващи се метода и алгоритми чрез SplitsTree, Gubbins pipeline и софтуера RDP4, приложените стратегии са устойчиви на обработка и филтриране на реорганизираните региони, причинени от сигнали за грешки. Въпреки това, за да се изключи интерференцията на гена PE/PPE върху софтуера Gubbins и RDP4 за идентифициране на SNP клъстери и следователно идентифициране на рекомбинационните региони, за които се предполага, че засягат гените narX и pks12, беше изследвана съседството на тези гени (Допълнителна фигура 3–5). В M. bovis AF2122/97, генът narX е разделен от narK2 и Mb1764c, докато pks12 е заобиколен от Mb2075c и Mb2073c (Допълнителна фигура 3-5). Картата, генерирана с помощта на MAUVE synline картата на пълния геном, предоставя информация за консервацията и пренареждането на генната последователност, показвайки четири колинеарни блока и никакви признаци на геномна транслокация или инверсия. Освен това, комплементарният анализ с аминокиселинната последователност доказа хомологията във всички пълни геноми и не бяха открити PE/PPE в съседните региони на narX или pks12. За narX, един геном (Mb0030) има по-нисък резултат за синонимия, тъй като генът narX е идентифициран като два фрагмента (фрагменти 1891 и 1890). За pks12, поради сходства, Mb0030 и Mb003 показаха по-ниски резултати за синлинейност, докато pks12 беше идентифициран съответно в два и три фрагмента, представляващи различни домейни на протеина (Допълнителна фигура 3-5). Вземайки предвид тази информация и след като софтуерът Gubbins и RDP4 извършиха анализ, провериха множественото подравняване в ядрото на максималните 500 bp в прозореца, потвърдихме, че генът PE/PPE няма да повлияе на рекомбинационния сигнал, който засяга narX и pks12.
Въпреки че рекомбинационните сигнали, открити в този набор от данни, могат да се считат за остатъчни, вярно е, че рекомбинацията в M. bovis не може да бъде изключена, така че тя трябва да продължи да бъде обект на по-нататъшен анализ, при който цели геноми от различни епидемиологични сценарии се секвенират до Важно.
Сравняването на филогенетичните дървета на ML, получени преди и след корекция на рекомбинацията (Фигура 2A, B), не доведе до значителни промени в изведената филогенетична връзка и щамовете на M. bovis бяха групирани в една и съща група.
След картографиране на 42 новосеквенирани прочитания на M. bovis с референтния геном на M. bovis AF2122/97, беше получено SNP подравняване, съдържащо 1816 полиморфни позиции. Повечето SNP (87,1%) са разположени в кодиращия регион, а засегнатите гени са характеризирани според функционалните категории, показани в Bovilist (Фигура 6A, B). Като се вземе предвид общият брой гени във всяка функционална категория, гените в категорията „липиден метаболизъм“ показаха повече SNP, следвани от „клетъчна стена и клетъчни процеси“ и „междинен метаболизъм и дишане“, което разкрива, че те са в еволюцията на M. bovis.
Йерархичен анализ на набора от данни за M. bovis от Португалия (n = 42). Общ брой регистрирани SNP и засегнати гени за всяка функционална категория (A). Общ брой синонимни и несинонимни промени, регистрирани по функционална категория (B).
В световен мащаб средното съотношение dN/dS е по-добро от 1,5, което показва, че глобалният еволюционен натиск е да се отървем от анцестралното състояние и представлява сценарий за положителен (диверсифициран или насочен) и/или облекчен избор на пречистване. В категориите „вирулентност, детоксикация, адаптация“, „инсерционни последователности и фаги“ и „регулаторни протеини“ повече от две трети от SNP са несиноними (Фигура 6B).
Във всички категории има гени с множество SNP, което води до средна честота на мутации (т.е. средния SNP на ген) по-голяма от 1 (Фигура 6А). Pks12 (Mb2074c) с 15 SNP и fas (Mb2553c) с 8 SNP имат по-високи стойности на мутации. И двата гена участват в метаболизма на мастните киселини. Генът pks кодира поликетид синтаза (PKS), която е многофункционален ензим, участващ в биосинтеза на липидите в клетъчната стена на микобактериите74,75. Този ген кодира многофункционален полипептид, който участва в синтеза на микокетиди74,76. Генът fas участва в синтеза на миколова киселина. И двата гена играят важна роля в биосинтеза на клетъчната стена в контакт с гостоприемника.
За да се проучи по-нататък еволюцията на Mycobacterium bovis, бяха анализирани два комплекта специфични гени. Предишни публикации, използващи методи за съставяне на последователности и филогенетични методи, идентифицираха гени, придобити от предци на MTBC чрез HGT преди диверсификацията37,38. Тези гени са изброени в Допълнителна таблица 2. Анализирано е SNP разпределението на общо 77 гена, които могат да бъдат свързани с HGT, и са идентифицирани 26 полиморфни сайта, които в повечето случаи (78%) са довели до несинонимични (NS) промени (Допълнителна таблица 2). Предишна работа върху генома на MTBC показа, че предполагаемият HGT регион показва по-високо съотношение NS SNP в сравнение с останалата част от генома. Ако се смята, че тези рекомбинационни региони са придобити от предци на MTBC и следователно те свръхпредставляват древни полиморфизми, тогава се очаква делът на синонимните промени да бъде по-висок, тъй като се очаква NS заместванията да бъдат елиминирани чрез негативна селекция, тъй като промените в аминокиселините могат да променят функцията на протеина. Следователно, нашите резултати показват, че функционалните последици могат да произтичат от заместването на HGT-подобни гени, което отразява тяхното значение за ценното адаптивно генетично разнообразие.
Успоредно с този анализ, гените, кодиращи компонентите на 3R (DNA repair, replication, and recombination) системата, бяха щателно изследвани в съответствие със списъка, публикуван по-рано от dos Vultos и сътрудници (2008)39. Обменът на идентични ДНК фрагменти не може да бъде наблюдаван директно, въпреки че може да е чест процес, когато са включени тясно свързани бактерии, както в случая с този набор от данни; освен това, този процес може да е ключът към методите за възстановяване на ДНК72, така че те играят роля в хомоложната рекомбинация. Идентифицирани са общо 26 полиморфни позиции, разпределени от 54 гена (Допълнителна таблица 3). В този набор от гени, NS промените представляват около 65% от последствията, което е в съответствие с предишни доклади за щамове на Mycobacterium tuberculosis.
Време на публикуване: 21 октомври 2021 г.