மறுசீரமைப்பு, பிறழ்வு மற்றும் நேர்மறை தேர்வு ஆகியவற்றின் மரபணு அளவிலான மதிப்பீடுகள் மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸின் மாறுபட்ட இயக்கிகளை ஊக்குவிக்கின்றன

நேச்சரைப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் CSS-க்கு குறைந்த ஆதரவு மட்டுமே உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்கு, உலாவியின் புதிய பதிப்பைப் பயன்படுத்துமாறு நாங்கள் பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை அணைக்கவும்). அதே நேரத்தில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, பாணிகள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாத தளங்களைக் காண்பிப்போம்.
மரபணு வரிசைமுறை தொற்று நோய் ஆராய்ச்சித் துறையை புத்துயிர் பெற்றுள்ளது, நோய் தொற்றுநோயியல், நோய்க்கிருமி உருவாக்கம், ஹோஸ்ட்-நோய்க்கிருமி தொடர்புகள் மற்றும் நோய்க்கிருமிகளின் மீது சுமத்தப்பட்ட பரிணாம செயல்முறை ஆகியவற்றை வெளிப்படுத்துகிறது. மைக்கோபாக்டீரியம் காசநோய் வளாகம் (MTBC), மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸை அதன் விலங்கு தகவமைப்பு உறுப்பினர்களில் ஒன்றாகக் கருதுகிறது, இது நிலப்பரப்பு பாலூட்டிகளில் காசநோயை (TB) ஏற்படுத்துகிறது, மேலும் இது பாக்டீரியா பரிணாம வளர்ச்சியின் ஒரு பொதுவான மாதிரியாகும். மற்ற MTBC உறுப்பினர்களைப் போலவே, மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் கண்டிப்பாக குளோன் செய்யப்பட்ட, மெதுவாக உருவாகும் நோய்க்கிருமியாகக் கருதப்படுகிறது, மேலும் மறுசீரமைப்பு அல்லது கிடைமட்ட மரபணு பரிமாற்றத்தின் எந்த அறிகுறியும் இல்லை. இந்த வேலையில், கால்நடைகளின் மரபணு பன்முகத்தன்மை பற்றிய நுண்ணறிவுகளைப் பெற, வெவ்வேறு வம்சாவளியைச் சேர்ந்த (ஐரோப்பா மற்றும் ஆப்பிரிக்கா) 70 கால்நடைகள் M. கொண்ட முழு மரபணு வரிசை (WGS) தரவுத்தொகுப்புக்கு ஒப்பீட்டு மரபணுவியலைப் பயன்படுத்துகிறோம். பரிணாம சக்தி. மறுசீரமைப்பின் அறிகுறிகளை மதிப்பிடுவதற்கு மூன்று வெவ்வேறு முறைகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. உலகளவில், உறுதியான ஆதரவுடன் இரண்டு சுயாதீன முறைகள் மூலம் குறைந்த எண்ணிக்கையிலான மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகள் அடையாளம் காணப்பட்டு உறுதிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன. இருப்பினும், பிறழ்வுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​மறுசீரமைப்பு M. bovis இன் பன்முகத்தன்மையில் பலவீனமான விளைவைக் கொண்டுள்ளது (ஒட்டுமொத்த r/m = 0.037). எங்கள் தரவுத் தொகுப்பில் உள்ள மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸின் குளோனல் வளாகத்தில் பெறப்பட்ட r/m சராசரி வேறுபாடு, அதே வகைபிரித்தல் இனங்களுக்கு ஒதுக்கப்பட்ட பரம்பரைகளுக்கு இடையில் மறுசீரமைப்பின் அளவு பெரிதும் மாறுபடலாம் என்ற பொதுவான கருத்துடன் ஒத்துப்போகிறது. இந்த வேலையின் அடிப்படையில், மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸில் மறுசீரமைப்பை நிராகரிக்க முடியாது, எனவே எதிர்கால ஒப்பீட்டு மரபியல் ஆராய்ச்சியில் இது மேலும் முயற்சிகளுக்கு உட்பட்டதாக இருக்க வேண்டும், இதில் உலகெங்கிலும் உள்ள பல்வேறு தொற்றுநோயியல் சூழ்நிலைகளிலிருந்து பெரிய தரவுத் தொகுப்புகளின் WGS முக்கியமானது. பின்னர் பல-ஹோஸ்ட் TB பரவலில் இருந்து சிறிய மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் தரவுத் தொகுப்பில் (n = 42) கூடுதல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, மேலும் 1,800 க்கும் மேற்பட்ட இடங்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன, அவற்றில் குறைந்தது ஒரு திரிபு ஒற்றை நியூக்ளியோடைடு பாலிமார்பிசத்தை (SNP) காட்டியது. பெரும்பாலானவை (87.1%) குறியீட்டுப் பகுதியில் அமைந்துள்ளன, மேலும் ஒத்த மாற்றங்களின் உலகளாவிய விகிதம் (dN/dS) 1.5 ஐ விட அதிகமாக உள்ளது, இது நேர்மறைத் தேர்வு என்பது M. bovis இல் செலுத்தப்படும் ஒரு முக்கியமான பரிணாம சக்தி என்பதைக் குறிக்கிறது. "லிப்பிட் வளர்சிதை மாற்றம்", "செல் சுவர் மற்றும் செல்லுலார் செயல்முறைகள்" மற்றும் "இடைநிலை வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் சுவாசம்" ஆகியவற்றின் செயல்பாட்டு வகைகளில் நிறைந்த மரபணுக்களில் SNP களின் அதிக விகிதம் கண்டறியப்பட்டது, இது மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸின் முக்கியத்துவத்தின் உயிரியல் மற்றும் பரிணாம வளர்ச்சியில் அவற்றின் திறனை வெளிப்படுத்துகிறது. MTBC மூதாதையர்களில் உள்ள மரபணுக்களை உற்று நோக்கினால், கிடைமட்ட மரபணு பரிமாற்றத்திற்கு ஆளாகக்கூடிய மற்றும் 3R (DNA பழுது, பிரதி மற்றும் மறுசீரமைப்பு) அமைப்பில் சேர்க்கப்பட்டுள்ளது, அவை தைஜிமாவின் D நடுநிலை சோதனையின் உலகளாவிய சராசரி எதிர்மறை மதிப்பை வெளிப்படுத்துகின்றன, இது கடந்த கால தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஸ்கேனிங்கைக் குறிக்கிறது. மக்கள்தொகை விரிவாக்கத்திற்குப் பிறகு சமீபத்திய தடையானது, ஹோஸ்டை எதிர்த்துப் போராட கட்டாய நோய்க்கிருமி மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் முக்கிய பரிணாம உந்து காரணியாக உள்ளது.
மைக்கோபாக்டீரியம் காசநோய் வளாகம் (MTBC) என்பது பாக்டீரியா நோய்க்கிருமிகளின் மிகவும் வெற்றிகரமான வகைகளில் ஒன்றாகும் மற்றும் பாக்டீரியா பரிணாம வளர்ச்சியின் ஒரு பொதுவான நிகழ்வாகும். அதன் உறுப்பினர்கள் மரபணு மட்டத்தில் (> 99%) 1,2 இல் வியக்கத்தக்க வகையில் அதிக நியூக்ளியோடைடு அடையாளத்தைக் காட்டுகிறார்கள். வெவ்வேறு MTBC சுற்றுச்சூழல் வகைகள் காசநோயை (TB) ஏற்படுத்தக்கூடும், இது ஒரு தொற்று கிரானுலோமாட்டஸ் நோயாகும், இது நுண்ணிய பாலூட்டிகள் முதல் மனிதர்கள் வரை பரந்த அளவிலான ஹோஸ்ட் இனங்களில் 3,4,5. தற்போது, ​​வளாகத்தில் மனிதர்கள் [M. காசநோய் (Mtb), மைக்கோபாக்டீரியம் ஆப்பிரிக்கானம்] மற்றும் விலங்கு-தழுவிய நோய்க்கிருமிகள் (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" மற்றும் "dassie") 5,6 ஆகியவை அடங்கும். எம். கேனெட்டி ("நோடோபாக்டர் கிளப்ராட்டா" என்றும் அழைக்கப்படுகிறது) மேற்கூறிய மைக்கோபாக்டீரியாவுடனான சராசரி நியூக்ளியோடைடு அடையாளம் 98% ஆகும், மேலும் ஒப்பீட்டு மரபியல் ஆய்வுகள் எம். கேனெட்டி மற்றும் மீதமுள்ள எம்டிபிசி ஆகியவை சமீபத்தில் பொதுவான மூதாதையரிடமிருந்து விலகிச் சென்றுள்ளன என்பதைக் காட்டுகின்றன.7 இந்தக் கருத்தைக் கருத்தில் கொண்டு, சில ஆசிரியர்கள் எம். கேனெட்டியை எம்டிபிசி 8 இன் உறுப்பினர் என்று அழைக்கின்றனர்.
MTBC ஒரு கண்டிப்பான குளோனல் வளாகமாக முறையாக விவரிக்கப்படுகிறது, மேலும் அதன் மக்கள்தொகை அமைப்பு குறைக்கப்பட்ட பன்முகத்தன்மை, தடைகள், தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஸ்கேனிங் மற்றும் மரபணு சறுக்கல் ஆகியவற்றால் தெளிவாக நிர்வகிக்கப்படுகிறது9,10. காணாமல் போன பாலிமார்பிஸங்கள் போன்ற சிக்கலான கண்டிப்பான குளோனல் பரிணாமத்தை மறுசீரமைப்பு மூலம் மீட்டெடுக்க முடியாது என்று கருதினால். இந்த முன்மாதிரியின் அடிப்படையில், வேறுபட்ட பகுதி (RD) மற்றும் TbD1 (Mtb குறிப்பிட்ட நீக்கம் 1 பகுதி) ஆகியவற்றின் மரபணு நீக்கத்தின் தொடர்ச்சியான நிகழ்வுகள் MTBC பரிணாம வளர்ச்சியின் மூலக்கூறு குறிப்பான்களாக முன்மொழியப்பட்டுள்ளன2,5,11. ஒப்பீட்டு மரபியல் மற்றும் முழு மரபணு வரிசைமுறை (WGS) பணி மனித-தழுவிய உறுப்பினர்களை ஒன்பது பரம்பரைகளாகப் பிரிப்பதை ஆதரிக்கிறது (மைக்கோபாக்டீரியம் காசநோய் L1 முதல் L4, L7 மற்றும் L8; மற்றும் மைக்கோபாக்டீரியம் ஆப்பிரிக்கானம் L5, L6, மற்றும் L9), பரம்பரைகள் L2 முதல் L4 பகிரப்பட்ட TbD1 பகுதியை நீக்கவும்2,11,12,13. கூடுதலாக, விலங்கு தழுவிய உறுப்பினர்கள் ஒரு பொதுவான மூதாதையரைப் பகிர்ந்து கொள்ள முன்மொழியப்படுகிறார்கள், இது RD7, RD8, RD9 மற்றும் RD102, 5, மற்றும் 14 இல் உள்ள கிளேட்-குறிப்பிட்ட நீக்குதல்களால் வரையறுக்கப்படுகிறது.
கிடைமட்ட மரபணு பரிமாற்றம் (HGT) மற்றும் மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகள் அரிதானதாகக் கருதப்படுகின்றன, மேலும் MTBC இன் மூதாதையர்களில் நிகழ்கின்றன, முழு MTBC உறுப்பினரின் வெவ்வேறு வரலாற்றை விட15,16,17. ஹியூஸ் மற்றும் கூட்டுப்பணியாளர்கள் (2002) மற்றும் குட்டாக்கர் மற்றும் கூட்டுப்பணியாளர்கள் (2006) ஆகியோரின் இரண்டு ஆரம்ப அறிக்கைகள், M. காசநோய் விகாரங்களில் குறிப்பிட்ட இடத்தைக் குறிக்கும் பாலிமார்பிஸங்களை வடிவமைக்க மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகள் உதவக்கூடும் என்று பரிந்துரைத்தன18,19. MTBC இல் மறுசீரமைப்பு இல்லாததற்கான வெளிப்படையான காரணங்கள்: (1) HGT இன் இயந்திர செயல்முறை மற்றும் திறன் இழப்பு; (2) HGT நிகழ்வுகளின் அரிதான தன்மை; (3) MTBC முக்கிய இடத்தில் மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளுக்கான வாய்ப்பு இல்லை14,17. சமீபத்தில், MTBC திரிபு 20 மற்றும் மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் 21 ஆகியவற்றில் பயன்படுத்தப்பட்ட சில முழு-மரபணு வரிசைமுறை (WGS) ஆய்வுகள் மறுசீரமைப்பிற்கான சான்றுகளை வழங்கியுள்ளன, MTBC விகாரங்கள் பெரும்பாலும் சிறிய DNA துண்டுகளை பரிமாறிக்கொள்கின்றன என்பதைக் காட்டிய முதல் நிகழ்வு, ஆனால் வரையறுக்கப்பட்ட நியூக்ளியோடைடு வரிசை மாறுபாடு காரணமாக, இந்த நிகழ்வுகள் இன்னும் கவனிக்கப்படவில்லை.
மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் என்பது கால்நடைகளிலிருந்து (முக்கியமாக கால்நடைகள்) பொதுவாக மீட்கப்படும் MTBC உறுப்பினர் ஆகும், இருப்பினும் இது சுதந்திரமாக-வரம்பு மற்றும் வேலி அமைக்கப்பட்ட காட்டு விலங்குகளிலிருந்தும் தனிமைப்படுத்தப்படலாம்4,22,23,24. M. போவிஸ் ஐந்து முக்கிய குளோனல் வளாகங்களாக [ஐரோப்பிய 1 (Eu1), ஐரோப்பிய 2 (Eu2), ஐரோப்பிய 3 (Eu3), ஆப்பிரிக்க 1 (Af1) மற்றும் ஆப்பிரிக்கா 2 (Af2)], குறிப்பிட்ட மரபணுக்களில் ஸ்போலிகோடைப்பிங் சுயவிவரம், குறிப்பிட்ட நீக்குதல்கள் மற்றும் ஒற்றை நியூக்ளியோடைடு பாலிமார்பிஸங்கள் (SNPs) 25, 26, 27, 28, 29 ஆகியவற்றின் படி பரிணமித்தது. இந்த குளோனல் வளாகங்கள் மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் மக்கள்தொகையின் மாறுபட்ட அமைப்பையும் புவியியல் பகுதிகளுடனான அதன் தொடர்பையும் நிரூபிக்கின்றன. கூடுதலாக, ஜிம்பல் மற்றும் கூட்டுப்பணியாளர்களால் மேற்கொள்ளப்பட்ட சமீபத்திய WGS பணி (2020) மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸின் SNP ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட ஒரு பைலோஜெனியை வடிவமைத்தது, 1,900 க்கும் மேற்பட்ட மரபணுக்களைக் கொண்டது, இது குறைந்தது நான்கு வெவ்வேறு பரம்பரைகள் (Lb1 முதல் Lb1 முதல் Lb4 வரை பெயரிடப்பட்டது) இருப்பதைக் குறிக்கிறது, அவை முன்னர் வரையறுக்கப்பட்ட குளோனல் வளாகத்துடன் முழுமையாக ஒத்துப்போகவில்லை, இருப்பினும் புவியியல் தனித்தன்மையையும் உறுதிப்படுத்த முடியும். இந்த ஆசிரியர்கள் பைலோஜெனி மற்றும் மூலக்கூறு டேட்டிங் ஆகியவற்றின் வேறுபட்ட பகுப்பாய்வைச் செய்தனர், ஆனால் மறுசீரமைப்பைப் படிக்கவில்லை.
ஸ்போலிகோடைப்பிங், MIRU-VNTR (மைக்கோபாக்டீரியல் இடைச்செருகல் ரிபீட் யூனிட்-மாறி டேன்டெம் ரிபீட் எண்) போன்ற பல்வேறு மூலக்கூறு நுட்பங்களைப் பயன்படுத்தி முந்தைய வேலை, மற்றும் சமீபத்திய SNP தட்டச்சு ஆகியவை M. போவிஸ் விகாரங்கள் 31,32,33, 34,35 ஆகியவற்றில் ஒரு குறிப்பிட்ட அளவிலான மரபணு வேறுபாட்டை வெளிப்படுத்தின. நோய் தொற்றுநோயியல் ஆய்வில் மரபணு மாறுபாட்டின் வேறுபாடு ஒரு முக்கியமான கருவியாக மாறியுள்ளது, இது நோய்க்கிருமி உருவாக்கம், வைரஸ் மற்றும் நோய் பரவுதல் பற்றிய ஆழமான புரிதலுக்கு உதவியாக உள்ளது. WGS முறையின் தோற்றம், வெவ்வேறு ஹோஸ்ட்கள் மற்றும் தொற்றுநோயியல் சூழ்நிலைகளுக்கு ஏற்ப தழுவல் மற்றும் நிலைத்தன்மையின் செயல்பாட்டில் மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் மரபணுவால் விதிக்கப்பட்ட பரிணாம உந்து காரணிகளை வெளிப்படுத்தும் வாய்ப்பை வழங்குகிறது.
இந்த வேலையில், பல்வேறு குளோனல் வளாகங்களிலிருந்து தனிமைப்படுத்தல்கள் உட்பட பல்வேறு மைக்கோபிளாஸ்மா போவிஸ் தரவுத்தொகுப்புகளில் (n=70) ஒப்பீட்டு மரபணு பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்துகிறோம், குறிப்பாக பைலோஜெனடிக் உறவுகள் மற்றும் மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளைத் தீர்க்க, மைக்கோபிளாஸ்மா போவிஸின் பரிணாம செயல்முறை பற்றிய நுண்ணறிவுகளைப் பெற. இந்த பகுப்பாய்விற்கு ஒரு துணைப் பொருளாக, போர்ச்சுகலில் நன்கு வகைப்படுத்தப்பட்ட பல-ஹோஸ்ட் காசநோய் பகுதியிலிருந்து பெறப்பட்ட M. போவிஸ் தனிமைப்படுத்தல்களின் (n=42) துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 31,36 மேலும் அடையாளம் இல்லாததை ஊகிக்க ஆராயப்பட்டது. ஒத்த (dS) நியூக்ளியோடைடு மாற்றுகளுக்கு உணர்வு (dN) மற்றும் இலக்கியத்தில் குறிப்பிடப்பட்டுள்ள குறிப்பிட்ட மரபணுக்களின் பரிணாம பங்களிப்புக்கு இடையிலான சமநிலை, அவை HGT மூலம் MTBC மூதாதையர்களால் பெறப்பட்ட 37,38 ஆகும், மேலும் 3R (DNA பழுது, பிரதி மற்றும் மறுசீரமைப்பு) அமைப்பு மரபணு கூறுகளை 39 குறியாக்கம் செய்கின்றன. HGT மூலம் பெறப்பட்ட மரபணுக்களைத் தேர்வுசெய்க, ஏனெனில் அவை பண்டைய பாலிமார்பிஸங்களைக் குறிக்கலாம், எனவே அவை ஒத்த மாற்றங்களின் அதிக விகிதத்தைக் கொண்டிருக்கலாம் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது. 3R அமைப்பில் சேர்க்கப்பட்டுள்ள மரபணுக்கள், M. காசநோய் விகாரங்கள் குறித்த முந்தைய பணிகள் இந்த மரபணுக்களில் செயல்படும் பொதுவான எதிர்மறை/சுத்திகரிப்புத் தேர்வுகளைக் குறிப்பிட்டதால் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன, மேலும் அவை பரிணாம வளர்ச்சியில் முக்கிய பங்கு வகிக்கக்கூடும் 39. மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளின் இருப்பை ஊகிப்பதே இந்த வேலையின் மற்றொரு குறிக்கோள். இந்த காரணத்திற்காக, போர்ச்சுகலில் இருந்து எங்கள் தரவுத்தொகுப்பில் ஐரோப்பிய குளோன் வளாகம் 2 இன் மரபணுக்கள் மற்றும் குளோன் வளாகத்தை ஒதுக்காத விகாரங்கள் மட்டுமே உள்ளன என்பதைக் கருத்தில் கொண்டு, அனைத்து குளோன் வளாகங்களின் பிரதிநிதியையும் இறுதியாகப் பெறவும், முடிவுகளின் வலிமை மற்றும் அகலத்தை மேம்படுத்தவும் பொதுவில் கிடைக்கும் மரபணு தரவைச் சேர்க்க முடிவு செய்தோம்.
போர்த்துகீசிய உள்ளூர் மல்டி-ஹோஸ்ட் காசநோய் காட்சியிலிருந்து புதிதாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட 42 மைக்கோபிளாஸ்மா போவிஸ் மரபணுக்கள் (கீழே உள்ள விவரங்கள்), முன்னர் ஒரு தொற்றுநோயியல் பார்வையில் இருந்து வகைப்படுத்தப்பட்டன36, இந்த வேலையின் மையமாகும். போர்ச்சுகலில் இருந்து தரவுத் தொகுப்பில் ஐரோப்பிய 2 குளோன் வளாகங்கள் மற்றும் நியமிக்கப்பட்ட வளாகங்கள் இல்லாத விகாரங்களின் பிரதிநிதிகள் மட்டுமே இருப்பதைக் கருத்தில் கொண்டு, M. போவிஸ் குளோன் வளாகங்களின் அனைத்து பிரதிநிதிகளையும் உள்ளடக்கிய தரவுத் தொகுப்பை விரிவுபடுத்த பொதுவில் கிடைக்கும் முழு-மரபணு வரிசைமுறை தரவு சேர்க்கப்பட்டுள்ளது. எனவே, இந்த வேலையில் மூன்று முழு-மரபணு வரிசைமுறை தரவு மூலங்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன: முழுமையான/வரைவு மரபணு அசெம்பிளி, NCBI (பயோடெக்னாலஜி தகவல் தேசிய மையம்) இல் சேமிக்கப்பட்ட 10 சாரக்கட்டுகள் வரை (n = 15 தனிமைப்படுத்தல்கள்); SRA இல் சேமிக்கப்பட்டது (வரிசை படிக்கப்பட்ட காப்பகத்தின் இல்லுமினா ஃபாஸ்ட்க் கோப்பு) M. போவிஸ் குளோன்களின் சிக்கலான பன்முகத்தன்மையைக் குறிக்கிறது (n = 12 தனிமைப்படுத்தல்கள்)30; மற்றும் போர்ச்சுகலில் இருந்து 42 புதிதாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்கள். மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் BCG (பேசில் கால்மெட்-குயெரின்) NCBI தேடலில் இருந்து விலக்கப்பட்டது. M. bovis AF2122/97 பொதுவாக தரவுத்தொகுப்பில் சேர்க்க ஒரு குறிப்பு மரபணுவாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஆப்பிரிக்க 1 குளோனிங் வளாகத்தால் குறிப்பிடப்படும் முழு மரபணு வரிசையும் பொதுவில் கிடைக்காததாலும், Af2 மற்றும் Eu1 இன் பிரதிநிதித்துவ விகாரங்களிலிருந்து குறைந்த எண்ணிக்கையிலான மரபணுக்கள் இருந்ததாலும், SRA வழங்கிய அசல் வரிசைமுறை தரவு இந்த நிகழ்வுகளில் பயன்படுத்தப்பட்டது. ஜிம்பல் மற்றும் அவரது கூட்டுப்பணியாளர்களின் பணி (2020) மேற்கூறிய குளோனிங் வளாகத்திலிருந்து மரபணுவை அடையாளம் காண உதவியது மற்றும் தரவுத் தொகுப்பில் சேர்ப்பதற்காக மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸைத் தேர்ந்தெடுக்க உதவியது. Eu3 க்கு, ஒரே ஒரு வகை மரபணு மட்டுமே விவரிக்கப்பட்டுள்ளது (Branger et al., 2020), எனவே நாம் சேர்க்கும் மரபணு Eu3 வளாகத்தின் தனி பிரதிநிதியாகும்.
உலகளவில், இந்தத் தரவுத் தொகுப்பில் 1985 முதல் 2016 வரை 12 நாடுகளில் விநியோகிக்கப்பட்ட 8 ஹோஸ்ட் இனங்களிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட 70 கால்நடை M. போவிஸ் அடங்கும். 36 இனங்கள் Eu2 என நியமிக்கப்பட்டுள்ளன, 7 இனங்கள் Eu1, 1 இனங்கள் Eu3, 3 இனங்கள் Af1, 4 இனங்கள் Af2 மற்றும் 19 இனங்கள் எந்த குளோனல் வளாகத்திற்கும் (விவரங்கள் கீழே) காரணமாக இல்லை. இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்படும் மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸின் விரிவான தகவல்கள் (அணுகல் எண் உட்பட) அட்டவணை 1 மற்றும் துணை அட்டவணை 1 இல் காட்டப்பட்டுள்ளன.
போர்ச்சுகலின் விலங்கு காசநோய் பரவும் இடங்களிலிருந்து 12 ஆண்டுகளுக்கும் மேலாக விநியோகிக்கப்பட்ட மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸின் 42 புதிய வரிசைப்படுத்தப்பட்ட முழு மரபணுக்கள் இந்த ஆய்வின் மையமாகும், ஏனெனில் சாத்தியமான வனவிலங்கு-கால்நடை நோய் அமைப்புகள் தொடர்ந்து கண்காணிக்கப்பட்டுள்ளன 31,36 (துணை படம் 1). அடுத்தடுத்த நடைமுறைகளின்படி, இந்த விகாரங்கள் 2003 முதல் 2015 வரை கால்நடைகள் (n = 14), சிவப்பு மான் (n = 16) மற்றும் காட்டுப்பன்றி (n = 12) ஆகியவற்றிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டன: பரிந்துரைக்கப்பட்ட நெறிமுறை வழிகாட்டுதல்களின்படி விலங்குகளை சேகரித்து கையாளவும். திசு மாதிரிகள் OIE நிலப்பரப்பு விலங்கு கையேட்டில் உள்ளன மற்றும் ஸ்டோன்பிரிங்க் மற்றும் லோவென்ஸ்டீன்-ஜென்சன் பைருவேட் திட ஊடகம் மற்றும் திரவ ஊடகத்தில் தடுப்பூசி போடப்படுகின்றன. கலாச்சாரங்கள் 37 °C இல் அடைகாக்கப்பட்டு, வாரத்திற்கு ஒரு முறை குறைந்தது 12 வாரங்களுக்கு வளர்ச்சி சரிபார்க்கப்படுகிறது. காலனிகள் நேரடியாக -80ºC இல் கிளிசரால் கரைசலில் சேமிக்கப்படுகின்றன. மைக்கோபாக்டீரியம் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஊடகத்தில் (மிடில்புரூக் 7H9, BD டயக்னாஸ்டிக்ஸ்), அசல் காப்பகப்படுத்தப்பட்ட மாதிரிகள் WGS திட்டத்தின் DNA ஐப் பெற ஒற்றை இன் விட்ரோ பாதை வழியாக அனுப்பப்பட்டன. இதற்காக, உறைந்த கலாச்சார பங்கு கரைசல் 5% சோடியம் பைருவேட் மற்றும் 10% ADS (50 கிராம் அல்புமின், 20 கிராம் குளுக்கோஸ், 1 லிட்டர் தண்ணீரில் 8.5 கிராம் சோடியம் குளோரைடு) மூலம் மிடில்புரூக் 7H9 இல் 37°C ரீட்ரெய்னில் செறிவூட்டப்பட்டது. 4 வார வளர்ச்சிக்குப் பிறகு, ஊடகம் புதுப்பிக்கப்பட்டு, வளர்ச்சி காணப்படும் வரை கலாச்சாரம் தொடர்ந்து கண்காணிக்கப்பட்டது. செல்கள் மையவிலக்கு மூலம் அறுவடை செய்யப்பட்டன, துகள் 500 µL பாஸ்பேட் பஃபர் செய்யப்பட்ட உப்புநீரில் (PBS) மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, 99 °C இல் 30 நிமிடங்கள் சூடேற்றப்பட்டு, மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு, சூப்பர்நேட்டண்ட் -20 °C இல் WGS வரை சேமிக்கப்பட்டது. அனைத்து நடைமுறைகளும் நிலை 3 உயிரியல் பாதுகாப்பு வசதிகளில் மேற்கொள்ளப்படுகின்றன.
WGS ஜோடி-இறுதி மரபணு நூலகம் ஒவ்வொரு DNA மாதிரியின் தனித்துவமான குறியீட்டைப் பயன்படுத்தி தயாரிக்கப்படுகிறது, மேலும் வரிசைப்படுத்துவதற்கு இல்லுமினா MiSeq (2 × 250 pb) (40 மாதிரிகள்) மற்றும் HiSeq (2 × 150 pb) (இரண்டு தனிமைப்படுத்தல்கள்) தொழில்நுட்பத்தை (யூரோஃபின்ஸ் ஜெனோமிக்ஸ், ஜெர்மனி) பயன்படுத்துகிறது. உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, மரபணு DNA ஐ வரிசைப்படுத்த இரட்டை முனை தொகுதி இணைப்புடன் இல்லுமினா ஜீனோம் அனலைசரைப் பயன்படுத்தவும், மேலும் நூலகத்தை உருவாக்க இல்லுமினாவிலிருந்து நெக்ஸ்டெரா XT DNA நூலக தயாரிப்பு கருவியைப் பயன்படுத்தவும்.
SRA (n = 12) இலிருந்து மீட்டெடுக்கப்பட்ட தரவை கணக்கில் எடுத்துக்கொண்டால், குளோன் வளாகத்தின் அடையாளத்தை தொடர்புடைய வெளியீடு 30, 41, 43 இன் மெட்டாடேட்டாவாகப் பயன்படுத்தலாம். முழுமையான மரபணுவைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது, ​​முறையே Eu1 மற்றும் Eu3 குளோனல் வளாகம் 25, 29 இன் அங்கீகரிக்கப்பட்ட உறுப்பினர்களான மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் AF2122/97 மற்றும் மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் 3601 தவிர, இது மைக்கோபாக்டீரியம் காசநோய் H37Rv (NCBI அணுகல் எண் NC_000962.3) இன் முழுமையான மரபணுவைப் போன்றது. மரபணு சீரமைப்பு MAFFT (அமினோ அமிலம் அல்லது நியூக்ளியோடைடு வரிசையின் பல சீரமைப்பு நிரல், பதிப்பு 7.458) மற்றும் அளவுரு -addfragments48 ஐப் பயன்படுத்தி செய்யப்படுகிறது. பின்னர், வெவ்வேறு குளோனல் வளாகங்கள் இல்லாதது மற்றும்/அல்லது SNP அம்சங்கள் இருப்பதைத் தேடுங்கள்.
புதிதாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் (n = 42) மற்றும் கூடியிருந்த மரபணு வரைவின் அசல் வாசிப்புகள் (n = 3) vSNP குழாய் வழியாக மைக்கோபாக்டீரியம் டியூபர்குலோசிஸ் H37Rv என்ற குறிப்பு மரபணுவுடன் வளாகத்தை சீரமைக்கின்றன மற்றும் வெவ்வேறு குளோன்களின் நீக்கம் மற்றும்/அல்லது SNP அம்சங்களின் இருப்பு ஒரு தேடல் நடத்தப்பட்டது.
தொடர்புடைய குளோனல் வளாகத்திற்கு மரபணு தரவை ஒதுக்க, அம்சங்களின் பற்றாக்குறை மற்றும்/அல்லது SNP மற்றும் ஸ்போலிகோடைப்பிங் சுயவிவரங்களின் இருப்பு/இல்லாமை ஆகியவற்றிலிருந்து தகவல்களைச் சேகரிக்கவும். நான்கு வரைவு கூட்டங்களுக்கு, ஸ்போலிகோடைப்பிங் சுயவிவரத்தை ஊகிக்க முடியாது, எனவே அவை "சிக்கலான தன்மை இல்லை" குழுவில் சேர்க்கப்பட்டுள்ளன.
இந்தப் பணியைத் தொடர்ந்து வரும் உயிர் தகவலியல் பணிப்பாய்வு, மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகள் மற்றும் குறிப்பிட்ட மரபணு பாலிமார்பிஸங்களை ஆராய்வதை நோக்கமாகக் கொண்டு, புதிய அசெம்பிளி மற்றும் மேப்பிங்கிலிருந்து ஒரு குறிப்பு உத்தி வரை தொடங்குகிறது. படம் 1 பின்பற்றப்படும் படிகளின் பாய்வு விளக்கப்படத்தை வழங்குகிறது. மறுசீரமைப்பு பகுப்பாய்விற்கு, அனைத்து மரபணுக்களும் அனுமானங்கள் மற்றும் தொடர்புடைய குறிகாட்டிகளின் வலிமையை அதிகரிக்கப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
மரபணு ஒருமித்த வரிசைமுறைகளை உருவாக்குவதில் பிழைகளைக் குறைப்பதற்காக, முதலில் நாங்கள் டி நோவோ அசெம்பிளியைப் பெற்றோம், பின்னர் கோர் மல்டிபிள் அலைன்மென்ட்களைப் பெற்றோம். யூனிசைக்லர் பைப்லைன் தற்போது https://github.com/rrwick/Unicycler49 இல் கிடைக்கிறது, மேலும் இது 54 வரிசைப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்களின் (42 புதிதாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட மற்றும் 12 ஃபாஸ்ட்க் கோப்புகள் SRA இலிருந்து மீட்டெடுக்கப்பட்டது) டி நோவோ அசெம்பிளியைச் செய்யப் பயன்படுகிறது. சுருக்கமாக, புதிதாக அசெம்பிள் செய்வதற்கு முன், FastQC பதிப்பு 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) மற்றும் டிரிம்மோமேடிக் பதிப்பு 0.36 ("படிப்புகளிலிருந்து அடாப்டர்கள் மற்றும் பிற லைட்டிங்-குறிப்பிட்ட வரிசைகளை வெட்டுதல்" மற்றும் "20 இன் வரம்பு தரத்தை விடக் குறைவாக இருந்தால், வாசிப்பின் முடிவில் இருந்து அடிப்படைகளை வெட்டுதல்") ஆகியவற்றில் வாசிப்பு தர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. பின்னர், SPAdes optimiser49 மரபணு அசெம்பிளுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் பைலான் பதிப்பு 1.1851 பிந்தைய அசெம்பிளுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது. தவறான அசெம்பிளியைத் தவிர்க்க ஒரு பழமைவாத பிரிட்ஜிங் பயன்முறை தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது, மேலும் k-mer அளவு தேடப்பட்டு வாசிப்பு நீளத்தின் 20% முதல் 95% வரை தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது. SPAdes வழிகாட்டுதல்களைப் பின்பற்றி, வாசிப்பு அளவைக் கருத்தில் கொள்ளுங்கள், 300 bp க்கும் குறைவான கான்டிஜ்களை நீக்குங்கள், மேலும் 52 இன் 20 ரீட் டெப்த் கவரேஜ் கட்ஆஃப் நிறுவவும். டி நோவோ அசெம்பிளி உத்தியில், அதிக அளவில் மீண்டும் மீண்டும் நிகழும் புரோலின்-குளுட்டமேட் (PE) மற்றும் புரோலின்-புரோலின் குளுட்டமேட் (PPE) பாராலாக்ஸ் போன்ற மரபணு பகுதிகள் அகற்றப்படவில்லை.
டி நோவோ அசெம்பிளியின் தரம், கான்டிஜ் மற்றும் எம். போவிஸ் AF2122/97 குறிப்பு மரபணுவைப் புதுப்பிக்க (NCBI அணுகல் எண் LT708304.1) வசதி செய்யும் QUAST பைப்லைன் (http://quast.sourceforge.net/quast.html) மூலம் மதிப்பிடப்படுகிறது (NCBI அணுகல் எண் LT708304.1) மேப்பிங் (தர அளவுருக்களுக்கு துணை அட்டவணை 1 ஐப் பார்க்கவும்).
vSNP பைப்லைனின் (https://github.com/USDA-VS/vSNP) உதவியுடன், இல்லுமினா சீக்வென்சிங்கிலிருந்து புதிதாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட M. போவிஸின் FASTQ கோப்பு, M. போவிஸ் AF2122/97 குறிப்பு மரபணுவுடன் (LT708304.1) ஒப்பிடப்படுகிறது. ஜீனோம் பகுப்பாய்வு கருவித்தொகுப்பு (GATK) 53, 54, 55 இன் சிறந்த நடைமுறை பரிந்துரைகளின்படி, மறுசீரமைப்பிற்கான நிலையான வடிகட்டி அளவுருக்கள் அல்லது மாறுபாடு நிறை மதிப்பெண்களைப் பயன்படுத்துகிறது. முடிவுகள் 150 மற்றும் AC = 2 என்ற மிகக் குறைந்த SAMtools நிறை மதிப்பெண்ணைப் பயன்படுத்தி வடிகட்டப்படுகின்றன. மாசுபாட்டை நிராகரிக்க வாசிப்புகளைச் சரிபார்க்க கிராக்கனையும் (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) பயன்படுத்தவும். எங்கள் வேலையில் வரிசைப்படுத்த உத்திகளை வரைபடமாக்கப் பயன்படுத்தப்படும் vSNP பைப்லைன் வரையறுக்கப்பட்ட SNPகள் மற்றும் இலக்குகளின் வரிசையை ஆராய்கிறது, மேலும் கலப்பு தொற்று சூழ்நிலைகளையும் விலக்குகிறது. படிக்கப்பட்ட மரபணு கவரேஜ் 99% ஐ விட சிறந்தது (துணை அட்டவணை 1).
மேப்பிங் பிழைகள் மற்றும் தவறான SNPகளைத் தவிர்க்க, பின்வரும் சந்தர்ப்பங்களில் ஒரு மாறுபாட்டை வடிகட்டவும்: (1) இது 20 க்கும் குறைவான அளவீடுகளால் ஆதரிக்கப்படுகிறது, (2) இது 0.9 க்கும் குறைவான அதிர்வெண்ணுடன் காணப்படுகிறது, (3) இது குறைந்தது ஒரு விகாரத்தில் உள்ளது, ஆனால் குறைந்தபட்சம் மற்றொரு விகாரத்தில் இடைவெளிகள் உள்ளன. ஒருங்கிணைந்த ஜெனோமிக்ஸ் வியூவர் (IGV) பதிப்பு 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 SNPகள் மற்றும் மேப்பிங் அல்லது சீரமைப்பு சிக்கல்களுடன் நிலைகளை பார்வைக்கு சரிபார்க்கப் பயன்படுத்தப்பட்டது. புரோலைன்-குளுட்டமேட் (PE) மற்றும் புரோலைன்-புரோலைன் குளுட்டமேட் (PPE) மரபணுக்கள் அதிக அளவில் நகலெடுக்கப்பட்டு பல மரபணு குடும்பத்தின் ஒரு பகுதியாக இருப்பதால், அவை இல்லுமினா வரிசைமுறை மற்றும் தவறான வரைபடத்தால் எளிதில் தவறாகப் புரிந்து கொள்ளப்படுகின்றன, எனவே அவை விரும்பப்படுகின்றன. மைக்கோபாக்டீரியல் பயோஇன்ஃபர்மேடிக்ஸ் பணிப்பாய்வு SNPகளை உறுதிப்படுத்த வரிசைக்கு மேப்பிங் செய்யும் உத்தியைப் பயன்படுத்தும் போது காசநோய் வளாகத்தின் உறுப்பினர்களை நீக்கியது. எனவே, பகுப்பாய்விலிருந்து PE/PPE மரபணுக்கள் மற்றும் இன்டெல்களை வடிகட்டினோம்.
போவிலிஸ்ட்டின் (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) கூற்றுப்படி, அனைத்து SNPகளும் செயல்பாட்டு வகைகளாகப் பிரிக்கப்பட்டுள்ளன. SnpEff பைப்லைன் (https://pcingola.github.io/SnpEff/) SNP விளைவுகளை (ஒத்த அல்லது ஒத்த அல்லாத மாற்றங்கள்) ஊகிக்கப் பயன்படுகிறது. மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் AF2122/97 மரபணுவின் (LT708304.1) புதிய தரவுத்தளத்தை உருவாக்கியது.
மைய மரபணு பல சீரமைப்பு, தற்போது https://github.com/marbl/parsnp57 இல் கிடைக்கும் Parsnp v1.2 ஐப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது, 69 முழுமையான மரபணுக்கள்/வரைவு அசெம்பிளிகளைப் பயன்படுத்தி (விருப்பம் -c உடன்) M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) ஒரு குறிப்பாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. நான்கு மைய மரபணு சீரமைப்புகள் செய்யப்பட்டன: Eu2 குளோனிங் வளாகத்தின் உறுப்பினர்கள் மட்டுமே (n = 37), ஐரோப்பிய குளோனிங் வளாகத்தின் அனைத்து உறுப்பினர்களையும் உள்ளடக்கியது (n = 44), ஐரோப்பிய மற்றும் ஆப்பிரிக்க குளோனிங் வளாகத்தின் சந்திப்பு புள்ளி உட்பட (n = 51), மேலும் இந்த ஆய்வில் அனைத்து மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸையும் உள்ளடக்கியது (n = 70).
Parsnp ஆல் உருவாக்கப்பட்ட மைய சீரமைப்பு, RAxML ஐப் பயன்படுத்தி CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 ஐப் பயன்படுத்தி அதிகபட்ச வாய்ப்பு (ML) பைலோஜெனடிக் மரத்தை ஊகிக்கப் பயன்படுகிறது, மேலும் 1000 வழிகாட்டப்பட்ட பிரதிகளைச் செய்கிறது.
மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளின் இருப்பை இணையாகச் சரிபார்க்க மூன்று வெவ்வேறு வழிமுறைகள் மற்றும் உயிரித் தகவலியல் கருவிகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன: SplitsTree4 மென்பொருள், Gubbins (நியூக்ளியோடைடு வரிசைகளில் மறுசீரமைப்பு மூலம் பாரபட்சமற்ற பரம்பரை) குழாய்வழி, மற்றும் RDP4 (மறுசீரமைப்பு கண்டறிதல் நிரல், பதிப்பு பீட்டா 4.101) மென்பொருள்.
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 இல் செயல்படுத்தப்பட்ட பிளவு சிதைவு முறை, புள்ளிவிவர சரிபார்ப்புக்காக Phi சோதனையைப் பயன்படுத்தி, வேர் இல்லாத பைலோஜெனடிக் நெட்வொர்க்கைக் கணக்கிடப் பயன்படுகிறது, மேலும் முக்கியத்துவ வரம்பு p = 0.05 ஆகும். Parsnp இன் மைய பல-சீரமைப்பு பகுப்பாய்வு உள்ளீடாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் பிணைய தரநிலையாக பிளவு சிதைவு உணரப்படுகிறது.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-patogens/gubbins60 மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸில் மறுசீரமைப்பின் தாக்கத்தை மதிப்பிடுவதற்கான மற்றொரு வழியாக இயல்புநிலை அளவுருக்களுடன் இயங்குகிறது. பைப்லைனில் செயல்படுத்தப்பட்ட வழிமுறை தொடர்புடைய குளோன் பரம்பரையை மறுகட்டமைக்கிறது. எங்கள் தரவுத் தொகுப்பின் முழுமையான மரபணு/வரைவு அசெம்பிளி மற்றும் குறிப்பு மரபணு (bovine bovid AF2122/97, LT708304.1) பரஸ்பரம் உள்ளன; மேலும் மறுசீரமைப்பு நிகழ்வைக் குறிக்கும் SNP கிளஸ்டரைக் கண்டறிய மரத்தின் ஒவ்வொரு கிளையிலும் SNP இன் நிலையை ஸ்கேன் செய்யவும். கிளையின் பூஜ்ஜியம் மறுசீரமைப்பு நிகழ்வு இல்லை என்று வைத்துக்கொள்வோம், அதாவது கிளையில் நிகழும் SNPகள் சமமாக விநியோகிக்கப்பட வேண்டும். Parsnp இலிருந்து கோர் மல்டிபிள் சீரமைப்பு மற்றும் RAxML இலிருந்து சிறந்த மதிப்பெண் பெற்ற ML மரம் உள்ளீட்டு கோப்புகளாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
இறுதியாக, கபின்ஸ் பைப்லைன் பரிந்துரைத்த மறுசீரமைப்பு நிகழ்வை உறுதிப்படுத்த, RDP467 இல் செயல்படுத்தப்பட்ட ஆறு வழிமுறைகள் (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 மற்றும் SiScan66) இயல்புநிலை அமைப்புகளின் கீழ் Parsnp இன் மைய பல சீரமைப்புக்குப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. RDP4 இல் செயல்படுத்தப்பட்ட வழிமுறைகளில் குறைந்தது மூன்று ஒவ்வொரு மறுசீரமைப்பு நிகழ்வையும் சரிபார்க்க ஒரு முக்கியமான சமிக்ஞையை தொடர்ந்து நிரூபிக்க வேண்டும் என்று நாங்கள் தீர்மானித்தோம்.
Gubbins மற்றும் RDP மென்பொருள் இரண்டும் 500 bp வரையிலான ஒரு சாளரத்தில் மைய பல சீரமைப்புகளைச் சரிபார்ப்பதன் மூலம் மறுசீரமைப்பு சமிக்ஞைகளைத் தேடுகின்றன என்பதைக் கருத்தில் கொண்டு, மேலும் de novo அசெம்பிளியின் போது PE/PPE மரபணுக்களைச் சேர்ப்பது கண்டறியப்பட்ட மறுசீரமைப்பு சமிக்ஞைகளில் தலையிடாது என்பதை உறுதிசெய்து, ஹோமோலீனியாரிட்டி மூலம் மேலும் பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது. மறுசீரமைப்பு நிகழ்வை அடையாளம் காணும் மரபணுவின் அருகாமையைச் சரிபார்க்கவும். முழுமையான மரபணுவைப் பயன்படுத்தும் ஒத்திசைவு வரைபடம் உள்ளூர் மரபணு இடமாற்றங்கள் அல்லது தலைகீழ் மாற்றங்களைத் தவிர்ப்பதற்காக MAUVE-மல்டி-ஜீனோம் சீரமைப்பு (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ஐப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டது. கூடுதலாக, SyntTax வலை சேவையகம் (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) மூலம் அமினோ அமில வரிசையில் ஓரினச்சேர்க்கை பகுப்பாய்வைச் செய்ய முழு மரபணுவும் பயன்படுத்தப்பட்டது.
போர்த்துகீசிய மல்டி-ஹோஸ்ட் காசநோய் அமைப்பிலிருந்து பெறப்பட்ட மரபணு தரவுத் தொகுப்பின் ஆழமான பகுப்பாய்வு, இலக்கியத்தில் குறிப்பிடப்பட்டுள்ள மரபணுக்களின் பாலிமார்பிஸத்தை சரிபார்க்க வேண்டும். இந்த மரபணுக்கள் 37,38 மற்றும் HGT (DNA பழுதுபார்ப்பு, பிரதி மற்றும் மறுசீரமைப்பு) அமைப்பு கூறுகள் 39 மூலம் MTBC மூதாதையர்களால் பெறப்பட்ட மரபணு குறியாக்கம் 3R ஆகும். மரபணு பன்முகத்தன்மை மற்றும் நியூக்ளியோடைடு பன்முகத்தன்மை (π) மற்றும் தாஜிமாவின் D நடுநிலை சோதனை அளவுரு உள்ளீட்டைக் கணக்கிட ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) ஐப் பயன்படுத்தவும் மற்றும் DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) ஐப் பயன்படுத்தவும்.
69 மைக்கோபிளாஸ்மா போவிஸ் தனிமைப்படுத்தல்கள் மற்றும் குறிப்பு மரபணுக்களை அடிப்படையாகக் கொண்ட அதிகபட்ச நிகழ்தகவு (ML) பைலோஜெனடிக் மரம் பெறப்பட்டது (படம் 2A). ஒற்றை மரபணு அடிப்படையிலான மரங்கள் அல்லது மல்டி-லோகஸ் அடிப்படையிலான மரங்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​இந்த உத்தி முழு மரபணுவின் மாறுபாட்டையும் கைப்பற்றாத அதிக சக்திவாய்ந்த மரங்களை உருவாக்க அனுமதிக்கிறது, எனவே இனங்கள் 68,69 க்கு இடையில் பாகுபாடு காட்டும் குறைந்த திறனை வெளிப்படுத்துகிறது. ML மரத்தின் இடவியல் அமைப்பு பொதுவாக குளோன்களின் சிக்கலான வகைப்பாட்டுடன் ஒத்துப்போகிறது. Eu2 இன் மரபணு ஒரு கிளையில் தொகுக்கப்பட்டுள்ளது, மேலும் Af1 இன் மரபணுவும் ஒன்றாக தொகுக்கப்பட்டுள்ளது (படம் 2A). இதன் விளைவாக மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸின் அறியப்பட்ட பரிணாம உறவுடன் ஒத்துப்போகிறது, அதாவது, Eu1 உறுப்பினருக்கும் மற்ற அனைத்து குளோனல் வளாகங்கள் மற்றும் மரபணுக்களைக் கொண்ட குழுவிற்கும் இடையே ஒரு பெரிய வித்தியாசம் உள்ளது, ஆனால் குளோனல் வளாகம் 30 குறிப்பிடப்படவில்லை. குளோனல் வளாகத்திற்கும் பைலோஜெனடிக் மரத்தில் காணப்பட்ட உறவுக்கும் இடையிலான சிறிய முரண்பாடு, குளோனல் வளாகம் குறிப்பிட்ட மரபணு பகுதிகளின் அடிப்படையில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளது என்பதன் மூலம் விளக்கப்படலாம், அதே நேரத்தில் பைலோஜெனடிக் மரம் முழு மரபணுவையும் குறிக்கும் மைய மரபணுக்களின் பல சீரமைப்புகளை அடிப்படையாகக் கொண்டது.
மறுசீரமைப்பு தளத்தை (A) அகற்றுவதற்கு முன்பும் (B) அகற்றிய பின்னரும் மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் மரபணுவின் மைய மரபணு சீரமைப்பின் அடிப்படையில் அதிகபட்ச வாய்ப்புள்ள பைலோஜெனடிக் மரம் (GTR) கட்டமைக்கப்படுகிறது. கிளை நிறங்கள் மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் குளோன் வளாகத்தைக் குறிக்கின்றன: ஐரோப்பா 1 ஊதா, ஐரோப்பா 2 சிவப்பு, ஐரோப்பா 3 நீலம், ஆப்பிரிக்கா 1 ஆரஞ்சு, மற்றும் ஆப்பிரிக்கா 2 பச்சை. மரம் வேரூன்றி அளவுகோலுக்கு இழுக்கப்படுகிறது, மேலும் கிளை நீளம் ஒவ்வொரு தளத்திற்கும் மாற்றாக அளவிடப்படுகிறது.
மைக்கோபாக்டீரியம் காசநோய் வளாகம் குளோனலாக பரிணாமம் அடைந்ததாக விவரிக்கப்படுகிறது, மேலும் பல ஆண்டுகளாக திரட்டப்பட்ட பெரும்பாலான சான்றுகள், MTBC15,17,18 இன் கண்டறியக்கூடிய மட்டத்தில் நடந்துகொண்டிருக்கும் HGT மற்றும் மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகள் நிகழாது என்ற கருத்தை ஆதரிக்கின்றன.
முந்தைய படைப்புகள் MTBC விகாரங்களுக்கு இடையில் மட்டுப்படுத்தப்பட்ட மறுசீரமைப்பு இருக்கலாம் என்பதைக் காட்டுகின்றன20,21, மற்றவை அளவிடக்கூடிய மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளை அடையாளம் காணத் தவறிவிட்டன70,71. மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸை மையமாகக் கொண்டு இந்தப் பிரச்சினையை மீண்டும் விவாதிக்கவும், இது மைக்கோபாக்டீரியம் காசநோய் 70,71 ஐ மட்டுமே கருத்தில் கொண்ட முந்தைய படைப்பிலிருந்து வேறுபட்டது; அல்லது MTBC ஐ முழுவதுமாகக் கருதுங்கள், கிட்டத்தட்ட 20 ஐக் குறிக்கும் M. போவிஸ் இல்லை; அல்லது கட்டுப்படுத்தப்பட்ட கால்நடை பின்னங்களை மட்டுமே கருத்தில் கொள்ளுங்கள். மைக்கோபாக்டீரியா தரவுத்தொகுப்பில், இந்த படைப்பில், அனைத்து குளோனல் வளாகங்களையும் குறிக்கும் மொத்தம் 70 விகாரங்கள் உள்ளன, அவை மறுசீரமைப்பிற்காகத் திரையிடப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. தரவுத் தொகுப்பு நான்கு ஒட்டுமொத்த நிலைகளின்படி அளவிடப்படுகிறது: (1) Eu2 உறுப்பினர்கள், (2) அனைத்து ஐரோப்பிய குளோன் சிக்கலான உறுப்பினர்கள் (அதாவது ஐரோப்பா), (3) ஐரோப்பிய மற்றும் ஆப்பிரிக்க குளோன் சிக்கலான (Eu + Af) மற்றும் (4) முழு தரவு சேகரிப்புகள் (ஏற்கனவே விவரிக்கப்பட்டுள்ள எந்த குளோனிங் வளாகங்களிலும் சேர்க்கப்படாத மரபணுக்கள் உட்பட).
இந்தக் கருதுகோளை மேலும் ஆய்வு செய்ய, மரபணுக்களுக்கு இடையில் மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகள் இல்லாததை மதிப்பிடுவதற்கு ஒரு பிளவு-சிதைவு வலையமைப்பு செய்யப்பட்டது, ஏனெனில் இந்த முறை தனிநபர்களுக்கிடையேயான மூதாதையர் உறவைக் காட்சிப்படுத்தவும் முரண்பட்ட பைலோஜெனடிக் சமிக்ஞைகளைக் காட்டவும் முடியும். பகுப்பாய்வில் உள்ள நான்கு தரவுத் தொகுப்புகளும் வலையமைப்பில் சுழல்கள் இருப்பதை உறுதிப்படுத்தின (அதாவது, ஒற்றை மரமாக ஒன்றிணைக்காத பகுதிகள்), ஆனால் Phi சோதனைக்கு புள்ளிவிவர ஆதரவு இல்லை (Eu2, p = 0.0956; ஐரோப்பா, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; முழு தரவுத் தொகுப்பு p = 0.2451), இது மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளின் இருப்புக்கான மோசமான ஆதாரங்களை வழங்குகிறது (படம் 3A-D).
ஐரோப்பாவில் 2 மரபணுக்கள் (n = 37) (A), ஐரோப்பிய மரபணுக்கள் (n = 44) (B), ஐரோப்பிய மற்றும் ஆப்பிரிக்க மரபணுக்கள் (n = 51) (C) மற்றும் முழு தரவு தொகுப்பு (n = 70) (D).
இந்த பகுப்பாய்விற்குப் பிறகு, அனைத்து நெட்வொர்க்குகளிலும் உள்ள சுழற்சி அவதானிப்புகளைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொண்டு, குபின்ஸ் குழாய்வழியில் செயல்படுத்தப்பட்ட மறுசீரமைப்பு வழிமுறை, குளோனல் பரம்பரையை மறுகட்டமைக்கவும், எம். போவிஸ் மரபணுவில் மறுசீரமைப்பின் விளைவை மதிப்பிடுவதற்கு துணைபுரியவும் பயன்படுத்தப்பட்டது. மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளின் ஒட்டுமொத்த எண்ணிக்கையை ஊகிக்கவும், அவற்றில் பெரும்பாலானவை முனையக் கிளைகளில் (அதாவது, ஒரு மரபணுவில்) நிகழ்ந்தன (அட்டவணை 2). இந்த குறிகாட்டிகள் முழு தரவுத் தொகுப்பின் நிலைத்தன்மையைக் காட்டுகின்றன மற்றும் மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளின் அதிர்வெண் பிறழ்வுகளை விட 200 முதல் 300 மடங்கு அதிகமாக இருப்பதைக் குறிக்கிறது. கிளையில் மறுசீரமைப்பு மற்றும் புள்ளி பிறழ்வுகளின் ஒப்பீட்டு விகிதங்களைக் குறிக்கும் ரோ/தீட்டா அளவுரு 0.0037 மற்றும் 0.0056 க்கு இடையில் இருப்பதாகத் தோன்றியவுடன் (அட்டவணை 3). சமீபத்தில், 38 M. bovis திரிபு பற்றிய வெளியிடப்பட்ட படைப்பு, இந்தத் தரவுத்தொகுப்பில் பெறப்பட்டதை விட அதிக rho/theta மதிப்பை (rho/theta = 0.1) நிரூபித்தது, ஆனால் படானே மற்றும் சக ஊழியர்களின் பணி மறுசீரமைப்பு அளவுருக்களை ஊகிக்க குறிப்பு அடிப்படையிலான அசெம்பிளியைப் பயன்படுத்தியது. அசெம்பிளி நடைமுறை காரணமாக, ஒரு நடைமுறை விவரம், முனையக் கிளையில் உள்ள உத்தேச மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளின் மிகுதியுடன் தொடர்புடையது.
அடுத்து, r/m அளவுரு மறுசீரமைப்பு மற்றும் பிறழ்வு அறிமுகத்தின் பன்முகத்தன்மை விகிதத்தைக் குறிக்கிறது, மேலும் அதன் சராசரி மதிப்பு 0.025 மற்றும் 0.037 க்கு இடையில் உள்ளது, இது பிறழ்வுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​மறுசீரமைப்பு M. bovis இன் மரபணு பன்முகத்தன்மையில் குறைந்த ஒட்டுமொத்த தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது (அட்டவணை 3)). விரிவான ஒப்பீட்டிற்கு, 23 மரபணுக்களைக் கொண்ட MTBC தரவுத்தொகுப்பிற்கான r/m அளவுருவை மதிப்பிடுவதற்கு இதேபோன்ற முறை பயன்படுத்தப்பட்டது, இது 0.48620 சராசரி மதிப்பைக் காட்டுகிறது, அதே நேரத்தில் படானே மற்றும் சக ஊழியர்களின் 38 M. bovis தரவுத்தொகுப்பிற்கு, இது சராசரி மதிப்பு 0.98 என்பதை நிரூபித்தது. முதல் ஆய்வில், M. bovis (M. bovis BCG மற்றும் குறிப்பு திரிபு) இன் பணியில் சேர்க்கப்பட்டுள்ள 23 மரபணுக்களில் இரண்டு மட்டுமே, எனவே பெறப்பட்ட மதிப்பு M. காசநோய் மரபணுவின் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு காரணமாக சார்புடையதாக இருக்கலாம். இரண்டாவது அறிக்கையில், பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் மக்கள்தொகை முக்கியமாக அமெரிக்கா மற்றும் கால்நடை ஹோஸ்ட்களிடமிருந்து மீட்டெடுக்கப்பட்டது. இதற்கு நேர்மாறாக, எங்கள் தரவுத் தொகுப்பில், அதிகமான புவியியல் இருப்பிடங்கள் மற்றும் புரவலன் இனங்கள் குறிப்பிடப்படுகின்றன, மேலும் வெவ்வேறு மக்கள்தொகை மரபணு பண்புகளைக் கொண்ட வெவ்வேறு குளோனல் வளாகங்களாக தொகுக்கப்பட்ட மரபணுக்களும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, இதனால் ஆழமான மற்றும் பரந்த மக்கள்தொகை அறிவை அடைகிறது. எங்கள் தரவுத் தொகுப்பிலிருந்து பெறப்பட்ட வேறுபாடு r/m சராசரி மதிப்பு, ஒரே வகைபிரித்தல் இனங்களுக்கு ஒதுக்கப்பட்ட பரம்பரைகளுக்கு இடையில் மறுசீரமைப்பின் அளவு பெரிதும் மாறுபடும் என்ற கருத்துடன் ஒத்துப்போகிறது, எனவே இந்த முடிவுகள் M. bovis குளோன் வளாகம் மறுசீரமைப்பு வேறுபாடுகளைக் காட்டக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது. தாக்கம் Didelot & Maiden72 பரிந்துரைத்தபடி உள்ளது. இருப்பினும், அதிக எண்ணிக்கையிலான M. bovis மரபணுக்களைச் சேர்ப்பதன் மூலம் இந்தத் தரவுத் தொகுப்பை கணிசமாக விரிவுபடுத்துவது இந்தப் புள்ளியை மேலும் தெளிவுபடுத்த அனுமதிக்கும். r/m மற்றும் rho/theta அளவுருக்கள் இரண்டும் கிளைகளுக்கு இடையில் மாறுபாட்டைக் காட்டுகின்றன, மேலும் இந்த முடிவு மற்ற பாக்டீரியா இனங்கள்72,73 பற்றிய அறிக்கைகளுடன் ஒத்துப்போகிறது.
இறுதியாக, குபின்ஸ் குழாய்த்திட்டத்தால் அடையாளம் காணப்பட்ட மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளை உறுதிப்படுத்த, வெவ்வேறு மைய பல-ஒப்பீடுகளை சுயாதீனமாக சோதிக்க RDP4 மென்பொருளில் ஆறு வெவ்வேறு வழிமுறைகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. உலகளவில், குபின்ஸால் அடையாளம் காணப்பட்ட நிகழ்வுகளில் பாதிக்கும் குறைவானவை RDP4 ஆல் உறுதிப்படுத்தப்பட்டன (அட்டவணைகள் 4 மற்றும் 5). முழு தரவுத் தொகுப்பையும் கருத்தில் கொண்டு, மூன்று மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகள் உறுதிப்படுத்தப்பட்டன, இரண்டு உள் முனைகளை உள்ளடக்கியது மற்றும் மற்றொன்று ஒரு முனையக் கிளையில் ஒரு ஒற்றை மரபணுவை உள்ளடக்கியது, இதற்காக குளோனல் வளாகங்களை ஒதுக்க முடியவில்லை (அட்டவணைகள் 4 மற்றும் 5). முனையக் கிளைகளில் நிகழ்வுகளை அடையாளம் காண்பது, சமகால M. bovis விகாரங்களில் மறுசீரமைப்பு இன்னும் செயல்பாட்டில் உள்ளது அல்லது முடிவு தவறாக உள்ளது என்பதைக் குறிக்கலாம்70. இந்த அனுமான மறுசீரமைப்பு பகுதியில், தோராயமாக 20% நிலைகள் வரையறுக்கப்படாத நியூக்ளியோடைடுகளைக் கொண்டுள்ளன (N), இதனால் மறுசீரமைப்பு சமிக்ஞையை பாதிக்கிறது (துணை படம் 2). கூடுதலாக, இந்தப் பகுதி rrs மரபணுவைப் பாதிக்கிறது, 16S ரைபோசோமால் RNA ஐ குறியாக்குகிறது, இது மிகவும் பாதுகாக்கப்படும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது, எனவே இந்த உத்தேச மறுசீரமைப்பு சமிக்ஞை வரிசைமுறை பிழைகள் அல்லது தவறான சீரமைப்பின் விளைவாக இருக்கலாம். பின்னர் Mb0003 மற்றும் Mycobacterium bovis AF2122/97 க்கு இடையில் முழு மரபணு சீரமைப்பு செய்யப்பட்டது, மேலும் வரையறுக்கப்படாத நியூக்ளியோடைடுகள் மற்றும் SNP களின் இருப்பு உறுதிப்படுத்தப்பட்டது, எனவே தவறான சீரமைப்புடன் தொடர்புடைய சாத்தியமான சிக்கல்கள் இந்த வேலையில் செயல்படுத்தப்பட்ட உயிரியல் தகவல்களால் அல்ல. நிரலைக் கற்றுக்கொண்ட பிறகு தோன்றியது.
உள் முனைகளின் மறுசீரமைப்புப் பகுதிகளில் இடைவெளிகளோ அல்லது வரையறுக்கப்படாத நியூக்ளியோடைடுகளோ காணப்படவில்லை (படங்கள் 4 மற்றும் 5). இந்த நிகழ்வுகளைப் பொறுத்தவரை, ஒன்று Eu2 மரபணுவை மட்டுமே கொண்டுள்ளது மற்றும் pks12 மரபணுவைப் பாதிக்கிறது, இது சாத்தியமான பாலிகெடைட் சின்தேஸை குறியாக்குகிறது; மற்றொன்று Eu1 மரபணுவில் பதிவு செய்யப்பட்டுள்ளது மற்றும் சாத்தியமான நைட்ரேட் ரிடக்டேஸை குறியாக்கம் செய்யும் narX மரபணுவைப் பாதிக்கிறது (அட்டவணை 4). பொதுவாக, மறுசீரமைப்பு பகுப்பாய்வு புள்ளிவிவர ஆதரவுடன் குறைந்த எண்ணிக்கையிலான மறுசீரமைப்பு துண்டுகள் இருப்பதைக் காட்டுகிறது, மேலும் ஊகிக்கப்பட்ட குறிகாட்டிகள் மறுசீரமைப்பு M. bovis பரம்பரையில் குறைந்த தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. மறுசீரமைப்பு சமிக்ஞை குறைவாக இருக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது, ஆனால் பின்னணி இரைச்சலில் இருந்து உண்மையான பரிணாம சமிக்ஞையை வேறுபடுத்துவது முக்கியம், இது ஒரு சவாலான பணியாகும். குறிப்பு அடிப்படையிலான அசெம்பிளி மற்றும் பொருந்தாத சிக்கல்கள் 70, 71 மூலம் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட இரைச்சல் சமிக்ஞையைக் குறைப்பதற்காக, முழுமையான மரபணுவைத் தவிர மீதமுள்ள அனைத்தும் புதிதாக ஒன்று சேர்க்கப்பட்டன, மேலும் அசெம்பிளி தரம் QUAST பைப்லைன் பகுப்பாய்வு (துணை அட்டவணை 1) மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டு உறுதி செய்யப்பட்டது. கூடுதலாக, ஒட்டுமொத்த கணக்கெடுப்பின் வலிமை மற்றும் துல்லியத்தை வழங்க தொடர்ச்சியான துணை பகுப்பாய்வுகள் நடத்தப்பட்டன. எனவே, மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் AF2122/97 க்கு எதிராக ரீட் மேப்பிங் மூலம் narX மற்றும் pks12 மரபணுக்களின் வரிசைமுறை தரம் மதிப்பிடப்பட்டது. முறை பிரிவில் குறிப்பிடப்பட்டுள்ள அளவுகோல்களைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் மறுசீரமைப்பு பகுதியில் பரிந்துரைக்கப்பட்ட SNP நிலை உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (குறைந்தது 20 அளவீடுகள் மற்றும் 0.9 மாற்ற அதிர்வெண்). narX மரபணுவின் பாலிமார்பிசம் இரண்டு மரபணுக்களிலும் (Mb1792361 மற்றும் Mb7240415; 2.3%) மற்றும் pks12 மரபணுவின் மரபணுக்களிலும் முழுமையாக உறுதிப்படுத்தப்பட்டது: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, மற்றும் Mb12 மரபணுக்கள். இருப்பினும், Mb2043 மரபணுவிற்கு, எட்டு நிலைகளில் ஆறு நிலைகள் வாசிப்பு ஆழ அளவுகோலை பூர்த்தி செய்யவில்லை, ஏனெனில் SNP அதிகபட்சமாக 17 வாசிப்புகளால் ஆதரிக்கப்படுகிறது, இது நிறுவப்பட்ட கட்ஆஃப் மதிப்பு 20 ஐ விடக் குறைவாக உள்ளது. எனவே, இந்த மரபணு தளத்தில் ஆறு மரபணுக்களின் (8.6%) மறுசீரமைப்பை உறுதிப்படுத்த முடியும் (படங்கள் 4 மற்றும் 5).
மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் தரவுத்தொகுப்பின் மறுசீரமைப்பு பகுதி சீரமைப்பின் விரிவான காட்சிப்படுத்தல், சாத்தியமான நைட்ரேட் ரிடக்டேஸை குறியாக்கம் செய்யும் நார்எக்ஸ் மரபணுவைப் பாதிக்கிறது. உள் முனைகளின் மறுசீரமைப்பு பகுதியில் எந்த இடைவெளிகளோ அல்லது வரையறுக்கப்படாத நியூக்ளியோடைடுகளோ காணப்படவில்லை. இந்த குறிப்பிட்ட நிகழ்வு Eu1 மரபணுவில் பதிவு செய்யப்பட்டுள்ளது. மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் AF2122/97 இன் வாசிப்புகளை வரைவதன் மூலம் நார்எக்ஸ் மரபணுவின் வரிசைமுறை தரம் மதிப்பிடப்பட்டது. முறைப் பிரிவில் குறிப்பிடப்பட்டுள்ள அளவுகோல்களைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் மறுசீரமைப்பு பகுதியில் பரிந்துரைக்கப்பட்ட SNP இருப்பிடத்தை உறுதிப்படுத்தவும் (குறைந்தது 20 வாசிப்புகள் மற்றும் 0.9 மாற்ற அதிர்வெண்). நார்எக்ஸ் மரபணுவின் பாலிமார்பிசம் Mb1792361 மற்றும் Mb7240415 (2.3%) மரபணுக்களில் முழுமையாக உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.
pks12 மரபணுவைப் பாதிக்கும் மைக்கோபிளாஸ்மா போவிஸ் தரவுத்தொகுப்பின் மறுசீரமைப்பு பகுதி சீரமைப்பின் விரிவான காட்சிப்படுத்தல். உள் முனைகளின் மறுசீரமைப்பு பகுதியில் இடைவெளிகள் அல்லது வரையறுக்கப்படாத நியூக்ளியோடைடுகள் எதுவும் காணப்படவில்லை. சாத்தியமான பாலிகெடைட் சின்தேஸை குறியாக்கம் செய்யும் pks12 மரபணுவைப் பாதிக்கும் நிகழ்வைப் பொறுத்தவரை, அது Eu2 மரபணுவை மட்டுமே கொண்டுள்ளது. மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸ் AF2122/97 இன் வாசிப்பு மேப்பிங் மூலம் pks12 இன் வரிசைமுறை தரம் மதிப்பிடப்பட்டது. முறைப் பிரிவில் குறிப்பிடப்பட்டுள்ள அளவுகோல்களைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் மறுசீரமைப்பு பகுதியில் பரிந்துரைக்கப்பட்ட SNP இருப்பிடத்தை உறுதிப்படுத்தவும் (குறைந்தது 20 அளவீடுகள் மற்றும் 0.9 மாற்ற அதிர்வெண்). Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, மற்றும் Mb1960 மரபணுக்களின் பாலிமார்பிஸங்கள் முழுமையாக உறுதிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன.
PE மற்றும் PPE மரபணுக்கள் இல்லுமினா வரிசைமுறை மற்றும் தவறான வரைபடத்தால் எளிதில் தவறாகப் படிக்கக்கூடிய மீண்டும் மீண்டும் நிகழும் பகுதிகளைக் கொண்டுள்ளன, எனவே அவை பொதுவாக M. காசநோய் உறுப்பினர்களின் பயோஇன்ஃபர்மேடிக்ஸ் பணிப்பாய்விலிருந்து மேப்பிங்-டு-சீக்வென்ஸ் உத்தியைப் பயன்படுத்தும் போது மட்டுமே நீக்கப்படும். இந்த வேலையில் பயன்படுத்தப்படும் மறுசீரமைப்பு நிகழ்வுகளின் அனுமானம் PE/PPE ஐ வடிகட்டாமல் de novo அசெம்பிளியை அடிப்படையாகக் கொண்டது. SplitsTree, Gubbins pipeline மற்றும் RDP4 மென்பொருள் மூலம் மூன்று வெவ்வேறு நிரப்பு முறைகள் மற்றும் வழிமுறைகளை செயல்படுத்துவதன் மூலம், பயன்படுத்தப்படும் உத்திகள் பிழை சமிக்ஞைகளால் ஏற்படும் மறுசீரமைக்கப்பட்ட பகுதிகளை செயலாக்குவதற்கும் வடிகட்டுவதற்கும் வலுவானவை என்று நாங்கள் நம்புகிறோம். இருப்பினும், SNP கிளஸ்டர்களை அடையாளம் காண Gubbins மற்றும் RDP4 மென்பொருளில் PE/PPE மரபணுவின் குறுக்கீட்டை விலக்குவதற்காகவும், எனவே narX மற்றும் pks12 மரபணுக்களை பாதிக்க முன்மொழியப்பட்ட மறுசீரமைப்பு பகுதிகளை அடையாளம் காணவும், இந்த மரபணுக்களின் சுற்றுப்புறம் ஆராயப்பட்டது (துணை படம். 3–5). M. bovis AF2122/97 இல், narX மரபணு narK2 மற்றும் Mb1764c ஆல் பிரிக்கப்பட்டுள்ளது, அதே நேரத்தில் pks12 Mb2075c e Mb2073c ஆல் சூழப்பட்டுள்ளது (துணை படம் 3-5). முழுமையான மரபணுவின் MAUVE ஒத்திசைவு வரைபடத்தைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்ட வரைபடம் மரபணு வரிசை பாதுகாப்பு மற்றும் மறுசீரமைப்பு பற்றிய தகவல்களை வழங்குகிறது, இது நான்கு கோலினியர் தொகுதிகளைக் காட்டுகிறது, மேலும் மரபணு இடமாற்றம் அல்லது தலைகீழ் மாற்றத்திற்கான அறிகுறிகள் எதுவும் இல்லை. கூடுதலாக, அமினோ அமில வரிசையுடன் நிரப்புதல் பகுப்பாய்வு அனைத்து முழுமையான மரபணுக்களிலும் ஹோமோலஜியை நிரூபித்தது, மேலும் narX அல்லது pks12 இன் அருகிலுள்ள பகுதிகளில் PE/PPE எதுவும் காணப்படவில்லை. narX க்கு, ஒரு மரபணு (Mb0030) குறைந்த ஒத்த மதிப்பெண்ணைக் கொண்டுள்ளது, ஏனெனில் narX மரபணு இரண்டு துண்டுகளாக அடையாளம் காணப்பட்டது (துண்டுகள் 1891 மற்றும் 1890). pks12-க்கு, ஒற்றுமைகள் காரணமாக, Mb0030 மற்றும் Mb003 குறைந்த ஒத்திசைவு மதிப்பெண்களைக் காட்டின, அதே நேரத்தில் pks12 முறையே இரண்டு மற்றும் மூன்று துண்டுகளாக அடையாளம் காணப்பட்டது, அவை புரதத்தின் வெவ்வேறு களங்களைக் குறிக்கின்றன (துணை படம் 3-5). இந்தத் தகவலைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொண்டு, Gubbins மற்றும் RDP4 மென்பொருள் இரண்டும் பகுப்பாய்வு செய்து, சாளரத்தில் அதிகபட்சம் 500 bp இன் மைய பல சீரமைப்பைச் சரிபார்த்து, PE/PPE மரபணு narX மற்றும் pks12-ஐ பாதிக்கும் மறுசீரமைப்பு சமிக்ஞையில் தலையிடாது என்பதை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம்.
இந்தத் தரவுத் தொகுப்பில் கண்டறியப்பட்ட மறுசீரமைப்பு சமிக்ஞைகள் எஞ்சியதாகக் கருதப்பட்டாலும், எம். போவிஸில் மறுசீரமைப்பை நிராகரிக்க முடியாது என்பது உண்மைதான், எனவே இது மேலும் பகுப்பாய்வின் பொருளாகத் தொடர வேண்டும், இதில் வெவ்வேறு தொற்றுநோயியல் சூழ்நிலைகளிலிருந்து முழு மரபணுக்களும் முக்கியமானவை என வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன.
மறுசீரமைப்பு திருத்தத்திற்கு முன்னும் பின்னும் பெறப்பட்ட ML பைலோஜெனடிக் மரங்களை ஒப்பிடுவது (படம் 2A, B) ஊகிக்கப்பட்ட பைலோஜெனடிக் உறவில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களுக்கு வழிவகுக்கவில்லை, மேலும் M. போவிஸ் விகாரங்கள் ஒரே குழுவில் கொத்தாக இருந்தன.
M. bovis AF2122/97 இன் குறிப்பு மரபணுவுடன் 42 புதிதாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட M. bovis வாசிப்புகளை வரைபடமாக்கிய பிறகு, 1816 பாலிமார்பிக் நிலைகளைக் கொண்ட ஒரு SNP சீரமைப்பு பெறப்பட்டது. பெரும்பாலான SNPகள் (87.1%) குறியீட்டு பகுதியில் அமைந்துள்ளன, மேலும் பாதிக்கப்பட்ட மரபணுக்கள் Bovilist இல் காட்டப்பட்டுள்ள செயல்பாட்டு வகைகளின்படி வகைப்படுத்தப்படுகின்றன (படம் 6A, B). ஒவ்வொரு செயல்பாட்டு வகையிலும் உள்ள மொத்த மரபணுக்களின் எண்ணிக்கையைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொண்டால், "லிப்பிட் வளர்சிதை மாற்றம்" பிரிவில் உள்ள மரபணுக்கள் அதிக SNPகளைக் காட்டின, அதைத் தொடர்ந்து "செல் சுவர் மற்றும் செல் செயல்முறைகள்" மற்றும் "இடைநிலை வளர்சிதை மாற்றம் மற்றும் சுவாசம்" ஆகியவை M. bovis பரிணாம வளர்ச்சியில் இருப்பதை வெளிப்படுத்தின.
போர்ச்சுகலில் இருந்து எம். போவிஸ் தரவுத்தொகுப்பின் படிநிலை பகுப்பாய்வு (n = 42). ஒவ்வொரு செயல்பாட்டு வகைக்கும் (A) பதிவுசெய்யப்பட்ட SNPகள் மற்றும் பாதிக்கப்பட்ட மரபணுக்களின் மொத்த எண்ணிக்கை. செயல்பாட்டு வகை (B) மூலம் பதிவுசெய்யப்பட்ட ஒத்த மற்றும் ஒத்த அல்லாத மாற்றங்களின் மொத்த எண்ணிக்கை.
உலகளாவிய அளவில், சராசரி dN/dS விகிதம் 1.5 ஐ விட சிறப்பாக உள்ளது, இது உலகளாவிய பரிணாம அழுத்தம் மூதாதையர் நிலையிலிருந்து விடுபடுவதாகும் என்பதைக் குறிக்கிறது மற்றும் இது ஒரு நேர்மறையான (பன்முகப்படுத்தப்பட்ட அல்லது இயக்கப்பட்ட) மற்றும்/அல்லது தளர்வான சுத்திகரிப்பு தேர்வு சூழ்நிலையைக் குறிக்கிறது. "வைரஸ், நச்சு நீக்கம், தழுவல்", "செருகும் வரிசைகள் மற்றும் பேஜ்கள்" மற்றும் "ஒழுங்குமுறை புரதங்கள்" ஆகிய வகைகளில், மூன்றில் இரண்டு பங்குக்கும் மேற்பட்ட SNPகள் ஒத்த சொற்கள் அல்ல (படம் 6B).
அனைத்து வகைகளிலும், பல SNP-களைக் கொண்ட மரபணுக்கள் உள்ளன, இதன் விளைவாக சராசரி பிறழ்வு விகிதம் (அதாவது, ஒரு மரபணுவிற்கு சராசரி SNP) 1 ஐ விட அதிகமாக உள்ளது (படம் 6A). 15 SNP-களைக் கொண்ட Pks12 (Mb2074c) மற்றும் 8 SNP-களைக் கொண்ட fas (Mb2553c) ஆகியவை அதிக பிறழ்வு மதிப்புகளைக் கொண்டுள்ளன. இந்த இரண்டு மரபணுக்களும் கொழுப்பு அமில வளர்சிதை மாற்றத்தில் ஈடுபட்டுள்ளன. pks மரபணு பாலிகெடைட் சின்தேஸை (PKS) குறியீடாக்குகிறது, இது மைக்கோபாக்டீரியல் செல் சுவர் லிப்பிட் உயிரியக்கத் தொகுப்பில் ஈடுபட்டுள்ள ஒரு மல்டிஃபங்க்ஸ்னல் நொதியாகும்74,75. இந்த மரபணு மைக்கோகெடைடுகளின் தொகுப்பில் ஈடுபட்டுள்ள ஒரு மல்டிஃபங்க்ஸ்னல் பாலிபெப்டைடை குறியீடாக்குகிறது74,76. ஃபாஸ் மரபணு மைக்கோலிக் அமிலத்தின் தொகுப்பில் ஈடுபட்டுள்ளது. இந்த இரண்டு மரபணுக்களும் ஹோஸ்டுடன் தொடர்பில் உள்ள செல் சுவரின் உயிரியக்கத் தொகுப்பில் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன.
மைக்கோபாக்டீரியம் போவிஸின் பரிணாம வளர்ச்சியை மேலும் ஆய்வு செய்வதற்காக, குறிப்பிட்ட மரபணுக்களின் இரண்டு தொகுப்புகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. வரிசை அமைப்பு மற்றும் பைலோஜெனடிக் முறைகளைப் பயன்படுத்தி முன்னர் வெளியிடப்பட்ட படைப்புகள், பல்வகைப்படுத்தலுக்கு முன் MTBC மூதாதையர்களால் HGT மூலம் பெறப்பட்ட மரபணுக்களை அடையாளம் கண்டன37,38. இந்த மரபணுக்கள் துணை அட்டவணை 2 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. HGT உடன் தொடர்புடையதாக இருக்கக்கூடிய மொத்தம் 77 மரபணுக்களின் SNP விநியோகம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, மேலும் 26 பாலிமார்பிக் தளங்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன, இதன் விளைவாக பெரும்பாலான சந்தர்ப்பங்களில் (78%) ஒத்த சொற்கள் அல்லாத (NS) மாற்றங்கள் ஏற்பட்டன (துணை அட்டவணை 2). MTBC மரபணுவின் முந்தைய வேலை, HGT பகுதி மற்ற மரபணுக்களுடன் ஒப்பிடும்போது அதிக NS SNP விகிதத்தைக் காட்டுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது. இந்த மறுசீரமைப்பு பகுதிகள் MTBC மூதாதையர்களால் பெறப்பட்டவை என்று ஒருவர் நினைத்தால், அவை பண்டைய பாலிமார்பிஸங்களை அதிகமாக பிரதிநிதித்துவப்படுத்துகின்றன, பின்னர் ஒத்த மாற்றங்களின் விகிதம் அதிகமாக இருக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது, ஏனெனில் அமினோ அமில மாற்றங்கள் காரணமாக NS மாற்றீடுகள் எதிர்மறைத் தேர்வால் அகற்றப்படும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது. புரதத்தின் செயல்பாட்டை மாற்றலாம். ஆகையால், செயல்பாட்டு விளைவுகள் HGT போன்ற மரபணுக்களை மாற்றுவதன் மூலம் உருவாகக்கூடும் என்பதை எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடுகின்றன, இது மதிப்புமிக்க தகவமைப்பு மரபணு பன்முகத்தன்மைக்கு அவற்றின் முக்கியத்துவத்தை பிரதிபலிக்கிறது.
இந்த பகுப்பாய்விற்கு இணையாக, 3R (DNA பழுதுபார்ப்பு, பிரதி எடுத்தல் மற்றும் மறுசீரமைப்பு) அமைப்பின் கூறுகளை குறியாக்கம் செய்யும் மரபணுக்கள், dos Vultos மற்றும் collaborators (2008) ஆல் முன்னர் வெளியிடப்பட்ட பட்டியலின்படி முழுமையாக ஆராயப்பட்டன. ஒரே மாதிரியான DNA துண்டுகளின் பரிமாற்றத்தை நேரடியாகக் கவனிக்க முடியாது, இருப்பினும் இந்த தரவுத் தொகுப்பைப் போலவே, நெருங்கிய தொடர்புடைய பாக்டீரியாக்கள் ஈடுபடும்போது இது அடிக்கடி நிகழும் செயல்முறையாக இருக்கலாம்; கூடுதலாக, இந்த செயல்முறை DNA பழுதுபார்க்கும் முறைகளுக்கு முக்கியமாக இருக்கலாம்72, எனவே ஹோமோலோகஸ் மறுசீரமைப்பில் பங்கு வகிக்கவும். 54 மரபணுக்களால் விநியோகிக்கப்பட்ட மொத்தம் 26 பாலிமார்பிக் நிலைகள் அடையாளம் காணப்பட்டன (துணை அட்டவணை 3). இந்த மரபணுக்களின் தொகுப்பில், NS மாற்றங்கள் சுமார் 65% விளைவுகளுக்குக் காரணமாக இருந்தன, இது மைக்கோபாக்டீரியம் காசநோய் விகாரங்கள் குறித்த முந்தைய அறிக்கைகளுடன் ஒத்துப்போகிறது.