Terima kasih telah mengunjungi Nature. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan versi peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Di saat yang sama, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Pengurutan genom telah merevitalisasi bidang penelitian penyakit menular, mengungkap epidemiologi penyakit, patogenesis, interaksi inang-patogen, dan proses evolusi yang dibebankan pada patogen. Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) menganggap Mycobacterium bovis sebagai salah satu anggota adaptif hewan yang menyebabkan tuberkulosis (TB) pada mamalia darat, dan merupakan model khas evolusi bakteri. Seperti anggota MTBC lainnya, Mycobacterium bovis diasumsikan sebagai patogen kloning ketat, berevolusi lambat, dan jelas tidak ada tanda-tanda rekombinasi atau transfer gen horizontal. Dalam karya ini, kami menerapkan genomika komparatif pada dataset urutan genom utuh (WGS) yang terdiri dari 70 M. sapi dari silsilah yang berbeda (Eropa dan Afrika) untuk mendapatkan wawasan tentang keragaman genetik M. sapi. Kekuatan evolusi. Tiga metode berbeda digunakan untuk memperkirakan tanda-tanda reorganisasi. Secara global, sejumlah kecil peristiwa rekombinasi telah diidentifikasi dan dikonfirmasi oleh dua metode independen dengan dukungan yang kuat. Namun demikian, dibandingkan dengan mutasi, rekombinasi memiliki efek yang lebih lemah pada keragaman M. bovis (r/m keseluruhan = 0,037). Perbedaan rata-rata r/m yang diperoleh dalam kompleks klonal Mycobacterium bovis dalam set data kami konsisten dengan konsep umum bahwa derajat rekombinasi dapat sangat bervariasi antara garis keturunan yang ditugaskan pada spesies taksonomi yang sama. Berdasarkan pekerjaan ini, rekombinasi dalam Mycobacterium bovis tidak dapat dikesampingkan, sehingga harus menjadi subjek upaya lebih lanjut dalam penelitian genomika komparatif di masa depan, di mana WGS dari set data besar dari berbagai skenario epidemiologi di seluruh dunia sangat penting. Analisis tambahan kemudian dilakukan pada set data Mycobacterium bovis yang lebih kecil (n = 42) dari prevalensi TB multi-host, dan lebih dari 1.800 lokus diidentifikasi, yang setidaknya satu strain menunjukkan polimorfisme nukleotida tunggal (SNP). Sebagian besar (87,1%) terletak di wilayah pengkode, dan rasio global perubahan non-sinonim (dN/dS) dari perubahan sinonim melebihi 1,5, menunjukkan bahwa seleksi positif merupakan kekuatan evolusi penting yang diberikan pada M. bovis. Proporsi SNP yang lebih tinggi terdeteksi pada gen yang kaya akan kategori fungsional "metabolisme lipid", "dinding sel dan proses seluler", serta "metabolisme intermediet dan respirasi", yang menunjukkan pentingnya potensi mereka dalam biologi dan evolusi Mycobacterium bovis. Pengamatan lebih dekat pada gen-gen pada nenek moyang MTBC yang rentan terhadap transfer gen horizontal dan termasuk dalam sistem 3R (perbaikan DNA, replikasi, dan rekombinasi) mengungkapkan nilai negatif rata-rata global dari uji netral D Taijima, yang menunjukkan pemindaian selektif sebelumnya. Hambatan baru-baru ini setelah ekspansi populasi masih menjadi faktor pendorong evolusi utama bagi patogen wajib Mycobacterium bovis untuk melawan inangnya.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) adalah salah satu taksa patogen bakteri yang paling berhasil dan merupakan kasus khas evolusi bakteri. Anggotanya menunjukkan identitas nukleotida yang sangat tinggi pada tingkat genom (>99%)1,2. Berbagai ekotipe MTBC dapat menyebabkan tuberkulosis (TB), yang merupakan penyakit granulomatosa menular, pada berbagai spesies inang, mulai dari mamalia mikro hingga manusia3,4,5. Saat ini, kompleks tersebut mencakup manusia [M. tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] dan patogen yang beradaptasi dengan hewan (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, Bacillus chimpanzee, dan Dassie)5,6. M. canettii (juga dikenal sebagai "Nodobacter glabrata") Identitas nukleotida rata-rata dengan mikobakteri yang disebutkan di atas adalah 98%, dan pekerjaan genomik komparatif telah menunjukkan bahwa M. canettii dan MTBC lainnya baru-baru ini menyimpang dari nenek moyang yang sama.7 Mempertimbangkan konsep ini, beberapa penulis menyebut M. canettii Anggota MTBC 8.
MTBC secara sistematis dideskripsikan sebagai kompleks klonal ketat, dan struktur populasinya jelas diatur oleh keragaman yang berkurang, kemacetan, pemindaian selektif, dan pergeseran genetik9,10. Dengan asumsi evolusi klonal ketat yang kompleks, seperti polimorfisme yang hilang, tidak dapat dipulihkan melalui rekombinasi. Berdasarkan premis ini, peristiwa berurutan delesi genomik daerah diferensial (RD) dan TbD1 (daerah delesi spesifik Mtb 1) telah diusulkan sebagai penanda molekuler evolusi MTBC2,5,11. Penelitian genomik komparatif dan pengurutan genom utuh (WGS) mendukung pembagian anggota yang beradaptasi dengan manusia menjadi sembilan garis keturunan (Mycobacterium tuberculosis L1 hingga L4, L7, dan L8; dan Mycobacterium africanum L5, L6, dan L9), garis keturunan L2 hingga L4 berbagi daerah delesi TbD12,11,12,13. Selain itu, anggota yang beradaptasi dengan hewan diusulkan untuk berbagi nenek moyang yang sama, yang didefinisikan oleh penghapusan spesifik klade pada RD7, RD8, RD9 dan RD102, 5, dan 14.
Transfer gen horizontal (HGT) dan peristiwa rekombinasi dianggap langka dan terjadi pada nenek moyang MTBC, alih-alih pada sejarah yang berbeda dari seluruh anggota MTBC15,16,17. Dua laporan awal oleh Hughes dkk. (2002) dan Gutacker dkk. (2006) menunjukkan bahwa peristiwa rekombinasi dapat membantu membentuk polimorfisme yang menandai lokus spesifik pada galur M. tuberculosis18,19. Alasan kurangnya rekombinasi yang jelas pada MTBC adalah: (1) proses mekanis dan hilangnya kemampuan HGT; (2) kelangkaan peristiwa HGT; (3) tidak ada kemungkinan peristiwa rekombinasi pada niche MTBC14,17. Baru-baru ini, beberapa studi pengurutan genom lengkap (WGS) yang diterapkan pada galur MTBC 20 dan Mycobacterium bovis 21 telah memberikan bukti rekombinasi, yang pertama menunjukkan bahwa galur MTBC sering kali bertukar fragmen DNA kecil, tetapi karena variasi urutan nukleotida yang terbatas, peristiwa ini masih belum diperhatikan.
Mycobacterium bovis adalah anggota MTBC yang paling umum ditemukan dari ternak (terutama sapi), meskipun juga dapat diisolasi dari hewan liar yang digembalakan dan dipagari4,22,23,24. M. bovis berevolusi menjadi lima kompleks klonal utama [Eropa 1 (Eu1), Eropa 2 (Eu2), Eropa 3 (Eu3), Afrika 1 (Af1), dan Afrika 2 (Af2)], berdasarkan profil spoligotyping, delesi spesifik, dan polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 pada gen spesifik. Kompleks klonal ini menunjukkan keragaman struktur populasi Mycobacterium bovis dan hubungannya dengan wilayah geografis. Selain itu, penelitian WGS terbaru yang dilakukan oleh Zimpel dan kolaboratornya (2020) merancang filogeni berdasarkan SNP Mycobacterium bovis, dengan lebih dari 1.900 genom, yang menunjukkan bahwa setidaknya terdapat empat garis keturunan yang berbeda (bernama Lb1 hingga Lb1 hingga Lb4). Garis-garis tersebut tidak sepenuhnya konsisten dengan kompleks klonal yang telah didefinisikan sebelumnya, meskipun spesifisitas geografis juga dapat dikonfirmasi30. Para penulis ini melakukan analisis diferensial filogeni dan penanggalan molekuler, tetapi tidak mempelajari rekombinasi30.
Penelitian sebelumnya yang menggunakan berbagai teknik molekuler, seperti spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), dan pengetikan SNP terbaru menunjukkan tingkat keragaman genetik tertentu di antara galur M. bovis 31,32,33,34,35. Diferensiasi variasi genetik telah menjadi alat penting dalam studi epidemiologi penyakit, yang bermanfaat untuk pemahaman mendalam tentang patogenesis, virulensi, dan penularan penyakit. Kemunculan metode WGS memberikan kemungkinan untuk mengungkap faktor pendorong evolusioner yang dipengaruhi oleh genom Mycobacterium bovis dalam proses adaptasi dan persistensi terhadap berbagai inang dan skenario epidemiologi.
Dalam karya ini, kami menggunakan analisis genomik komparatif pada berbagai set data Mycoplasma bovis (n=70), termasuk isolat dari berbagai kompleks klonal, untuk memperoleh wawasan tentang proses evolusi Mycoplasma bovis, terutama untuk menyelesaikan hubungan filogenetik dan peristiwa rekombinasi. Sebagai suplemen untuk analisis ini, sub-set data isolat M. bovis (n = 42) yang diperoleh dari area tuberkulosis multi-inang yang berkarakterisasi dengan baik di Portugal 31,36 dieksplorasi lebih lanjut untuk menyimpulkan non-identitas Keseimbangan antara rasio relatif substitusi nukleotida sense (dN) terhadap sinonim (dS), serta kontribusi evolusi genom spesifik yang disebutkan dalam literatur, mereka 37,38 diperoleh oleh nenek moyang MTBC melalui HGT, dan mengkode komponen gen sistem 3R (perbaikan DNA, replikasi, dan rekombinasi) 39. Pilih gen yang diperoleh melalui HGT karena mereka dapat mewakili polimorfisme kuno, sehingga diharapkan bahwa mereka mungkin mengandung proporsi perubahan sinonim yang lebih tinggi. Gen yang termasuk dalam sistem 3R dipilih karena pekerjaan sebelumnya pada strain M. tuberculosis menunjukkan seleksi negatif/pemurnian umum yang bekerja pada gen-gen ini, dan mereka dapat memainkan peran penting dalam evolusi 39. Tujuan lain dari pekerjaan ini adalah untuk menyimpulkan keberadaan peristiwa reorganisasi. Oleh karena itu, mengingat bahwa kumpulan data kami dari Portugal hanya berisi genom kompleks klon Eropa 2 dan galur yang belum menetapkan kompleks klon, kami memutuskan untuk menyertakan data genom yang tersedia untuk umum agar akhirnya memperoleh perwakilan dari semua kompleks klon, dan meningkatkan ketahanan dan keluasan hasil.
42 genom Mycoplasma bovis yang baru diurutkan dari lokasi tuberkulosis multi-inang endemik Portugal (detail di bawah), yang sebelumnya dikarakterisasi dari perspektif epidemiologi36, menjadi pusat penelitian ini. Mengingat bahwa set data dari Portugal hanya memiliki perwakilan dari kompleks klon Eropa 2 dan galur tanpa kompleks yang ditentukan, data sekuensing genom utuh yang tersedia untuk umum telah ditambahkan untuk memperluas set data yang mencakup semua perwakilan dari kompleks klon M. bovis. Oleh karena itu, tiga sumber data sekuensing genom utuh digunakan dalam penelitian ini: perakitan genom lengkap/draf, hingga 10 perancah yang disimpan di NCBI (Pusat Informasi Bioteknologi Nasional) (n = 15 isolat); disimpan dalam SRA (file fastq Illumina dari arsip pembacaan sekuens) yang mewakili keragaman kompleks klon M. bovis (n = 12 isolat)30; dan 42 genom yang baru diurutkan dari Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) tidak dimasukkan dalam pencarian NCBI. M. bovis AF2122/97 biasanya digunakan sebagai genom referensi untuk dimasukkan ke dalam set data. Karena tidak tersedianya seluruh urutan genom yang diwakili oleh kompleks kloning African 1 untuk umum, dan sedikitnya jumlah genom dari galur representatif Af2 dan Eu1, data sekuensing asli yang disediakan oleh SRA digunakan dalam kasus ini. Penelitian Zimpel dan kolaboratornya (2020) membantu mengidentifikasi genom dari kompleks kloning yang disebutkan di atas dan membantu memilih Mycobacterium bovis untuk dimasukkan ke dalam set data. Untuk Eu3, hanya satu jenis genom yang dideskripsikan (Branger dkk., 2020), sehingga genom yang kami sertakan merupakan representasi terpisah dari kompleks Eu3.
Secara global, set data ini mencakup 70 M. bovis sapi yang diisolasi dari 8 spesies inang, tersebar di 12 negara dari tahun 1985 hingga 2016. 36 spesies diklasifikasikan sebagai Eu2, 7 spesies sebagai Eu1, 1 spesies sebagai Eu3, 3 spesies sebagai Af1, 4 spesies sebagai Af2, dan 19 spesies tidak terkait dengan kompleks klonal mana pun (detail di bawah). Informasi detail (termasuk nomor aksesi) Mycobacterium bovis yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada Tabel 1 dan Tabel Tambahan 1.
42 genom utuh Mycobacterium bovis yang baru diurutkan dari hotspot tuberkulosis hewan di Portugal dan didistribusikan selama lebih dari 12 tahun menjadi pusat studi ini, karena sistem penyakit satwa liar-ternak yang potensial telah dipantau secara berkala 31,36 (Gambar Tambahan 1). Menurut prosedur selanjutnya, strain ini diisolasi dari sapi (n = 14), rusa merah (n = 16) dan babi hutan (n = 12) dari tahun 2003 hingga 2015: kumpulkan dan tangani hewan sesuai dengan pedoman protokol yang direkomendasikan Sampel jaringan ada di Buku Pegangan Hewan Terestrial OIE dan diinokulasi pada media padat piruvat Stonebrink dan Löwenstein-Jensen serta media cair. Kultur diinkubasi pada suhu 37 °C dan pertumbuhannya diperiksa seminggu sekali selama minimal 12 minggu. Koloni disimpan langsung dalam larutan gliserol pada suhu -80ºC. Dalam medium selektif Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), sampel asli yang diarsipkan dilewatkan melalui satu jalur in vitro untuk mendapatkan DNA program WGS. Untuk tujuan ini, larutan stok kultur beku diperkaya dengan 5% natrium piruvat dan 10% ADS (50 g albumin, 20 g glukosa, 8,5 g natrium klorida dalam 1 L air) pada Middlebrook 7H9 pada suhu 37°C Retrain. Setelah 4 minggu pertumbuhan, medium diperbarui dan kultur dipantau secara berkala hingga pertumbuhan diamati. Sel dipanen dengan sentrifugasi, pelet disuspensikan kembali dalam 500 µL larutan penyangga fosfat (PBS), dipanaskan pada suhu 99 °C selama 30 menit, disentrifugasi, dan supernatan disimpan pada suhu -20 °C hingga WGS. Semua prosedur dilakukan di fasilitas biosafety level 3.
Pustaka genom berpasangan WGS disiapkan menggunakan indeks unik setiap sampel DNA, dan menggunakan teknologi Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 sampel) dan HiSeq (2 × 150 pb) (dua isolat) (Eurofins Genomics, Jerman) untuk pengurutan. Sesuai petunjuk produsen, gunakan Illumina Genome Analyzer dengan modul tambahan berujung ganda untuk mengurutkan DNA genom, dan gunakan Nextera XT DNA Library Prep Kit dari Illumina untuk membangun pustaka tersebut.
Dengan mempertimbangkan data yang diperoleh dari SRA (n = 12), identifikasi kompleks klon dapat digunakan sebagai metadata dari publikasi terkait 30, 41, dan 43. Ketika mempertimbangkan genom lengkap, kecuali Mycobacterium bovis AF2122/97 dan Mycobacterium bovis 3601, yang masing-masing merupakan anggota kompleks klonal Eu1 dan Eu3 25, 29, genom tersebut sama dengan genom lengkap Mycobacterium tuberculosis H37Rv (nomor akses NCBI NC_000962.3). Penjajaran genom dilakukan menggunakan MAFFT (multiple alignment program of amino acid or nucleotide sequence, versi 7.458) dan parameter -addfragments48. Kemudian, dicari keberadaan kompleks klonal yang berbeda dan/atau keberadaan fitur SNP.
Mycobacterium bovis yang baru diurutkan (n = 42) dan bacaan asli dari draf genom yang telah dirakit (n = 3) menyelaraskan kompleks tersebut dengan genom referensi Mycobacterium tuberculosis H37Rv melalui jalur vSNP dan keberadaan fitur penghapusan dan/atau SNP dari klon yang berbeda. Pencarian pun dilakukan.
Kumpulkan informasi dari ketiadaan fitur dan/atau ada/tidaknya SNP dan profil spoligotyping untuk menetapkan data genomik ke kompleks klonal yang sesuai. Untuk keempat rancangan rakitan, profil spoligotyping tidak dapat disimpulkan, sehingga dimasukkan ke dalam kelompok "tanpa kompleksitas".
Alur kerja bioinformatika yang diikuti dalam penelitian ini dimulai dari perakitan dan pemetaan de novo hingga strategi referensi, dengan tujuan mengeksplorasi peristiwa rekombinasi dan polimorfisme genom spesifik. Gambar 1 menyediakan diagram alur langkah-langkah yang diikuti. Untuk analisis rekombinasi, semua genom digunakan untuk meningkatkan ketahanan inferensi dan indikator terkait.
Untuk mengurangi kesalahan dalam pembuatan sekuens konsensus genom, pertama-tama kami memperoleh perakitan de novo, kemudian memperoleh penyelarasan multipel inti. Alur kerja Unicycler saat ini tersedia di https://github.com/rrwick/Unicycler49 dan digunakan untuk melakukan perakitan de novo dari 54 genom yang telah diurutkan (42 berkas baru yang telah diurutkan dan 12 berkas fastq yang dipulihkan dari SRA). Singkatnya, sebelum merakit dari awal, analisis kualitas baca dilakukan di FastQC versi 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) dan Trimmomatic versi 0.36 (opsi "memotong Adaptor dan sekuens khusus pencahayaan lainnya dari pembacaan" dan "Memotong basa dari akhir pembacaan, jika kualitasnya lebih rendah dari ambang batas 20" diterapkan) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Kemudian, pengoptimal SPAdes49 digunakan untuk perakitan genom, dan Pilon versi 1.1851 digunakan untuk optimasi pasca-perakitan. Mode bridging konservatif dipilih untuk menghindari perakitan yang salah, dan ukuran k-mer dicari dan dipilih antara 20% dan 95% dari panjang pembacaan. Ikuti panduan SPAdes dan pertimbangkan ukuran bacaan, hapus kontig yang lebih kecil dari 300 bp, dan tetapkan batas cakupan kedalaman bacaan 20 sebesar 52. Dalam strategi perakitan de novo, wilayah genom seperti paralog prolin-glutamat (PE) dan prolin-prolin glutamat (PPE) yang sangat repetitif tidak dihilangkan.
Kualitas perakitan de novo dinilai melalui jalur QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), yang memfasilitasi pembaruan contig dan pemetaan genom referensi M. bovis AF2122/97 (nomor akses NCBI LT708304.1) (lihat Tabel Tambahan 1 untuk parameter kualitas).
Dengan bantuan jalur vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), berkas FASTQ dari M. bovis yang baru diurutkan dari sekuensing Illumina dibandingkan dengan genom referensi M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Menurut rekomendasi praktik terbaik dari Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55 terapkan parameter filter standar atau skor massa varian untuk kalibrasi ulang. Hasilnya difilter menggunakan skor massa SAMtools terendah 150 dan AC = 2. Gunakan juga Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) untuk memeriksa pembacaan untuk menyingkirkan kontaminasi. Jalur vSNP yang digunakan untuk memetakan strategi sekuens dalam pekerjaan kami memeriksa serangkaian SNP dan target yang ditentukan, dan juga mengecualikan skenario infeksi campuran. Cakupan genom pembacaan lebih baik dari 99% (Tabel Tambahan 1).
Untuk menghindari kesalahan pemetaan dan SNP yang salah, saring varian dalam kasus berikut: (1) didukung oleh kurang dari 20 pembacaan, (2) ditemukan dengan frekuensi kurang dari 0,9, (3) terdapat pada setidaknya satu galur, tetapi setidaknya terdapat celah pada galur lain. Penampil genomik terintegrasi (IGV) versi 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 digunakan untuk memverifikasi SNP dan posisi secara visual dengan masalah pemetaan atau penyelarasan. Karena gen prolin-glutamat (PE) dan prolin-prolin glutamat (PPE) sangat terduplikasi dan merupakan bagian dari keluarga multigen, gen tersebut mudah disalahpahami oleh pengurutan dan pemetaan yang salah oleh Illumina, sehingga gen tersebut lebih disukai. Alur kerja bioinformatika mikobakteri menghilangkan anggota kompleks tuberkulosis saat menggunakan strategi pemetaan untuk mengurutkan guna mengonfirmasi SNP. Oleh karena itu, kami menyaring gen PE/PPE dan indel dari analisis.
Menurut Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), semua SNP dibagi ke dalam kategori fungsional. Jalur SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) digunakan untuk menyimpulkan konsekuensi SNP (perubahan sinonim atau non-sinonim). Basis data baru genom Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1) telah dibuat.
Penyelarasan ganda genom inti dilakukan menggunakan Parsnp v1.2, yang saat ini tersedia di https://github.com/marbl/parsnp57, menggunakan 69 genom lengkap/rancangan rakitan (dengan opsi -c) dan M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) digunakan sebagai referensi. Empat penyelarasan ganda genom inti dilakukan: hanya anggota kompleks kloning Eu2 (n = 37), termasuk semua anggota kompleks kloning Eropa (n = 44), termasuk titik persimpangan kompleks kloning Eropa dan Afrika (n = 51), dan mencakup semua Mycobacterium bovis dalam penelitian ini (n = 70).
Penyelarasan inti yang dihasilkan oleh Parsnp digunakan untuk menyimpulkan pohon filogenetik kemungkinan maksimum (ML) menggunakan CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 menggunakan RAxML, dan melakukan 1000 replikasi terpandu.
Tiga algoritma dan alat bioinformatika yang berbeda digunakan untuk memeriksa keberadaan peristiwa rekombinasi secara paralel: perangkat lunak SplitsTree4, jalur Gubbins (garis keturunan yang tidak bias melalui rekombinasi dalam urutan nukleotida), dan perangkat lunak RDP4 (program deteksi rekombinasi, versi beta 4.101).
Metode dekomposisi split yang diimplementasikan dalam SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 digunakan untuk menghitung jaringan filogenetik tanpa akar, menggunakan uji Phi untuk verifikasi statistik, dan ambang batas signifikansi adalah p = 0,05. Analisis multi-alignment inti Parsnp digunakan sebagai input, dan dekomposisi splitting sebagai standar jaringan direalisasikan.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 berjalan dengan parameter default sebagai cara lain untuk mengevaluasi dampak rekombinasi pada Mycobacterium bovis. Algoritme yang diterapkan dalam pipeline merekonstruksi garis keturunan klon yang relevan. Rakitan genom/draf lengkap dari set data kami dan genom referensi (bovine bovid AF2122/97, LT708304.1) saling; dan memindai posisi SNP pada setiap cabang pohon untuk mendeteksi klaster SNP yang mewakili peristiwa rekombinasi. Nol cabang Asumsikan tidak ada peristiwa rekombinasi, yang berarti SNP yang terjadi pada cabang harus didistribusikan secara merata. Penjajaran ganda inti dari Parsnp dan pohon ML dengan skor terbaik dari RAxML digunakan sebagai berkas masukan.
Akhirnya, untuk mengonfirmasi peristiwa reorganisasi yang disarankan oleh alur kerja Gubbins, enam algoritma yang diimplementasikan dalam RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65, dan SiScan66) diterapkan pada penyelarasan multipel inti Parsnp dengan pengaturan default. Kami menentukan bahwa setidaknya tiga algoritma yang diimplementasikan dalam RDP4 harus secara konsisten menunjukkan sinyal penting untuk memverifikasi setiap peristiwa rekombinasi.
Mengingat bahwa perangkat lunak Gubbins dan RDP mencari sinyal rekombinasi dengan memeriksa beberapa penyelarasan inti dalam jendela hingga 500 bp, dan memastikan bahwa penyertaan gen PE/PPE selama perakitan de novo tidak akan mengganggu sinyal rekombinasi yang ditemukan, analisis lebih lanjut dilakukan dengan pemeriksaan homolinearitas di sekitar gen yang mengidentifikasi peristiwa rekombinasi. Peta sinklinier menggunakan genom lengkap dibangun menggunakan penyelarasan multigenom MAUVE (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) untuk mengecualikan translokasi atau inversi genom lokal. Selain itu, seluruh genom digunakan untuk melakukan analisis homolinearitas pada urutan asam amino melalui server web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Analisis yang lebih mendalam terhadap set data genom yang diperoleh dari sistem tuberkulosis multi-inang Portugis bertujuan untuk memeriksa polimorfisme gen yang disebutkan dalam literatur. Gen-gen ini adalah 37, 38, dan gen pengkode 3R yang diperoleh oleh nenek moyang MTBC melalui komponen sistem HGT (perbaikan, replikasi, dan rekombinasi DNA) 39. Gunakan ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) dan gunakan DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) untuk menghitung keragaman gen dan keragaman nukleotida (π) serta input parameter uji netral D Tajima.
Pohon filogenetik kemungkinan maksimum (ML) berdasarkan 69 isolat Mycoplasma bovis dan genom referensi diperoleh (Gambar 2A). Dibandingkan dengan pohon berbasis gen tunggal atau pohon berbasis multilokus, strategi ini memungkinkan untuk menghasilkan pohon yang lebih kuat yang tidak menangkap variabilitas seluruh genom dan oleh karena itu menunjukkan kemampuan yang lebih rendah untuk membedakan antara spesies 68,69. Struktur topologi pohon ML biasanya konsisten dengan klasifikasi klon yang kompleks. Genom Eu2 dikelompokkan dalam cabang, dan genom Af1 juga dikelompokkan bersama (Gambar 2A). Hasilnya juga konsisten dengan hubungan evolusi Mycobacterium bovis yang diketahui, yaitu, ada perbedaan besar antara anggota Eu1 dan kelompok yang terdiri dari semua kompleks klonal dan genom lainnya, tetapi kompleks klonal 30 tidak ditentukan. Ketidakkonsistenan kecil antara kompleks klonal dan hubungan yang diamati pada pohon filogenetik dapat dijelaskan oleh fakta bahwa kompleks klonal dijelaskan berdasarkan wilayah genom tertentu, sedangkan pohon filogenetik didasarkan pada beberapa penyelarasan genom inti yang mewakili keseluruhan genom.
Pohon filogenetik kemungkinan maksimum (GTR) dibangun berdasarkan penyelarasan genom inti Mycobacterium bovis sebelum (A) dan setelah (B) penghilangan situs rekombinasi. Warna cabang mewakili kompleks klon Mycobacterium bovis: Eropa 1 berwarna ungu, Eropa 2 berwarna merah, Eropa 3 berwarna biru, Afrika 1 berwarna oranye, dan Afrika 2 berwarna hijau. Pohon tersebut di-root dan digambar sesuai skala, dan panjang cabang diukur sebagai pengganti untuk setiap situs.
Kompleks Mycobacterium tuberculosis digambarkan sebagai evolusi klonal, dan sebagian besar bukti yang terkumpul selama bertahun-tahun mendukung gagasan bahwa peristiwa HGT dan rekombinasi yang sedang berlangsung tidak akan terjadi pada tingkat MTBC yang terdeteksi15,17,18.
Pekerjaan sebelumnya telah menunjukkan bahwa mungkin ada rekombinasi terbatas antara strain MTBC20,21, sementara yang lain gagal mengidentifikasi kejadian rekombinasi yang terukur70,71. Diskusikan kembali masalah ini dengan fokus pada Mycobacterium bovis, yang berbeda dari pekerjaan sebelumnya yang hanya mempertimbangkan Mycobacterium tuberculosis70,71; atau pertimbangkan MTBC secara keseluruhan, dengan hampir tidak ada M. bovis yang mewakili 20; atau hanya pertimbangkan fraksi sapi restriktif. Dataset mikobakteri, dalam pekerjaan ini, ada total 70 strain, yang mewakili semua kompleks klonal, yang digunakan untuk menyaring rekombinasi. Set data diskalakan menurut empat tingkat kumulatif: (1) anggota Eu2, (2) semua anggota kompleks klon Eropa (yaitu Eropa), (3) kompleks klon Eropa dan Afrika (Eu + Af) dan (4) seluruh koleksi data (termasuk genom yang tidak termasuk dalam kompleks kloning yang sudah dijelaskan).
Untuk mempelajari hipotesis ini lebih lanjut, jaringan dekomposisi terpisah dilakukan untuk menilai tidak adanya peristiwa rekombinasi antar genom, karena metode ini dapat memvisualisasikan hubungan leluhur antar individu dan menampilkan sinyal filogenetik yang saling bertentangan. Keempat set data dalam analisis mengonfirmasi keberadaan loop dalam jaringan (yaitu, area yang tidak konvergen menjadi satu pohon), tetapi uji Phi tidak memiliki dukungan statistik (Eu2, p = 0,0956; Eropa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; seluruh set data p = 0,2451), yang memberikan bukti yang lemah untuk keberadaan peristiwa reorganisasi (Gambar 3A-D).
Di Eropa 2 genom (n = 37) (A), genom Eropa (n = 44) (B), genom Eropa dan Afrika (n = 51) (C) dan seluruh kumpulan data (n = 70) (D).
Bahasa Indonesia: Setelah analisis ini, dan dengan mempertimbangkan pengamatan siklik di semua jaringan, algoritma rekonstruksi yang diimplementasikan dalam alur kerja Gubbins diaplikasikan untuk merekonstruksi garis keturunan klonal dan untuk melengkapi estimasi efek rekombinasi pada genom M. bovis. Simpulkan jumlah kumulatif peristiwa rekombinasi, yang sebagian besar terjadi di cabang terminal (yaitu, dalam genom tunggal) (Tabel 2). Indikator-indikator ini menunjukkan konsistensi seluruh set data dan mengindikasikan bahwa frekuensi peristiwa rekombinasi adalah 200 hingga 300 kali lipat dari mutasi. Setelah parameter rho/theta yang merepresentasikan laju relatif rekombinasi dan mutasi titik pada cabang tampak berada di antara 0,0037 dan 0,0056 (Tabel 3). Baru-baru ini, karya yang diterbitkan dari strain 38 M. bovis menunjukkan nilai rho/theta yang lebih tinggi (rho/theta = 0,1) daripada yang diperoleh dalam kumpulan data ini, tetapi karya Patané dan koleganya menggunakan perakitan berbasis referensi untuk menyimpulkan parameter rekombinasi. Detail prosedural, karena prosedur perakitan, telah dikaitkan dengan banyaknya peristiwa rekombinasi putatif di cabang terminal.
Berikutnya, parameter r/m merepresentasikan rasio keragaman rekombinasi dan pengenalan mutasi, dan nilai rata-ratanya antara 0,025 dan 0,037, yang mengindikasikan bahwa dibandingkan dengan mutasi, rekombinasi memiliki dampak keseluruhan yang lebih rendah pada keragaman genetik M. bovis (Tabel 3). Untuk perbandingan yang lebih luas, metode serupa digunakan untuk memperkirakan parameter r/m untuk dataset MTBC yang terdiri dari 23 genom, yang menunjukkan nilai rata-rata 0,48620, sedangkan untuk dataset 38 M. bovis milik Patané dan kolega, terbukti nilai rata-ratanya adalah 0,98. Dalam studi pertama, hanya dua dari 23 genom yang disertakan dalam karya M. bovis (M. bovis BCG dan strain referensi), sehingga nilai yang diperoleh mungkin bias karena ekspresi berlebih dari genom M. tuberculosis. Dalam laporan kedua, populasi Mycobacterium bovis yang dianalisis sebagian besar diperoleh dari Amerika Serikat dan inang ternak. Sebaliknya, dalam set data kami, lebih banyak lokasi geografis dan spesies inang terwakili, dan genom yang dikelompokkan ke dalam kompleks klonal yang berbeda dengan karakteristik genetik populasi yang berbeda juga digunakan, sehingga mencapai pengetahuan Populasi yang lebih dalam dan lebih luas. Nilai rata-rata r/m perbedaan yang diperoleh dengan set data kami konsisten dengan konsep bahwa derajat rekombinasi sangat bervariasi antara garis keturunan yang ditetapkan pada spesies taksonomi yang sama, sehingga hasil ini menunjukkan bahwa kompleks klon M. bovis dapat menunjukkan perbedaan rekombinasi Dampaknya juga seperti yang disarankan oleh Didelot & Maiden72. Namun demikian, memperluas set data ini secara signifikan dengan memasukkan lebih banyak genom M. bovis akan memungkinkan klarifikasi lebih lanjut tentang hal ini. Baik parameter r/m maupun rho/theta menunjukkan variabilitas antar cabang, dan hasil ini konsisten dengan laporan pada spesies bakteri lainnya72,73.
Akhirnya, untuk mengonfirmasi peristiwa reorganisasi yang diidentifikasi oleh jalur Gubbins, enam algoritma berbeda digunakan dalam perangkat lunak RDP4 untuk menguji secara independen berbagai perbandingan inti. Secara global, kurang dari setengah peristiwa yang diidentifikasi oleh Gubbins dikonfirmasi oleh RDP4 (Tabel 4 dan 5). Mempertimbangkan seluruh set data, tiga peristiwa rekombinasi dikonfirmasi, dua melibatkan simpul internal dan yang lainnya melibatkan genom tunggal di cabang terminal, yang kompleks klonalnya tidak dapat ditetapkan (Tabel 4 dan 5). Identifikasi peristiwa di cabang terminal dapat menunjukkan bahwa rekombinasi masih berlangsung pada galur M. bovis kontemporer atau hasilnya salah tempat70. Di wilayah rekombinasi hipotetis ini, sekitar 20% posisi memiliki nukleotida yang tidak terdefinisi (N), sehingga memengaruhi sinyal rekombinasi (Gambar Tambahan 2). Selain itu, wilayah ini memengaruhi gen rrs, yang mengkode RNA ribosom 16S yang diperkirakan sangat terkonservasi. Oleh karena itu, sinyal rekombinasi dugaan ini kemungkinan merupakan hasil dari kesalahan sekuensing atau misalignment. Kemudian, dilakukan penyelarasan genom lengkap antara Mb0003 dan Mycobacterium bovis AF2122/97, dan keberadaan nukleotida dan SNP yang tidak terdefinisi dikonfirmasi. Dengan demikian, kemungkinan masalah terkait kesalahan penyelarasan tersebut bukan disebabkan oleh informasi biologis yang diimplementasikan dalam penelitian ini. Hal ini muncul setelah mempelajari program tersebut.
Tidak ditemukan celah atau nukleotida tak terdefinisi di daerah rekombinasi simpul internal (Gambar 4 dan 5). Mengenai peristiwa ini, satu hanya berisi genom Eu2 dan memengaruhi gen pks12, yang mengkode kemungkinan poliketida sintase; sementara yang lain terdaftar dalam genom Eu1 dan memengaruhi gen narX yang mengkode kemungkinan nitrat reduktase (Tabel 4). Secara umum, analisis rekombinasi menunjukkan bahwa ada sejumlah kecil fragmen rekombinasi dengan dukungan statistik, dan indikator yang disimpulkan menunjukkan bahwa rekombinasi memiliki dampak rendah pada garis keturunan M. bovis. Sinyal rekombinasi diharapkan rendah, tetapi penting untuk membedakan sinyal evolusi sebenarnya dari gangguan latar belakang, yang merupakan tugas yang menantang. Untuk mengurangi sinyal derau yang ditimbulkan oleh masalah perakitan berbasis referensi dan ketidakcocokan 70, 71, seluruh genom lainnya, kecuali genom lengkap, dirakit dari awal, dan kualitas perakitan diperiksa serta dipastikan melalui analisis jalur QUAST (Tabel Tambahan 1). Selain itu, serangkaian analisis tambahan dilakukan untuk memastikan ketahanan dan akurasi survei secara keseluruhan. Oleh karena itu, kualitas sekuensing gen narX dan pks12 dievaluasi dengan pemetaan pembacaan terhadap Mycobacterium bovis AF2122/97. Posisi SNP yang direkomendasikan di daerah rekombinasi dikonfirmasi dengan menerapkan kriteria yang disebutkan di bagian metode (minimal 20 pembacaan dan frekuensi perubahan 0,9). Polimorfisme gen narX terkonfirmasi sepenuhnya pada kedua genom (Mb1792361 dan Mb7240415; 2,3%) dan genom pks12: gen Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, dan Mb12. Namun, untuk genom Mb2043, enam dari delapan posisi tidak memenuhi kriteria kedalaman pembacaan karena SNP didukung oleh maksimum 17 pembacaan, yang berada di bawah nilai batas yang ditetapkan, yaitu 20. Oleh karena itu, rekombinasi enam genom (8,6%) pada situs genom ini dapat terkonfirmasi (Gambar 4 dan 5).
Visualisasi detail penyelarasan wilayah rekombinasi dari dataset Mycobacterium bovis memengaruhi gen narX yang mengkode kemungkinan nitrat reduktase. Tidak ditemukan celah atau nukleotida yang tidak terdefinisi di wilayah rekombinasi simpul internal. Peristiwa khusus ini tercatat dalam genom Eu1. Kualitas sekuensing gen narX dievaluasi dengan memplot pembacaan Mycobacterium bovis AF2122/97. Konfirmasikan lokasi SNP yang direkomendasikan di wilayah rekombinasi dengan menerapkan kriteria yang disebutkan di bagian metode (minimal 20 pembacaan dan frekuensi perubahan 0,9). Polimorfisme gen narX terkonfirmasi sepenuhnya dalam genom Mb1792361 dan Mb7240415 (2,3%).
Visualisasi detail penyelarasan wilayah rekombinasi dari dataset Mycoplasma bovis yang memengaruhi gen pks12. Tidak ditemukan celah atau nukleotida yang tidak terdefinisi di wilayah rekombinasi simpul internal. Mengenai peristiwa yang memengaruhi gen pks12 yang mengkode kemungkinan poliketida sintase, gen tersebut hanya mengandung genom Eu2. Kualitas sekuensing pks12 dievaluasi dengan pemetaan pembacaan Mycobacterium bovis AF2122/97. Konfirmasikan lokasi SNP yang direkomendasikan di wilayah rekombinasi dengan menerapkan kriteria yang disebutkan di bagian metode (minimal 20 pembacaan dan frekuensi perubahan 0,9). Polimorfisme genom Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, dan Mb1960 telah terkonfirmasi sepenuhnya.
Gen PE dan PPE memiliki daerah berulang yang mudah salah dibaca oleh pengurutan dan pemetaan Illumina, sehingga biasanya dihapus dari alur kerja bioinformatika anggota M. tuberculosis hanya ketika menggunakan strategi pemetaan-ke-pengurutan. Inferensi peristiwa rekombinasi yang diterapkan dalam pekerjaan ini didasarkan pada perakitan de novo tanpa menyaring PE/PPE. Kami percaya bahwa dengan menerapkan tiga metode dan algoritma komplementer yang berbeda melalui SplitsTree, jalur Gubbins dan perangkat lunak RDP4, strategi yang diterapkan kuat untuk memproses dan menyaring daerah yang direorganisasi yang disebabkan oleh sinyal kesalahan. Namun, untuk mengecualikan interferensi gen PE/PPE pada perangkat lunak Gubbins dan RDP4 untuk mengidentifikasi klaster SNP, dan oleh karena itu identifikasi daerah rekombinasi yang diusulkan untuk memengaruhi gen narX dan pks12, lingkungan gen-gen ini diperiksa (Gambar Tambahan 3-5). Pada M. bovis AF2122/97, gen narX dipisahkan oleh narK2 dan Mb1764c, sementara pks12 dikelilingi oleh Mb2075c dan Mb2073c (Gambar Tambahan 3-5). Peta yang dihasilkan menggunakan peta sinlin MAUVE dari genom lengkap memberikan informasi tentang konservasi dan penataan ulang urutan gen, menunjukkan empat blok kolinear, dan tidak ada tanda-tanda translokasi atau inversi genom. Selain itu, analisis komplementasi dengan urutan asam amino membuktikan homologi pada semua genom lengkap, dan tidak ditemukan PE/PPE pada daerah yang berdekatan dari narX atau pks12. Untuk narX, satu genom (Mb0030) memiliki skor sinonimi yang lebih rendah karena gen narX diidentifikasi sebagai dua fragmen (fragmen 1891 dan 1890). Untuk pks12, karena kemiripannya, Mb0030 dan Mb003 menunjukkan skor sinklinieritas yang lebih rendah, sementara pks12 diidentifikasi dalam dua dan tiga fragmen, masing-masing mewakili domain protein yang berbeda (Gambar Tambahan 3-5). Dengan mempertimbangkan informasi ini, dan dengan Gubbins serta perangkat lunak RDP4 yang melakukan analisis dan memeriksa keselarasan kelipatan inti maksimum 500 bp dalam jendela, kami mengonfirmasi bahwa gen PE/PPE tidak akan mengganggu sinyal rekombinasi yang memengaruhi narX dan pks12.
Meskipun sinyal rekombinasi yang terdeteksi dalam kumpulan data ini dapat dianggap residual, memang benar bahwa rekombinasi dalam M. bovis tidak dapat dikesampingkan, sehingga harus tetap menjadi subjek analisis lebih lanjut, di mana seluruh genom dari berbagai skenario epidemiologi diurutkan hingga Penting.
Membandingkan pohon filogenetik ML yang diperoleh sebelum dan sesudah koreksi rekombinasi (Gambar 2A, B) tidak menyebabkan perubahan signifikan dalam hubungan filogenetik yang disimpulkan, dan strain M. bovis dikelompokkan dalam kelompok yang sama.
Setelah memetakan 42 pembacaan M. bovis yang baru diurutkan dengan genom referensi M. bovis AF2122/97, diperoleh penyelarasan SNP yang berisi 1816 posisi polimorfik. Sebagian besar SNP (87,1%) terletak di daerah pengkode, dan gen yang terpengaruh dikarakterisasi berdasarkan kategori fungsional yang ditunjukkan dalam Bovilist (Gambar 6A, B). Dengan mempertimbangkan jumlah total gen dalam setiap kategori fungsional, gen dalam kategori "metabolisme lipid" menunjukkan lebih banyak SNP, diikuti oleh "dinding sel dan proses sel" serta "metabolisme intermediet dan respirasi", yang menunjukkan bahwa gen-gen tersebut berada dalam evolusi M. bovis.
Analisis hierarkis dataset M. bovis dari Portugal (n = 42). Jumlah total SNP yang terdaftar dan gen yang terpengaruh untuk setiap kategori fungsional (A). Jumlah total perubahan sinonim dan non-sinonim yang terdaftar berdasarkan kategori fungsional (B).
Dalam skala global, rasio dN/dS rata-rata lebih baik dari 1,5, yang menunjukkan bahwa tekanan evolusi global adalah untuk menyingkirkan keadaan leluhur dan mewakili skenario pilihan pemurnian yang positif (terdiversifikasi atau terarah) dan/atau lebih longgar. Dalam kategori "virulensi, detoksifikasi, adaptasi", "sekuens penyisipan dan fag", dan "protein pengatur", lebih dari dua pertiga SNP bersifat non-sinonim (Gambar 6B).
Di semua kategori, terdapat gen dengan beberapa SNP, yang menghasilkan tingkat mutasi rata-rata (yaitu, rata-rata SNP per gen) lebih besar dari 1 (Gambar 6A). Pks12 (Mb2074c) dengan 15 SNP dan fas (Mb2553c) dengan 8 SNP memiliki nilai mutasi yang lebih tinggi. Kedua gen ini terlibat dalam metabolisme asam lemak. Gen pks mengkode poliketida sintase (PKS), yang merupakan enzim multifungsi yang terlibat dalam biosintesis lipid dinding sel mikobakteri74,75. Gen ini mengkode polipeptida multifungsi yang terlibat dalam sintesis mikoketida74,76. Gen fas terlibat dalam sintesis asam mikolat. Kedua gen ini memainkan peran penting dalam biosintesis dinding sel yang bersentuhan dengan inang.
Untuk mempelajari lebih lanjut evolusi Mycobacterium bovis, dua set gen spesifik dianalisis. Penelitian yang telah dipublikasikan sebelumnya menggunakan metode komposisi sekuens dan filogenetik mengidentifikasi gen-gen yang diperoleh oleh leluhur MTBC melalui HGT sebelum diversifikasi37,38. Gen-gen ini tercantum dalam Tabel Tambahan 2. Distribusi SNP dari total 77 gen yang mungkin terkait dengan HGT dianalisis, dan 26 situs polimorfik diidentifikasi, yang dalam sebagian besar kasus (78%) menghasilkan perubahan non-sinonim (NS) (Tabel Tambahan 2). Penelitian sebelumnya pada genom MTBC menunjukkan bahwa wilayah HGT yang diduga menunjukkan rasio SNP NS yang lebih tinggi dibandingkan dengan bagian genom lainnya. Jika diasumsikan bahwa wilayah rekombinasi ini diperoleh oleh leluhur MTBC, dan oleh karena itu, mereka merepresentasikan polimorfisme purba secara berlebihan, maka proporsi perubahan sinonim diperkirakan lebih tinggi, karena substitusi NS diperkirakan akan dihilangkan oleh seleksi negatif akibat perubahan asam amino yang dapat mengubah fungsi protein. Oleh karena itu, hasil kami menunjukkan bahwa konsekuensi fungsional mungkin berasal dari penggantian gen mirip HGT, yang mencerminkan pentingnya gen tersebut bagi keragaman genetik adaptif yang berharga.
Sejalan dengan analisis ini, gen-gen yang mengkode komponen sistem 3R (perbaikan, replikasi, dan rekombinasi DNA) diperiksa secara menyeluruh sesuai dengan daftar yang sebelumnya diterbitkan oleh dos Vultos dkk. (2008)39. Pertukaran fragmen DNA yang identik tidak dapat diamati secara langsung, meskipun mungkin merupakan proses yang sering terjadi ketika bakteri yang berkerabat dekat terlibat, seperti dalam kasus kumpulan data ini; selain itu, proses ini mungkin menjadi kunci metode perbaikan DNA72, sehingga berperan dalam rekombinasi homolog. Sebanyak 26 posisi polimorfik yang didistribusikan oleh 54 gen telah diidentifikasi (Tabel Tambahan 3). Dalam kumpulan gen ini, perubahan NS menyumbang sekitar 65% dari konsekuensinya, yang konsisten dengan laporan sebelumnya tentang galur Mycobacterium tuberculosis.
Waktu posting: 21-Okt-2021