రీకాంబినేషన్, మ్యుటేషన్ మరియు పాజిటివ్ సెలెక్షన్ యొక్క జీనోమ్-వైడ్ అంచనాలు మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ యొక్క విభిన్న డ్రైవర్లను ప్రేరేపిస్తాయి

నేచర్‌ను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSS కి పరిమిత మద్దతు ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు బ్రౌజర్ యొక్క కొత్త వెర్షన్‌ను ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో అనుకూలత మోడ్‌ను ఆపివేయండి). అదే సమయంలో, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము శైలులు మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేని సైట్‌లను ప్రదర్శిస్తాము.
జన్యు శ్రేణి అంటు వ్యాధుల పరిశోధన రంగాన్ని పునరుజ్జీవింపజేసింది, వ్యాధి ఎపిడెమియాలజీ, పాథోజెనిసిస్, హోస్ట్-పాథోజెన్ పరస్పర చర్యలు మరియు వ్యాధికారకాలపై విధించిన పరిణామ ప్రక్రియను వెల్లడించింది. మైకోబాక్టీరియం ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ కాంప్లెక్స్ (MTBC) మైకోబాక్టీరియం బోవిస్‌ను దాని జంతు అనుకూల సభ్యులలో ఒకటిగా పరిగణిస్తుంది, ఇది భూసంబంధమైన క్షీరదాలలో క్షయవ్యాధి (TB)కి కారణమవుతుంది మరియు ఇది బ్యాక్టీరియా పరిణామానికి ఒక సాధారణ నమూనా. ఇతర MTBC సభ్యుల మాదిరిగానే, మైకోబాక్టీరియం బోవిస్‌ను ఖచ్చితంగా క్లోన్ చేయబడిన, నెమ్మదిగా అభివృద్ధి చెందుతున్న వ్యాధికారకంగా భావించబడుతుంది మరియు పునఃసంయోగం లేదా క్షితిజ సమాంతర జన్యు బదిలీకి ఎటువంటి సంకేతం లేదు. ఈ పనిలో, పశువుల జన్యు వైవిధ్యంపై అంతర్దృష్టులను పొందడానికి వివిధ వంశపారంపర్య (యూరప్ మరియు ఆఫ్రికా) నుండి 70 పశువుల M.తో కూడిన మొత్తం జన్యు శ్రేణి (WGS) డేటాసెట్‌కు మేము తులనాత్మక జన్యుశాస్త్రాలను వర్తింపజేస్తాము. పరిణామ శక్తి. పునర్వ్యవస్థీకరణ సంకేతాలను అంచనా వేయడానికి మూడు వేర్వేరు పద్ధతులు ఉపయోగించబడతాయి. ప్రపంచవ్యాప్తంగా, ఘన మద్దతుతో రెండు స్వతంత్ర పద్ధతుల ద్వారా తక్కువ సంఖ్యలో పునఃసంయోగ సంఘటనలు గుర్తించబడ్డాయి మరియు నిర్ధారించబడ్డాయి. అయినప్పటికీ, ఉత్పరివర్తనాలతో పోలిస్తే, పునఃసంయోగం M. బోవిస్ వైవిధ్యంపై బలహీనమైన ప్రభావాన్ని చూపుతుంది (మొత్తం r/m = 0.037). మా డేటా సెట్‌లోని మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ యొక్క క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌లో పొందిన r/m సగటు వ్యత్యాసం, ఒకే వర్గీకరణ జాతులకు కేటాయించిన వంశాల మధ్య పునఃసంయోగం యొక్క డిగ్రీ చాలా తేడా ఉండవచ్చనే సాధారణ భావనకు అనుగుణంగా ఉంటుంది. ఈ పని ఆధారంగా, మైకోబాక్టీరియం బోవిస్‌లో పునఃసంయోగాన్ని తోసిపుచ్చలేము, కాబట్టి భవిష్యత్ తులనాత్మక జన్యుశాస్త్ర పరిశోధనలో ఇది మరింత ప్రయత్నాలకు సంబంధించిన అంశంగా ఉండాలి, దీనిలో ప్రపంచవ్యాప్తంగా వివిధ ఎపిడెమియోలాజికల్ దృశ్యాల నుండి పెద్ద డేటా సెట్‌ల WGS చాలా ముఖ్యమైనది. మల్టీ-హోస్ట్ TB ప్రాబల్యం నుండి చిన్న మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ డేటా సెట్ (n = 42) పై అదనపు విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది మరియు 1,800 కంటే ఎక్కువ స్థానాలను గుర్తించారు, వీటిలో కనీసం ఒక జాతి ఒకే న్యూక్లియోటైడ్ పాలిమార్ఫిజం (SNP)ని చూపించింది. చాలా వరకు (87.1%) కోడింగ్ ప్రాంతంలో ఉన్నాయి మరియు పర్యాయపద మార్పుల యొక్క పర్యాయపదాలు కాని మార్పుల (dN/dS) ప్రపంచ నిష్పత్తి 1.5 మించిపోయింది, ఇది సానుకూల ఎంపిక అనేది M. బోవిస్‌పై ప్రయోగించబడే ఒక ముఖ్యమైన పరిణామ శక్తి అని సూచిస్తుంది. "లిపిడ్ జీవక్రియ", "సెల్ గోడ మరియు సెల్యులార్ ప్రక్రియలు" మరియు "ఇంటర్మీడియట్ జీవక్రియ మరియు శ్వాసక్రియ" యొక్క క్రియాత్మక వర్గాలతో సమృద్ధిగా ఉన్న జన్యువులలో SNPల యొక్క అధిక నిష్పత్తి కనుగొనబడింది, ఇది మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ ప్రాముఖ్యత యొక్క జీవశాస్త్రం మరియు పరిణామంలో వాటి సామర్థ్యాన్ని వెల్లడిస్తుంది. MTBC పూర్వీకులలోని జన్యువులను నిశితంగా పరిశీలిస్తే, అవి క్షితిజ సమాంతర జన్యు బదిలీకి గురయ్యేవి మరియు 3R (DNA మరమ్మత్తు, ప్రతిరూపణ మరియు పునఃసంయోగం) వ్యవస్థలో చేర్చబడ్డాయి, ఇవి తైజిమా యొక్క D తటస్థ పరీక్ష యొక్క ప్రపంచ సగటు ప్రతికూల విలువను వెల్లడిస్తాయి, ఇది గత ఎంపిక స్కానింగ్‌ను సూచిస్తుంది. జనాభా విస్తరణ తర్వాత ఇటీవలి అడ్డంకి ఇప్పటికీ తప్పనిసరి వ్యాధికారక మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ హోస్ట్‌తో పోరాడటానికి ప్రధాన పరిణామాత్మక చోదక కారకం.
మైకోబాక్టీరియం ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ కాంప్లెక్స్ (MTBC) అనేది బాక్టీరియల్ వ్యాధికారకాలలో అత్యంత విజయవంతమైన టాక్సా మరియు బాక్టీరియల్ పరిణామానికి ఒక సాధారణ సందర్భం. దీని సభ్యులు జన్యు స్థాయిలో (> 99%)1,2 వద్ద ఆశ్చర్యకరంగా అధిక న్యూక్లియోటైడ్ గుర్తింపును చూపుతారు. వివిధ MTBC ఎకోటైప్‌లు సూక్ష్మ క్షయవ్యాధి నుండి మానవుల వరకు విస్తృత శ్రేణి హోస్ట్ జాతులలో అంటువ్యాధి గ్రాన్యులోమాటస్ వ్యాధి అయిన క్షయవ్యాధి (TB)కి కారణమవుతాయి3,4,5. ప్రస్తుతం, ఈ కాంప్లెక్స్‌లో మానవులు [M. క్షయవ్యాధి (Mtb), మైకోబాక్టీరియం ఆఫ్రికానమ్] మరియు జంతువులకు అనుగుణంగా ఉండే వ్యాధికారకాలు (మైకోబాక్టీరియం బోవిస్, మైకోబాక్టీరియం కాపిటమ్, మైకోబాక్టీరియం పిన్నిపెడమ్, మైకోబాక్టీరియం మైక్రోటోబాక్టర్, మైకోబాక్టీరియం మోంగీ, మైకోబాక్టీరియం మియ్సాని, మైకోబాక్టీరియం సురికా, "బాసిల్లస్ చింపాంజీ" మరియు "డాస్సీ") 5,6 ఉన్నాయి. M. కానెట్టి (దీనిని "నోడోబాక్టర్ గ్లాబ్రాటా" అని కూడా పిలుస్తారు) పైన పేర్కొన్న మైకోబాక్టీరియాతో సగటు న్యూక్లియోటైడ్ గుర్తింపు 98%, మరియు తులనాత్మక జన్యుశాస్త్ర పని M. కానెట్టి మరియు మిగిలిన MTBC ఇటీవల సాధారణ పూర్వీకుల నుండి వేరుపడ్డాయని చూపించింది.7 ఈ భావనను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, కొంతమంది రచయితలు M. కానెట్టిని MTBC 8 సభ్యునిగా పిలుస్తారు.
MTBC ని క్రమబద్ధంగా కఠినమైన క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌గా వర్ణించారు మరియు దాని జనాభా నిర్మాణం స్పష్టంగా తగ్గిన వైవిధ్యం, అడ్డంకులు, సెలెక్టివ్ స్కానింగ్ మరియు జన్యు ప్రవాహం ద్వారా నిర్వహించబడుతుంది9,10. తప్పిపోయిన పాలిమార్ఫిజమ్‌ల వంటి సంక్లిష్ట కఠినమైన క్లోనల్ పరిణామాన్ని పునఃసంయోగం ద్వారా పునరుద్ధరించలేము అని ఊహిస్తే. ఈ ప్రాతిపదికన, అవకలన ప్రాంతం (RD) మరియు TbD1 (Mtb నిర్దిష్ట తొలగింపు 1 ప్రాంతం) యొక్క జన్యు తొలగింపు యొక్క వరుస సంఘటనలు MTBC పరిణామం యొక్క పరమాణు గుర్తులుగా ప్రతిపాదించబడ్డాయి2,5,11. తులనాత్మక జన్యుశాస్త్రం మరియు మొత్తం జన్యు శ్రేణి (WGS) పని మానవ-అనుకూల సభ్యులను తొమ్మిది వంశాలుగా విభజించడానికి మద్దతు ఇస్తుంది (మైకోబాక్టీరియం ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ L1 నుండి L4, L7 మరియు L8; మరియు మైకోబాక్టీరియం ఆఫ్రికానమ్ L5, L6 మరియు L9), వంశాలు L2 నుండి L4 షేర్డ్ తొలగింపు TbD1 ప్రాంతం2,11,12,13. అదనంగా, జంతువులను స్వీకరించిన సభ్యులు ఒక సాధారణ పూర్వీకుడిని పంచుకోవాలని ప్రతిపాదించబడ్డారు, ఇది RD7, RD8, RD9 మరియు RD102, 5, మరియు 14 లలో క్లాడ్-నిర్దిష్ట తొలగింపుల ద్వారా నిర్వచించబడింది.
క్షితిజ సమాంతర జన్యు బదిలీ (HGT) మరియు పునఃసంయోగ సంఘటనలు అరుదైనవిగా పరిగణించబడతాయి మరియు MTBC యొక్క పూర్వీకులలో సంభవిస్తాయి, మొత్తం MTBC సభ్యుని యొక్క విభిన్న చరిత్ర కంటే15,16,17. హ్యూస్ మరియు సహకారులు (2002) మరియు గుటాకర్ మరియు సహకారులు (2006) చేసిన రెండు ప్రారంభ నివేదికలు M. ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ జాతులలో నిర్దిష్ట స్థానాన్ని గుర్తించే పాలిమార్ఫిజమ్‌లను రూపొందించడంలో రీకాంబినేషన్ సంఘటనలు సహాయపడతాయని సూచించాయి18,19. MTBCలో పునఃసంయోగం స్పష్టంగా లేకపోవడానికి కారణాలు: (1) HGT యొక్క యాంత్రిక ప్రక్రియ మరియు సామర్థ్యం కోల్పోవడం; (2) HGT సంఘటనల అరుదు; (3) MTBC సముచితంలో పునఃసంయోగ సంఘటనల అవకాశం లేదు14,17. ఇటీవల, MTBC జాతి 20 మరియు మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ 21 లకు వర్తింపజేసిన కొన్ని పూర్తి-జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్ (WGS) అధ్యయనాలు పునఃసంయోగానికి ఆధారాలను అందించాయి, MTBC జాతులు తరచుగా చిన్న DNA భాగాలను మార్పిడి చేస్తాయని చూపించిన మొదటిది, కానీ పరిమిత న్యూక్లియోటైడ్ శ్రేణి వైవిధ్యం కారణంగా, ఈ సంఘటనలు ఇప్పటికీ గమనించబడలేదు.
మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ అనేది పశువుల నుండి (ప్రధానంగా పశువులు) సాధారణంగా కోలుకునే MTBC సభ్యుడు, అయినప్పటికీ దీనిని స్వేచ్ఛా-శ్రేణి మరియు కంచె వేయబడిన అడవి జంతువుల నుండి కూడా వేరుచేయవచ్చు4,22,23,24. M. బోవిస్ ఐదు ప్రధాన క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌లుగా పరిణామం చెందింది [యూరోపియన్ 1 (Eu1), యూరోపియన్ 2 (Eu2), యూరోపియన్ 3 (Eu3), ఆఫ్రికన్ 1 (Af1) మరియు ఆఫ్రికా 2 (Af2)], స్పోలిగోటైపింగ్ ప్రొఫైల్ ప్రకారం, నిర్దిష్ట తొలగింపులు మరియు సింగిల్ న్యూక్లియోటైడ్ పాలిమార్ఫిజమ్స్ (SNPలు) 25, 26, 27, 28, 29 నిర్దిష్ట జన్యువులలో. ఈ క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌లు మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ జనాభా యొక్క వైవిధ్యమైన నిర్మాణాన్ని మరియు భౌగోళిక ప్రాంతాలతో దాని అనుబంధాన్ని ప్రదర్శిస్తాయి. అదనంగా, జింపెల్ మరియు సహకారులు (2020) నిర్వహించిన ఇటీవలి WGS పని 1,900 కంటే ఎక్కువ జన్యువులతో మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ యొక్క SNP ఆధారంగా ఒక ఫైలోజెనిని రూపొందించింది, ఇది కనీసం నాలుగు వేర్వేరు వంశాలు (Lb1 నుండి Lb1 నుండి Lb4 వరకు పేరు పెట్టబడింది) ఉన్నాయని సూచిస్తుంది, అవి గతంలో నిర్వచించిన క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌తో పూర్తిగా స్థిరంగా లేవు, అయినప్పటికీ భౌగోళిక విశిష్టతను కూడా నిర్ధారించవచ్చు30. ఈ రచయితలు ఫైలోజెని మరియు మాలిక్యులర్ డేటింగ్ యొక్క అవకలన విశ్లేషణను నిర్వహించారు, కానీ పునఃసంయోగాన్ని అధ్యయనం చేయలేదు30.
స్పోలిగోటైపింగ్, MIRU-VNTR (మైకోబాక్టీరియల్ ఇంటర్‌స్పెర్స్డ్ రిపీట్ యూనిట్-వేరియబుల్ టాండమ్ రిపీట్ నంబర్) వంటి విభిన్న మాలిక్యులర్ టెక్నిక్‌లను ఉపయోగించి గతంలో చేసిన పని మరియు ఇటీవలి SNP టైపింగ్ M. బోవిస్ జాతులు 31,32,33, 34,35 మధ్య ఒక నిర్దిష్ట స్థాయి జన్యు వైవిధ్యాన్ని వెల్లడించాయి. వ్యాధి ఎపిడెమియాలజీ అధ్యయనంలో జన్యు వైవిధ్యం యొక్క భేదం ఒక ముఖ్యమైన సాధనంగా మారింది, ఇది వ్యాధికారకత, వైరలెన్స్ మరియు వ్యాధి ప్రసారం యొక్క లోతైన అవగాహనకు సహాయపడుతుంది. WGS పద్ధతి యొక్క ఆవిర్భావం మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ జన్యువు విధించిన పరిణామాత్మక చోదక కారకాలను వివిధ హోస్ట్‌లు మరియు ఎపిడెమియోలాజికల్ దృశ్యాలకు అనుగుణంగా మరియు నిలకడగా ఉండే ప్రక్రియలో బహిర్గతం చేసే అవకాశాన్ని అందిస్తుంది.
ఈ పనిలో, మైకోప్లాస్మా బోవిస్ యొక్క పరిణామ ప్రక్రియపై అంతర్దృష్టులను పొందడానికి, ముఖ్యంగా ఫైలోజెనెటిక్ సంబంధాలు మరియు పునఃసంయోగ సంఘటనలను పరిష్కరించడానికి, వివిధ క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌ల నుండి ఐసోలేట్‌లతో సహా వివిధ మైకోప్లాస్మా బోవిస్ డేటాసెట్‌లపై (n=70) తులనాత్మక జన్యు విశ్లేషణను ఉపయోగిస్తాము. ఈ విశ్లేషణకు అనుబంధంగా, పోర్చుగల్‌లోని బాగా వర్గీకరించబడిన బహుళ-హోస్ట్ క్షయవ్యాధి ప్రాంతం నుండి పొందిన M. బోవిస్ ఐసోలేట్‌ల (n=42) ఉప-డేటా సెట్ 31,36 గుర్తింపు లేని భావాన్ని అంచనా వేయడానికి మరింత అన్వేషించబడింది. పర్యాయపద (dS) న్యూక్లియోటైడ్ ప్రత్యామ్నాయాలకు ఇంద్రియ (dN) యొక్క సాపేక్ష నిష్పత్తి, అలాగే సాహిత్యంలో పేర్కొన్న నిర్దిష్ట జన్యువుల పరిణామ సహకారం మధ్య సమతుల్యత, అవి MTBC పూర్వీకులు HGT ద్వారా పొందిన 37,38 మరియు 3R (DNA మరమ్మత్తు, ప్రతిరూపణ మరియు పునఃసంయోగం) వ్యవస్థ జన్యు భాగాలు 39ని ఎన్కోడ్ చేస్తాయి. HGT ద్వారా పొందిన జన్యువులను ఎంచుకోండి ఎందుకంటే అవి పురాతన పాలిమార్ఫిజమ్‌లను సూచిస్తాయి, కాబట్టి అవి పర్యాయపద మార్పుల యొక్క అధిక నిష్పత్తిని కలిగి ఉండవచ్చని భావిస్తున్నారు. M. ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ జాతులపై మునుపటి పని ఈ జన్యువులపై పనిచేసే సాధారణ ప్రతికూల/శుద్దీకరణ ఎంపికలను సూచించినందున 3R వ్యవస్థలో చేర్చబడిన జన్యువులను ఎంపిక చేశారు మరియు అవి పరిణామంలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషించవచ్చు 39. ఈ పని యొక్క మరొక లక్ష్యం పునర్వ్యవస్థీకరణ సంఘటనల ఉనికిని ఊహించడం. ఈ కారణంగా, పోర్చుగల్ నుండి మా డేటాసెట్ యూరోపియన్ క్లోన్ కాంప్లెక్స్ 2 యొక్క జన్యువులను మరియు క్లోన్ కాంప్లెక్స్‌ను కేటాయించని జాతులను మాత్రమే కలిగి ఉందని పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, అన్ని క్లోన్ కాంప్లెక్స్‌ల ప్రతినిధిని చివరకు పొందేందుకు మరియు ఫలితాల దృఢత్వం మరియు విస్తృతిని మెరుగుపరచడానికి బహిరంగంగా అందుబాటులో ఉన్న జన్యు డేటాను చేర్చాలని మేము నిర్ణయించుకున్నాము.
పోర్చుగీస్ స్థానిక మల్టీ-హోస్ట్ ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ సీన్ నుండి 42 కొత్తగా సీక్వెన్స్ చేయబడిన మైకోప్లాస్మా బోవిస్ జన్యువులు (క్రింద వివరాలు), గతంలో ఎపిడెమియోలాజికల్ కోణం నుండి వర్గీకరించబడ్డాయి36, ఈ పనికి కేంద్రం. పోర్చుగల్ నుండి వచ్చిన డేటా సెట్‌లో యూరోపియన్ 2 క్లోన్ కాంప్లెక్స్‌లు మరియు నియమించబడిన కాంప్లెక్స్‌లు లేని స్ట్రెయిన్‌ల ప్రతినిధులు మాత్రమే ఉన్నారని పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, M. బోవిస్ క్లోన్ కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క అన్ని ప్రతినిధులను కలిగి ఉన్న డేటా సెట్‌ను విస్తరించడానికి బహిరంగంగా అందుబాటులో ఉన్న హోల్-జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్ డేటా జోడించబడింది. అందువల్ల, ఈ పనిలో మూడు హోల్-జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్ డేటా సోర్స్‌లు ఉపయోగించబడ్డాయి: పూర్తి/డ్రాఫ్ట్ జీనోమ్ అసెంబ్లీ, NCBI (నేషనల్ సెంటర్ ఫర్ బయోటెక్నాలజీ ఇన్ఫర్మేషన్)లో నిల్వ చేయబడిన 10 స్కాఫోల్డ్‌ల వరకు (n = 15 ఐసోలేట్‌లు); SRAలో నిల్వ చేయబడింది (సీక్వెన్స్ రీడ్ ఆర్కైవ్ యొక్క ఇల్యూమినా ఫాస్ట్‌క్ ఫైల్) M. బోవిస్ క్లోన్‌ల సంక్లిష్ట వైవిధ్యాన్ని సూచిస్తుంది (n = 12 ఐసోలేట్‌లు)30; మరియు పోర్చుగల్ నుండి 42 కొత్తగా సీక్వెన్స్ చేయబడిన జన్యువులు. మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ BCG (బాసిల్లే కాల్మెట్-గ్యురిన్) NCBI శోధన నుండి మినహాయించబడింది. M. bovis AF2122/97 సాధారణంగా డేటాసెట్‌లో చేర్చడానికి రిఫరెన్స్ జీనోమ్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది. ఆఫ్రికన్ 1 క్లోనింగ్ కాంప్లెక్స్ ద్వారా ప్రాతినిధ్యం వహించే మొత్తం జీనోమ్ సీక్వెన్స్ ప్రజలకు అందుబాటులో లేకపోవడం మరియు Af2 మరియు Eu1 యొక్క ప్రాతినిధ్య జాతుల నుండి తక్కువ సంఖ్యలో జన్యువులు ఉండటం వలన, SRA అందించిన అసలు సీక్వెన్సింగ్ డేటా ఈ సందర్భాలలో ఉపయోగించబడింది. జింపెల్ మరియు అతని సహకారుల పని (2020) పైన పేర్కొన్న క్లోనింగ్ కాంప్లెక్స్ నుండి జన్యువును గుర్తించడంలో సహాయపడింది మరియు డేటా సెట్‌లో చేర్చడానికి మైకోబాక్టీరియం బోవిస్‌ను ఎంచుకోవడంలో సహాయపడింది. Eu3 కోసం, ఒక రకమైన జన్యువు మాత్రమే వివరించబడింది (Branger et al., 2020), కాబట్టి మనం చేర్చే జన్యువు Eu3 కాంప్లెక్స్ యొక్క ప్రత్యేక ప్రతినిధి.
ప్రపంచవ్యాప్తంగా, ఈ డేటా సెట్‌లో 1985 నుండి 2016 వరకు 12 దేశాలలో పంపిణీ చేయబడిన 8 హోస్ట్ జాతుల నుండి వేరుచేయబడిన 70 పశువులు M. బోవిస్ ఉన్నాయి. 36 జాతులు Eu2గా గుర్తించబడ్డాయి, 7 జాతులు Eu1, 1 జాతులు Eu3, 3 జాతులు Af1, 4 జాతులు Af2 మరియు 19 ఏ క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌కు ఆపాదించబడలేదు (వివరాలు క్రింద ఉన్నాయి). ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ యొక్క వివరణాత్మక సమాచారం (యాక్సెషన్ నంబర్‌తో సహా) టేబుల్ 1 మరియు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1లో చూపబడింది.
పోర్చుగల్‌లోని జంతువుల క్షయవ్యాధి హాట్‌స్పాట్‌ల నుండి 12 సంవత్సరాలకు పైగా పంపిణీ చేయబడిన 42 కొత్తగా క్రమబద్ధీకరించబడిన మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ మొత్తం జన్యువులు ఈ అధ్యయనానికి కేంద్రంగా ఉన్నాయి, ఎందుకంటే సంభావ్య వన్యప్రాణుల-పశువుల వ్యాధి వ్యవస్థలను క్రమం తప్పకుండా పర్యవేక్షించడం జరిగింది 31,36 (అనుబంధ చిత్రం 1). తదుపరి విధానాల ప్రకారం, ఈ జాతులు 2003 నుండి 2015 వరకు పశువులు (n = 14), ఎర్ర జింకలు (n = 16) మరియు అడవి పంది (n = 12) నుండి వేరుచేయబడ్డాయి: సిఫార్సు చేయబడిన ప్రోటోకాల్ మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా జంతువులను సేకరించి నిర్వహించండి కణజాల నమూనాలు OIE టెరెస్ట్రియల్ యానిమల్ హ్యాండ్‌బుక్‌లో ఉన్నాయి మరియు స్టోన్‌బ్రింక్ మరియు లోవెన్‌స్టెయిన్-జెన్సెన్ పైరువేట్ ఘన మాధ్యమం మరియు ద్రవ మాధ్యమంలో టీకాలు వేయబడతాయి. సంస్కృతులు 37 °C వద్ద పొదిగేవి మరియు పెరుగుదల వారానికి ఒకసారి కనీసం 12 వారాల పాటు తనిఖీ చేయబడుతుంది. కాలనీలు నేరుగా -80ºC వద్ద గ్లిసరాల్ ద్రావణంలో నిల్వ చేయబడతాయి. మైకోబాక్టీరియం సెలెక్టివ్ మాధ్యమంలో (మిడిల్‌బ్రూక్ 7H9, BD డయాగ్నోస్టిక్స్), WGS ప్రోగ్రామ్ యొక్క DNA ను పొందడానికి అసలు ఆర్కైవ్ చేయబడిన నమూనాలను ఒకే ఇన్ విట్రో పాసేజ్ ఇన్ విట్రో ద్వారా పంపించారు. దీని కోసం, మిడిల్‌బ్రూక్ 7H9 లో 37°C రీట్రెయిన్ వద్ద స్తంభింపచేసిన కల్చర్ స్టాక్ ద్రావణాన్ని 5% సోడియం పైరువేట్ మరియు 10% ADS (50 గ్రా అల్బుమిన్, 20 గ్రా గ్లూకోజ్, 8.5 గ్రా సోడియం క్లోరైడ్ 1 లీటరు నీటిలో) తో సుసంపన్నం చేశారు. 4 వారాల పెరుగుదల తర్వాత, మాధ్యమం పునరుద్ధరించబడింది మరియు పెరుగుదల గమనించే వరకు కల్చర్‌ను క్రమం తప్పకుండా పర్యవేక్షించారు. కణాలను సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా సేకరించారు, గుళికను 500 µL ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్ (PBS) లో తిరిగి అమర్చారు, 99 °C వద్ద 30 నిమిషాలు వేడి చేసి, సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు మరియు సూపర్‌నాటెంట్‌ను -20 °C వద్ద WGS వరకు నిల్వ చేశారు. అన్ని విధానాలు స్థాయి 3 బయోసేఫ్టీ సౌకర్యాలలో నిర్వహించబడతాయి.
WGS పెయిర్డ్-ఎండ్ జీనోమ్ లైబ్రరీ ప్రతి DNA నమూనా యొక్క ప్రత్యేక సూచికను ఉపయోగించి తయారు చేయబడుతుంది మరియు సీక్వెన్సింగ్ కోసం ఇల్యూమినా మిసెక్ (2 × 250 pb) (40 నమూనాలు) మరియు హైసెక్ (2 × 150 pb) (రెండు ఐసోలేట్లు) టెక్నాలజీని (యూరోఫిన్స్ జెనోమిక్స్, జర్మనీ) ఉపయోగిస్తుంది. తయారీదారు సూచనల ప్రకారం, జెనోమిక్ DNA ను సీక్వెన్స్ చేయడానికి డబుల్-ఎండ్ మాడ్యూల్ అటాచ్‌మెంట్‌తో ఇల్యూమినా జీనోమ్ ఎనలైజర్‌ను ఉపయోగించండి మరియు లైబ్రరీని నిర్మించడానికి ఇల్యూమినా నుండి నెక్స్టెరా XT DNA లైబ్రరీ ప్రిపరేషన్ కిట్‌ను ఉపయోగించండి.
SRA (n = 12) నుండి కోలుకున్న డేటాను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, క్లోన్ కాంప్లెక్స్ యొక్క గుర్తింపును సంబంధిత ప్రచురణ 30, 41, 43 యొక్క మెటాడేటాగా ఉపయోగించవచ్చు. Eu1 మరియు Eu3 క్లోనల్ కాంప్లెక్స్ 25, 29 యొక్క గుర్తింపు పొందిన సభ్యులుగా ఉన్న మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ AF2122/97 మరియు మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ 3601 మినహా పూర్తి జన్యువును పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు, ఇది మైకోబాక్టీరియం ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ H37Rv (NCBI యాక్సెషన్ నంబర్ NC_000962.3) యొక్క పూర్తి జన్యువుతో సమానంగా ఉంటుంది. MAFFT (అమైనో ఆమ్లం లేదా న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్ యొక్క బహుళ అమరిక కార్యక్రమం, వెర్షన్ 7.458) మరియు పారామితి -addfragments48 ఉపయోగించి జీనోమ్ అమరికను నిర్వహిస్తారు. తరువాత, విభిన్న క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌లు లేకపోవడం మరియు/లేదా SNP లక్షణాల ఉనికి కోసం శోధించండి.
కొత్తగా క్రమం చేయబడిన మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ (n = 42) మరియు అసెంబుల్ చేయబడిన జీనోమ్ డ్రాఫ్ట్ (n = 3) యొక్క అసలు రీడ్‌లు vSNP పైప్‌లైన్ ద్వారా రిఫరెన్స్ జీనోమ్ మైకోబాక్టీరియం ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ H37Rv తో కాంప్లెక్స్‌ను సమలేఖనం చేస్తాయి మరియు వివిధ క్లోన్‌ల తొలగింపు మరియు/లేదా SNP లక్షణాల ఉనికిని తనిఖీ చేశారు.
సంబంధిత క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌కు జన్యుసంబంధమైన డేటాను కేటాయించడానికి లక్షణాల లేకపోవడం మరియు/లేదా SNP మరియు స్పోలిగోటైపింగ్ ప్రొఫైల్‌ల ఉనికి/లేకపోవడం నుండి సమాచారాన్ని సేకరించండి. నాలుగు డ్రాఫ్ట్ అసెంబ్లీలకు, స్పోలిగోటైపింగ్ ప్రొఫైల్‌ను ఊహించలేము, కాబట్టి అవి "సంక్లిష్టత లేదు" సమూహంలో చేర్చబడ్డాయి.
ఈ పని తర్వాత బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ వర్క్‌ఫ్లో డి నోవో అసెంబ్లీ మరియు మ్యాపింగ్ నుండి రిఫరెన్స్ స్ట్రాటజీ వరకు ప్రారంభమవుతుంది, రీకాంబినేషన్ ఈవెంట్‌లు మరియు నిర్దిష్ట జీనోమ్ పాలిమార్ఫిజమ్‌లను అన్వేషించే లక్ష్యంతో. ఫిగర్ 1 అనుసరించిన దశల ఫ్లోచార్ట్‌ను అందిస్తుంది. రీకాంబినేషన్ విశ్లేషణ కోసం, అన్ని జీనోమ్‌లను అనుమితులు మరియు సంబంధిత సూచికల దృఢత్వాన్ని పెంచడానికి ఉపయోగిస్తారు.
జీనోమ్ ఏకాభిప్రాయ శ్రేణుల ఉత్పత్తిలో లోపాలను తగ్గించడానికి, మేము మొదట డి నోవో అసెంబ్లీని పొందాము, ఆపై కోర్ బహుళ అలైన్‌మెంట్‌లను పొందాము. యూనిసైక్లర్ పైప్‌లైన్ ప్రస్తుతం https://github.com/rrwick/Unicycler49 వద్ద అందుబాటులో ఉంది మరియు 54 సీక్వెన్స్డ్ జీనోమ్‌ల (42 కొత్తగా సీక్వెన్స్డ్ మరియు 12 ఫాస్ట్‌క్ ఫైల్స్ SRA నుండి తిరిగి పొందబడ్డాయి) డి నోవో అసెంబ్లీని నిర్వహించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది. సంక్షిప్తంగా, మొదటి నుండి అసెంబుల్ చేయడానికి ముందు, రీడ్ క్వాలిటీ విశ్లేషణ FastQC వెర్షన్ 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), మరియు ట్రిమ్మోమాటిక్ వెర్షన్ 0.36 ("రీడ్‌ల నుండి అడాప్టర్‌లు మరియు ఇతర లైటింగ్-నిర్దిష్ట సీక్వెన్స్‌లను కత్తిరించడం" మరియు "రీడ్ ముగింపు నుండి బేస్‌లను కత్తిరించడం, 20 థ్రెషోల్డ్ నాణ్యత కంటే తక్కువగా ఉంటే" వర్తింపజేయబడింది) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50లో నిర్వహించబడింది. అప్పుడు, SPAdes ఆప్టిమైజర్49 ను జీనోమ్ అసెంబ్లీ కోసం ఉపయోగించారు మరియు పైలాన్ వెర్షన్ 1.1851 ను పోస్ట్-అసెంబ్లీ ఆప్టిమైజేషన్ కోసం ఉపయోగించారు. తప్పు అసెంబ్లీని నివారించడానికి సంప్రదాయవాద బ్రిడ్జింగ్ మోడ్‌ను ఎంచుకున్నారు మరియు k-mer పరిమాణాన్ని శోధించి, రీడ్ పొడవులో 20% మరియు 95% మధ్య ఎంచుకున్నారు. SPAdes మార్గదర్శకాలను అనుసరించండి మరియు రీడ్ సైజును పరిగణించండి, 300 bp కంటే తక్కువ కాంటిగ్‌లను తొలగించండి మరియు 52 యొక్క 20 రీడ్ డెప్త్ కవరేజ్ కటాఫ్‌ను ఏర్పాటు చేయండి. డి నోవో అసెంబ్లీ వ్యూహంలో, అధిక పునరావృత ప్రోలిన్-గ్లుటామేట్ (PE) మరియు ప్రోలిన్-ప్రోలిన్ గ్లుటామేట్ (PPE) పారాలాగ్‌లు వంటి జన్యు ప్రాంతాలు తొలగించబడలేదు.
డి నోవో అసెంబ్లీ నాణ్యతను QUAST పైప్‌లైన్ (http://quast.sourceforge.net/quast.html) ద్వారా అంచనా వేస్తారు, ఇది కాంటిగ్ మరియు M. bovis AF2122/97 రిఫరెన్స్ జీనోమ్ (NCBI యాక్సెషన్ నంబర్ LT708304.1) మ్యాపింగ్ పునరుద్ధరణను సులభతరం చేస్తుంది (నాణ్యత పారామితుల కోసం అనుబంధ పట్టిక 1 చూడండి).
vSNP పైప్‌లైన్ (https://github.com/USDA-VS/vSNP) సహాయంతో, ఇల్యూమినా సీక్వెన్సింగ్ నుండి కొత్తగా సీక్వెన్స్ చేయబడిన M. బోవిస్ యొక్క FASTQ ఫైల్‌ను M. బోవిస్ AF2122/97 రిఫరెన్స్ జీనోమ్ (LT708304.1)) తో పోల్చారు. జీనోమ్ అనాలిసిస్ టూల్‌కిట్ (GATK) 53, 54, 55 యొక్క ఉత్తమ అభ్యాస సిఫార్సుల ప్రకారం రీకాలిబ్రేషన్ కోసం ప్రామాణిక ఫిల్టర్ పారామితులు లేదా వేరియంట్ మాస్ స్కోర్‌లను వర్తింపజేస్తాయి. ఫలితాలు 150 మరియు AC = 2 యొక్క అత్యల్ప SAMtools మాస్ స్కోర్‌ను ఉపయోగించి ఫిల్టర్ చేయబడతాయి. కాలుష్యాన్ని తోసిపుచ్చడానికి రీడింగ్‌లను తనిఖీ చేయడానికి క్రాకెన్ (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) ను కూడా ఉపయోగించండి. మా పనిలో సీక్వెన్స్ వ్యూహాలను మ్యాప్ చేయడానికి ఉపయోగించే vSNP పైప్‌లైన్ నిర్వచించబడిన SNPలు మరియు లక్ష్యాల శ్రేణిని పరిశీలిస్తుంది మరియు మిశ్రమ సంక్రమణ దృశ్యాలను కూడా మినహాయిస్తుంది. రీడ్ జీనోమ్ కవరేజ్ 99% కంటే మెరుగ్గా ఉంది (అనుబంధ పట్టిక 1).
మ్యాపింగ్ లోపాలు మరియు తప్పు SNP లను నివారించడానికి, ఈ క్రింది సందర్భాలలో ఒక వేరియంట్‌ను ఫిల్టర్ చేయండి: (1) దీనికి 20 కంటే తక్కువ రీడింగ్‌లు మద్దతు ఇస్తాయి, (2) దీనికి 0.9 కంటే తక్కువ ఫ్రీక్వెన్సీతో కనుగొనబడుతుంది, (3) దీనికి కనీసం ఒక స్ట్రెయిన్‌లో ఉంటుంది, కానీ కనీసం మరొక స్ట్రెయిన్‌లో ఖాళీలు ఉంటాయి. ఇంటిగ్రేటెడ్ జెనోమిక్స్ వ్యూయర్ (IGV) వెర్షన్ 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 ను SNP లను మరియు మ్యాపింగ్ లేదా అలైన్‌మెంట్ సమస్యలతో స్థానాలను దృశ్యమానంగా ధృవీకరించడానికి ఉపయోగించారు. ప్రోలైన్-గ్లుటామేట్ (PE) మరియు ప్రోలైన్-ప్రోలైన్ గ్లుటామేట్ (PPE) జన్యువులు చాలా నకిలీవి మరియు బహుళ-జన్యు కుటుంబంలో భాగం కాబట్టి, అవి ఇల్యూమినా సీక్వెన్సింగ్ మరియు మిస్‌మ్యాపింగ్ ద్వారా సులభంగా తప్పుగా అర్థం చేసుకోబడతాయి, కాబట్టి అవి ప్రాధాన్యతనిస్తాయి. SNP లను నిర్ధారించడానికి మ్యాపింగ్ టు సీక్వెన్స్ వ్యూహాన్ని ఉపయోగించినప్పుడు మైకోబాక్టీరియల్ బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ వర్క్‌ఫ్లో క్షయవ్యాధి కాంప్లెక్స్ సభ్యులను తొలగించింది. అందువల్ల, మేము విశ్లేషణ నుండి PE/PPE జన్యువులు మరియు ఇండెల్‌లను ఫిల్టర్ చేసాము.
బోవిలిస్ట్ (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) ప్రకారం, అన్ని SNPలు క్రియాత్మక వర్గాలుగా విభజించబడ్డాయి. SnpEff పైప్‌లైన్ (https://pcingola.github.io/SnpEff/) SNP పరిణామాలను (పర్యాయపదాలు లేదా పర్యాయపదాలు కాని మార్పులు) అంచనా వేయడానికి ఉపయోగించబడుతుంది. మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ AF2122/97 జన్యువు (LT708304.1) యొక్క కొత్త డేటాబేస్ సృష్టించబడింది.
కోర్ జీనోమ్ బహుళ అమరికను Parsnp v1.2 ఉపయోగించి నిర్వహించారు, ఇది ప్రస్తుతం https://github.com/marbl/parsnp57 లో అందుబాటులో ఉంది, 69 పూర్తి జీనోమ్‌లు/డ్రాఫ్ట్ అసెంబ్లీలను (ఎంపిక -c తో) ఉపయోగించి మరియు M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) ను సూచనగా ఉపయోగించారు. నాలుగు కోర్ బహుళ అమరికలు జరిగాయి: Eu2 క్లోనింగ్ కాంప్లెక్స్ సభ్యులు మాత్రమే (n = 37), యూరోపియన్ క్లోనింగ్ కాంప్లెక్స్‌లోని అన్ని సభ్యులు (n = 44), యూరోపియన్ మరియు ఆఫ్రికన్ క్లోనింగ్ కాంప్లెక్స్ యొక్క జంక్షన్ పాయింట్ (n = 51)తో సహా, మరియు ఈ అధ్యయనంలో అన్ని మైకోబాక్టీరియం బోవిస్‌లను చేర్చారు (n = 70).
RAxML ఉపయోగించి CIPRES సైన్స్ గేట్‌వే v3.3 (http://www.phylo.org/)58 ఉపయోగించి గరిష్ట సంభావ్యత (ML) ఫైలోజెనెటిక్ ట్రీని అంచనా వేయడానికి మరియు 1000 గైడెడ్ రెప్లికేషన్‌లను నిర్వహించడానికి Parsnp ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన కోర్ అలైన్‌మెంట్ ఉపయోగించబడుతుంది.
పునఃసంయోగ సంఘటనల ఉనికిని సమాంతరంగా తనిఖీ చేయడానికి మూడు వేర్వేరు అల్గోరిథంలు మరియు బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ సాధనాలను ఉపయోగిస్తారు: స్ప్లిట్స్‌ట్రీ4 సాఫ్ట్‌వేర్, గుబ్బిన్స్ (న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్‌లలో పునఃసంయోగం ద్వారా నిష్పాక్షిక వంశం) పైప్‌లైన్ మరియు RDP4 (పునఃసంయోగ గుర్తింపు ప్రోగ్రామ్, వెర్షన్ బీటా 4.101) సాఫ్ట్‌వేర్.
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 లో అమలు చేయబడిన స్ప్లిట్ డికంపోజిషన్ పద్ధతిని గణాంక ధృవీకరణ కోసం Phi పరీక్షను ఉపయోగించి, రూట్‌లెస్ ఫైలోజెనెటిక్ నెట్‌వర్క్‌ను లెక్కించడానికి ఉపయోగిస్తారు మరియు ప్రాముఖ్యత థ్రెషోల్డ్ p = 0.05. Parsnp యొక్క కోర్ మల్టీ-అలైన్‌మెంట్ విశ్లేషణను ఇన్‌పుట్‌గా ఉపయోగిస్తారు మరియు నెట్‌వర్క్ ప్రమాణంగా స్ప్లిటింగ్ డికంపోజిషన్ గ్రహించబడుతుంది.
గబ్బిన్స్ పైప్‌లైన్ v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 మైకోబాక్టీరియం బోవిస్‌పై పునఃసంయోగం ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడానికి మరొక మార్గంగా డిఫాల్ట్ పారామితులతో నడుస్తుంది. పైప్‌లైన్‌లో అమలు చేయబడిన అల్గోరిథం సంబంధిత క్లోన్ వంశాన్ని పునర్నిర్మిస్తుంది మా డేటా సెట్ యొక్క పూర్తి జీనోమ్/డ్రాఫ్ట్ అసెంబ్లీ మరియు రిఫరెన్స్ జీనోమ్ (బోవిన్ బోవిడ్ AF2122/97, LT708304.1) పరస్పరం ఉంటాయి; మరియు పునఃసంయోగం ఈవెంట్‌ను సూచించే SNP క్లస్టర్‌ను గుర్తించడానికి చెట్టు యొక్క ప్రతి శాఖపై SNP స్థానాన్ని స్కాన్ చేయండి. బ్రాంచ్ యొక్క సున్నా పునఃసంయోగం ఈవెంట్ లేదని భావించండి, అంటే బ్రాంచ్‌లో సంభవించే SNPలు సమానంగా పంపిణీ చేయబడాలి. Parsnp నుండి కోర్ బహుళ అమరిక మరియు RAxML నుండి ఉత్తమ స్కోర్ చేసిన ML చెట్టు ఇన్‌పుట్ ఫైల్‌లుగా ఉపయోగించబడతాయి.
చివరగా, గుబ్బిన్స్ పైప్‌లైన్ సూచించిన పునర్వ్యవస్థీకరణ ఈవెంట్‌ను నిర్ధారించడానికి, RDP467లో అమలు చేయబడిన ఆరు అల్గోరిథంలు (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 మరియు SiScan66) డిఫాల్ట్ సెట్టింగ్‌ల కింద పార్స్‌ఎన్‌పి యొక్క కోర్ బహుళ అమరికకు వర్తింపజేయబడ్డాయి. ప్రతి పునఃసంయోగ ఈవెంట్‌ను ధృవీకరించడానికి RDP4లో అమలు చేయబడిన అల్గోరిథంలలో కనీసం మూడు స్థిరంగా ఒక ముఖ్యమైన సంకేతాన్ని ప్రదర్శించాలని మేము నిర్ణయించాము.
గబ్బిన్స్ మరియు RDP సాఫ్ట్‌వేర్ రెండూ 500 bp వరకు ఉన్న విండోలో కోర్ బహుళ అమరికలను తనిఖీ చేయడం ద్వారా రీకాంబినేషన్ సిగ్నల్‌ల కోసం చూస్తాయని మరియు డి నోవో అసెంబ్లీ సమయంలో PE/PPE జన్యువులను చేర్చడం వలన కనుగొనబడిన రీకాంబినేషన్ సిగ్నల్‌లకు అంతరాయం కలగదని నిర్ధారించడం ద్వారా, హోమోలీనియారిటీ ద్వారా మరింత విశ్లేషణ జరుగుతుంది రీకాంబినేషన్ ఈవెంట్‌ను గుర్తించే జన్యువు యొక్క పరిసరాలను తనిఖీ చేయండి. పూర్తి జన్యువును ఉపయోగించే సిన్‌లీనియర్ మ్యాప్ MAUVE-మల్టీ-జీనోమ్ అమరిక (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ఉపయోగించి స్థానిక జన్యు బదిలీలు లేదా విలోమాలను మినహాయించడానికి నిర్మించబడింది. అదనంగా, మొత్తం జన్యువును SyntTax వెబ్ సర్వర్ (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) ద్వారా అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిపై హోమోలీనియారిటీ విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి ఉపయోగించారు.
పోర్చుగీస్ మల్టీ-హోస్ట్ ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ సిస్టమ్ నుండి పొందిన జీనోమ్ డేటా సెట్ యొక్క మరింత లోతైన విశ్లేషణ ఏమిటంటే, సాహిత్యంలో పేర్కొన్న జన్యువుల పాలిమార్ఫిజమ్‌ను తనిఖీ చేయడం. ఈ జన్యువులు 37,38 మరియు HGT (DNA మరమ్మత్తు, ప్రతిరూపణ మరియు పునఃసంయోగం) సిస్టమ్ భాగాలు 39 ద్వారా MTBC పూర్వీకులు పొందిన జన్యు ఎన్‌కోడింగ్ 3R. జన్యు వైవిధ్యం మరియు న్యూక్లియోటైడ్ వైవిధ్యం (π) మరియు తాజిమా యొక్క D తటస్థ పరీక్ష పారామితి ఇన్‌పుట్‌ను లెక్కించడానికి ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/)ని ఉపయోగించండి మరియు DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/)ని ఉపయోగించండి.
69 మైకోప్లాస్మా బోవిస్ ఐసోలేట్లు మరియు రిఫరెన్స్ జీనోమ్‌ల ఆధారంగా గరిష్ట సంభావ్యత (ML) ఫైలోజెనెటిక్ చెట్టు పొందబడింది (మూర్తి 2A). సింగిల్-జీన్-ఆధారిత చెట్లు లేదా మల్టీ-లోకస్-ఆధారిత చెట్లతో పోలిస్తే, ఈ వ్యూహం మొత్తం జన్యువు యొక్క వైవిధ్యాన్ని సంగ్రహించని మరింత శక్తివంతమైన చెట్ల ఉత్పత్తికి అనుమతిస్తుంది మరియు అందువల్ల జాతుల 68,69 మధ్య వివక్ష చూపే తక్కువ సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శిస్తుంది. ML చెట్టు యొక్క టోపోలాజికల్ నిర్మాణం సాధారణంగా క్లోన్‌ల సంక్లిష్ట వర్గీకరణకు అనుగుణంగా ఉంటుంది. Eu2 యొక్క జన్యువు ఒక శాఖలో సమూహంగా ఉంటుంది మరియు Af1 యొక్క జన్యువు కూడా కలిసి సమూహంగా ఉంటుంది (మూర్తి 2A). ఫలితం మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ యొక్క తెలిసిన పరిణామ సంబంధానికి కూడా అనుగుణంగా ఉంటుంది, అంటే, Eu1 సభ్యుడు మరియు అన్ని ఇతర క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌లు మరియు జన్యువులతో కూడిన సమూహం మధ్య పెద్ద వ్యత్యాసం ఉంది, కానీ క్లోనల్ కాంప్లెక్స్ 30 పేర్కొనబడలేదు. క్లోనల్ కాంప్లెక్స్ మరియు ఫైలోజెనెటిక్ చెట్టుపై గమనించిన సంబంధం మధ్య ఉన్న చిన్న అస్థిరతను, క్లోనల్ కాంప్లెక్స్ నిర్దిష్ట జన్యు ప్రాంతాల ఆధారంగా వివరించబడిందనే వాస్తవం ద్వారా వివరించవచ్చు, అయితే ఫైలోజెనెటిక్ చెట్టు మొత్తం జన్యువును సూచించే కోర్ జన్యువుల బహుళ అమరికలపై ఆధారపడి ఉంటుంది.
రీకాంబినేషన్ సైట్ యొక్క (A) తొలగింపుకు ముందు మరియు (B) తర్వాత మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ జన్యువు యొక్క కోర్ జీనోమ్ అలైన్‌మెంట్ ఆధారంగా గరిష్ట సంభావ్యత ఫైలోజెనెటిక్ ట్రీ (GTR) నిర్మించబడింది. శాఖ రంగులు మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ క్లోన్ కాంప్లెక్స్‌ను సూచిస్తాయి: యూరప్ 1 ఊదా రంగు, యూరప్ 2 ఎరుపు, యూరప్ 3 నీలం, ఆఫ్రికా 1 నారింజ మరియు ఆఫ్రికా 2 ఆకుపచ్చ రంగులో ఉంటాయి. చెట్టు వేళ్ళు పెరిగే మరియు స్కేల్‌కు డ్రా చేయబడి, ప్రతి సైట్‌కు ప్రత్యామ్నాయంగా శాఖ పొడవును కొలుస్తారు.
మైకోబాక్టీరియం ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ కాంప్లెక్స్‌ను క్లోనల్‌గా పరిణామం చెందినదిగా వర్ణించారు మరియు సంవత్సరాలుగా సేకరించబడిన చాలా ఆధారాలు కొనసాగుతున్న HGT మరియు పునఃసంయోగ సంఘటనలు MTBC15,17,18 యొక్క గుర్తించదగిన స్థాయిలో జరగవు అనే ఆలోచనకు మద్దతు ఇస్తున్నాయి.
మునుపటి పని MTBC జాతుల మధ్య పరిమిత పునఃసంయోగం ఉండవచ్చని చూపించింది20,21, అయితే ఇతరులు కొలవగల పునఃసంయోగ సంఘటనలను గుర్తించడంలో విఫలమయ్యారు70,71. మైకోబాక్టీరియం బోవిస్‌పై దృష్టి సారించి ఈ సమస్యను తిరిగి చర్చించండి, ఇది మైకోబాక్టీరియం ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ 70,71ని మాత్రమే పరిగణించిన మునుపటి పనికి భిన్నంగా ఉంటుంది; లేదా MTBCని మొత్తంగా పరిగణించండి, దాదాపు M. బోవిస్ 20ని సూచించకుండా; లేదా నిర్బంధ పశువుల భిన్నాలను మాత్రమే పరిగణించండి. మైకోబాక్టీరియా డేటాసెట్, ఈ పనిలో, పునఃసంయోగం కోసం స్క్రీనింగ్ చేయడానికి ఉపయోగించే అన్ని క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌లను సూచించే మొత్తం 70 జాతులు ఉన్నాయి. డేటా సెట్ నాలుగు సంచిత స్థాయిల ప్రకారం స్కేల్ చేయబడింది: (1) Eu2 సభ్యులు, (2) అన్ని యూరోపియన్ క్లోన్ కాంప్లెక్స్ సభ్యులు (అంటే యూరప్), (3) యూరోపియన్ మరియు ఆఫ్రికన్ క్లోన్ కాంప్లెక్స్ (Eu + Af) మరియు (4) మొత్తం డేటా సేకరణలు (ఇప్పటికే వివరించిన ఏ క్లోనింగ్ కాంప్లెక్స్‌లలో చేర్చబడని జన్యువులతో సహా).
ఈ పరికల్పనను మరింత అధ్యయనం చేయడానికి, జన్యువుల మధ్య పునఃసంయోగ సంఘటనలు లేకపోవడాన్ని అంచనా వేయడానికి స్ప్లిట్-డికంపోజిషన్ నెట్‌వర్క్ నిర్వహించబడింది, ఎందుకంటే ఈ పద్ధతి వ్యక్తుల మధ్య పూర్వీకుల సంబంధాన్ని దృశ్యమానం చేయగలదు మరియు విరుద్ధమైన ఫైలోజెనెటిక్ సంకేతాలను ప్రదర్శిస్తుంది. విశ్లేషణలోని నాలుగు డేటా సెట్‌లు నెట్‌వర్క్‌లో లూప్‌ల ఉనికిని నిర్ధారించాయి (అంటే, ఒకే చెట్టుగా కలుస్తాయి కాని ప్రాంతాలు), కానీ ఫై పరీక్షకు గణాంక మద్దతు లేదు (Eu2, p = 0.0956; యూరప్, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; మొత్తం డేటా సెట్ p = 0.2451), ఇది పునర్వ్యవస్థీకరణ సంఘటనల ఉనికికి పేలవమైన ఆధారాలను అందిస్తుంది (మూర్తి 3A-D).
యూరప్‌లో 2 జన్యువులు (n = 37) (A), యూరోపియన్ జన్యువులు (n = 44) (B), యూరోపియన్ మరియు ఆఫ్రికన్ జన్యువులు (n = 51) (C) మరియు మొత్తం డేటా సెట్ (n = 70) (D).
ఈ విశ్లేషణ తర్వాత, మరియు అన్ని నెట్‌వర్క్‌లలోని చక్రీయ పరిశీలనలను పరిగణనలోకి తీసుకుని, గుబ్బిన్స్ పైప్‌లైన్‌లో అమలు చేయబడిన పునర్నిర్మాణ అల్గోరిథం క్లోనల్ వంశాన్ని పునర్నిర్మించడానికి మరియు M. బోవిస్ జన్యువుపై పునఃసంయోగం యొక్క ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడానికి వర్తించబడింది. పునఃసంయోగ సంఘటనల సంచిత సంఖ్యను ఊహించండి, వీటిలో ఎక్కువ భాగం టెర్మినల్ శాఖలలో (అంటే, ఒకే జన్యువులో) సంభవించాయి (టేబుల్ 2). ఈ సూచికలు మొత్తం డేటా సెట్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని చూపుతాయి మరియు పునఃసంయోగ సంఘటనల ఫ్రీక్వెన్సీ ఉత్పరివర్తనాల కంటే 200 నుండి 300 రెట్లు ఉంటుందని సూచిస్తున్నాయి. శాఖపై పునఃసంయోగం మరియు పాయింట్ ఉత్పరివర్తనాల సాపేక్ష రేట్లను సూచించే రో/తీటా పరామితి 0.0037 మరియు 0.0056 మధ్య ఉన్నట్లు కనిపించిన తర్వాత (టేబుల్ 3). ఇటీవల, 38 M. బోవిస్ జాతి యొక్క ప్రచురించబడిన పని ఈ డేటాసెట్‌లో పొందిన దానికంటే ఎక్కువ rho/theta విలువను (rho/theta = 0.1) ప్రదర్శించింది, అయితే పటానే మరియు సహచరుల పని పునఃసంయోగ పారామితులను ఊహించడానికి సూచన-ఆధారిత అసెంబ్లీని ఉపయోగించింది, అసెంబ్లీ విధానం కారణంగా ఒక విధానపరమైన వివరాలు, టెర్మినల్ బ్రాంచ్‌లో పుటేటివ్ పునఃసంయోగ సంఘటనల సమృద్ధితో ముడిపడి ఉన్నాయి.
తరువాత, r/m పరామితి పునఃసంయోగం మరియు ఉత్పరివర్తన పరిచయం యొక్క వైవిధ్య నిష్పత్తిని సూచిస్తుంది మరియు దాని సగటు విలువ 0.025 మరియు 0.037 మధ్య ఉంటుంది, ఉత్పరివర్తనలతో పోలిస్తే, పునఃసంయోగం M. బోవిస్ యొక్క జన్యు వైవిధ్యంపై తక్కువ మొత్తం ప్రభావాన్ని చూపుతుందని సూచిస్తుంది (టేబుల్ 3)). విస్తృతమైన పోలిక కోసం, 23 జన్యువులతో కూడిన MTBC డేటాసెట్ కోసం r/m పరామితిని అంచనా వేయడానికి ఇదే విధమైన పద్ధతిని ఉపయోగించారు, ఇది 0.48620 సగటు విలువను చూపుతుంది, అయితే పటానే మరియు సహచరుల 38 M. బోవిస్ డేటాసెట్ కోసం, ఇది సగటు విలువ 0.98 అని నిరూపించింది. మొదటి అధ్యయనంలో, M. బోవిస్ (M. బోవిస్ BCG మరియు రిఫరెన్స్ స్ట్రెయిన్) యొక్క పనిలో చేర్చబడిన 23 జన్యువులలో రెండు మాత్రమే, కాబట్టి పొందిన విలువ M. ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ జన్యువు యొక్క అతిగా వ్యక్తీకరణ కారణంగా పక్షపాతంతో ఉండవచ్చు. రెండవ నివేదికలో, విశ్లేషించబడిన మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ జనాభా ప్రధానంగా యునైటెడ్ స్టేట్స్ మరియు పశువుల హోస్ట్‌ల నుండి తిరిగి పొందబడింది. దీనికి విరుద్ధంగా, మా డేటా సెట్‌లో, ఎక్కువ భౌగోళిక స్థానాలు మరియు హోస్ట్ జాతులు ప్రాతినిధ్యం వహిస్తాయి మరియు విభిన్న జనాభా జన్యు లక్షణాలతో విభిన్న క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌లుగా వర్గీకరించబడిన జన్యువులు కూడా ఉపయోగించబడతాయి, తద్వారా లోతైన మరియు విస్తృత జనాభా జ్ఞానాన్ని సాధిస్తాయి. మా డేటా సెట్‌తో పొందిన వ్యత్యాసం r/m సగటు విలువ ఒకే వర్గీకరణ జాతులకు కేటాయించిన వంశాల మధ్య పునఃసంయోగం యొక్క డిగ్రీ చాలా తేడా ఉంటుందనే భావనకు అనుగుణంగా ఉంటుంది, కాబట్టి ఈ ఫలితాలు M. బోవిస్ క్లోన్ కాంప్లెక్స్ పునఃసంయోగం తేడాలను ప్రదర్శించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి. ప్రభావం కూడా డిడెలోట్ & మైడెన్72 సూచించినట్లుగా ఉంది. అయినప్పటికీ, పెద్ద సంఖ్యలో M. బోవిస్ జన్యువులను చేర్చడం ద్వారా ఈ డేటా సెట్‌ను గణనీయంగా విస్తరించడం వల్ల ఈ పాయింట్ యొక్క మరింత స్పష్టత లభిస్తుంది. r/m మరియు rho/theta పారామితులు రెండూ శాఖల మధ్య వైవిధ్యాన్ని చూపుతాయి మరియు ఈ ఫలితం ఇతర బాక్టీరియా జాతులపై నివేదికలతో స్థిరంగా ఉంటుంది72,73.
చివరగా, గుబ్బిన్స్ పైప్‌లైన్ ద్వారా గుర్తించబడిన పునర్వ్యవస్థీకరణ సంఘటనలను నిర్ధారించడానికి, RDP4 సాఫ్ట్‌వేర్‌లో ఆరు వేర్వేరు అల్గోరిథంలను ఉపయోగించి వేర్వేరు కోర్ బహుళ-పోలికలను స్వతంత్రంగా పరీక్షించారు. ప్రపంచవ్యాప్తంగా, గుబ్బిన్స్ గుర్తించిన సంఘటనలలో సగం కంటే తక్కువ RDP4 ద్వారా నిర్ధారించబడ్డాయి (పట్టికలు 4 మరియు 5). మొత్తం డేటా సెట్‌ను పరిశీలిస్తే, మూడు పునఃసంయోగ సంఘటనలు నిర్ధారించబడ్డాయి, రెండు అంతర్గత నోడ్‌లను కలిగి ఉంటాయి మరియు మరొకటి టెర్మినల్ బ్రాంచ్‌లోని ఒకే జన్యువును కలిగి ఉంటాయి, వీటి కోసం క్లోనల్ కాంప్లెక్స్‌లను కేటాయించలేము (పట్టికలు 4 మరియు 5). టెర్మినల్ బ్రాంచ్‌లలోని సంఘటనల గుర్తింపు సమకాలీన M. బోవిస్ జాతులలో పునఃసంయోగం ఇప్పటికీ పురోగతిలో ఉందని లేదా ఫలితం తప్పుగా ఉందని సూచిస్తుంది70. ఈ ఊహాత్మక పునఃసంయోగ ప్రాంతంలో, దాదాపు 20% స్థానాలు నిర్వచించబడని న్యూక్లియోటైడ్‌లను (N) కలిగి ఉంటాయి, తద్వారా పునఃసంయోగ సిగ్నల్‌ను ప్రభావితం చేస్తుంది (అనుబంధ చిత్రం 2). అదనంగా, ఈ ప్రాంతం rrs జన్యువును ప్రభావితం చేస్తుంది, ఇది బాగా సంరక్షించబడుతుందని భావిస్తున్న 16S రైబోసోమల్ RNAను ఎన్కోడ్ చేస్తుంది, కాబట్టి ఈ పుటేటివ్ రీకాంబినేషన్ సిగ్నల్ సీక్వెన్సింగ్ లోపాలు లేదా తప్పుగా అమర్చడం ఫలితంగా ఉండవచ్చు. అప్పుడు Mb0003 మరియు మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ AF2122/97 మధ్య మొత్తం జీనోమ్ అమరిక నిర్వహించబడింది మరియు నిర్వచించబడని న్యూక్లియోటైడ్లు మరియు SNPల ఉనికి నిర్ధారించబడింది, కాబట్టి తప్పు అమరికకు సంబంధించిన సమస్యలు ఈ పనిలో అమలు చేయబడిన జీవసంబంధమైన సమాచారం వల్ల కాదు. ప్రోగ్రామ్ నేర్చుకున్న తర్వాత కనిపించింది.
అంతర్గత నోడ్‌ల పునఃసంయోగ ప్రాంతాలలో ఖాళీలు లేదా నిర్వచించబడని న్యూక్లియోటైడ్‌లు కనుగొనబడలేదు (చిత్రాలు 4 మరియు 5). ఈ సంఘటనలకు సంబంధించి, ఒకటి Eu2 జన్యువును మాత్రమే కలిగి ఉంటుంది మరియు pks12 జన్యువును ప్రభావితం చేస్తుంది, ఇది సాధ్యమయ్యే పాలికెటైడ్ సింథేస్‌ను ఎన్కోడ్ చేస్తుంది; మరొకటి Eu1 జన్యువులో నమోదు చేయబడి, సాధ్యమయ్యే నైట్రేట్ రిడక్టేజ్‌ను ఎన్కోడ్ చేసే నార్ఎక్స్ జన్యువును ప్రభావితం చేస్తుంది (టేబుల్ 4). సాధారణంగా, పునఃసంయోగ విశ్లేషణ గణాంక మద్దతుతో పరిమిత సంఖ్యలో పునఃసంయోగ భాగాలు ఉన్నాయని చూపిస్తుంది మరియు ఊహించిన సూచికలు పునఃసంయోగం M. బోవిస్ వంశంపై తక్కువ ప్రభావాన్ని చూపుతుందని సూచిస్తున్నాయి. పునఃసంయోగం సిగ్నల్ తక్కువగా ఉంటుందని భావిస్తున్నారు, కానీ నేపథ్య శబ్దం నుండి నిజమైన పరిణామ సంకేతాన్ని వేరు చేయడం ముఖ్యం, ఇది ఒక సవాలుతో కూడిన పని. రిఫరెన్స్-ఆధారిత అసెంబ్లీ మరియు అసమతుల్యత సమస్యలు 70, 71 ద్వారా ప్రవేశపెట్టబడిన శబ్ద సంకేతాన్ని తగ్గించడానికి, పూర్తి జన్యువు మినహా మిగిలినవన్నీ మొదటి నుండి సమీకరించబడ్డాయి మరియు అసెంబ్లీ నాణ్యతను QUAST పైప్‌లైన్ విశ్లేషణ (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1) ద్వారా తనిఖీ చేసి నిర్ధారించారు. అదనంగా, మొత్తం సర్వే యొక్క దృఢత్వం మరియు ఖచ్చితత్వాన్ని అందించడానికి అనుబంధ విశ్లేషణల శ్రేణిని నిర్వహించారు. అందువల్ల, మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ AF2122/97 కు వ్యతిరేకంగా రీడ్ మ్యాపింగ్ ద్వారా narX మరియు pks12 జన్యువుల శ్రేణి నాణ్యతను అంచనా వేశారు. రీకాంబినేషన్ ప్రాంతంలో సిఫార్సు చేయబడిన SNP స్థానం పద్ధతి విభాగంలో పేర్కొన్న ప్రమాణాలను (కనీసం 20 రీడింగ్‌లు మరియు 0.9 మార్పు ఫ్రీక్వెన్సీ) వర్తింపజేయడం ద్వారా నిర్ధారించబడింది. narX జన్యువు యొక్క పాలిమార్ఫిజం రెండు జన్యువులలో (Mb1792361 మరియు Mb7240415; 2.3%) మరియు pks12 జన్యువు యొక్క జన్యువులలో పూర్తిగా నిర్ధారించబడింది: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, మరియు Mb12 జన్యువులు. అయితే, Mb2043 జన్యువుకు సంబంధించి, ఎనిమిది స్థానాల్లో ఆరు రీడ్ డెప్త్ ప్రమాణాన్ని అందుకోలేదు ఎందుకంటే SNP గరిష్టంగా 17 రీడ్‌ల ద్వారా మద్దతు ఇస్తుంది, ఇది స్థాపించబడిన కటాఫ్ విలువ 20 కంటే తక్కువ. అందువల్ల, ఈ జన్యు ప్రదేశంలో ఆరు జన్యువుల (8.6%) పునఃసంయోగాన్ని నిర్ధారించవచ్చు (చిత్రాలు 4 మరియు 5).
మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ డేటాసెట్ యొక్క రీకాంబినేషన్ రీజియన్ అలైన్‌మెంట్ యొక్క వివరణాత్మక విజువలైజేషన్, నైట్రేట్ రిడక్టేజ్‌ను ఎన్కోడ్ చేసే నార్ఎక్స్ జన్యువును ప్రభావితం చేస్తుంది. అంతర్గత నోడ్‌ల రీకాంబినేషన్ ప్రాంతంలో ఖాళీలు లేదా నిర్వచించబడని న్యూక్లియోటైడ్‌లు కనుగొనబడలేదు. ఈ ప్రత్యేక సంఘటన Eu1 జన్యువులో నమోదు చేయబడింది. మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ AF2122/97 యొక్క రీడ్‌లను ప్లాట్ చేయడం ద్వారా నార్ఎక్స్ జన్యువు యొక్క సీక్వెన్సింగ్ నాణ్యతను అంచనా వేశారు. పద్ధతి విభాగంలో పేర్కొన్న ప్రమాణాలను (కనీసం 20 రీడింగ్‌లు మరియు 0.9 మార్పు ఫ్రీక్వెన్సీ) వర్తింపజేయడం ద్వారా రీకాంబినేషన్ ప్రాంతంలో సిఫార్సు చేయబడిన SNP స్థానాన్ని నిర్ధారించండి. Mb1792361 మరియు Mb7240415 (2.3%) జన్యువులలో నార్ఎక్స్ జన్యువు యొక్క పాలిమార్ఫిజం పూర్తిగా నిర్ధారించబడింది.
pks12 జన్యువును ప్రభావితం చేసే మైకోప్లాస్మా బోవిస్ డేటాసెట్ యొక్క రీకాంబినేషన్ ప్రాంత అమరిక యొక్క వివరణాత్మక విజువలైజేషన్. అంతర్గత నోడ్‌ల రీకాంబినేషన్ ప్రాంతంలో ఖాళీలు లేదా నిర్వచించబడని న్యూక్లియోటైడ్‌లు కనుగొనబడలేదు. pks12 జన్యువును ఎన్‌కోడింగ్ చేసే పాలీకెటైడ్ సింథేస్‌ను ప్రభావితం చేసే సంఘటనకు సంబంధించి, ఇది Eu2 జన్యువును మాత్రమే కలిగి ఉంటుంది. మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ AF2122/97 యొక్క రీడ్ మ్యాపింగ్ ద్వారా pks12 యొక్క సీక్వెన్సింగ్ నాణ్యతను అంచనా వేశారు. పద్ధతి విభాగంలో పేర్కొన్న ప్రమాణాలను (కనీసం 20 రీడింగ్‌లు మరియు 0.9 మార్పు ఫ్రీక్వెన్సీ) వర్తింపజేయడం ద్వారా రీకాంబినేషన్ ప్రాంతంలో సిఫార్సు చేయబడిన SNP స్థానాన్ని నిర్ధారించండి. Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, మరియు Mb1960 జన్యువుల పాలిమార్ఫిజమ్‌లు పూర్తిగా నిర్ధారించబడ్డాయి.
PE మరియు PPE జన్యువులు ఇల్యూమినా సీక్వెన్సింగ్ మరియు మిస్‌మ్యాపింగ్ ద్వారా సులభంగా తప్పుగా చదవబడే పునరావృత ప్రాంతాలను కలిగి ఉంటాయి, కాబట్టి అవి సాధారణంగా M. ట్యూబర్‌క్యులోసిస్ సభ్యుల బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ వర్క్‌ఫ్లో నుండి తొలగించబడతాయి, మ్యాపింగ్-టు-సీక్వెన్స్ వ్యూహాన్ని ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు మాత్రమే. ఈ పనిలో వర్తించే రీకాంబినేషన్ ఈవెంట్‌ల అనుమితి PE/PPEని ఫిల్టర్ చేయకుండా డి నోవో అసెంబ్లీపై ఆధారపడి ఉంటుంది. స్ప్లిట్స్‌ట్రీ, గుబ్బిన్స్ పైప్‌లైన్ మరియు RDP4 సాఫ్ట్‌వేర్ ద్వారా మూడు వేర్వేరు పరిపూరకరమైన పద్ధతులు మరియు అల్గారిథమ్‌లను అమలు చేయడం ద్వారా, వర్తించే వ్యూహాలు ఎర్రర్ సిగ్నల్‌ల వల్ల కలిగే పునర్వ్యవస్థీకరించబడిన ప్రాంతాలను ప్రాసెస్ చేయడానికి మరియు ఫిల్టర్ చేయడానికి బలంగా ఉన్నాయని మేము విశ్వసిస్తున్నాము. అయితే, SNP క్లస్టర్‌లను గుర్తించడానికి గుబ్బిన్స్ మరియు RDP4 సాఫ్ట్‌వేర్‌పై PE/PPE జన్యువు యొక్క జోక్యాన్ని మినహాయించడానికి మరియు అందువల్ల narX మరియు pks12 జన్యువులను ప్రభావితం చేయడానికి ప్రతిపాదించబడిన రీకాంబినేషన్ ప్రాంతాల గుర్తింపును, ఈ జన్యువుల పొరుగు ప్రాంతాన్ని పరిశీలించారు (అనుబంధ చిత్రం 3–5). M. bovis AF2122/97 లో, narX జన్యువును narK2 మరియు Mb1764c లు వేరు చేస్తాయి, అయితే pks12 చుట్టూ Mb2075c e Mb2073c (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 3-5) ఉంటుంది. పూర్తి జన్యువు యొక్క MAUVE సింలైన్ మ్యాప్ ఉపయోగించి రూపొందించబడిన మ్యాప్ జన్యు శ్రేణి పరిరక్షణ మరియు పునర్వ్యవస్థీకరణ గురించి సమాచారాన్ని అందిస్తుంది, నాలుగు కోలినియర్ బ్లాక్‌లను చూపిస్తుంది మరియు జన్యురాశి బదిలీ లేదా విలోమ సంకేతాలు లేవు. అదనంగా, అమైనో ఆమ్ల శ్రేణితో పూరక విశ్లేషణ అన్ని పూర్తి జన్యువులలో హోమోలజీని నిరూపించింది మరియు narX లేదా pks12 యొక్క ప్రక్కనే ఉన్న ప్రాంతాలలో PE/PPE కనుగొనబడలేదు. narX కొరకు, ఒక జన్యువు (Mb0030) తక్కువ పర్యాయపద స్కోరును కలిగి ఉంది ఎందుకంటే narX జన్యువు రెండు శకలాలుగా గుర్తించబడింది (శకలాలు 1891 మరియు 1890). pks12 కొరకు, సారూప్యతల కారణంగా, Mb0030 మరియు Mb003 తక్కువ సిన్‌లీనియారిటీ స్కోర్‌లను ప్రదర్శించాయి, అయితే pks12 వరుసగా రెండు మరియు మూడు భాగాలలో గుర్తించబడింది, ఇవి ప్రోటీన్ యొక్క విభిన్న డొమైన్‌లను సూచిస్తాయి (అనుబంధ చిత్రం 3-5). ఈ సమాచారాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకుని, గుబ్బిన్స్ మరియు RDP4 సాఫ్ట్‌వేర్ రెండూ విశ్లేషణను నిర్వహిస్తాయి, విండోలో గరిష్టంగా 500 bp యొక్క కోర్ బహుళ అమరికను తనిఖీ చేయండి, PE/PPE జన్యువు narX మరియు pks12 లను ప్రభావితం చేసే రీకాంబినేషన్ సిగ్నల్‌తో జోక్యం చేసుకోదని మేము నిర్ధారించాము.
ఈ డేటా సమితిలో కనుగొనబడిన పునఃసంయోగ సంకేతాలను అవశేషంగా పరిగణించవచ్చు, అయితే M. బోవిస్‌లో పునఃసంయోగాన్ని తోసిపుచ్చలేము అనేది నిజం, కాబట్టి ఇది మరింత విశ్లేషణకు సంబంధించిన అంశంగా కొనసాగాలి, దీనిలో వివిధ ఎపిడెమియోలాజికల్ దృశ్యాల నుండి మొత్తం జన్యువులు ముఖ్యమైనవిగా క్రమం చేయబడతాయి.
పునఃసంయోగ దిద్దుబాటుకు ముందు మరియు తరువాత పొందిన ML ఫైలోజెనెటిక్ చెట్లను పోల్చడం (మూర్తి 2A, B) ఊహించిన ఫైలోజెనెటిక్ సంబంధంలో గణనీయమైన మార్పులకు దారితీయలేదు మరియు M. బోవిస్ జాతులు ఒకే సమూహంలో సమూహంగా ఉన్నాయి.
M. bovis AF2122/97 యొక్క రిఫరెన్స్ జీనోమ్‌తో 42 కొత్తగా క్రమం చేయబడిన M. bovis రీడ్‌లను మ్యాప్ చేసిన తర్వాత, 1816 పాలిమార్ఫిక్ స్థానాలను కలిగి ఉన్న SNP అలైన్‌మెంట్ పొందబడింది. చాలా SNPలు (87.1%) కోడింగ్ ప్రాంతంలో ఉన్నాయి మరియు ప్రభావిత జన్యువులు బోవిలిస్ట్ (మూర్తి 6A, B)లో చూపిన ఫంక్షనల్ వర్గాల ప్రకారం వర్గీకరించబడతాయి. ప్రతి ఫంక్షనల్ వర్గంలోని మొత్తం జన్యువుల సంఖ్యను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, "లిపిడ్ జీవక్రియ" వర్గంలోని జన్యువులు మరిన్ని SNPలను చూపించాయి, తరువాత "సెల్ వాల్ మరియు సెల్ ప్రక్రియలు" మరియు "ఇంటర్మీడియట్ జీవక్రియ మరియు శ్వాసక్రియ", అవి M. bovis పరిణామంలో ఉన్నాయని వెల్లడిస్తున్నాయి.
పోర్చుగల్ నుండి M. బోవిస్ డేటాసెట్ యొక్క క్రమానుగత విశ్లేషణ (n = 42). ప్రతి క్రియాత్మక వర్గం (A) కోసం నమోదైన SNPలు మరియు ప్రభావిత జన్యువుల మొత్తం సంఖ్య. క్రియాత్మక వర్గం (B) ద్వారా నమోదు చేయబడిన పర్యాయపదాలు మరియు పర్యాయపదాలు కాని మార్పుల మొత్తం సంఖ్య.
ప్రపంచ స్థాయిలో, సగటు dN/dS నిష్పత్తి 1.5 కంటే మెరుగ్గా ఉంది, ఇది ప్రపంచ పరిణామ ఒత్తిడి పూర్వీకుల స్థితిని వదిలించుకోవడమేనని మరియు సానుకూల (వైవిధ్యభరితమైన లేదా దర్శకత్వం వహించిన) మరియు/లేదా సడలించిన శుద్దీకరణ ఎంపిక దృశ్యాన్ని సూచిస్తుందని సూచిస్తుంది. "వైరలెన్స్, నిర్విషీకరణ, అనుసరణ", "చొప్పింపు శ్రేణులు మరియు ఫేజ్‌లు" మరియు "నియంత్రణ ప్రోటీన్లు" వర్గాలలో, SNPలలో మూడింట రెండు వంతుల కంటే ఎక్కువ పర్యాయపదాలు కావు (మూర్తి 6B).
అన్ని వర్గాలలో, బహుళ SNP లతో జన్యువులు ఉన్నాయి, దీని ఫలితంగా సగటు మ్యుటేషన్ రేటు (అంటే, జన్యువుకు సగటు SNP) 1 కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది (మూర్తి 6A). 15 SNP లతో Pks12 (Mb2074c) మరియు 8 SNP లతో fas (Mb2553c) అధిక మ్యుటేషన్ విలువలను కలిగి ఉంటాయి. ఈ రెండు జన్యువులు కొవ్వు ఆమ్ల జీవక్రియలో పాల్గొంటాయి. pks జన్యువు పాలికెటైడ్ సింథేస్ (PKS) ను ఎన్కోడ్ చేస్తుంది, ఇది మైకోబాక్టీరియల్ సెల్ వాల్ లిపిడ్ బయోసింథసిస్74,75 లో పాల్గొన్న మల్టీఫంక్షనల్ ఎంజైమ్. ఈ జన్యువు మైకోకెటైడ్స్74,76 సంశ్లేషణలో పాల్గొన్న మల్టీఫంక్షనల్ పాలీపెప్టైడ్‌ను ఎన్కోడ్ చేస్తుంది. ఫాస్ జన్యువు మైకోలిక్ ఆమ్లం యొక్క సంశ్లేషణలో పాల్గొంటుంది. ఈ రెండు జన్యువులు హోస్ట్‌తో సంబంధంలో ఉన్న సెల్ గోడ యొక్క బయోసింథసిస్‌లో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తాయి.
మైకోబాక్టీరియం బోవిస్ పరిణామాన్ని మరింత అధ్యయనం చేయడానికి, రెండు సెట్ల నిర్దిష్ట జన్యువులను విశ్లేషించారు. సీక్వెన్స్ కంపోజిషన్ మరియు ఫైలోజెనెటిక్ పద్ధతులను ఉపయోగించి గతంలో ప్రచురించబడిన రచనలు వైవిధ్యీకరణకు ముందు MTBC పూర్వీకులు HGT ద్వారా పొందిన జన్యువులను గుర్తించాయి37,38. ఈ జన్యువులు అనుబంధ పట్టిక 2లో జాబితా చేయబడ్డాయి. HGTకి సంబంధించిన మొత్తం 77 జన్యువుల SNP పంపిణీని విశ్లేషించారు మరియు 26 పాలిమార్ఫిక్ సైట్‌లను గుర్తించారు, దీని ఫలితంగా చాలా సందర్భాలలో (78%) పర్యాయపదాలు కాని (NS) మార్పులు వచ్చాయి (అనుబంధ పట్టిక 2). MTBC జన్యువుపై మునుపటి పని, పుటేటివ్ HGT ప్రాంతం మిగిలిన జన్యువుతో పోలిస్తే అధిక NS SNP నిష్పత్తిని ప్రదర్శిస్తుందని నిరూపించింది. ఈ పునఃసంయోగ ప్రాంతాలు MTBC పూర్వీకులచే పొందబడ్డాయని మరియు అందువల్ల, అవి పురాతన పాలిమార్ఫిజమ్‌లను ఎక్కువగా సూచిస్తాయని ఎవరైనా భావిస్తే, పర్యాయపద మార్పుల నిష్పత్తి ఎక్కువగా ఉంటుందని భావిస్తున్నారు, ఎందుకంటే NS ప్రత్యామ్నాయాలు అమైనో ఆమ్ల మార్పుల కారణంగా ప్రతికూల ఎంపిక ద్వారా తొలగించబడతాయని భావిస్తున్నారు ప్రోటీన్ యొక్క పనితీరును మార్చవచ్చు. అందువల్ల, మా ఫలితాలు HGT-వంటి జన్యువుల భర్తీ నుండి ఉత్పన్నమవుతాయని సూచిస్తున్నాయి, ఇది విలువైన అనుకూల జన్యు వైవిధ్యానికి వాటి ప్రాముఖ్యతను ప్రతిబింబిస్తుంది.
ఈ విశ్లేషణకు సమాంతరంగా, 3R (DNA మరమ్మత్తు, ప్రతిరూపణ మరియు పునఃసంయోగం) వ్యవస్థ యొక్క భాగాలను ఎన్కోడ్ చేసే జన్యువులను dos Vultos మరియు సహకారులు (2008) గతంలో ప్రచురించిన జాబితాకు అనుగుణంగా క్షుణ్ణంగా పరిశీలించారు. ఒకేలాంటి DNA భాగాల మార్పిడిని నేరుగా గమనించలేము, అయినప్పటికీ దగ్గరి సంబంధం ఉన్న బ్యాక్టీరియా పాల్గొన్నప్పుడు ఇది తరచుగా జరిగే ప్రక్రియ కావచ్చు, ఉదాహరణకు ఈ డేటా సెట్ విషయంలో; అదనంగా, ఈ ప్రక్రియ DNA మరమ్మత్తు పద్ధతులకు కీలకం కావచ్చు72, కాబట్టి హోమోలాగస్ పునఃసంయోగంలో పాత్ర పోషించండి. 54 జన్యువుల ద్వారా పంపిణీ చేయబడిన మొత్తం 26 పాలిమార్ఫిక్ స్థానాలను గుర్తించారు (అనుబంధ పట్టిక 3). ఈ జన్యువుల సమితిలో, NS మార్పులు దాదాపు 65% పరిణామాలకు కారణమయ్యాయి, ఇది మైకోబాక్టీరియం క్షయవ్యాధి జాతులపై మునుపటి నివేదికలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.