Mèsi paske ou te vizite Nature. Vèsyon navigatè w ap itilize a pa gen sipò limite pou CSS. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon vèsyon navigatè ki pi resan (oswa dezaktive mòd konpatibilite a nan Internet Explorer). An menm tan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral montre sit san estil ak JavaScript.
Sekansaj jènòm lan revitalize domèn rechèch maladi enfeksyon yo, li revele epidemyoloji maladi a, patogenez, entèraksyon lame-patojèn, ak pwosesis evolisyonè ki enpoze sou patojèn yo. Konplèks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) la konsidere Mycobacterium bovis kòm youn nan manm adaptasyon animal li yo ki lakòz tibèkiloz (TB) nan mamifè terès yo, epi li se yon modèl tipik evolisyon bakteri. Tankou lòt manm MTBC yo, yo sipoze Mycobacterium bovis se yon patojèn ki klone estrikteman, ki evolye dousman, epi evidamman pa gen okenn siy rekombinasyon oswa transfè jèn orizontal. Nan travay sa a, nou aplike jenomik konparatif nan yon seri done sekans jènòm konplè (WGS) ki konpoze de 70 bèf M. ki soti nan diferan jenealoji (Ewòp ak Afrik) pou nou ka jwenn plis enfòmasyon sou divèsite jenetik bèf M. pouvwa evolisyonè. Twa metòd diferan yo itilize pou estime siy reorganizasyon yo. Globalman, yo te idantifye yon ti kantite evènman rekombinasyon epi konfime pa de metòd endepandan ak sipò solid. Sepandan, konpare ak mitasyon yo, rekombinasyon an gen yon efè pi fèb sou divèsite M. bovis la (an jeneral r/m = 0.037). Diferans mwayèn r/m ki jwenn nan konplèks klonal Mycobacterium bovis nan seri done nou an konsistan avèk konsèp jeneral la ke degre rekombinasyon an ka varye anpil ant liyaj ki asiyen nan menm espès taksonomik la. Baze sou travay sa a, rekombinasyon nan Mycobacterium bovis pa ka eskli, kidonk li ta dwe sijè a plis efò nan rechèch jenomik konparatif nan lavni, nan ki WGS nan gwo seri done ki soti nan diferan senaryo epidemyolojik atravè mond lan enpòtan anpil. Lè sa a, yo te fè yon analiz adisyonèl sou pi piti seri done Mycobacterium bovis la (n = 42) ki soti nan prevalans TB milti-òt la, epi yo te idantifye plis pase 1,800 lokus, pami yo omwen yon souch te montre yon polimòfis nikleotid sèl (SNP). Pifò (87.1%) yo sitiye nan rejyon kodaj la, epi rapò mondyal chanjman ki pa sinonim (dN/dS) chanjman sinonim yo depase 1.5, sa ki endike ke seleksyon pozitif se yon fòs evolisyonè enpòtan ki egzèse sou M. bovis. Yo te detekte yon pi gwo pwopòsyon SNP nan jèn ki rich nan kategori fonksyonèl "metabolism lipid", "pwosesis miray selilè ak selilè", ak "metabolism ak respirasyon entèmedyè", sa ki revele potansyèl yo nan byoloji ak evolisyon enpòtans Mycobacterium bovis. Yon gade pi pre sou jèn ki nan zansèt MTBC yo ki gen tandans pou transfè jèn orizontal epi ki enkli nan sistèm 3R (reparasyon ADN, replikasyon, ak rekombinasyon) revele valè negatif mwayèn mondyal tès net D Taijima a, ki endike eskanè selektif sot pase a. Blòk ki sot pase a apre ekspansyon popilasyon an toujou prensipal faktè kondwi evolisyonè pou patojèn obligatwa Mycobacterium bovis la pou konbat lame a.
Konplèks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) la se youn nan taksa patojèn bakteri ki gen plis siksè e se yon ka tipik evolisyon bakteri. Manm li yo montre yon idantite nikleotid etonanman wo nan nivo jenomik la (> 99%)1,2. Diferan ekotip MTBC ka lakòz tibèkiloz (TB), ki se yon maladi granulomatè enfeksyon, nan yon pakèt espès lame, soti nan mikwo-mamifè rive nan moun3,4,5. Kounye a, konplèks la gen ladan moun [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] ak patojèn adapte ak bèt (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" ak "dassie") 5,6. M. canettii (ke yo rele tou "Nodobacter glabrata") Idantite nikleotid mwayèn ak mikobakteri yo mansyone pi wo a se 98%, epi travay jenomik konparatif yo montre ke M. canettii ak rès MTBC yo fèk divèje soti nan zansèt komen an.7 Lè nou konsidere konsèp sa a, gen kèk otè ki rele M. canettii Manm MTBC 8.
Yo dekri MTBC sistematikman kòm yon konplèks klonal strik, epi estrikti popilasyon li a byen klè gouvène pa divèsite redwi, blokaj, eskanè selektif, ak derive jenetik9,10. Sipoze evolisyon klonal strik konplèks, tankou polimòfis ki manke, pa ka retabli pa rekombinasyon. Baze sou prensip sa a, yo te pwopoze evènman konsekitif sipresyon jenomik rejyon diferansyèl la (RD) ak TbD1 (rejyon sipresyon espesifik Mtb 1) kòm makè molekilè evolisyon MTBC2,5,11. Travay jenomik konparatif ak sekansaj jenòm konplè (WGS) sipòte divizyon manm adapte ak moun an nèf liyaj (Mycobacterium tuberculosis L1 rive L4, L7, ak L8; ak Mycobacterium africanum L5, L6, ak L9), liyaj L2 rive L4 te pataje rejyon sipresyon TbD1 la2,11,12,13. Anplis de sa, yo pwopoze ke manm ki adapte ak bèt yo pataje yon zansèt komen, ki defini pa sipresyon espesifik klad nan RD7, RD8, RD9 ak RD102, 5, ak 14.
Yo konsidere transfè jèn orizontal (HGT) ak evènman rekombinasyon kòm bagay ki ra epi ki rive nan zansèt MTBC yo, olye ke istwa diferan tout manm MTBC a15,16,17. De premye rapò pa Hughes ak kolaboratè li yo (2002) ak Gutacker ak kolaboratè li yo (2006) te sijere ke evènman rekombinasyon yo ka ede fòme polimòfis ki make lokus espesifik nan souch M. tuberculosis18,19. Rezon ki fè mank evidan rekombinasyon an nan MTBC yo se: (1) pwosesis mekanik la ak pèt kapasite HGT a; (2) rarite evènman HGT yo; (3) pa gen okenn chans pou evènman rekombinasyon nan nich MTBC a14,17. Dènyèman, kèk etid sekansaj jènòm konplè (WGS) ki aplike sou souch MTBC 20 ak Mycobacterium bovis 21 te bay prèv rekombinasyon, premye a ki montre ke souch MTBC yo souvan echanje ti fragman ADN, men akòz varyasyon sekans nikleotid limite, evènman sa yo toujou pa remake.
Mycobacterium bovis se manm MTBC ki pi souvan jwenn nan bèt (sitou bèf), byenke li kapab izole tou nan bèt sovaj ki viv lib ak nan kloti4,22,23,24. M. bovis te evolye an senk gwo konplèks klonal [Ewopeyen 1 (Eu1), Ewopeyen 2 (Eu2), Ewopeyen 3 (Eu3), Afriken 1 (Af1) ak Afrik 2 (Af2)], dapre pwofil spoligotyping lan, sipresyon espesifik ak polimòfis mononikleotid (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 nan jèn espesifik. Konplèks klonal sa yo demontre divèsite estrikti popilasyon Mycobacterium bovis la ak asosyasyon li ak rejyon jewografik yo. Anplis de sa, dènye travay WGS Zimpel ak kolaboratè li yo (2020) te fè a te konsevwa yon filojenè ki baze sou SNP Mycobacterium bovis la, ak plis pase 1,900 jenòm, ki endike ke gen omwen kat liy diferan (yo rele Lb1 rive Lb1 rive Lb4), yo pa totalman konsistan avèk konplèks klonal ki te defini anvan an, byenke espesifikasyon jewografik la kapab konfime tou30. Otè sa yo te fè analiz diferansyèl filojenè ak datasyon molekilè, men yo pa t etidye rekombinasyon30.
Travay anvan yo te fè lè l sèvi avèk diferan teknik molekilè, tankou spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), ak tipifikasyon SNP resan te revele yon sèten nivo divèsite jenetik pami souch M. bovis 31,32,33, 34,35. Diferansyasyon varyasyon jenetik la vin tounen yon zouti enpòtan nan etid epidemyoloji maladi, ki itil pou yon konpreyansyon apwofondi sou patogenez, virulans ak transmisyon maladi. Aparisyon metòd WGS la bay posiblite pou revele faktè kondwi evolisyonè ke jenòm Mycobacterium bovis la enpoze nan pwosesis adaptasyon ak pèsistans nan diferan lame ak senaryo epidemyolojik.
Nan travay sa a, nou itilize analiz jenomik konparatif sou plizyè ansanm done Mycoplasma bovis (n=70), ki gen ladan izolat ki soti nan diferan konplèks klonal, pou nou ka jwenn plis enfòmasyon sou pwosesis evolisyonè Mycoplasma bovis la, espesyalman pou rezoud relasyon filogenetik ak evènman rekombinasyon. Kòm yon sipleman pou analiz sa a, nou te eksplore plis yon sou-ansanm done izolat M. bovis (n = 42) ki te jwenn nan yon zòn tibèkiloz milti-òt byen karakterize nan Pòtigal 31,36 pou nou te dedwi non-idantite. Balans ki genyen ant rapò relatif sibstitisyon nikleotid sans (dN) ak sinonim (dS), ansanm ak kontribisyon evolisyonè jènòm espesifik yo mansyone nan literati a, yo 37,38 jwenn pa zansèt MTBC atravè HGT, epi yo kode konpozan jèn sistèm 3R (reparasyon ADN, replikasyon, ak rekombinasyon) 39. Chwazi jèn yo jwenn atravè HGT paske yo ka reprezante polimòfis ansyen, kidonk li espere ke yo ka genyen yon pi gwo pwopòsyon chanjman sinonim. Yo te chwazi jèn ki enkli nan sistèm 3R la paske travay anvan yo sou souch M. tuberculosis yo te endike seleksyon jeneral negatif/pirifikasyon ki travay sou jèn sa yo, epi yo ka jwe yon wòl enpòtan nan evolisyon 39. Yon lòt objektif travay sa a se pou dedwi egzistans evènman reorganizasyon. Pou rezon sa a, lè nou konsidere ke seri done nou an ki soti nan Pòtigal sèlman gen ladan l jenòm konplèks klon Ewopeyen 2 a ak souch ki pa gen konplèks klon an, nou te deside mete done jenòm ki disponib piblikman pou finalman jwenn yon reprezantan tout konplèks klon yo, epi amelyore robustès ak lajè rezilta yo.
42 nouvo sekans jenòm Mycoplasma bovis ki soti nan sèn tibèkiloz milti-òt andemik Pòtigè a (detay anba a), ki te deja karakterize nan yon pèspektiv epidemyolojik36, se sant travay sa a. Etandone ke seri done ki soti nan Pòtigal la sèlman gen reprezantan konplèks klon 2 Ewopeyen yo ak souch san konplèks deziyen, done sekansaj jenòm konplè ki disponib piblikman te ajoute pou elaji seri done ki gen ladan tout reprezantan konplèks klon M. bovis yo. Se poutèt sa, twa sous done sekansaj jenòm konplè te itilize nan travay sa a: asanblaj jenòm konplè/bouyon, jiska 10 echafodaj ki estoke nan NCBI (Sant Nasyonal pou Enfòmasyon sou Byoteknoloji) (n = 15 izolat); ki estoke nan SRA (dosye Illumina fastq nan achiv lekti sekans lan) reprezante divèsite konplèks klon M. bovis yo (n = 12 izolat)30; ak 42 nouvo sekans jenòm ki soti nan Pòtigal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) te eskli nan rechèch NCBI a. Anjeneral, yo itilize M. bovis AF2122/97 kòm yon jenòm referans pou mete nan seri done a. Akòz endisponiblite piblik sekans jenòm konplè ki reprezante pa konplèks klonaj African 1 lan, ak ti kantite jenòm ki soti nan souch reprezantatif Af2 ak Eu1 yo, yo te itilize done sekans orijinal SRA te bay yo nan ka sa yo. Travay Zimpel ak kolaboratè li yo (2020) te ede idantifye jenòm ki soti nan konplèks klonaj susmansyone a epi li te ede chwazi Mycobacterium bovis pou enklizyon nan seri done a. Pou Eu3, se yon sèl kalite jenòm ki dekri (Branger et al., 2020), kidonk jenòm nou mete a se yon reprezantan separe nan konplèks Eu3 la.
Globalman, ansanm done sa a gen ladan l 70 bèf M. bovis izole nan 8 espès lame, distribye nan 12 peyi soti 1985 rive 2016. 36 espès yo deziyen kòm Eu2, 7 espès se Eu1, 1 espès se Eu3, 3 espès se Af1, 4 espès se Af2 epi 19 pa atribiyab a okenn konplèks klonal (detay anba a). Enfòmasyon detaye (ki gen ladan nimewo aksè a) sou Mycobacterium bovis ki te itilize nan etid sa a montre nan Tablo 1 ak Tablo Siplemantè 1.
42 nouvo sekans jenòm Mycobacterium bovis ki soti nan zòn ki gen tibèkiloz nan bèt nan Pòtigal epi ki distribye pandan plis pase 12 ane se sant etid sa a, paske sistèm potansyèl maladi bèt sovaj yo te kontwole regilyèman 31,36 (Fig. Siplemantè 1). Selon pwosedi ki vin apre yo, souch sa yo te izole nan bèf (n = 14), sèf wouj (n = 16) ak kochon mawon (n = 12) soti nan 2003 rive 2015: kolekte epi manyen bèt yo an akò ak direktiv pwotokòl rekòmande yo. Echantiyon tisi yo nan Manyèl Animal Terès OIE a epi yo inokile sou mwayen solid ak mwayen likid piruvat Stonebrink ak Löwenstein-Jensen. Kilti yo enkube a 37 °C epi yo tcheke kwasans lan yon fwa pa semèn pandan omwen 12 semèn. Koloni yo estoke dirèkteman nan yon solisyon gliserol a -80ºC. Nan medyòm selektif Mycobacterium lan (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), echantiyon orijinal achiv yo te pase nan yon sèl pasaj in vitro pou jwenn ADN pwogram WGS la. Pou sa, solisyon stock kilti konjele a te anrichi ak 5% piruvat sodyòm ak 10% ADS (50 g albumin, 20 g glikoz, 8.5 g klori sodyòm nan 1 L dlo) sou Middlebrook 7H9 a 37°C Retrain. Apre 4 semèn kwasans, medyòm nan te renouvle epi kilti a te kontwole regilyèman jiskaske yo te obsève kwasans. Selil yo te rekòlte pa santrifijasyon, pelet la te resispann nan 500 µL saline tampon fosfat (PBS), chofe a 99 °C pandan 30 minit, santrifije, epi sipènatant la te estoke a -20 °C jiskaske WGS. Tout pwosedi yo te fèt nan enstalasyon byosekirite nivo 3.
Bibliyotèk jenòm pè WGS la prepare lè l sèvi avèk endèks inik chak echantiyon ADN, epi li itilize teknoloji Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 echantiyon) ak HiSeq (2 × 150 pb) (de izolat) (Eurofins Genomics, Almay) pou sekansaj. Selon enstriksyon manifakti a, sèvi ak Illumina Genome Analyzer ak atachman modil doub bout pou sekansye ADN jenomik la, epi sèvi ak Twous Preparasyon Bibliyotèk ADN Nextera XT ki soti nan Illumina pou konstwi bibliyotèk la.
Lè nou pran an kont done yo rekipere nan SRA a (n = 12), idantifikasyon konplèks klon an ka itilize kòm metadone piblikasyon korespondan an 30, 41, 43. Lè n ap konsidere jenòm konplè a, eksepte pou Mycobacterium bovis AF2122/97 ak Mycobacterium bovis 3601, ki se manm rekonèt nan konplèks klonal Eu1 ak Eu3 25, 29, respektivman, li se menm ak jenòm konplè Mycobacterium tuberculosis H37Rv (nimewo aksè NCBI NC_000962.3). Aliyman jenòm lan fèt lè l sèvi avèk MAFFT (pwogram aliyman miltip asid amine oswa sekans nikleotid, vèsyon 7.458) ak paramèt -addfragments48. Apre sa, chèche absans diferan konplèks klonal ak/oswa prezans karakteristik SNP.
Nouvo sekans Mycobacterium bovis la (n = 42) ansanm ak lekti orijinal bouyon jenòm ki te rasanble a (n = 3) aliyen konplèks la ak jenòm referans Mycobacterium tuberculosis H37Rv la atravè tiyo vSNP la epi prezans karakteristik sipresyon ak/oswa SNP diferan klon yo. Yo te fè yon rechèch.
Kolekte enfòmasyon sou mank karakteristik ak/oswa prezans/absans SNP ak pwofil spoligotipaj pou asiyen done jenomik nan konplèks klonal korespondan an. Pou kat bouyon asanblaj yo, pwofil spoligotipaj la pa ka dedwi, kidonk yo enkli nan gwoup "pa gen konpleksite" a.
Pwosesis byoenformatik ki swiv nan travay sa a kòmanse depi asanblaj de novo ak mapifikasyon nan yon estrateji referans, ak objektif pou eksplore evènman rekombinasyon ak polimòfis jenòm espesifik. Figi 1 bay yon òganigram etap ki swiv yo. Pou analiz rekombinasyon, tout jenòm yo itilize pou ogmante robustès konklizyon yo ak endikatè ki gen rapò.
Pou nou te kapab diminye erè nan jenerasyon sekans konsansis jenòm yo, nou te premye jwenn asanblaj de novo, epi answit nou te jwenn aliyman miltip debaz yo. Tiyo Unicycler la disponib kounye a nan https://github.com/rrwick/Unicycler49 epi li itilize pou fè asanblaj de novo 54 jenòm sekansye (42 ki fèk sekansye ak 12 fichye fastq ki refè nan SRA). An brèf, anvan asanblaj la depi nan kòmansman, analiz kalite lekti a te fèt nan FastQC vèsyon 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), ak Trimmomatic vèsyon 0.36 (opsyon "koupe Adaptè ak lòt sekans espesifik ekleraj nan lekti yo" ak "Koupe baz yo nan fen lekti a, si kalite papòt 20 an pi ba pase 20" yo aplike) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Apre sa, nou te itilize SPAdes optimizer49 pou asanblaj jenòm nan, epi nou te itilize Pilon vèsyon 1.1851 pou optimize apre asanblaj la. Yo te chwazi yon mòd pon konsèvatif pou evite move asanblaj, epi yo te chèche epi chwazi gwosè k-mer la ant 20% ak 95% nan longè lekti a. Swiv direktiv SPAdes yo epi konsidere gwosè lekti a, efase kontig ki pi piti pase 300 bp, epi etabli yon papòt kouvèti pwofondè lekti 20 ki egal a 52. Nan estrateji asanblaj de novo a, yo pa t retire rejyon jenomik tankou paralòg prolin-glutamat (PE) ak prolin-glutamat (PPE) ki trè repetitif yo.
Yo evalye kalite asanblaj de novo a atravè tiyo QUAST la (http://quast.sourceforge.net/quast.html), ki fasilite renouvèlman kontig la ak maping jenòm referans M. bovis AF2122/97 la (nimewo aksè NCBI LT708304.1) (gade Tablo Siplemantè 1 pou paramèt kalite yo).
Avèk èd tiyo vSNP la (https://github.com/USDA-VS/vSNP), yo konpare fichye FASTQ M. bovis ki fèk sekansye a nan sekansaj Illumina a ak jenòm referans M. bovis AF2122/97 la (LT708304.1)). Selon pi bon rekòmandasyon pratik Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, aplike paramèt filtè estanda oswa nòt mas varyant pou rekalibrasyon. Rezilta yo filtre lè l sèvi avèk pi ba nòt mas SAMtools la ki se 150 ak AC = 2. Itilize tou Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) pou verifye lekti yo pou elimine kontaminasyon. Tiyo vSNP ki itilize pou trase estrateji sekans nan travay nou an egzamine yon seri SNP ak sib defini, epi li eskli tou senaryo enfeksyon melanje. Kouvèti jenòm lekti a pi bon pase 99% (Tablo Siplemantè 1).
Pou evite erè maping ak SNP ki pa kòrèk, filtre yon varyant nan ka sa yo: (1) li sipòte pa mwens pase 20 lekti, (2) li jwenn ak yon frekans mwens pase 0.9, (3) li nan omwen yon Souch, men omwen gen twou nan yon lòt souch. Vèsyon 2.4.19 entegre visualiseur jenomik (IGV) (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 te itilize pou verifye vizyèlman SNP ak pozisyon ki gen pwoblèm maping oswa aliyman. Piske jèn prolin-glutamat (PE) ak prolin-prolin glutamat (PPE) yo trè kopi epi yo fè pati yon fanmi milti-jèn, sekansaj Illumina a fasil pou mal konprann yo ak move maping, kidonk yo pi pito. Pwosesis byoenformatik mikobakteri a te retire manm konplèks tibèkiloz la lè yo te itilize estrateji maping nan sekans pou konfime SNP yo. Se poutèt sa, nou te filtre jèn PE/PPE ak endel nan analiz la.
Dapre Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), tout SNP yo divize an kategori fonksyonèl. Yo itilize tiyo SnpEff la (https://pcingola.github.io/SnpEff/) pou dedwi konsekans SNP yo (chanjman sinonim oswa non-sinonim). Yo kreye yon nouvo baz done sou jenòm Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Aliyman miltip jenòm debaz la te fèt lè l sèvi avèk Parsnp v1.2, ki disponib kounye a nan https://github.com/marbl/parsnp57, lè l sèvi avèk 69 jenòm konplè/asanblaj bouyon (avèk opsyon -c) epi M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) te itilize kòm referans. Kat aliyman miltip debaz te fèt: sèlman manm konplèks klonaj Eu2 a (n = 37), ki gen ladan tout manm konplèks klonaj Ewopeyen an (n = 44), ki gen ladan pwen jonksyon konplèks klonaj Ewopeyen ak Afriken an (n = 51), epi ki gen ladan tout Mycobacterium bovis nan etid sa a (n = 70).
Aliyman debaz Parsnp pwodui a itilize pou dedwi pyebwa filogenetik maksimòm pwobabilite (ML) la lè l sèvi avèk CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 lè l sèvi avèk RAxML, epi fè 1000 replikasyon gide.
Yo itilize twa algoritm ak zouti byoenformatik diferan pou tcheke prezans evènman rekombinasyon an paralèl: lojisyèl SplitsTree4, pipeline Gubbins (liyaj san patipri atravè rekombinasyon nan sekans nikleotid), ak lojisyèl RDP4 (pwogram deteksyon rekombinasyon, vèsyon beta 4.101).
Metòd dekonpozisyon divize ki aplike nan SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 la itilize pou kalkile rezo filojenetik san rasin lan, lè l sèvi avèk tès Phi pou verifikasyon estatistik, epi papòt siyifikasyon an se p = 0.05. Analiz milti-aliyman debaz Parsnp la itilize kòm done antre, epi dekonpozisyon divize a kòm yon estanda rezo reyalize.
Tiyo Gubbins v2.3.1 la (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) fonksyone ak paramèt default kòm yon lòt fason pou evalye enpak rekombinasyon sou Mycobacterium bovis. Algorit ki aplike nan tiyo a rekonstwi liy klon ki enpòtan an. Asanblaj konplè jenòm/bouyon seri done nou an ak jenòm referans lan (bovin bovid AF2122/97, LT708304.1) yo mityèlman; epi eskane pozisyon SNP a sou chak branch pyebwa a pou detekte gwoup SNP ki reprezante evènman rekombinasyon an. Zewo branch lan. Sipoze ke pa gen okenn evènman rekombinasyon, ki vle di ke SNP ki rive sou branch lan ta dwe distribye respire. Aliyman miltip debaz ki soti nan Parsnp ak pi bon pyebwa ML ki gen nòt ki soti nan RAxML yo itilize kòm fichye opinyon.
Finalman, pou konfime evènman reorganizasyon ki sijere pa Gubbins pipeline lan, sis algoritm ki aplike nan RDP467 yo (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 ak SiScan66) aplike nan aliyman miltip debaz Parsnp la anba paramèt defo yo. Nou detèmine ke omwen twa nan algoritm ki aplike nan RDP4 yo dwe demontre yon siyal enpòtan pou verifye chak evènman rekombinasyon.
Etandone ke tou de lojisyèl Gubbins ak RDP yo ap chèche siyal rekombinasyon lè yo tcheke aliyman miltip debaz yo nan yon fenèt jiska 500 bp, epi konfime ke enklizyon jèn PE/PPE pandan asanblaj de novo a pap entèfere ak siyal rekombinasyon yo jwenn yo, yo fè plis analiz pa omolinearite. Tcheke vwazinaj jèn ki idantifye evènman rekombinasyon an. Yo te konstwi kat sinlineyè a lè l sèvi avèk jenòm konplè a lè l sèvi avèk aliyman MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) pou eskli translokasyon oswa envèsyon jenòm lokal yo. Anplis de sa, yo te itilize tout jenòm lan pou fè analiz omolinearite sou sekans asid amine a atravè sèvè entènèt SyntTax la (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Yon analiz pi pwofon sou ansanm done jenòm yo jwenn nan sistèm tibèkiloz milti-òt Pòtigè a se pou verifye polimòfis jèn yo mansyone nan literati a. Jèn sa yo se 37,38 ak jèn ki kode 3R la jwenn pa zansèt MTBC yo atravè konpozan sistèm HGT (reparasyon ADN, replikasyon ak rekombinasyon) 39. Sèvi ak ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) epi sèvi ak DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) pou kalkile divèsite jèn ak divèsite nikleotid (π) ak paramèt tès net D Tajima a.
Yo te jwenn yon pyebwa filojenetik maksimòm pwobabilite (ML) ki baze sou 69 izolat Mycoplasma bovis ak jenòm referans (Figi 2A). Konpare ak pyebwa ki baze sou yon sèl jèn oswa pyebwa ki baze sou plizyè lokis, estrateji sa a pèmèt jenerasyon pyebwa ki pi puisan ki pa kaptire varyabilite tout jenòm lan e pakonsekan montre yon kapasite pi ba pou distenge ant espès yo 68,69. Estrikti topolojik pyebwa ML la anjeneral konsistan avèk klasifikasyon konplèks klon yo. Jenòm Eu2 a gwoupe nan yon branch, epi jenòm Af1 a gwoupe ansanm tou (Figi 2A). Rezilta a konsistan tou avèk relasyon evolisyonè Mycobacterium bovis la, sa vle di, gen yon gwo diferans ant manm Eu1 la ak gwoup ki konpoze de tout lòt konplèks klonal ak jenòm yo, men konplèks klonal 30 la pa espesifye. Ti enkonsistans ki genyen ant konplèks klonal la ak relasyon yo obsève sou pyebwa filojenetik la ka eksplike pa lefèt ke konplèks klonal la dekri dapre rejyon jenomik espesifik, alòske pyebwa filojenetik la baze sou plizyè aliyman jenòm debaz ki reprezante tout jenòm lan.
Yo konstwi pyebwa filojenetik maksimòm pwobabilite a (GTR) baze sou aliyman jenòm debaz jenòm Mycobacterium bovis la anvan (A) ak apre (B) retire sit rekombinasyon an. Koulè branch yo reprezante konplèks klon Mycobacterium bovis la: Ewòp 1 se koulè mov, Ewòp 2 se wouj, Ewòp 3 se ble, Afrik 1 se zoranj, epi Afrik 2 se vèt. Yo pran rasin pyebwa a epi yo trase l nan echèl, epi yo mezire longè branch yo kòm yon ranplasman pou chak sit.
Yo dekri konplèks Mycobacterium tuberculosis la kòm yon bagay ki evolye klonalman, epi pifò prèv ki akimile pandan ane yo sipòte lide ke evènman HGT ak rekombinasyon ki kontinye ap fèt p ap rive nan nivo MTBC ki ka detekte a15,17,18.
Travay anvan yo te montre ke ka gen yon rekombinasyon limite ant souch MTBC yo20,21, alòske lòt moun pa t rive idantifye evènman rekombinasyon mezirab70,71. Re-diskite pwoblèm sa a ak konsantrasyon sou Mycobacterium bovis, ki diferan de travay anvan an ki te sèlman konsidere Mycobacterium tuberculosis 70,71; oubyen konsidere MTBC an antye, prèske pa gen okenn M. bovis ki reprezante 20; oubyen sèlman konsidere fraksyon bèf restriksyon yo. Ansanm done mikobakteri yo, nan travay sa a, gen yon total de 70 souch, ki reprezante tout konplèks klonal yo, yo itilize pou fè tès depistaj pou rekombinasyon. Ansanm done yo klase selon kat nivo kimilatif: (1) manm Eu2 yo, (2) tout manm konplèks klon Ewopeyen yo (sa vle di Ewòp), (3) konplèks klon Ewopeyen ak Afriken (Eu + Af) ak (4) tout Koleksyon done yo (ki gen ladan jenòm ki pa enkli nan okenn konplèks klonaj ki deja dekri).
Pou etidye ipotèz sa a pi lwen, yo te fè yon rezo dekonpozisyon divize pou evalye absans evènman rekombinasyon ant jenòm yo, paske metòd sa a ka vizyalize relasyon zansèt ki genyen ant moun yo epi montre siyal filogenetik ki konfli. Tout kat ansanm done nan analiz la te konfime egzistans bouk nan rezo a (sa vle di, zòn ki pa konvèje nan yon sèl pyebwa), men tès Phi a pa gen okenn sipò estatistik (Eu2, p = 0.0956; Ewòp, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; tout ansanm done a p = 0.2451), ki bay move prèv pou egzistans evènman reorganizasyon (Figi 3A-D).
An Ewòp 2 jenòm (n = 37) (A), jenòm Ewopeyen (n = 44) (B), jenòm Ewopeyen ak Afriken (n = 51) (C) ak tout seri done yo (n = 70) (D).
Apre analiz sa a, epi pran an kont obsèvasyon siklik yo nan tout rezo yo, yo te aplike algoritm rekonstriksyon ki te aplike nan tiyo Gubbins lan pou rekonstwi liy klonal la epi pou konplete estimasyon efè rekombinasyon an sou jenòm M. bovis la. Dedwi kantite kimilatif evènman rekombinasyon yo, pifò ladan yo te fèt nan branch tèminal yo (sa vle di, nan yon sèl jenòm) (Tablo 2). Endikatè sa yo montre konsistans tout ansanm done yo epi endike ke frekans evènman rekombinasyon yo se 200 a 300 fwa frekans mitasyon yo. Yon fwa paramèt rho/theta ki reprezante to relatif rekombinasyon ak mitasyon pwen sou branch lan parèt ant 0.0037 ak 0.0056 (Tablo 3). Resaman, travay ki te pibliye sou 38 souch M. bovis la te demontre yon valè rho/theta ki pi wo (rho/theta = 0.1) pase sa ki te jwenn nan seri done sa a, men travay Patané ak kòlèg li yo te itilize asanblaj ki baze sou referans pou dedwi paramèt rekombinasyon yo. Yon detay pwosediral, akòz pwosedi asanblaj la, te asosye avèk abondans evènman rekombinasyon swadizan nan branch tèminal la.
Apre sa, paramèt r/m lan reprezante rapò divèsite rekombinasyon ak entwodiksyon mitasyon an, epi valè mwayèn li ant 0.025 ak 0.037, sa ki endike ke konpare ak mitasyon yo, rekombinasyon gen yon enpak jeneral ki pi ba sou divèsite jenetik M. bovis la (Tablo 3). Pou yon konparezon detaye, yo te itilize yon metòd menm jan an pou estime paramèt r/m lan pou ansanm done MTBC ki konpoze de 23 jenòm, ki montre yon valè mwayèn 0.48620, alòske pou ansanm done 38 M. bovis Patané ak kòlèg li yo, li te pwouve valè mwayèn lan se 0.98. Nan premye etid la, se sèlman de nan 23 jenòm yo ki te enkli nan travay M. bovis la (M. bovis BCG ak souch referans lan), kidonk valè yo jwenn nan ka gen yon patipri akòz surekspresyon jenòm M. tuberculosis la. Nan dezyèm rapò a, popilasyon Mycobacterium bovis yo te analize yo te sitou refè Ozetazini ak nan bèt ki resevwa bèt. Okontrè, nan ansanm done nou an, nou reprezante plis kote jewografik ak espès lame, epi nou itilize tou jènòm gwoupe an diferan konplèks klonal ak diferan karakteristik jenetik popilasyon, kidonk nou rive jwenn yon konesans popilasyon ki pi pwofon e ki pi laj. Diferans valè mwayèn r/m ki jwenn ak ansanm done nou an konsistan avèk konsèp ke degre rekombinasyon an varye anpil ant liyaj ki asiyen nan menm espès taksonomik la, kidonk rezilta sa yo endike ke konplèks klon M. bovis la ka montre diferans rekombinasyon. Enpak la se tou jan Didelot & Maiden72 te sijere a. Sepandan, elaji anpil ansanm done sa a lè nou mete yon pi gwo kantite jènòm M. bovis ap pèmèt plis klarifikasyon sou pwen sa a. Tou de paramèt r/m ak rho/theta yo montre varyabilite ant branch yo, e rezilta sa a konsistan avèk rapò sou lòt espès bakteri yo72,73.
Finalman, pou konfime evènman reorganizasyon yo idantifye pa tiyo Gubbins lan, sis algoritm diferan te itilize nan lojisyèl RDP4 la pou teste diferan milti-konparezon debaz yo yon fason endepandan. Globalman, mwens pase mwatye nan evènman Gubbins yo te idantifye yo te konfime pa RDP4 (Tablo 4 ak 5). Lè nou konsidere tout seri done yo, twa evènman rekombinasyon te konfime, de ki enplike ne entèn yo ak lòt la ki enplike yon sèl jenòm nan yon branch tèminal, pou ki konplèks klonal yo pa t kapab asiyen (Tablo 4 ak 5). Idantifikasyon evènman nan branch tèminal yo ka endike ke rekombinasyon an toujou ap pwogrese nan souch kontanporen M. bovis oswa rezilta a mal plase70. Nan rejyon rekombinasyon ipotetik sa a, apeprè 20% nan pozisyon yo gen nikleotid (N) ki pa defini, kidonk afekte siyal rekombinasyon an (Figi Siplemantè 2). Anplis de sa, rejyon sa a afekte jèn rrs la, ki kode ARN ribozomal 16S la ki espere trè konsève, kidonk siyal rekombinasyon swadizan sa a ka rezilta erè sekans oswa move aliyman. Apre sa, yo te fè aliyman tout jenòm ant Mb0003 ak Mycobacterium bovis AF2122/97 la, epi yo te konfime egzistans nikleotid ak SNP ki pa defini yo, kidonk pwoblèm posib ki gen rapò ak move aliyman an pa t akòz enfòmasyon byolojik ki te aplike nan travay sa a ki te parèt apre yo te fin aprann pwogram nan.
Pa gen okenn twou oswa nikleotid ki pa defini ki te jwenn nan rejyon rekombinasyon ne entèn yo (Figi 4 ak 5). Konsènan evènman sa yo, youn genyen sèlman jenòm Eu2 a epi li afekte jèn pks12 la, ki kode yon posib poliketid sentaz; pandan ke lòt la anrejistre nan jenòm Eu1 la epi li afekte jèn narX la ki kode yon posib nitrat reduktaz (Tablo 4). An jeneral, analiz rekombinasyon an montre ke gen yon kantite limite fragman rekombinasyon ki gen sipò estatistik, epi endikatè yo dedwi yo endike ke rekombinasyon an gen yon enpak ki ba sou liyaj M. bovis la. Siyal rekombinasyon an espere ba, men li enpòtan pou distenge vrè siyal evolisyon an ak bri background nan, ki se yon travay difisil. Pou diminye siyal bri ki entwodui pa asanblaj ki baze sou referans ak pwoblèm matche 70, 71, tout rès yo eksepte jenòm konplè a te rasanble depi zewo, epi bon jan kalite asanblaj la te verifye ak asire pa analiz pipeline QUAST (Tablo Siplemantè 1). Anplis de sa, yo te fè yon seri analiz siplemantè pou bay solidité ak presizyon sondaj jeneral la. Se poutèt sa, yo te evalye kalite sekansaj jèn narX ak pks12 yo lè yo te fè lekti katografi kont Mycobacterium bovis AF2122/97. Yo te konfime pozisyon SNP rekòmande a nan rejyon rekombinasyon an lè yo te aplike kritè yo mansyone nan seksyon metòd la (omwen 20 lekti ak 0.9 frekans chanjman). Yo te konfime polimòfis jèn narX la nèt nan de jènòm yo (Mb1792361 ak Mb7240415; 2.3%) ak jènòm jènòm pks12 la: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, ak jèn Mb12 yo. Sepandan, pou jenòm Mb2043 la, sis nan uit pozisyon yo pa satisfè kritè pwofondè lekti a paske SNP a sipòte pa yon maksimòm de 17 lekti, ki anba valè papòt 20 etabli a. Se poutèt sa, yo ka konfime rekombinasyon sis jenòm (8.6%) nan sit jenòm sa a (Figi 4 ak 5).
Vizyalizasyon detaye sou aliyman rejyon rekombinasyon nan seri done Mycobacterium bovis la afekte jèn narX la ki kode yon posib reduktaz nitrat. Pa gen okenn twou oswa nikleotid endefini ki te jwenn nan rejyon rekombinasyon ne entèn yo. Evènman patikilye sa a anrejistre nan jenòm Eu1 la. Kalite sekansaj jèn narX la te evalye lè yo te trase lekti Mycobacterium bovis AF2122/97 yo. Konfime kote SNP rekòmande a nan zòn rekombinasyon an lè w aplike kritè yo mansyone nan seksyon metòd la (omwen 20 lekti ak 0.9 frekans chanjman). Polimòfis jèn narX la te konfime nèt nan jenòm Mb1792361 ak Mb7240415 (2.3%).
Vizyalizasyon detaye sou aliyman rejyon rekombinasyon nan seri done Mycoplasma bovis ki afekte jèn pks12 la. Pa gen okenn twou oswa nikleotid endefini ki te jwenn nan rejyon rekombinasyon ne entèn yo. Konsènan evènman ki afekte jèn pks12 ki kode posib poliketid sentaz la, li sèlman gen jenòm Eu2 la. Kalite sekans pks12 la te evalye pa lekti map Mycobacterium bovis AF2122/97 la. Konfime kote SNP rekòmande a nan zòn rekombinasyon an lè w aplike kritè yo mansyone nan seksyon metòd la (omwen 20 lekti ak 0.9 frekans chanjman). Polimòfis jenòm Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, ak Mb1960 yo te konplètman konfime.
Jèn PE ak PPE yo gen rejyon repetitif ke sekansaj Illumina ak move mapping fasil pou li, kidonk yo anjeneral efase nan workflow byoenformatik manm M. tuberculosis yo sèlman lè w ap itilize estrateji mapping-to-sekans lan. Dediksyon evènman rekombinasyon ki aplike nan travay sa a baze sou asanblaj de novo san filtraj PE/PPE. Nou kwè ke lè nou aplike twa metòd ak algoritm konplemantè diferan atravè SplitsTree, Gubbins pipeline ak lojisyèl RDP4, estrateji yo aplike yo solid pou trete ak filtraj rejyon reòganize ki koze pa siyal erè yo. Sepandan, pou eskli entèferans jèn PE/PPE a sou lojisyèl Gubbins ak RDP4 pou idantifye gwoup SNP yo, e pakonsekan idantifikasyon rejyon rekombinasyon yo pwopoze pou afekte jèn narX ak pks12 yo, yo te egzamine vwazinaj jèn sa yo (Fig. Siplemantè 3-5). Nan M. bovis AF2122/97, jèn narX la separe pa narK2 ak Mb1764c, alòske pks12 antoure pa Mb2075c ak Mb2073c (Figi Siplemantè 3-5). Kat ki pwodui lè l sèvi avèk kat sinlin MAUVE nan jenòm konplè a bay enfòmasyon sou konsèvasyon ak rearanjman sekans jèn, ki montre kat blòk kolineyè, epi pa gen okenn siy translokasyon oswa envèsyon jenòm. Anplis de sa, analiz konplemantasyon an ak sekans asid amine a te pwouve omoloji a nan tout jenòm konplè yo, epi pa gen okenn PE/PPE ki te jwenn nan rejyon adjasan narX oswa pks12 yo. Pou narX, yon jenòm (Mb0030) gen yon nòt sinonimi ki pi ba paske jèn narX la te idantifye kòm de fragman (fragman 1891 ak 1890). Pou pks12, akòz resanblans yo, Mb0030 ak Mb003 te montre pi ba nòt sinlinearite, alòske pks12 te idantifye nan de ak twa fragman, respektivman, ki reprezante diferan domèn pwoteyin nan (Figi Siplemantè 3-5). Lè nou pran an kont enfòmasyon sa a, epi lojisyèl Gubbins ak RDP4 yo toulede fè analiz, tcheke aliyman miltip debaz la nan maksimòm 500 bp nan fenèt la, nou konfime ke jèn PE/PPE a pap entèfere ak siyal rekombinasyon ki afekte narX ak pks12.
Malgre ke siyal rekombinasyon yo detekte nan seri done sa a ka konsidere kòm rezidyèl, li vre ke rekombinasyon nan M. bovis pa ka elimine, kidonk li ta dwe kontinye sijè a plis analiz, nan ki genòm konplè ki soti nan diferan senaryo epidemyolojik yo sekansye pou yo enpòtan.
Konparezon pyebwa filogenetik ML yo jwenn anvan ak apre koreksyon rekombinasyon an (Figi 2A, B) pa t mennen nan chanjman siyifikatif nan relasyon filogenetik yo te dedwi a, epi souch M. bovis yo te gwoupe nan menm gwoup la.
Apre yo te fin mete 42 nouvo lekti M. bovis ki te sekansye avèk jenòm referans M. bovis AF2122/97 la sou kat jeyografik, yo te jwenn yon aliyman SNP ki gen 1816 pozisyon polimòfik. Pifò SNP yo (87.1%) sitiye nan rejyon kodaj la, epi jèn ki afekte yo karakterize dapre kategori fonksyonèl yo montre nan Bovilist (Figi 6A, B). Lè nou pran an kont kantite total jèn nan chak kategori fonksyonèl, jèn ki nan kategori "metabolism lipid" yo te montre plis SNP, apre sa jèn ki nan kategori "miray selilè ak pwosesis selilè" ak "metabolism ak respirasyon entèmedyè", sa ki revele ke yo nan evolisyon M. bovis.
Analiz yerarchik sou seri done M. bovis ki soti nan Pòtigal (n = 42). Kantite total SNP anrejistre ak jèn ki afekte pou chak kategori fonksyonèl (A). Kantite total chanjman sinonim ak non-sinonim anrejistre pa kategori fonksyon (B).
Sou yon echèl mondyal, rapò mwayèn dN/dS la pi bon pase 1.5, sa ki endike ke presyon evolisyonè mondyal la se pou debarase m de eta zansèt la epi li reprezante yon senaryo chwa pirifikasyon pozitif (divèsifye oswa dirije) ak/oswa rilaks. Nan kategori "virulans, dezentoksikasyon, adaptasyon", "sekans ensèsyon ak faj", ak "pwoteyin regilatè", plis pase de tyè nan SNP yo pa sinonim (Figi 6B).
Nan tout kategori yo, gen jèn ki gen plizyè SNP, sa ki lakòz yon to mitasyon mwayèn (sa vle di, mwayèn SNP pa jèn) ki pi gran pase 1 (Figi 6A). Pks12 (Mb2074c) ak 15 SNP ak fas (Mb2553c) ak 8 SNP gen valè mitasyon ki pi wo. Toulede jèn sa yo enplike nan metabolis asid gra. Jèn pks la kode poliketid sintaz (PKS), ki se yon anzim miltifonksyonèl ki enplike nan byosentèz lipid miray selil mikobakteri yo74,75. Jèn sa a kode yon polipeptid miltifonksyonèl ki enplike nan sentèz mikoketid yo74,76. Jèn fas la enplike nan sentèz asid mikolik la. Toulede jèn sa yo jwe yon wòl enpòtan nan byosentèz miray selilè a an kontak ak lame a.
Pou nou te ka etidye evolisyon Mycobacterium bovis pi lwen, nou te analize de seri jèn espesifik. Travay ki te pibliye deja lè l sèvi avèk metòd konpozisyon sekans ak filojenetik te idantifye jèn ke zansèt MTBC yo te akeri atravè HGT anvan divèsifikasyon37,38. Jèn sa yo nan lis nan Tablo Siplemantè 2. Nou te analize distribisyon SNP yon total de 77 jèn ki ka gen rapò ak HGT, epi nou te idantifye 26 sit polimòfik, ki nan pifò ka yo (78%) te lakòz chanjman ki pa sinonim (NS) (Tablo Siplemantè 2). Travay anvan sou jenòm MTBC a te demontre ke rejyon HGT swadizan an montre yon rapò SNP NS ki pi wo konpare ak rès jenòm lan. Si yon moun panse ke rejyon rekombinasyon sa yo te akeri pa zansèt MTBC yo, e pakonsekan, yo reprezante twòp polimòfis ansyen yo, alò pwopòsyon chanjman sinonim yo espere pi wo, paske nou espere sibstitisyon NS yo elimine pa seleksyon negatif paske chanjman asid amine yo ka chanje fonksyon pwoteyin nan. Se poutèt sa, rezilta nou yo endike ke konsekans fonksyonèl yo ka soti nan ranplasman jèn ki sanble ak HGT yo, ki reflete enpòtans yo pou divèsite jenetik adaptatif ki gen anpil valè.
An paralèl ak analiz sa a, yo te byen egzamine jèn ki kode konpozan sistèm 3R (reparasyon ADN, replikasyon ak rekombinasyon) yo, dapre lis dos Vultos ak kolaboratè li yo te pibliye deja (2008)39. Yo pa ka obsève echanj fragman ADN idantik yo dirèkteman, byenke li ka yon pwosesis souvan lè bakteri ki gen rapò sere sere yo enplike, tankou nan ka seri done sa a; anplis, pwosesis sa a ka kle metòd reparasyon ADN72, kidonk li jwe yon wòl nan rekombinasyon omolog. Yo te idantifye yon total 26 pozisyon polimòfik distribye pa 54 jèn (Tablo Siplemantè 3). Nan seri jèn sa a, chanjman NS yo te reprezante anviwon 65% nan konsekans yo, ki konsistan avèk rapò anvan yo sou souch Mycobacterium tuberculosis yo.
Dat piblikasyon: 21 oktòb 2021