Faleminderit që vizituat Nature. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ne ju rekomandojmë të përdorni një version më të ri të shfletuesit (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Në të njëjtën kohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do t'i shfaqim faqet pa stile dhe JavaScript.
Sekuencimi i gjenomit ka rigjallëruar fushën e kërkimit të sëmundjeve infektive, duke zbuluar epidemiologjinë e sëmundjes, patogjenezën, ndërveprimet pritës-patogjen dhe procesin evolucionar të imponuar mbi patogjenët. Kompleksi Mycobacterium tuberculosis (MTBC) e konsideron Mycobacterium bovis si një nga anëtarët e tij adaptivë shtazor që shkaktojnë tuberkuloz (TB) te gjitarët tokësorë dhe është një model tipik i evolucionit bakterial. Ashtu si anëtarët e tjerë të MTBC, Mycobacterium bovis supozohet të jetë një patogjen i klonuar në mënyrë strikte, që evoluon ngadalë, dhe padyshim nuk ka shenja të rekombinimit ose transferimit horizontal të gjenit. Në këtë punim, ne aplikojmë gjenomikën krahasuese në një set të dhënash të sekuencës së tërë gjenomit (WGS) të përbërë nga 70 bagëti M. nga pedigre të ndryshme (Evropë dhe Afrikë) për të fituar njohuri mbi diversitetin gjenetik të bagëtive M. Fuqia evolucionare. Tre metoda të ndryshme përdoren për të vlerësuar shenjat e riorganizimit. Globalisht, një numër i vogël i ngjarjeve të rekombinimit janë identifikuar dhe konfirmuar nga dy metoda të pavarura me mbështetje të fortë. Megjithatë, krahasuar me mutacionet, rekombinimi ka një efekt më të dobët në diversitetin e M. bovis (r/m i përgjithshëm = 0.037). Diferenca mesatare r/m e marrë në kompleksin klonal të Mycobacterium bovis në të dhënat tona është në përputhje me konceptin e përgjithshëm se shkalla e rekombinimit mund të ndryshojë shumë midis linjave të caktuara për të njëjtën specie taksonomike. Bazuar në këtë punë, rekombinimi në Mycobacterium bovis nuk mund të përjashtohet, kështu që duhet të jetë objekt i përpjekjeve të mëtejshme në kërkimet e ardhshme krahasuese të gjenomikës, në të cilat WGS e grupeve të mëdha të të dhënave nga skenarë të ndryshëm epidemiologjikë në të gjithë botën është thelbësore. Një analizë shtesë u krye më pas në grupin më të vogël të të dhënave Mycobacterium bovis (n = 42) nga prevalenca e TB shumë-pritësve, dhe u identifikuan më shumë se 1,800 lokuse, nga të cilat të paktën një lloj tregoi një polimorfizëm të vetëm nukleotidi (SNP). Shumica (87.1%) ndodhen në rajonin kodues, dhe raporti global i ndryshimeve jo-sinonime (dN/dS) të ndryshimeve sinonime tejkalon 1.5, duke treguar se përzgjedhja pozitive është një forcë e rëndësishme evolucionare e ushtruar mbi M. bovis. Një përqindje më e lartë e SNP-ve u zbuluan në gjenet e pasura me kategori funksionale të "metabolizmit të lipideve", "murit qelizor dhe proceseve qelizore" dhe "metabolizmit dhe frymëmarrjes së ndërmjetme", duke zbuluar potencialin e tyre në biologjinë dhe evolucionin e rëndësisë së Mycobacterium bovis. Një vështrim më i afërt i gjeneve në paraardhësit e MTBC që janë të prirur ndaj transferimit horizontal të gjeneve dhe të përfshira në sistemin 3R (riparimi, replikimi dhe rekombinimi i ADN-së) zbulon vlerën mesatare negative globale të testit neutral D të Taijima-s, i cili tregon skanimin selektiv të kaluar. Ngushtica e fundit pas zgjerimit të popullatës është ende faktori kryesor nxitës evolucionar për patogjenin e detyrueshëm Mycobacterium bovis për të luftuar strehuesin.
Kompleksi i Mycobacterium tuberculosis (MTBC) është një nga taksat më të suksesshme të patogjenëve bakterialë dhe një rast tipik i evolucionit bakterial. Anëtarët e tij tregojnë identitet çuditërisht të lartë nukleotidesh në nivelin gjenomik (> 99%)1,2. Ekotipe të ndryshme të MTBC mund të shkaktojnë tuberkuloz (TB), i cili është një sëmundje granulomatoze infektive, në një gamë të gjerë speciesh pritëse nga mikro-gjitarët te njerëzit3,4,5. Aktualisht, kompleksi përfshin njerëzit [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] dhe patogjenë të adaptuar ndaj kafshëve (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" dhe "dassie") 5,6. M. canettii (i njohur edhe si "Nodobacter glabrata") Identiteti mesatar i nukleotideve me mikobakteret e lartpërmendura është 98%, dhe puna krahasuese e gjenomikës ka treguar se M. canettii dhe pjesa tjetër e MTBC-së kohët e fundit janë divergjuar nga paraardhësi i përbashkët.7 Duke marrë parasysh këtë koncept, disa autorë e quajnë M. canettii Anëtar të MTBC-së 8.
MTBC përshkruhet sistematikisht si një kompleks klonal strikt, dhe struktura e popullsisë së tij drejtohet qartë nga diversiteti i reduktuar, pengesat, skanimi selektiv dhe zhvendosja gjenetike9,10. Duke supozuar se evolucioni kompleks klonal strikt, siç janë polimorfizmat që mungojnë, nuk mund të rikthehen me anë të rekombinimit. Bazuar në këtë premisë, ngjarjet e njëpasnjëshme të fshirjes gjenomike të rajonit diferencial (RD) dhe TbD1 (rajoni 1 i fshirjes specifike të Mtb) janë propozuar si shënjues molekularë të evolucionit të MTBC2,5,11. Gjenomika krahasuese dhe puna e sekuencimit të të gjithë gjenomit (WGS) mbështet ndarjen e anëtarëve të përshtatur nga njeriu në nëntë linja (Mycobacterium tuberculosis L1 deri në L4, L7 dhe L8; dhe Mycobacterium africanum L5, L6 dhe L9), linjat L2 deri në L4 kanë rajonin TbD1 me fshirje të përbashkët2,11,12,13. Përveç kësaj, propozohet që anëtarët e adaptuar ndaj kafshëve ndajnë një paraardhës të përbashkët, i cili përcaktohet nga fshirjet specifike të kladës në RD7, RD8, RD9 dhe RD102, 5 dhe 14.
Transferimi horizontal i gjenit (HGT) dhe ngjarjet e rekombinimit konsiderohen të rralla dhe ndodhin tek paraardhësit e MTBC, në vend të historisë së ndryshme të të gjithë anëtarit të MTBC15,16,17. Dy raporte të hershme nga Hughes dhe bashkëpunëtorët (2002) dhe Gutacker dhe bashkëpunëtorët (2006) sugjeruan që ngjarjet e rekombinimit mund të ndihmojnë në formësimin e polimorfizmave që shënojnë lokuse specifike në llojet e M. tuberculosis18,19. Arsyet për mungesën e dukshme të rekombinimit në MTBC janë: (1) procesi mekanik dhe humbja e aftësisë së HGT; (2) rrallësia e ngjarjeve të HGT; (3) nuk ka shanse për ngjarje rekombinimi në vendndodhjen MTBC14,17. Kohët e fundit, disa studime të sekuencimit të të gjithë gjenomit (WGS) të aplikuara në llojin MTBC 20 dhe Mycobacterium bovis 21 kanë dhënë prova të rekombinimit, të parat që tregojnë se llojet MTBC shpesh shkëmbejnë fragmente të vogla të ADN-së, por për shkak të ndryshimit të kufizuar të sekuencës së nukleotideve, këto ngjarje ende nuk vihen re.
Mycobacterium bovis është anëtari MTBC që gjendet më shpesh te bagëtitë (kryesisht bagëtia), megjithëse mund të izolohet edhe nga kafshët e egra që jetojnë në vende të lira dhe të rrethuara4,22,23,24. M. bovis evoluoi në pesë komplekse kryesore klonale [Evropian 1 (Eu1), Evropian 2 (Eu2), Evropian 3 (Eu3), Afrikan 1 (Af1) dhe Afrika 2 (Af2)], sipas profilit të spoligotipizimit, fshirjeve specifike dhe polimorfizmave të nukleotideve të vetme (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 në gjene specifike. Këto komplekse klonale demonstrojnë strukturën e larmishme të popullatës së Mycobacterium bovis dhe lidhjen e saj me rajonet gjeografike. Përveç kësaj, puna e fundit WGS e kryer nga Zimpel dhe bashkëpunëtorët (2020) projektoi një filogjeni bazuar në SNP-në e Mycobacterium bovis, me më shumë se 1,900 gjenoma, duke treguar se ekzistojnë të paktën katër linja të ndryshme (të emëruara nga Lb1 në Lb1 në Lb4), ato nuk janë plotësisht në përputhje me kompleksin klonal të përcaktuar më parë, megjithëse mund të konfirmohet edhe specifikimi gjeografik30. Këta autorë kryen analizë diferenciale të filogjenisë dhe datimit molekular, por nuk studiuan rekombinimin30.
Punimet e mëparshme duke përdorur teknika të ndryshme molekulare, të tilla si spoligotipizimi, MIRU-VNTR (numri i përsëritjes në tandem të njësisë së përsëritur të ndërthurur me ndryshore mikobakteriale) dhe tipizimi i fundit i SNP zbuluan një nivel të caktuar të diversitetit gjenetik midis llojeve të M. bovis 31,32,33, 34,35. Diferencimi i variacionit gjenetik është bërë një mjet i rëndësishëm në studimin e epidemiologjisë së sëmundjeve, i cili është i dobishëm për një kuptim të thellë të patogjenezës, virulencës dhe transmetimit të sëmundjeve. Shfaqja e metodës WGS ofron mundësinë për të zbuluar faktorët nxitës evolucionarë të imponuar nga gjenomi i Mycobacterium bovis në procesin e përshtatjes dhe qëndrueshmërisë ndaj pritësve dhe skenarëve të ndryshëm epidemiologjikë.
Në këtë punim, ne përdorim analizë gjenomike krahasuese në grupe të ndryshme të të dhënave të Mycoplasma bovis (n = 70), duke përfshirë izolate nga komplekse të ndryshme klonale, për të fituar njohuri mbi procesin evolucionar të Mycoplasma bovis, veçanërisht për të zgjidhur marrëdhëniet filogjenetike dhe ngjarjet e rekombinimit. Si shtesë e kësaj analize, një grup nën-të dhënash i izolateve të M. bovis (n = 42) të marra nga një zonë e mirë-karakterizuar e tuberkulozit me shumë pritës në Portugali 31,36 u eksplorua më tej për të nxjerrë përfundime mbi mos-identitetin. Bilanci midis raportit relativ të zëvendësimeve të nukleotideve sens (dN) dhe sinonime (dS), si dhe kontributit evolucionar të gjenomeve specifike të përmendura në literaturë, ato 37,38 janë marrë nga paraardhësit e MTBC përmes HGT, dhe kodojnë komponentët e gjeneve të sistemit 3R (riparimi, replikimi dhe rekombinimi i ADN-së) 39. Zgjidhni gjenet e marra përmes HGT sepse ato mund të përfaqësojnë polimorfizma të lashta, kështu që pritet që ato të përmbajnë një përqindje më të lartë të ndryshimeve sinonime. Gjenet e përfshira në sistemin 3R u përzgjodhën sepse puna e mëparshme mbi llojet e M. tuberculosis tregoi përzgjedhje të përgjithshme negative/pastrimi që funksionojnë në këto gjene, dhe ato mund të luajnë një rol të rëndësishëm në evolucion 39. Një qëllim tjetër i kësaj pune është të nxjerrë përfundimin për ekzistencën e ngjarjeve të riorganizimit. Për këtë arsye, duke marrë parasysh që të dhënat tona nga Portugalia përmbajnë vetëm gjenomet e kompleksit evropian të klonit 2 dhe llojet që nuk e kanë caktuar kompleksin e klonit, vendosëm të përfshijmë të dhëna të gjenomit të disponueshme publikisht për të marrë më në fund një përfaqësues të të gjitha komplekseve të kloneve, dhe për të përmirësuar qëndrueshmërinë dhe gjerësinë e rezultateve.
42 gjenome të sekuencuara rishtazi të Mycoplasma bovis nga skena endemike portugeze e tuberkulozit shumë-pritës (detajet më poshtë), të karakterizuara më parë nga një perspektivë epidemiologjike36, janë qendra e këtij punimi. Duke pasur parasysh se grupi i të dhënave nga Portugalia ka vetëm përfaqësues të 2 komplekseve dhe llojeve të kloneve evropiane pa komplekse të përcaktuara, të dhënat e sekuencimit të të gjithë gjenomit të disponueshme publikisht janë shtuar për të zgjeruar grupin e të dhënave që përfshin të gjithë përfaqësuesit e komplekseve të kloneve të M. bovis. Prandaj, në këtë punim u përdorën tre burime të të dhënave të sekuencimit të të gjithë gjenomit: montimi i plotë/draft i gjenomit, deri në 10 skela të ruajtura në NCBI (Qendra Kombëtare për Informacion Bioteknologjik) (n = 15 izolate); të ruajtura në SRA (skedari Illumina fastq i arkivit të leximit të sekuencave) përfaqëson diversitetin kompleks të kloneve të M. bovis (n = 12 izolate)30; dhe 42 gjenome të sekuencuara rishtazi nga Portugalia. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) u përjashtua nga kërkimi i NCBI. M. bovis AF2122/97 zakonisht përdoret si një gjenom reference për t'u përfshirë në të dhënat e dhënash. Për shkak të mosdisponueshmërisë publike të të gjithë sekuencës së gjenomit të përfaqësuar nga kompleksi i klonimit African 1, dhe numrit të vogël të gjenomeve nga llojet përfaqësuese të Af2 dhe Eu1, të dhënat origjinale të sekuencimit të ofruara nga SRA u përdorën në këto raste. Puna e Zimpel dhe bashkëpunëtorëve të tij (2020) ndihmoi në identifikimin e gjenomit nga kompleksi i klonimit i lartpërmendur dhe ndihmoi në përzgjedhjen e Mycobacterium bovis për përfshirje në të dhënat e dhëna. Për Eu3, përshkruhet vetëm një lloj gjenomi (Branger et al., 2020), kështu që gjenomi që përfshijmë është një përfaqësues i veçantë i kompleksit Eu3.
Globalisht, ky grup të dhënash përfshin 70 gjedhë M. bovis të izoluara nga 8 specie pritëse, të shpërndara në 12 vende nga viti 1985 deri në vitin 2016. 36 specie janë përcaktuar si Eu2, 7 specie janë Eu1, 1 specie është Eu3, 3 specie janë Af1, 4 specie janë Af2 dhe 19 nuk i atribuohen asnjë kompleksi klonal (detajet më poshtë). Informacioni i detajuar (përfshirë numrin e hyrjes) i Mycobacterium bovis i përdorur në këtë studim tregohet në Tabelën 1 dhe Tabelën Plotësuese 1.
42 gjenome të plota të sekuencuara rishtazi të Mycobacterium bovis nga vatrat e nxehta të tuberkulozit në kafshë të Portugalisë dhe të shpërndara për më shumë se 12 vjet janë qendra e këtij studimi, pasi sistemet e mundshme të sëmundjeve të kafshëve të egra-bagëti janë monitoruar rregullisht 31,36 (Fig. Plotësuese 1). Sipas procedurave të mëvonshme, këto lloje u izoluan nga bagëtia (n = 14), dreri i kuq (n = 16) dhe derri i egër (n = 12) nga viti 2003 deri në vitin 2015: mblidhni dhe trajtoni kafshët në përputhje me udhëzimet e rekomanduara të protokollit. Mostrat e indeve janë në Manualin e Kafshëve Tokësore të OIE-së dhe inokulohen në mjedis të ngurtë dhe të lëngshëm piruvati Stonebrink dhe Löwenstein-Jensen. Kulturat inkubohen në 37 °C dhe rritja kontrollohet një herë në javë për të paktën 12 javë. Kolonitë ruhen direkt në një tretësirë gliceroli në -80ºC. Në mjedisin selektiv të Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), mostrat origjinale të arkivuara u kaluan përmes një kalimi të vetëm in vitro in vitro për të marrë ADN-në e programit WGS. Për këtë, tretësira e ngrirë e kulturës bazë u pasurua me 5% piruvat natriumi dhe 10% ADS (50 g albuminë, 20 g glukozë, 8.5 g klorur natriumi në 1 L ujë) në Middlebrook 7H9 në 37°C Retrain. Pas 4 javësh rritjeje, mjedisi u rinovua dhe kultura u monitorua rregullisht derisa të vërehej rritje. Qelizat u mblodhën me anë të centrifugimit, peleti u risuspendua në 500 µL tretësirë fiziologjike të tamponuar me fosfat (PBS), u ngroh në 99 °C për 30 minuta, u centrifugua dhe supernatanti u ruajt në -20 °C deri në WGS. Të gjitha procedurat kryhen në mjedise të biosigurisë së nivelit 3.
Biblioteka e gjenomit me skaje të çiftëzuara WGS përgatitet duke përdorur indeksin unik të secilës mostër ADN-je dhe përdor teknologjinë Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 mostra) dhe HiSeq (2 × 150 pb) (dy izolate) (Eurofins Genomics, Gjermani) për sekuencimin. Sipas udhëzimeve të prodhuesit, përdorni Analizuesin e Gjenomit Illumina me bashkim moduli me skaje të dyfishta për të sekuencuar ADN-në gjenomike dhe përdorni Kit-in e Përgatitjes së Bibliotekës së ADN-së Nextera XT nga Illumina për të ndërtuar bibliotekën.
Duke marrë parasysh të dhënat e marra nga SRA (n = 12), identifikimi i kompleksit të klonit mund të përdoret si meta të dhëna të botimit përkatës 30, 41, 43. Kur merret në konsideratë gjenomi i plotë, përveç Mycobacterium bovis AF2122/97 dhe Mycobacterium bovis 3601, të cilët janë anëtarë të njohur të kompleksit klonal Eu1 dhe Eu3 25, 29, përkatësisht, ai është i njëjtë me gjenomin e plotë të Mycobacterium tuberculosis H37Rv (numri i hyrjes në NCBI NC_000962.3). Rreshtimi i gjenomit kryhet duke përdorur MAFFT (programi i shtrirjes së shumëfishtë të sekuencës së aminoacideve ose nukleotideve, versioni 7.458) dhe parametrin -addfragments48. Pastaj, kërkoni për mungesën e komplekseve të ndryshme klonale dhe/ose praninë e karakteristikave të SNP.
Mycobacterium bovis i sekuencuar rishtazi (n = 42) dhe leximet origjinale të draftit të gjenomit të mbledhur (n = 3) e lidhin kompleksin me gjenomin referues Mycobacterium tuberculosis H37Rv përmes tubacionit vSNP dhe praninë e fshirjes dhe/ose karakteristikave SNP të kloneve të ndryshme. U krye një kërkim.
Mblidhni informacion nga mungesa e karakteristikave dhe/ose prania/mungesa e SNP-së dhe profileve të spoligotipimit për të caktuar të dhënat gjenomike në kompleksin përkatës klonal. Për katër bashkësitë e draftit, profili i spoligotipimit nuk mund të nxirret, kështu që ato përfshihen në grupin "pa kompleksitet".
Fluksi i punës bioinformatike i ndjekur nga kjo punë fillon nga montimi de novo dhe hartëzimi në një strategji referimi, me qëllim eksplorimin e ngjarjeve të rekombinimit dhe polimorfizmave specifike të gjenomit. Figura 1 ofron një diagram rrjedhës të hapave të ndjekur. Për analizën e rekombinimit, të gjitha gjenomet përdoren për të rritur qëndrueshmërinë e përfundimeve dhe treguesve përkatës.
Për të zvogëluar gabimet në gjenerimin e sekuencave të konsensusit të gjenomit, së pari morëm montimin de novo dhe më pas morëm rreshtime të shumëfishta thelbësore. Tubacioni Unicycler është aktualisht i disponueshëm në https://github.com/rrwick/Unicycler49 dhe përdoret për të kryer montimin de novo të 54 gjenomeve të sekuencuara (42 skedarë të sekuencuar rishtas dhe 12 skedarë fastq të rikuperuar nga SRA). Shkurt, para montimit nga e para, analiza e cilësisë së leximit u krye në FastQC versionin 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) dhe Trimmomatic versionin 0.36 (aplikohen opsionet "prerja e adaptorëve dhe sekuencave të tjera specifike për ndriçimin nga leximet" dhe "Prit bazat nga fundi i leximit, nëse cilësia e pragut është më e ulët se 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Pastaj, SPAdes optimizer49 u përdor për montimin e gjenomit dhe Pilon versioni 1.1851 u përdor për optimizimin pas montimit. U zgjodh një mënyrë konservative urash për të shmangur montimin e pasaktë, dhe madhësia e k-mer u kërkua dhe u zgjodh midis 20% dhe 95% të gjatësisë së leximit. Ndiqni udhëzimet SPAdes dhe merrni në konsideratë madhësinë e leximit, fshini kontigjet më të vogla se 300 bp dhe vendosni një kufi mbulimi të thellësisë së leximit prej 20 prej 52. Në strategjinë e montimit de novo, rajonet gjenomike si paralogët shumë përsëritës të prolinës-glutamatit (PE) dhe prolinës-prolinës-glutamatit (PPE) nuk u hoqën.
Cilësia e montimit de novo vlerësohet përmes tubacionit QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), i cili lehtëson rinovimin e kontigut dhe të gjenomit referues M. bovis AF2122/97 (numri i hyrjes në NCBI LT708304.1) Hartografik (shih Tabelën Plotësuese 1 për parametrat e cilësisë).
Me ndihmën e tubacionit vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), skedari FASTQ i M. bovis të sekuencuar rishtazi nga sekuencimi i Illumina krahasohet me gjenomin referues AF2122/97 të M. bovis (LT708304.1)). Sipas rekomandimeve të praktikave më të mira të Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, aplikohen parametra standardë të filtrit ose rezultate të masës variante për rikalibrim. Rezultatet filtrohen duke përdorur rezultatin më të ulët të masës SAMtools prej 150 dhe AC = 2. Gjithashtu përdorni Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) për të kontrolluar leximet për të përjashtuar kontaminimin. Tubacioni vSNP i përdorur për t'u lidhur me strategjitë e sekuencimit në punën tonë shqyrton një seri SNP-sh dhe objektivash të përcaktuar, dhe gjithashtu përjashton skenarët e infeksionit të përzier. Mbulimi i gjenomit të lexuar është më i mirë se 99% (Tabela Plotësuese 1).
Për të shmangur gabimet në hartëzim dhe SNP-të e gabuara, filtroni një variant në rastet e mëposhtme: (1) mbështetet nga më pak se 20 lexime, (2) gjendet me një frekuencë më të vogël se 0.9, (3) është në të paktën një lloj, por të paktën ka boshllëqe në një lloj tjetër. Shikuesi i integruar i gjenomikës (IGV) versioni 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 u përdor për të verifikuar vizualisht SNP-të dhe pozicionet me probleme hartëzimi ose rreshtimi. Meqenëse gjenet prolinë-glutamat (PE) dhe prolinë-prolinë glutamat (PPE) janë shumë të dyfishta dhe janë pjesë e një familjeje me shumë gjene, ato keqkuptohen lehtësisht nga sekuencimi dhe keqhartimi i Illumina, kështu që ato preferohen. Fluksi i punës së bioinformatikës mikobakteriale hoqi anëtarët e kompleksit të tuberkulozit kur përdorej strategjia e hartëzimit për të renditur për të konfirmuar SNP-të. Prandaj, ne filtruam gjenet dhe indelet PE/PPE nga analiza.
Sipas Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), të gjitha SNP-të ndahen në kategori funksionale. Linja e të dhënave SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) përdoret për të nxjerrë përfundime mbi pasojat e SNP-ve (ndryshime sinonime ose jo-sinonime). Krijuar një bazë të dhënash të re të gjenomit Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Rreshtimi i shumëfishtë i gjenomit kryesor u krye duke përdorur Parsnp v1.2, aktualisht i disponueshëm në https://github.com/marbl/parsnp57, duke përdorur 69 gjenome/asamble draft të plota (me opsionin -c) dhe M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) është përdorur si referencë. U kryen katër rreshtime të shumëfishta kryesore: vetëm anëtarët e kompleksit të klonimit Eu2 (n = 37), duke përfshirë të gjithë anëtarët e kompleksit të klonimit evropian (n = 44), duke përfshirë pikën e kryqëzimit të kompleksit të klonimit evropian dhe afrikan (n = 51), dhe duke përfshirë të gjithë Mycobacterium bovis në këtë studim (n = 70).
Rreshtimi thelbësor i gjeneruar nga Parsnp përdoret për të nxjerrë pemën filogjenetike të gjasës maksimale (ML) duke përdorur CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 duke përdorur RAxML, dhe për të kryer 1000 replikime të udhëhequra.
Tre algoritme dhe mjete bioinformatike të ndryshme përdoren për të kontrolluar praninë e ngjarjeve të rekombinimit paralelisht: softueri SplitsTree4, tubacioni Gubbins (linja e paanshme përmes rekombinimit në sekuencat e nukleotideve) dhe softueri RDP4 (programi i zbulimit të rekombinimit, versioni beta 4.101).
Metoda e dekompozimit të ndarjes e zbatuar në SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 përdoret për të llogaritur rrjetin filogjenetik pa rrënjë, duke përdorur testin Phi për verifikim statistikor, dhe pragu i rëndësisë është p = 0.05. Analiza thelbësore e shumë-rreshtimit të Parsnp përdoret si input, dhe realizohet dekompozimi i ndarjes si standard rrjeti.
Tubacioni Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) funksionon me parametra të paracaktuar si një mënyrë tjetër për të vlerësuar ndikimin e rekombinimit në Mycobacterium bovis. Algoritmi i zbatuar në tubacion rindërton linjën përkatëse të kloneve. Gjenomi/drafti i plotë i grupit tonë të të dhënave dhe gjenomi i referencës (gjeli i gjedhit AF2122/97, LT708304.1) janë reciprokisht; dhe skanojnë pozicionin e SNP në secilën degë të pemës për të zbuluar grumbullin SNP që përfaqëson ngjarjen e rekombinimit. Zero e degës. Supozojmë se nuk ka ngjarje rekombinimi, që do të thotë se SNP-të që ndodhin në degë duhet të shpërndahen në mënyrë të barabartë. Rreshtimi i shumëfishtë thelbësor nga Parsnp dhe pema ML me rezultatin më të mirë nga RAxML përdoren si skedarë hyrës.
Së fundmi, për të konfirmuar ngjarjen e riorganizimit të sugjeruar nga tubacioni Gubbins, gjashtë algoritmet e zbatuara në RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 dhe SiScan66) aplikohen në shtrirjen e shumëfishtë thelbësore të Parsnp sipas cilësimeve të paracaktuara. Ne përcaktuam se të paktën tre nga algoritmet e zbatuara në RDP4 duhet të demonstrojnë vazhdimisht një sinjal të rëndësishëm për të verifikuar çdo ngjarje rekombinimi.
Duke marrë parasysh që si softueri Gubbins ashtu edhe ai RDP kërkojnë sinjale rekombinimi duke kontrolluar rreshtimet e shumëfishta thelbësore në një dritare deri në 500 bp, dhe duke konfirmuar që përfshirja e gjeneve PE/PPE gjatë montimit de novo nuk do të ndërhyjë në sinjalet e rekombinimit të gjetura, analiza e mëtejshme bëhet me anë të homolinearitetit. Kontrolloni afërsinë e gjenit që identifikon ngjarjen e rekombinimit. Harta sinlineare duke përdorur gjenomin e plotë u ndërtua duke përdorur rreshtimin MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) për të përjashtuar translokacionet ose inversionet lokale të gjenomit. Përveç kësaj, i gjithë gjenomi u përdor për të kryer analizën e homolinearitetit në sekuencën e aminoacideve përmes serverit web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Një analizë më e thelluar e të dhënave të gjenomit të marra nga sistemi portugez i tuberkulozit me shumë pritës është të kontrollohet polimorfizmi i gjeneve të përmendura në literaturë. Këto gjene janë 37,38 dhe gjeni që kodon 3R i marrë nga paraardhësit e MTBC përmes komponentëve të sistemit HGT (riparimi, replikimi dhe rekombinimi i ADN-së) 39. Përdorni ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) dhe përdorni DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) për të llogaritur diversitetin e gjeneve dhe diversitetin e nukleotideve (π) dhe inputin e parametrit të testit neutral D të Tajima-s.
U mor një pemë filogjenetike me gjasën maksimale (ML) bazuar në 69 izolate dhe gjenome referuese të Mycoplasma bovis (Figura 2A). Krahasuar me pemët me bazë një gjen të vetëm ose pemët me bazë shumë-lokusesh, kjo strategji lejon gjenerimin e pemëve më të fuqishme që nuk kapin ndryshueshmërinë e të gjithë gjenomit dhe për këtë arsye shfaqin një aftësi më të ulët për të dalluar midis specieve 68,69. Struktura topologjike e pemës ML zakonisht është në përputhje me klasifikimin kompleks të kloneve. Gjenomi i Eu2 është i grupuar në një degë, dhe gjenomi i Af1 është gjithashtu i grupuar së bashku (Figura 2A). Rezultati është gjithashtu në përputhje me marrëdhënien e njohur evolucionare të Mycobacterium bovis, domethënë, ekziston një ndryshim i madh midis anëtarit Eu1 dhe grupit që përbëhet nga të gjitha komplekset dhe gjenomet e tjera klonale, por kompleksi klonal 30 nuk është specifikuar. Mospërputhja e vogël midis kompleksit klonal dhe marrëdhënies së vërejtur në pemën filogjenetike mund të shpjegohet me faktin se kompleksi klonal përshkruhet bazuar në rajone specifike gjenomike, ndërsa pema filogjenetike bazohet në rreshtime të shumëfishta të gjenomeve kryesore që përfaqësojnë të gjithë gjenomin.
Pema filogjenetike e gjasës maksimale (GTR) ndërtohet bazuar në shtrirjen e gjenomit kryesor të gjenomit të Mycobacterium bovis para (A) dhe pas (B) heqjes së vendit të rekombinimit. Ngjyrat e degëve përfaqësojnë kompleksin e kloneve të Mycobacterium bovis: Evropa 1 është vjollcë, Evropa 2 është e kuqe, Evropa 3 është blu, Afrika 1 është portokalli dhe Afrika 2 është e gjelbër. Pema është e rrënjosur dhe e vizatuar në shkallë, dhe gjatësia e degës matet si zëvendësim për secilën vend.
Kompleksi Mycobacterium tuberculosis përshkruhet si i evoluar në mënyrë klonale, dhe shumica e provave të grumbulluara gjatë viteve mbështesin idenë se ngjarjet e vazhdueshme të HGT dhe rekombinimit nuk do të ndodhin në nivelin e dallueshëm të MTBC15,17,18.
Punimet e mëparshme kanë treguar se mund të ketë rekombinim të kufizuar midis llojeve të MTBC20,21, ndërsa të tjerët nuk kanë arritur të identifikojnë ngjarje të matshme të rekombinimit70,71. Ridiskutoni këtë çështje me fokus në Mycobacterium bovis, i cili është i ndryshëm nga puna e mëparshme që merrte në konsideratë vetëm Mycobacterium tuberculosis70,71; ose merrni në konsideratë MTBC si një të tërë, me pothuajse asnjë M. bovis që përfaqëson20; ose merrni në konsideratë vetëm fraksione kufizuese të bagëtive. Seti i të dhënave të mikobaktereve, në këtë punim, ka gjithsej 70 lloje, që përfaqësojnë të gjitha komplekset klonale, të përdorura për të kontrolluar rekombinimin. Seti i të dhënave është shkallëzuar sipas katër niveleve kumulative: (1) anëtarët Eu2, (2) të gjithë anëtarët e kompleksit të kloneve evropiane (domethënë Evropa), (3) kompleksi i kloneve evropiane dhe afrikane (Eu + Af) dhe (4) të gjitha Koleksionet e të dhënave (duke përfshirë gjenomet që nuk përfshihen në asnjë kompleks klonimi të përshkruar tashmë).
Për të studiuar më tej këtë hipotezë, u krye një rrjet i dekompozimit të ndarë për të vlerësuar mungesën e ngjarjeve të rekombinimit midis gjenomeve, sepse kjo metodë mund të vizualizojë marrëdhënien stërgjyshore midis individëve dhe të shfaqë sinjale filogjenetike kontradiktore. Të katër grupet e të dhënave në analizë konfirmuan ekzistencën e sytheve në rrjet (domethënë, zona që nuk konvergojnë në një pemë të vetme), por testi Phi nuk ka mbështetje statistikore (Eu2, p = 0.0956; Evropë, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; i gjithë grupi i të dhënave p = 0.2451), gjë që ofron prova të dobëta për ekzistencën e ngjarjeve të riorganizimit (Figura 3A-D).
Në Evropë 2 gjenome (n = 37) (A), gjenome evropiane (n = 44) (B), gjenome evropiane dhe afrikane (n = 51) (C) dhe i gjithë grupi i të dhënave (n = 70) (D).
Pas kësaj analize, dhe duke marrë parasysh vëzhgimet ciklike në të gjitha rrjetet, algoritmi i rindërtimit i zbatuar në tubacionin Gubbins u aplikua për të rindërtuar linjën klonale dhe për të plotësuar vlerësimin e efektit të rekombinimit në gjenomën e M. bovis. Nxirrni numrin kumulativ të ngjarjeve të rekombinimit, shumica e të cilave ndodhën në degët terminale (domethënë, në një gjenom të vetëm) (Tabela 2). Këta tregues tregojnë konsistencën e të gjithë grupit të të dhënave dhe tregojnë se frekuenca e ngjarjeve të rekombinimit është 200 deri në 300 herë më e madhe se ajo e mutacioneve. Pasi parametri rho/theta që përfaqëson shkallët relative të rekombinimit dhe mutacionet pikësore në degë duket të jetë midis 0.0037 dhe 0.0056 (Tabela 3). Kohët e fundit, puna e publikuar e llojit 38 M. bovis tregoi një vlerë më të lartë rho/theta (rho/theta = 0.1) sesa ajo e marrë në këtë grup të dhënash, por puna e Patané dhe kolegëve përdori montimin e bazuar në referencë për të nxjerrë parametrat e rekombinimit. Një detaj procedural, për shkak të procedurës së montimit, është shoqëruar me bollëkun e ngjarjeve të supozuara të rekombinimit në degën terminale.
Më pas, parametri r/m përfaqëson raportin e diversitetit të rekombinimit dhe futjes së mutacionit, dhe vlera mesatare e tij është midis 0.025 dhe 0.037, duke treguar se krahasuar me mutacionet, rekombinimi ka një ndikim më të ulët të përgjithshëm në diversitetin gjenetik të M. bovis (Tabela 3). Për krahasim të gjerë, një metodë e ngjashme u përdor për të vlerësuar parametrin r/m për të dhënat MTBC të përbërë nga 23 gjenome, duke treguar një vlerë mesatare prej 0.48620, ndërsa për të dhënat e Patané dhe kolegëve të tij për 38 gjenome të M. bovis, u vërtetua se vlera mesatare është 0.98. Në studimin e parë, vetëm dy nga 23 gjenome të përfshira në punën e M. bovis (M. bovis BCG dhe lloji i referencës), kështu që vlera e marrë mund të jetë e anshme për shkak të mbishprehjes së gjenomit të M. tuberculosis. Në raportin e dytë, popullatat e analizuara të Mycobacterium bovis u gjetën kryesisht nga Shtetet e Bashkuara dhe bagëtitë pritëse. Në të kundërt, në të dhënat tona, përfaqësohen më shumë vendndodhje gjeografike dhe specie pritëse, dhe përdoren gjithashtu gjenome të grupuara në komplekse të ndryshme klonale me karakteristika të ndryshme gjenetike të popullsisë, duke arritur kështu një njohuri më të thellë dhe më të gjerë të popullsisë. Vlera mesatare e ndryshimit r/m e marrë me të dhënat tona është në përputhje me konceptin se shkalla e rekombinimit ndryshon shumë midis linjave të caktuara për të njëjtën specie taksonomike, kështu që këto rezultate tregojnë se kompleksi i klonit M. bovis mund të shfaqë ndryshime në rekombinim. Ndikimi është gjithashtu siç sugjerohet nga Didelot & Maiden72. Megjithatë, zgjerimi i ndjeshëm i këtij grupi të dhënash duke përfshirë një numër më të madh të gjenomeve të M. bovis do të lejojë sqarim të mëtejshëm të kësaj pike. Si parametrat r/m ashtu edhe rho/theta tregojnë ndryshueshmëri midis degëve, dhe ky rezultat është në përputhje me raportet mbi speciet e tjera bakteriale72,73.
Së fundmi, për të konfirmuar ngjarjet e riorganizimit të identifikuara nga tubacioni Gubbins, gjashtë algoritme të ndryshme u përdorën në softuerin RDP4 për të testuar në mënyrë të pavarur krahasime të ndryshme thelbësore. Globalisht, më pak se gjysma e ngjarjeve të identifikuara nga Gubbins u konfirmuan nga RDP4 (Tabelat 4 dhe 5). Duke marrë parasysh të gjithë grupin e të dhënave, u konfirmuan tre ngjarje rekombinimi, dy që përfshinin nyje të brendshme dhe tjetra që përfshinte një gjenom të vetëm në një degë terminale, për të cilën nuk mund të caktoheshin komplekse klonale (Tabelat 4 dhe 5). Identifikimi i ngjarjeve në degët terminale mund të tregojë se rekombinimi është ende në zhvillim e sipër në llojet bashkëkohore të M. bovis ose rezultati është i gabuar70. Në këtë rajon hipotetik të rekombinimit, afërsisht 20% e pozicioneve kanë nukleotide të pacaktuara (N), duke ndikuar kështu në sinjalin e rekombinimit (Figura Plotësuese 2). Përveç kësaj, ky rajon ndikon në gjenin rrs, duke koduar ARN-në ribozomale 16S që pritet të jetë shumë e ruajtur, kështu që ky sinjal i supozuar i rekombinimit mund të jetë rezultat i gabimeve të sekuencimit ose mosrespektimit. Pastaj u krye shtrirja e të gjithë gjenomit midis Mb0003 dhe Mycobacterium bovis AF2122/97, dhe u konfirmua ekzistenca e nukleotideve dhe SNP-ve të pacaktuara, kështu që problemet e mundshme që lidhen me shtrirjen e gabuar nuk ishin për shkak të informacionit biologjik të zbatuar në këtë punim. U shfaq pas mësimit të programit.
Nuk u gjetën boshllëqe ose nukleotide të pacaktuara në rajonet e rekombinimit të nyjeve të brendshme (Figurat 4 dhe 5). Lidhur me këto ngjarje, njëra përmban vetëm gjenomën Eu2 dhe ndikon në gjenin pks12, i cili kodon një sintazë të mundshme poliketide; ndërsa tjetra është e regjistruar në gjenomën Eu1 dhe ndikon në gjenin narX që kodon një reduktazë të mundshme të nitratit (Tabela 4). Në përgjithësi, analiza e rekombinimit tregon se ekziston një numër i kufizuar i fragmenteve të rekombinimit me mbështetje statistikore, dhe treguesit e nxjerrë tregojnë se rekombinimi ka një ndikim të ulët në linjën M. bovis. Sinjali i rekombinimit pritet të jetë i ulët, por është e rëndësishme të dallohet sinjali i vërtetë i evolucionit nga zhurma e sfondit, e cila është një detyrë sfiduese. Për të zvogëluar sinjalin e zhurmës të futur nga problemet e montimit të bazuar në referencë dhe mospërputhjes 70, 71, të gjithë pjesa tjetër përveç gjenomit të plotë u mblodhën nga e para, dhe cilësia e montimit u kontrollua dhe u sigurua nga analiza e tubacionit QUAST (Tabela Plotësuese 1). Përveç kësaj, u kryen një sërë analizash plotësuese për të siguruar qëndrueshmërinë dhe saktësinë e studimit të përgjithshëm. Prandaj, cilësia e sekuencimit të gjeneve narX dhe pks12 u vlerësua duke bërë hartën e leximit kundrejt Mycobacterium bovis AF2122/97. Pozicioni i rekomanduar i SNP në rajonin e rekombinimit u konfirmua duke zbatuar kriteret e përmendura në seksionin e metodës (të paktën 20 lexime dhe frekuencë ndryshimi 0.9). Polimorfizmi i gjenit narX u konfirmua plotësisht në dy gjenomet (Mb1792361 dhe Mb7240415; 2.3%) dhe gjenomet e gjenomit pks12: gjenet Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 dhe Mb12. Megjithatë, për gjenomin Mb2043, gjashtë nga tetë pozicionet nuk e plotësojnë kriterin e thellësisë së leximit sepse SNP mbështetet nga një maksimum prej 17 leximesh, që është nën vlerën e përcaktuar të pragut prej 20. Prandaj, mund të konfirmohet rekombinimi i gjashtë gjenomeve (8.6%) në këtë vend të gjenomit (Figurat 4 dhe 5).
Vizualizimi i detajuar i shtrirjes së rajonit të rekombinimit të të dhënave Mycobacterium bovis ndikon në gjenin narX që kodon një reduktazë të mundshme të nitratit. Nuk u gjetën boshllëqe ose nukleotide të pacaktuara në rajonin e rekombinimit të nyjeve të brendshme. Kjo ngjarje e veçantë është regjistruar në gjenomën Eu1. Cilësia e sekuencimit të gjenit narX u vlerësua duke paraqitur grafikisht leximet e Mycobacterium bovis AF2122/97. Konfirmoni vendndodhjen e rekomanduar të SNP në zonën e rekombinimit duke zbatuar kriteret e përmendura në seksionin e metodës (të paktën 20 lexime dhe frekuencë ndryshimi 0.9). Polimorfizmi i gjenit narX u konfirmua plotësisht në gjenomet e Mb1792361 dhe Mb7240415 (2.3%).
Vizualizim i detajuar i shtrirjes së rajonit të rekombinimit të të dhënave Mycoplasma bovis që ndikon në gjenin pks12. Nuk u gjetën boshllëqe ose nukleotide të pacaktuara në rajonin e rekombinimit të nyjeve të brendshme. Lidhur me ngjarjen që ndikon në gjenin pks12 që kodon sintetazën e mundshme të poliketidit, ai përmban vetëm gjenomin Eu2. Cilësia e sekuencimit të pks12 u vlerësua nga hartëzimi i leximit të Mycobacterium bovis AF2122/97. Konfirmoni vendndodhjen e rekomanduar të SNP në zonën e rekombinimit duke zbatuar kriteret e përmendura në seksionin e metodës (të paktën 20 lexime dhe frekuencë ndryshimi 0.9). Polimorfizmat e gjenomeve Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 dhe Mb1960 janë konfirmuar plotësisht.
Gjenet PE dhe PPE kanë rajone përsëritëse që lexohen gabimisht lehtësisht nga sekuencimi dhe keq-hartimi i Illumina, kështu që ato zakonisht fshihen nga rrjedha e punës bioinformatike e anëtarëve të M. tuberculosis vetëm kur përdoret strategjia e hartëzimit në sekuencë. Përfundimi i ngjarjeve të rekombinimit të aplikuara në këtë punim bazohet në montimin de novo pa filtruar PE/PPE. Ne besojmë se duke zbatuar tre metoda dhe algoritme të ndryshme plotësuese përmes SplitsTree, tubacionit Gubbins dhe softuerit RDP4, strategjitë e aplikuara janë të forta për përpunimin dhe filtrimin e rajoneve të riorganizuara të shkaktuara nga sinjalet e gabimit. Megjithatë, për të përjashtuar ndërhyrjen e gjenit PE/PPE në softuerin Gubbins dhe RDP4 për të identifikuar grupet SNP, dhe për këtë arsye identifikimin e rajoneve të rekombinimit të propozuara për të ndikuar në gjenet narX dhe pks12, u ekzaminua afërsia e këtyre gjeneve (Fig. Plotësuese 3-5). Në M. bovis AF2122/97, gjeni narX është i ndarë nga narK2 dhe Mb1764c, ndërsa pks12 është i rrethuar nga Mb2075c e Mb2073c (Figura plotësuese 3-5). Harta e gjeneruar duke përdorur hartën sinline MAUVE të gjenomit të plotë ofron informacion në lidhje me ruajtjen dhe rirregullimin e sekuencës së gjenit, duke treguar katër blloqe kolineare dhe asnjë shenjë të translokimit ose inversionit të gjenomit. Përveç kësaj, analiza e plotësimit me sekuencën e aminoacideve vërtetoi homologjinë në të gjitha gjenomet e plota dhe nuk u gjet asnjë PE/PPE në rajonet ngjitur të narX ose pks12. Për narX, një gjenom (Mb0030) ka një rezultat më të ulët sinonimie sepse gjeni narX u identifikua si dy fragmente (fragmentet 1891 dhe 1890). Për pks12, për shkak të ngjashmërive, Mb0030 dhe Mb003 shfaqën rezultate më të ulëta të sinlinearitetit, ndërsa pks12 u identifikua në dy dhe tre fragmente, përkatësisht, duke përfaqësuar domene të ndryshme të proteinës (Figura plotësuese 3-5). Duke marrë parasysh këtë informacion, dhe duke marrë parasysh që softuerët Gubbins dhe RDP4 kryejnë analiza, kontrolloni shtrirjen e shumëfishtë thelbësore të maksimumit 500 bp në dritare, ne konfirmuam që gjeni PE/PPE nuk do të ndërhyjë në sinjalin e rekombinimit që ndikon në narX dhe pks12.
Edhe pse sinjalet e rekombinimit të zbuluara në këtë grup të dhënash mund të konsiderohen si rezidualë, është e vërtetë që rekombinimi në M. bovis nuk mund të përjashtohet, kështu që ai duhet të vazhdojë të jetë objekt analizash të mëtejshme, në të cilat gjenome të tëra nga skenarë të ndryshëm epidemiologjikë renditen në të Rëndësishme.
Krahasimi i pemëve filogjenetike ML të marra para dhe pas korrigjimit të rekombinimit (Figura 2A, B) nuk çoi në ndryshime të rëndësishme në marrëdhënien filogjenetike të nxjerrë, dhe llojet e M. bovis u grupuan në të njëjtin grup.
Pas hartëzimit të 42 leximeve të M. bovis të sekuencuara rishtazi me gjenomin referues të M. bovis AF2122/97, u mor një rreshtim SNP që përmbante 1816 pozicione polimorfike. Shumica e SNP-ve (87.1%) ndodhen në rajonin kodues, dhe gjenet e prekura karakterizohen sipas kategorive funksionale të treguara në Bovilist (Figura 6A, B). Duke marrë parasysh numrin total të gjeneve në secilën kategori funksionale, gjenet në kategorinë "metabolizëm lipidik" treguan më shumë SNP, të ndjekura nga "muri qelizor dhe proceset qelizore" dhe "metabolizmi dhe frymëmarrja e ndërmjetme", duke zbuluar se ato janë në evolucion të M. bovis.
Analiza hierarkike e të dhënave të M. bovis nga Portugalia (n = 42). Numri i përgjithshëm i SNP-ve të regjistruara dhe gjeneve të prekura për secilën kategori funksionale (A). Numri i përgjithshëm i ndryshimeve sinonime dhe jo-sinonime të regjistruara sipas kategorisë së funksionit (B).
Në shkallë globale, raporti mesatar dN/dS është më i mirë se 1.5, gjë që tregon se presioni global evolucionar është për t'u çliruar nga gjendja stërgjyshore dhe përfaqëson një skenar pozitiv (të larmishëm ose të drejtuar) dhe/ose të relaksuar të zgjedhjes së pastrimit. Në kategoritë e "virulencës, detoksifikimit, adaptimit", "sekuencave të futjes dhe fagëve" dhe "proteinave rregullatore", më shumë se dy të tretat e SNP-ve nuk janë sinonime (Figura 6B).
Në të gjitha kategoritë, ekzistojnë gjene me SNP të shumëfishta, duke rezultuar në një shkallë mesatare mutacioni (domethënë, SNP mesatare për gjen) më të madhe se 1 (Figura 6A). Pks12 (Mb2074c) me 15 SNP dhe fas (Mb2553c) me 8 SNP kanë vlera më të larta mutacioni. Të dy këta gjene janë të përfshirë në metabolizmin e acideve yndyrore. Gjeni pks kodon poliketid sintazën (PKS), e cila është një enzimë shumëfunksionale e përfshirë në biosintezën e lipideve të murit qelizor të mikobaktereve74,75. Ky gjen kodon një polipeptid shumëfunksional që është i përfshirë në sintezën e mikoketideve74,76. Gjeni fas është i përfshirë në sintezën e acidit mikolik. Të dy këta gjene luajnë një rol të rëndësishëm në biosintezën e murit qelizor në kontakt me strehuesin.
Për të studiuar më tej evolucionin e Mycobacterium bovis, u analizuan dy grupe gjenesh specifike. Punimet e botuara më parë duke përdorur përbërjen e sekuencës dhe metodat filogjenetike identifikuan gjenet që u fituan nga paraardhësit e MTBC përmes HGT para diversifikimit37,38. Këto gjene janë renditur në Tabelën Plotësuese 2. Shpërndarja e SNP e një totali prej 77 gjenesh që mund të lidhen me HGT u analizua dhe u identifikuan 26 vende polimorfike, të cilat në shumicën e rasteve (78%) rezultuan në ndryshime jo-sinonime (NS) (Tabela Plotësuese 2). Punimet e mëparshme në gjenomën MTBC treguan se rajoni i supozuar HGT shfaq një raport më të lartë NS SNP krahasuar me pjesën tjetër të gjenomit. Nëse dikush mendon se këto rajone rekombinimi u fituan nga paraardhësit e MTBC, dhe për këtë arsye, ato mbipërfaqësojnë polimorfizmat e lashta, atëherë përqindja e ndryshimeve sinonime pritet të jetë më e lartë, sepse zëvendësimet e NS pritet të eliminohen nga përzgjedhja negative për shkak të ndryshimeve të aminoacideve që mund të ndryshojnë funksionin e proteinës. Prandaj, rezultatet tona tregojnë se pasojat funksionale mund të rrjedhin nga zëvendësimi i gjeneve të ngjashme me HGT, gjë që pasqyron rëndësinë e tyre për diversitetin gjenetik adaptiv të vlefshëm.
Paralelisht me këtë analizë, gjenet që kodojnë komponentët e sistemit 3R (riparimi, replikimi dhe rekombinimi i ADN-së) u shqyrtuan plotësisht në përputhje me listën e publikuar më parë nga dos Vultos dhe bashkëpunëtorët (2008)39. Shkëmbimi i fragmenteve identike të ADN-së nuk mund të vëzhgohet drejtpërdrejt, megjithëse mund të jetë një proces i shpeshtë kur përfshihen baktere të lidhura ngushtë, siç është në rastin e këtij grupi të dhënash; përveç kësaj, ky proces mund të jetë çelësi i metodave të riparimit të ADN-së72, kështu që luan një rol në rekombinimin homolog. U identifikuan gjithsej 26 pozicione polimorfike të shpërndara nga 54 gjene (Tabela Plotësuese 3). Në këtë grup gjenesh, ndryshimet NS përbënin rreth 65% të pasojave, gjë që është në përputhje me raportet e mëparshme mbi llojet e Mycobacterium tuberculosis.
Koha e postimit: 21 tetor 2021