Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ hạn chế cho CSS. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng phiên bản trình duyệt mới hơn (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Đồng thời, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị các trang web không có kiểu dáng và JavaScript.
Giải trình tự bộ gen đã làm sống lại lĩnh vực nghiên cứu bệnh truyền nhiễm, hé lộ dịch tễ học bệnh, sinh bệnh, tương tác vật chủ-bệnh nguyên và quá trình tiến hóa áp đặt lên mầm bệnh. Phức hợp Mycobacterium tuberculosis (MTBC) coi Mycobacterium bovis là một trong những thành viên thích nghi ở động vật gây bệnh lao (TB) ở động vật có vú trên cạn và là mô hình điển hình về sự tiến hóa của vi khuẩn. Giống như các thành viên MTBC khác, Mycobacterium bovis được coi là một mầm bệnh được nhân bản nghiêm ngặt, tiến hóa chậm và rõ ràng không có dấu hiệu tái tổ hợp hoặc chuyển gen theo chiều ngang. Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng hệ gen so sánh vào tập dữ liệu trình tự toàn bộ bộ gen (WGS) bao gồm 70 chủng M. ở bò từ các phả hệ khác nhau (Châu Âu và Châu Phi) để hiểu sâu hơn về sự đa dạng di truyền của chủng M. ở bò. Sức mạnh tiến hóa. Ba phương pháp khác nhau được sử dụng để ước tính các dấu hiệu của sự tái tổ chức. Trên toàn cầu, một số lượng nhỏ các sự kiện tái tổ hợp đã được xác định và xác nhận bằng hai phương pháp độc lập với sự hỗ trợ vững chắc. Tuy nhiên, so với đột biến, tái tổ hợp có tác động yếu hơn đến sự đa dạng của M. bovis (tổng thể r/m = 0,037). Sự khác biệt r/m trung bình thu được trong phức hợp vô tính của Mycobacterium bovis trong tập dữ liệu của chúng tôi phù hợp với khái niệm chung rằng mức độ tái tổ hợp có thể thay đổi rất nhiều giữa các dòng được chỉ định cho cùng một loài phân loại. Dựa trên công trình này, tái tổ hợp ở Mycobacterium bovis không thể bị loại trừ, vì vậy nó nên là chủ đề của những nỗ lực tiếp theo trong nghiên cứu về hệ gen so sánh trong tương lai, trong đó WGS của các tập dữ liệu lớn từ các kịch bản dịch tễ học khác nhau trên khắp thế giới là rất quan trọng. Sau đó, một phân tích bổ sung đã được thực hiện trên tập dữ liệu Mycobacterium bovis nhỏ hơn (n = 42) từ tỷ lệ mắc bệnh lao ở nhiều vật chủ và hơn 1.800 locus đã được xác định, trong đó ít nhất một chủng biểu hiện đa hình nucleotide đơn (SNP). Phần lớn (87,1%) nằm trong vùng mã hóa, và tỷ lệ toàn cầu của các thay đổi không đồng nghĩa (dN/dS) so với các thay đổi đồng nghĩa vượt quá 1,5, cho thấy chọn lọc tích cực là một lực tiến hóa quan trọng tác động lên M. bovis. Tỷ lệ SNP cao hơn được phát hiện trong các gen giàu các loại chức năng của "chuyển hóa lipid", "thành tế bào và các quá trình tế bào" và "chuyển hóa trung gian và hô hấp", cho thấy tiềm năng của chúng trong sinh học và sự tiến hóa của tầm quan trọng của Mycobacterium bovis. Khi xem xét kỹ hơn các gen trong tổ tiên MTBC dễ bị chuyển gen theo chiều ngang và được đưa vào hệ thống 3R (sửa chữa, sao chép và tái tổ hợp DNA), ta thấy giá trị âm trung bình toàn cầu của phép thử trung tính D của Taijima, cho thấy quá trình quét chọn lọc trong quá khứ. Nút thắt gần đây sau khi quần thể mở rộng vẫn là yếu tố thúc đẩy tiến hóa chính để mầm bệnh bắt buộc Mycobacterium bovis chống lại vật chủ.
Phức hợp Mycobacterium tuberculosis (MTBC) là một trong những nhóm vi khuẩn gây bệnh thành công nhất và là một trường hợp điển hình của quá trình tiến hóa vi khuẩn. Các thành viên của nó thể hiện tính đồng nhất nucleotide cao đáng ngạc nhiên ở cấp độ bộ gen (> 99%)1,2 . Các kiểu gen MTBC khác nhau có thể gây bệnh lao (TB), một bệnh u hạt truyền nhiễm, ở nhiều loài vật chủ, từ động vật có vú nhỏ đến người3,4,5. Hiện nay, phức hợp này bao gồm người [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] và các tác nhân gây bệnh thích nghi với động vật (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" và "dassie") 5,6. M. canettii (còn được gọi là "Nodobacter glabrata") Mức độ đồng nhất nucleotide trung bình với vi khuẩn lao nói trên là 98% và công trình nghiên cứu bộ gen so sánh đã chỉ ra rằng M. canettii và phần còn lại của MTBC gần đây đã tách ra khỏi tổ tiên chung.7 Xem xét khái niệm này, một số tác giả gọi M. canettii là Thành viên của MTBC 8.
MTBC được mô tả một cách có hệ thống là một phức hợp vô tính nghiêm ngặt, và cấu trúc quần thể của nó rõ ràng được chi phối bởi sự đa dạng giảm, các nút thắt, quét chọn lọc và trôi dạt di truyền9,10. Giả sử quá trình tiến hóa vô tính nghiêm ngặt phức tạp, chẳng hạn như các đa hình bị mất không thể được phục hồi bằng tái tổ hợp. Dựa trên tiền đề này, các sự kiện liên tiếp của việc xóa bộ gen của vùng khác biệt (RD) và TbD1 (vùng xóa đặc hiệu 1 của MTB) đã được đề xuất là các dấu hiệu phân tử của quá trình tiến hóa MTBC2,5,11. Công việc giải trình tự toàn bộ bộ gen và so sánh bộ gen (WGS) hỗ trợ việc phân chia các thành viên thích nghi với con người thành chín dòng (Mycobacterium tuberculosis L1 đến L4, L7 và L8; và Mycobacterium africanum L5, L6 và L9), các dòng L2 đến L4 chia sẻ xóa vùng TbD12,11,12,13. Ngoài ra, các thành viên thích nghi với động vật được cho là có chung một tổ tiên, được xác định bằng các đoạn xóa đặc trưng của nhánh trong RD7, RD8, RD9 và RD102, 5 và 14.
Sự kiện chuyển gen theo chiều ngang (HGT) và tái tổ hợp được coi là hiếm gặp và xảy ra ở tổ tiên của MTBC, thay vì lịch sử khác nhau của toàn bộ thành viên MTBC15,16,17. Hai báo cáo ban đầu của Hughes và cộng sự (2002) và Gutacker và cộng sự (2006) cho thấy rằng các sự kiện tái tổ hợp có thể giúp hình thành các đa hình đánh dấu các locus cụ thể trong các chủng M. tuberculosis18,19. Lý do cho sự thiếu tái tổ hợp rõ ràng trong MTBC là: (1) quá trình cơ học và mất khả năng của HGT; (2) sự hiếm gặp của các sự kiện HGT; (3) không có khả năng xảy ra các sự kiện tái tổ hợp trong hốc MTBC14,17. Gần đây, một số nghiên cứu giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) được áp dụng cho chủng MTBC 20 và Mycobacterium bovis 21 đã cung cấp bằng chứng về tái tổ hợp, nghiên cứu đầu tiên cho thấy các chủng MTBC thường trao đổi các đoạn DNA nhỏ, nhưng do biến đổi trình tự nucleotide hạn chế nên các sự kiện này vẫn chưa được chú ý.
Mycobacterium bovis là thành viên MTBC được phục hồi phổ biến nhất từ gia súc (chủ yếu là gia súc), mặc dù nó cũng có thể được phân lập từ động vật hoang dã thả rông và có hàng rào4,22,23,24. M. bovis đã tiến hóa thành năm phức hợp vô tính chính [Châu Âu 1 (Eu1), Châu Âu 2 (Eu2), Châu Âu 3 (Eu3), Châu Phi 1 (Af1) và Châu Phi 2 (Af2)], theo hồ sơ spoligotyping, các xóa đoạn cụ thể và các đa hình nucleotide đơn (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 trong các gen cụ thể. Các phức hợp vô tính này chứng minh cấu trúc đa dạng của quần thể Mycobacterium bovis và mối liên hệ của nó với các khu vực địa lý. Ngoài ra, công trình WGS gần đây do Zimpel và cộng sự thực hiện (2020) đã thiết kế một phả hệ dựa trên SNP của Mycobacterium bovis, với hơn 1.900 bộ gen, cho thấy có ít nhất bốn dòng dõi khác nhau (được đặt tên từ Lb1 đến Lb1 đến Lb4), chúng không hoàn toàn phù hợp với phức hợp vô tính đã được xác định trước đó, mặc dù tính đặc hiệu địa lý cũng có thể được xác nhận30. Các tác giả này đã thực hiện phân tích khác biệt về phả hệ và xác định niên đại phân tử, nhưng không nghiên cứu tái tổ hợp30.
Các nghiên cứu trước đây sử dụng các kỹ thuật phân tử khác nhau, chẳng hạn như phân tích spoligotyping, MIRU-VNTR (số lần lặp lại đơn vị xen kẽ của vi khuẩn Mycobacterium), và phân tích SNP gần đây đã cho thấy mức độ đa dạng di truyền nhất định giữa các chủng M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Việc phân biệt biến dị di truyền đã trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu dịch tễ học bệnh, giúp hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh, độc lực và sự lây truyền bệnh. Sự ra đời của phương pháp WGS mang lại khả năng khám phá các yếu tố thúc đẩy tiến hóa do bộ gen Mycobacterium bovis áp đặt trong quá trình thích nghi và tồn tại trên các vật chủ và các kịch bản dịch tễ khác nhau.
Trong công trình này, chúng tôi sử dụng phân tích bộ gen so sánh trên nhiều tập dữ liệu Mycoplasma bovis (n = 70), bao gồm các phân lập từ các phức hợp vô tính khác nhau, để hiểu sâu hơn về quá trình tiến hóa của Mycoplasma bovis, đặc biệt là để giải quyết các mối quan hệ phát sinh loài và các sự kiện tái tổ hợp. Để bổ sung cho phân tích này, một tập dữ liệu phụ của các phân lập M. bovis (n = 42) thu được từ một khu vực lao đa vật chủ được mô tả rõ ở Bồ Đào Nha 31,36 đã được khám phá thêm để suy ra sự không đồng nhất Sự cân bằng giữa tỷ lệ tương đối của các thay thế nucleotide có nghĩa (dN) so với đồng nghĩa (dS), cũng như sự đóng góp tiến hóa của các bộ gen cụ thể được đề cập trong tài liệu, chúng 37,38 thu được bởi tổ tiên MTBC thông qua HGT và mã hóa các thành phần gen của hệ thống 3R (sửa chữa, sao chép và tái tổ hợp DNA) 39. Chọn các gen thu được thông qua HGT vì chúng có thể đại diện cho các đa hình cổ xưa, do đó, người ta mong đợi rằng chúng có thể chứa tỷ lệ thay đổi đồng nghĩa cao hơn. Các gen được đưa vào hệ thống 3R được lựa chọn vì các nghiên cứu trước đây về các chủng M. tuberculosis đã chỉ ra các lựa chọn âm tính/tinh sạch chung tác động lên các gen này, và chúng có thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tiến hóa 39. Một mục tiêu khác của nghiên cứu này là suy ra sự tồn tại của các sự kiện tái tổ chức. Vì lý do này, xét đến việc tập dữ liệu của chúng tôi từ Bồ Đào Nha chỉ bao gồm bộ gen của phức hợp dòng vô tính châu Âu 2 và các chủng chưa được gán phức hợp dòng vô tính, chúng tôi quyết định đưa vào dữ liệu bộ gen có sẵn công khai để cuối cùng có được một đại diện cho tất cả các phức hợp dòng vô tính, và cải thiện độ tin cậy và phạm vi của kết quả.
42 bộ gen Mycoplasma bovis mới được giải trình tự từ bối cảnh bệnh lao đa ký chủ đặc hữu của Bồ Đào Nha (chi tiết bên dưới), trước đây được mô tả theo góc độ dịch tễ học36, là trọng tâm của công trình này. Xem xét rằng tập dữ liệu từ Bồ Đào Nha chỉ có đại diện của 2 phức hợp dòng vô tính châu Âu và các chủng không có phức hợp được chỉ định, dữ liệu giải trình tự toàn bộ bộ gen có sẵn công khai đã được bổ sung để mở rộng tập dữ liệu bao gồm tất cả các đại diện của các phức hợp dòng vô tính M. bovis. Do đó, ba nguồn dữ liệu giải trình tự toàn bộ bộ gen đã được sử dụng trong công trình này: lắp ráp bộ gen hoàn chỉnh/bản nháp, tối đa 10 khung được lưu trữ trong NCBI (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia) (n = 15 phân lập); được lưu trữ trong SRA (Tệp fastq Illumina của kho lưu trữ đọc trình tự) đại diện cho sự đa dạng phức tạp của các dòng vô tính M. bovis (n = 12 phân lập)30; và 42 bộ gen mới được giải trình tự từ Bồ Đào Nha. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) đã bị loại khỏi tìm kiếm của NCBI. M. bovis AF2122/97 thường được sử dụng làm bộ gen tham chiếu để đưa vào tập dữ liệu. Do trình tự toàn bộ bộ gen đại diện cho phức hợp nhân bản African 1 không được công bố rộng rãi, và số lượng bộ gen từ các chủng đại diện của Af2 và Eu1 còn ít, dữ liệu giải trình tự gốc do SRA cung cấp đã được sử dụng trong những trường hợp này. Công trình của Zimpel và các cộng sự (2020) đã giúp xác định bộ gen từ phức hợp nhân bản nói trên và giúp lựa chọn Mycobacterium bovis để đưa vào tập dữ liệu. Đối với Eu3, chỉ có một loại bộ gen được mô tả (Branger và cộng sự, 2020), vì vậy bộ gen chúng tôi đưa vào là một đại diện riêng biệt của phức hợp Eu3.
Trên toàn cầu, bộ dữ liệu này bao gồm 70 loài vi khuẩn M. bovis ở gia súc được phân lập từ 8 loài vật chủ, phân bố tại 12 quốc gia từ năm 1985 đến năm 2016. 36 loài được chỉ định là Eu2, 7 loài là Eu1, 1 loài là Eu3, 3 loài là Af1, 4 loài là Af2 và 19 loài không thuộc bất kỳ phức hợp vô tính nào (chi tiết bên dưới). Thông tin chi tiết (bao gồm cả số hiệu truy cập) của Mycobacterium bovis được sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày trong Bảng 1 và Bảng bổ sung 1.
42 bộ gen toàn phần mới được giải trình tự của Mycobacterium bovis từ các điểm nóng bệnh lao động vật của Bồ Đào Nha và được phân phối trong hơn 12 năm là trung tâm của nghiên cứu này, vì các hệ thống bệnh tiềm ẩn ở động vật hoang dã-gia súc đã được theo dõi thường xuyên 31,36 (Hình bổ sung 1). Theo các quy trình tiếp theo, các chủng này đã được phân lập từ gia súc (n = 14), hươu đỏ (n = 16) và lợn rừng (n = 12) từ năm 2003 đến năm 2015: thu thập và xử lý động vật theo hướng dẫn giao thức được khuyến nghị Các mẫu mô có trong Sổ tay động vật trên cạn của OIE và được cấy trên môi trường rắn và môi trường lỏng pyruvate Stonebrink và Löwenstein-Jensen. Các nền nuôi cấy được ủ ở 37 ° C và sự phát triển được kiểm tra một lần một tuần trong ít nhất 12 tuần. Các khuẩn lạc được bảo quản trực tiếp trong dung dịch glycerol ở -80ºC. Trong môi trường chọn lọc Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), các mẫu lưu trữ ban đầu được truyền qua một lần chuyển in vitro duy nhất để thu được DNA của chương trình WGS. Đối với điều này, dung dịch gốc nuôi cấy đông lạnh được làm giàu với 5% natri pyruvate và 10% ADS (50 g albumin, 20 g glucose, 8,5 g natri clorua trong 1 L nước) trên Middlebrook 7H9 ở nhiệt độ 37°C Retrain. Sau 4 tuần phát triển, môi trường được thay mới và nuôi cấy được theo dõi thường xuyên cho đến khi quan sát thấy sự phát triển. Các tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm, cặn được tái huyền phù trong 500 µL dung dịch đệm phosphate (PBS), đun nóng ở 99 °C trong 30 phút, ly tâm và phần dịch nổi được bảo quản ở -20 °C cho đến khi WGS. Tất cả các quy trình được thực hiện trong các cơ sở an toàn sinh học cấp độ 3.
Thư viện bộ gen ghép nối WGS được chuẩn bị bằng cách sử dụng chỉ số duy nhất của mỗi mẫu DNA và sử dụng công nghệ Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 mẫu) và HiSeq (2 × 150 pb) (hai mẫu phân lập) (Eurofins Genomics, Đức) để giải trình tự. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, hãy sử dụng Máy phân tích bộ gen Illumina với đầu nối mô-đun hai đầu để giải trình tự DNA bộ gen và sử dụng Bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện DNA Nextera XT của Illumina để xây dựng thư viện.
Xét đến dữ liệu thu được từ SRA (n = 12), việc xác định phức hợp dòng vô tính có thể được sử dụng làm siêu dữ liệu của ấn phẩm tương ứng 30, 41, 43. Khi xem xét toàn bộ bộ gen, ngoại trừ Mycobacterium bovis AF2122/97 và Mycobacterium bovis 3601, lần lượt là các thành viên được công nhận của phức hợp dòng vô tính Eu1 và Eu3 25, 29, thì toàn bộ bộ gen này giống với toàn bộ bộ gen của Mycobacterium tuberculosis H37Rv (mã số truy cập NCBI NC_000962.3). Việc căn chỉnh bộ gen được thực hiện bằng MAFFT (chương trình căn chỉnh đa chuỗi trình tự axit amin hoặc nucleotide, phiên bản 7.458) và tham số -addfragments48. Sau đó, tìm kiếm sự vắng mặt của các phức hợp dòng vô tính khác nhau và/hoặc sự hiện diện của các đặc điểm SNP.
Mycobacterium bovis mới được giải trình tự (n = 42) và các bản đọc ban đầu của bản thảo bộ gen đã lắp ráp (n = 3) sắp xếp phức hợp này với bộ gen tham chiếu Mycobacterium tuberculosis H37Rv thông qua đường ống vSNP và sự hiện diện của các đặc điểm xóa và/hoặc SNP của các bản sao khác nhau. Một tìm kiếm đã được tiến hành.
Thu thập thông tin từ việc thiếu các đặc điểm và/hoặc sự hiện diện/vắng mặt của SNP và hồ sơ spoligotyping để gán dữ liệu bộ gen cho phức hợp dòng vô tính tương ứng. Đối với bốn bản thảo lắp ráp, hồ sơ spoligotyping không thể suy ra được, vì vậy chúng được đưa vào nhóm "không phức tạp".
Quy trình tin sinh học tiếp theo của công trình này bắt đầu từ lắp ráp de novo và lập bản đồ đến một chiến lược tham chiếu, với mục tiêu khám phá các sự kiện tái tổ hợp và các đa hình bộ gen cụ thể. Hình 1 cung cấp sơ đồ các bước được thực hiện. Đối với phân tích tái tổ hợp, tất cả các bộ gen được sử dụng để tăng độ tin cậy của các suy luận và các chỉ số liên quan.
Để giảm thiểu sai sót trong quá trình tạo trình tự đồng thuận bộ gen, trước tiên chúng tôi thu thập dữ liệu lắp ráp de novo, sau đó thu thập dữ liệu căn chỉnh đa lõi. Quy trình Unicycler hiện có sẵn tại https://github.com/rrwick/Unicycler49 và được sử dụng để thực hiện lắp ráp de novo 54 bộ gen đã được giải trình tự (42 tệp mới được giải trình tự và 12 tệp fastq thu được từ SRA). Tóm lại, trước khi lắp ráp từ đầu, phân tích chất lượng đọc đã được thực hiện trong FastQC phiên bản 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) và Trimmomatic phiên bản 0.36 (áp dụng tùy chọn "cắt Bộ điều hợp và các chuỗi đặc trưng ánh sáng khác khỏi các lần đọc" và "Cắt các bazơ từ cuối lần đọc, nếu chất lượng thấp hơn ngưỡng 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Sau đó, trình tối ưu hóa SPAdes49 được sử dụng để lắp ráp bộ gen, và Pilon phiên bản 1.1851 được sử dụng để tối ưu hóa sau lắp ráp. Chế độ cầu nối bảo thủ được chọn để tránh lắp ráp không chính xác, và kích thước k-mer được tìm kiếm và chọn trong khoảng từ 20% đến 95% chiều dài đoạn đọc. Thực hiện theo hướng dẫn của SPAdes và xem xét kích thước đoạn đọc, xóa các đoạn contig nhỏ hơn 300 bp và thiết lập ngưỡng độ sâu đoạn đọc 20 là 52. Trong chiến lược lắp ráp de novo, các vùng bộ gen như paralog proline-glutamate (PE) và proline-proline glutamate (PPE) có tính lặp lại cao không bị loại bỏ.
Chất lượng của quá trình lắp ráp de novo được đánh giá thông qua quy trình QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), giúp tạo điều kiện cho việc đổi mới contig và lập bản đồ bộ gen tham chiếu M. bovis AF2122/97 (số hiệu truy cập NCBI LT708304.1) (xem Bảng bổ sung 1 để biết các thông số chất lượng).
Với sự trợ giúp của đường ống vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), tệp FASTQ của M. bovis mới được giải trình tự từ giải trình tự Illumina được so sánh với bộ gen tham chiếu AF2122/97 của M. bovis (LT708304.1)). Theo các khuyến nghị thực hành tốt nhất của Bộ công cụ Phân tích Bộ gen (GATK) 53, 54, 55, hãy áp dụng các tham số bộ lọc tiêu chuẩn hoặc điểm khối lượng biến thể để hiệu chuẩn lại. Kết quả được lọc bằng điểm khối lượng SAMtools thấp nhất là 150 và AC = 2. Cũng sử dụng Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) để kiểm tra các kết quả đọc nhằm loại trừ nhiễm bẩn. Đường ống vSNP được sử dụng để ánh xạ đến các chiến lược giải trình tự trong nghiên cứu của chúng tôi kiểm tra một loạt các SNP và mục tiêu đã xác định, đồng thời loại trừ các trường hợp nhiễm trùng hỗn hợp. Độ bao phủ bộ gen đã đọc tốt hơn 99% (Bảng Bổ sung 1).
Để tránh lỗi lập bản đồ và SNP sai, hãy lọc ra một biến thể trong các trường hợp sau: (1) nó được hỗ trợ bởi ít hơn 20 lần đọc, (2) nó được tìm thấy với tần suất ít hơn 0,9, (3) nó nằm trong ít nhất một chủng, nhưng ít nhất có những khoảng trống trong một chủng khác. Trình xem bộ gen tích hợp (IGV) phiên bản 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 đã được sử dụng để xác minh trực quan các SNP và vị trí có vấn đề về lập bản đồ hoặc căn chỉnh. Vì các gen proline-glutamate (PE) và proline-proline glutamate (PPE) được nhân đôi nhiều và là một phần của họ đa gen, nên chúng dễ bị hiểu sai do giải trình tự Illumina và lập bản đồ sai, do đó chúng được ưu tiên Quy trình tin sinh học vi khuẩn lao đã loại bỏ các thành viên của phức hợp bệnh lao khi sử dụng chiến lược lập bản đồ để xác nhận SNP. Do đó, chúng tôi đã lọc ra các gen PE/PPE và indel khỏi phân tích.
Theo Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), tất cả các SNP đều được chia thành các nhóm chức năng. Đường dẫn SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) được sử dụng để suy ra hậu quả của SNP (những thay đổi đồng nghĩa hoặc không đồng nghĩa). Đã tạo một cơ sở dữ liệu mới về bộ gen Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Việc căn chỉnh đa bội bộ gen lõi được thực hiện bằng Parsnp v1.2, hiện có sẵn tại https://github.com/marbl/parsnp57, sử dụng 69 bộ gen/bản thảo hoàn chỉnh (với tùy chọn -c) và M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) được sử dụng làm tham chiếu. Bốn lần căn chỉnh đa bội lõi đã được thực hiện: chỉ các thành viên của phức hợp nhân bản Eu2 (n = 37), bao gồm tất cả các thành viên của phức hợp nhân bản châu Âu (n = 44), bao gồm điểm giao nhau của phức hợp nhân bản châu Âu và châu Phi (n = 51), và bao gồm tất cả Mycobacterium bovis trong nghiên cứu này (n = 70).
Sự sắp xếp cốt lõi do Parsnp tạo ra được sử dụng để suy ra cây phát sinh loài có độ tin cậy tối đa (ML) bằng cách sử dụng CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 bằng RAxML và thực hiện 1000 lần sao chép có hướng dẫn.
Ba thuật toán và công cụ tin sinh học khác nhau được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của các sự kiện tái tổ hợp song song: phần mềm SplitsTree4, quy trình Gubbins (dòng dõi không thiên vị thông qua tái tổ hợp trong trình tự nucleotide) và phần mềm RDP4 (chương trình phát hiện tái tổ hợp, phiên bản beta 4.101).
Phương pháp phân tách được triển khai trong SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 được sử dụng để tính toán mạng phát sinh loài không có gốc, sử dụng kiểm định Phi để xác minh thống kê, và ngưỡng ý nghĩa là p = 0,05. Phân tích đa liên kết cốt lõi của Parsnp được sử dụng làm đầu vào, và phân tách phân tách như một tiêu chuẩn mạng đã được thực hiện.
Đường ống Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 chạy với các tham số mặc định như một cách khác để đánh giá tác động của tái tổ hợp trên Mycobacterium bovis. Thuật toán được triển khai trong đường ống tái tạo dòng dõi bản sao có liên quan Bộ gen/bản nháp hoàn chỉnh của bộ dữ liệu của chúng tôi và bộ gen tham chiếu (bovine bovid AF2122/97, LT708304.1) là tương hỗ; và quét vị trí của SNP trên mỗi nhánh của cây để phát hiện cụm SNP biểu diễn sự kiện tái tổ hợp. Số không của nhánh Giả sử rằng không có sự kiện tái tổ hợp nào, điều đó có nghĩa là các SNP xảy ra trên nhánh phải được phân bổ đều. Căn chỉnh bội lõi từ Parsnp và cây ML có điểm cao nhất từ RAxML được sử dụng làm tệp đầu vào.
Cuối cùng, để xác nhận sự kiện tái tổ chức được đề xuất bởi đường ống Gubbins, sáu thuật toán được triển khai trong RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 và SiScan66) được áp dụng cho phép căn chỉnh đa lõi của Parsnp theo các thiết lập mặc định. Chúng tôi xác định rằng ít nhất ba thuật toán được triển khai trong RDP4 phải liên tục thể hiện một tín hiệu quan trọng để xác minh mỗi sự kiện tái tổ hợp.
Xét thấy cả phần mềm Gubbins và RDP đều tìm kiếm tín hiệu tái tổ hợp bằng cách kiểm tra các sắp xếp đa nhân lõi trong một cửa sổ lên đến 500 bp, và xác nhận rằng việc đưa gen PE/PPE vào trong quá trình lắp ráp de novo sẽ không ảnh hưởng đến các tín hiệu tái tổ hợp được tìm thấy, phân tích sâu hơn được thực hiện bằng phương pháp kiểm tra tính đồng nhất. Kiểm tra vùng lân cận của gen xác định sự kiện tái tổ hợp. Bản đồ đồng nhất tuyến tính sử dụng toàn bộ bộ gen đã được xây dựng bằng phương pháp sắp xếp đa bộ gen MAUVE (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) để loại trừ các chuyển vị hoặc đảo đoạn bộ gen cục bộ. Ngoài ra, toàn bộ bộ gen đã được sử dụng để thực hiện phân tích tính đồng nhất tuyến tính trên trình tự axit amin thông qua máy chủ web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Một phân tích sâu hơn về bộ dữ liệu bộ gen thu được từ hệ thống bệnh lao đa ký chủ Bồ Đào Nha là kiểm tra tính đa hình của các gen được đề cập trong tài liệu. Các gen này là 37,38 và gen mã hóa 3R được thu thập bởi tổ tiên MTBC thông qua các thành phần của hệ thống HGT (sửa chữa, sao chép và tái tổ hợp DNA) 39. Sử dụng ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) và DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) để tính toán độ đa dạng gen và độ đa dạng nucleotide (π) và đầu vào tham số kiểm tra trung tính D của Tajima.
Cây phát sinh loài theo độ tin cậy tối đa (ML) dựa trên 69 phân lập Mycoplasma bovis và bộ gen tham chiếu đã thu được (Hình 2A). So với các cây dựa trên gen đơn hoặc cây dựa trên nhiều locus, chiến lược này cho phép tạo ra các cây mạnh hơn mà không nắm bắt được tính biến đổi của toàn bộ bộ gen và do đó thể hiện khả năng phân biệt giữa các loài thấp hơn 68,69. Cấu trúc tôpô của cây ML thường phù hợp với phân loại phức tạp của các dòng vô tính. Bộ gen của Eu2 được nhóm lại thành một nhánh, và bộ gen của Af1 cũng được nhóm lại với nhau (Hình 2A). Kết quả cũng phù hợp với mối quan hệ tiến hóa đã biết của Mycobacterium bovis, nghĩa là có sự khác biệt lớn giữa thành viên Eu1 và nhóm bao gồm tất cả các phức hợp dòng vô tính và bộ gen khác, nhưng phức hợp dòng vô tính 30 không được chỉ định. Sự không nhất quán nhỏ giữa phức hợp vô tính và mối quan hệ được quan sát thấy trên cây phát sinh loài có thể được giải thích bởi thực tế là phức hợp vô tính được mô tả dựa trên các vùng bộ gen cụ thể, trong khi cây phát sinh loài dựa trên nhiều sự sắp xếp của bộ gen cốt lõi đại diện cho toàn bộ bộ gen.
Cây phát sinh loài theo xác suất tối đa (GTR) được xây dựng dựa trên sự sắp xếp bộ gen lõi của bộ gen Mycobacterium bovis trước (A) và sau (B) khi loại bỏ vị trí tái tổ hợp. Màu sắc của các nhánh đại diện cho phức hợp dòng Mycobacterium bovis: Châu Âu 1 màu tím, Châu Âu 2 màu đỏ, Châu Âu 3 màu xanh lam, Châu Phi 1 màu cam và Châu Phi 2 màu xanh lá cây. Cây được tạo gốc và vẽ theo tỷ lệ, và chiều dài nhánh được đo để thay thế cho mỗi vị trí.
Phức hợp Mycobacterium tuberculosis được mô tả là tiến hóa theo kiểu vô tính, và hầu hết các bằng chứng tích lũy trong nhiều năm qua đều ủng hộ ý tưởng rằng các sự kiện HGT và tái tổ hợp đang diễn ra sẽ không xảy ra ở mức có thể phát hiện được của MTBC15,17,18.
Các công trình trước đây đã chỉ ra rằng có thể có sự tái tổ hợp hạn chế giữa các chủng MTBC20,21, trong khi những công trình khác không xác định được các sự kiện tái tổ hợp có thể đo lường được70,71. Thảo luận lại vấn đề này với trọng tâm là Mycobacterium bovis, khác với công trình trước đây chỉ xem xét Mycobacterium tuberculosis 70,71; hoặc xem xét MTBC nói chung, hầu như không có M. bovis đại diện cho 20; hoặc chỉ xem xét các phân số hạn chế ở gia súc. Bộ dữ liệu mycobacteria, trong công trình này, có tổng cộng 70 chủng, đại diện cho tất cả các phức hợp vô tính, được sử dụng để sàng lọc tái tổ hợp. Bộ dữ liệu được chia tỷ lệ theo bốn cấp độ tích lũy: (1) các thành viên Eu2, (2) tất cả các thành viên phức hợp vô tính châu Âu (tức là châu Âu), (3) phức hợp vô tính châu Âu và châu Phi (Eu + Af) và (4) toàn bộ Bộ sưu tập dữ liệu (bao gồm các bộ gen không có trong bất kỳ phức hợp vô tính nào đã được mô tả).
Để nghiên cứu sâu hơn giả thuyết này, một mạng lưới phân tách-phân rã đã được thực hiện để đánh giá sự vắng mặt của các sự kiện tái tổ hợp giữa các bộ gen, vì phương pháp này có thể trực quan hóa mối quan hệ tổ tiên giữa các cá thể và hiển thị các tín hiệu phát sinh loài mâu thuẫn. Cả bốn bộ dữ liệu trong phân tích đều xác nhận sự tồn tại của các vòng lặp trong mạng lưới (tức là các vùng không hội tụ thành một cây duy nhất), nhưng kiểm định Phi không có giá trị thống kê hỗ trợ (Eu2, p = 0,0956; Europe, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; toàn bộ bộ dữ liệu p = 0,2451), điều này cung cấp bằng chứng yếu kém về sự tồn tại của các sự kiện tái tổ hợp (Hình 3A-D).
Ở Châu Âu có 2 bộ gen (n = 37) (A), bộ gen Châu Âu (n = 44) (B), bộ gen Châu Âu và Châu Phi (n = 51) (C) và toàn bộ tập dữ liệu (n = 70) (D).
Sau khi phân tích này, và tính đến các quan sát tuần hoàn trong tất cả các mạng, thuật toán tái cấu trúc được triển khai trong quy trình Gubbins đã được áp dụng để tái cấu trúc dòng vô tính và bổ sung cho việc ước tính tác động của tái tổ hợp lên bộ gen M. bovis. Suy ra số lượng tích lũy các sự kiện tái tổ hợp, phần lớn xảy ra ở các nhánh tận cùng (tức là trong một bộ gen duy nhất) (Bảng 2). Các chỉ số này cho thấy tính nhất quán của toàn bộ tập dữ liệu và chỉ ra rằng tần suất các sự kiện tái tổ hợp cao gấp 200 đến 300 lần so với đột biến. Khi tham số rho/theta biểu thị tỷ lệ tương đối của tái tổ hợp và đột biến điểm trên nhánh, dường như nằm trong khoảng từ 0,0037 đến 0,0056 (Bảng 3). Gần đây, công trình đã công bố về chủng M. bovis 38 đã chứng minh giá trị rho/theta cao hơn (rho/theta = 0,1) so với giá trị thu được trong tập dữ liệu này, nhưng công trình của Patané và các đồng nghiệp đã sử dụng phương pháp lắp ráp dựa trên tham chiếu để suy ra các tham số tái tổ hợp. Một chi tiết về thủ tục, do quy trình lắp ráp, đã được liên kết với sự phong phú của các sự kiện tái tổ hợp được cho là ở nhánh cuối.
Tiếp theo, tham số r/m biểu thị tỷ lệ đa dạng của tái tổ hợp và đột biến, giá trị trung bình của nó nằm trong khoảng từ 0,025 đến 0,037, cho thấy rằng so với đột biến, tái tổ hợp có tác động tổng thể thấp hơn đến đa dạng di truyền của M. bovis (Bảng 3)). Để so sánh mở rộng, một phương pháp tương tự đã được sử dụng để ước tính tham số r/m cho tập dữ liệu MTBC bao gồm 23 bộ gen, cho thấy giá trị trung bình là 0,48620, trong khi đối với tập dữ liệu 38 M. bovis của Patané và đồng nghiệp, phương pháp này chứng minh giá trị trung bình là 0,98. Trong nghiên cứu đầu tiên, chỉ có hai trong số 23 bộ gen được đưa vào công trình nghiên cứu về M. bovis (M. bovis BCG và chủng tham chiếu), do đó giá trị thu được có thể bị sai lệch do sự biểu hiện quá mức của bộ gen M. tuberculosis. Trong báo cáo thứ hai, các quần thể Mycobacterium bovis được phân tích chủ yếu được thu hồi từ Hoa Kỳ và vật chủ là gia súc. Ngược lại, trong tập dữ liệu của chúng tôi, nhiều vị trí địa lý và loài vật chủ hơn được thể hiện và các bộ gen được nhóm thành các phức hợp vô tính khác nhau với các đặc điểm di truyền quần thể khác nhau cũng được sử dụng, do đó đạt được kiến thức sâu hơn và rộng hơn về Quần thể. Giá trị trung bình r/m khác biệt thu được với tập dữ liệu của chúng tôi phù hợp với khái niệm rằng mức độ tái tổ hợp thay đổi rất nhiều giữa các dòng được chỉ định cho cùng một loài phân loại, do đó những kết quả này chỉ ra rằng phức hợp vô tính M. bovis có thể biểu hiện sự khác biệt về tái tổ hợp. Tác động này cũng giống như Didelot & Maiden72 đề xuất. Tuy nhiên, việc mở rộng đáng kể tập dữ liệu này bằng cách bao gồm một số lượng lớn hơn các bộ gen M. bovis sẽ cho phép làm rõ hơn điểm này. Cả tham số r/m và rho/theta đều cho thấy sự thay đổi giữa các nhánh và kết quả này phù hợp với các báo cáo về các loài vi khuẩn khác72,73.
Cuối cùng, để xác nhận các sự kiện tái tổ chức được xác định bởi đường ống Gubbins, sáu thuật toán khác nhau đã được sử dụng trong phần mềm RDP4 để kiểm tra độc lập các phép so sánh đa lõi khác nhau. Trên toàn cầu, chưa đến một nửa số sự kiện do Gubbins xác định được RDP4 xác nhận (Bảng 4 và 5). Xem xét toàn bộ tập dữ liệu, ba sự kiện tái tổ hợp đã được xác nhận, hai sự kiện liên quan đến các nút bên trong và sự kiện còn lại liên quan đến một bộ gen duy nhất trong một nhánh tận cùng, mà các phức hợp vô tính không thể được chỉ định (Bảng 4 và 5). Việc xác định các sự kiện trong các nhánh tận cùng có thể chỉ ra rằng quá trình tái tổ hợp vẫn đang diễn ra ở các chủng M. bovis đương thời hoặc kết quả bị đặt sai chỗ70. Trong vùng tái tổ hợp giả định này, khoảng 20% vị trí có các nucleotide chưa xác định (N), do đó ảnh hưởng đến tín hiệu tái tổ hợp (Hình bổ sung 2). Ngoài ra, vùng này ảnh hưởng đến gen rrs, mã hóa RNA ribosome 16S, được dự đoán là có tính bảo tồn cao, do đó, tín hiệu tái tổ hợp giả định này có thể là kết quả của lỗi giải trình tự hoặc sai lệch. Sau đó, toàn bộ hệ gen giữa Mb0003 và Mycobacterium bovis AF2122/97 đã được căn chỉnh, và sự tồn tại của các nucleotide và SNP chưa xác định đã được xác nhận, do đó, các vấn đề có thể liên quan đến sai lệch căn chỉnh không phải do thông tin sinh học được triển khai trong nghiên cứu này. Xuất hiện sau khi học chương trình.
Không tìm thấy khoảng trống hoặc nucleotide không xác định nào trong vùng tái tổ hợp của các nút bên trong (Hình 4 và 5). Liên quan đến các sự kiện này, một sự kiện chỉ chứa bộ gen Eu2 và ảnh hưởng đến gen pks12, mã hóa một polyketide synthase có thể có; trong khi sự kiện còn lại được đăng ký trong bộ gen Eu1 và ảnh hưởng đến gen narX mã hóa một nitrate reductase có thể có (Bảng 4). Nhìn chung, phân tích tái tổ hợp cho thấy có một số lượng hạn chế các đoạn tái tổ hợp có hỗ trợ thống kê và các chỉ số suy ra cho thấy rằng tái tổ hợp có tác động thấp đến dòng dõi M. bovis. Tín hiệu tái tổ hợp dự kiến sẽ thấp, nhưng điều quan trọng là phải phân biệt tín hiệu tiến hóa thực sự với nhiễu nền, đây là một nhiệm vụ đầy thách thức. Để giảm tín hiệu nhiễu do các vấn đề lắp ráp và không khớp dựa trên tham chiếu 70, 71 đưa vào, tất cả các phần còn lại ngoại trừ bộ gen hoàn chỉnh đều được lắp ráp từ đầu và chất lượng lắp ráp đã được kiểm tra và đảm bảo bằng phân tích đường ống QUAST (Bảng bổ sung 1). Ngoài ra, một loạt các phân tích bổ sung đã được thực hiện để đảm bảo tính vững chắc và chính xác của toàn bộ khảo sát. Do đó, chất lượng giải trình tự của gen narX và pks12 đã được đánh giá bằng cách lập bản đồ đọc với Mycobacterium bovis AF2122/97. Vị trí SNP được khuyến nghị trong vùng tái tổ hợp đã được xác nhận bằng cách áp dụng các tiêu chí được đề cập trong phần phương pháp (ít nhất 20 lần đọc và tần số thay đổi 0,9). Tính đa hình của gen narX đã được xác nhận đầy đủ trong hai bộ gen (Mb1792361 và Mb7240415; 2,3%) và các bộ gen của bộ gen pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 và Mb12. Tuy nhiên, đối với bộ gen Mb2043, sáu trong số tám vị trí không đáp ứng tiêu chí độ sâu đọc vì SNP được hỗ trợ bởi tối đa 17 lần đọc, thấp hơn giá trị ngưỡng đã thiết lập là 20. Do đó, sự tái tổ hợp của sáu bộ gen (8,6%) tại vị trí bộ gen này có thể được xác nhận (Hình 4 và 5).
Hình ảnh trực quan chi tiết về sự sắp xếp vùng tái tổ hợp của bộ dữ liệu Mycobacterium bovis ảnh hưởng đến gen narX mã hóa một enzyme khử nitrat tiềm năng. Không tìm thấy khoảng trống hoặc nucleotide chưa xác định nào trong vùng tái tổ hợp của các nút bên trong. Sự kiện cụ thể này được ghi nhận trong bộ gen Eu1. Chất lượng giải trình tự của gen narX được đánh giá bằng cách vẽ đồ thị các đoạn đọc của Mycobacterium bovis AF2122/97. Xác nhận vị trí SNP được khuyến nghị trong vùng tái tổ hợp bằng cách áp dụng các tiêu chí được đề cập trong phần phương pháp (ít nhất 20 đoạn đọc và tần số thay đổi 0,9). Tính đa hình của gen narX đã được xác nhận đầy đủ trong bộ gen của Mb1792361 và Mb7240415 (2,3%).
Hình ảnh trực quan chi tiết về sự sắp xếp vùng tái tổ hợp của bộ dữ liệu Mycoplasma bovis ảnh hưởng đến gen pks12. Không tìm thấy khoảng trống hoặc nucleotide chưa xác định nào trong vùng tái tổ hợp của các nút bên trong. Về sự kiện ảnh hưởng đến gen pks12 mã hóa polyketide synthase, nó chỉ chứa bộ gen Eu2. Chất lượng giải trình tự của pks12 được đánh giá bằng cách lập bản đồ đọc của Mycobacterium bovis AF2122/97. Xác nhận vị trí SNP được khuyến nghị trong vùng tái tổ hợp bằng cách áp dụng các tiêu chí được đề cập trong phần phương pháp (ít nhất 20 lần đọc và tần số thay đổi 0,9). Các đa hình của bộ gen Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 và Mb1960 đã được xác nhận đầy đủ.
Các gen PE và PPE có các vùng lặp lại dễ bị đọc sai do giải trình tự và lập bản đồ sai của Illumina, do đó chúng thường bị xóa khỏi quy trình tin sinh học của các thành viên M. tuberculosis chỉ khi sử dụng chiến lược lập bản đồ theo trình tự. Việc suy luận các sự kiện tái tổ hợp được áp dụng trong công trình này dựa trên lắp ráp de novo mà không lọc ra PE/PPE. Chúng tôi tin rằng bằng cách triển khai ba phương pháp và thuật toán bổ sung khác nhau thông qua SplitsTree, đường ống Gubbins và phần mềm RDP4, các chiến lược được áp dụng là mạnh mẽ để xử lý và lọc các vùng được sắp xếp lại do tín hiệu lỗi gây ra. Tuy nhiên, để loại trừ sự can thiệp của gen PE/PPE trên phần mềm Gubbins và RDP4 để xác định các cụm SNP, và do đó xác định các vùng tái tổ hợp được đề xuất ảnh hưởng đến gen narX và pks12, vùng lân cận của các gen này đã được kiểm tra (Hình bổ sung 3–5). Ở M. bovis AF2122/97, gen narX được phân tách bởi narK2 và Mb1764c, trong khi pks12 được bao quanh bởi Mb2075c và Mb2073c (Hình bổ sung 3-5). Bản đồ được tạo ra bằng cách sử dụng bản đồ synline MAUVE của toàn bộ bộ gen cung cấp thông tin về sự bảo tồn và sắp xếp lại trình tự gen, cho thấy bốn khối thẳng hàng và không có dấu hiệu của sự dịch chuyển hoặc đảo ngược bộ gen. Ngoài ra, phân tích bổ sung với trình tự axit amin đã chứng minh sự tương đồng trong tất cả các bộ gen hoàn chỉnh và không tìm thấy PE/PPE nào ở các vùng lân cận của narX hoặc pks12. Đối với narX, một bộ gen (Mb0030) có điểm đồng nghĩa thấp hơn vì gen narX được xác định là hai đoạn (đoạn 1891 và 1890). Đối với pks12, do có nhiều điểm tương đồng, Mb0030 và Mb003 biểu hiện điểm đồng tuyến tính thấp hơn, trong khi pks12 được xác định lần lượt ở hai và ba đoạn, đại diện cho các miền khác nhau của protein (Hình bổ sung 3-5). Xem xét thông tin này, cùng với việc phần mềm Gubbins và RDP4 đều thực hiện phân tích, kiểm tra sự liên kết bội lõi của 500 bp tối đa trong cửa sổ, chúng tôi đã xác nhận rằng gen PE/PPE sẽ không can thiệp vào tín hiệu tái tổ hợp ảnh hưởng đến narX và pks12.
Mặc dù các tín hiệu tái tổ hợp được phát hiện trong tập dữ liệu này có thể được coi là còn sót lại, nhưng sự thật là không thể loại trừ tái tổ hợp ở M. bovis, do đó, nó vẫn phải tiếp tục là chủ đề của các phân tích sâu hơn, trong đó toàn bộ bộ gen từ các kịch bản dịch tễ học khác nhau được giải trình tự thành Quan trọng.
Việc so sánh các cây phát sinh loài ML thu được trước và sau khi hiệu chỉnh tái tổ hợp (Hình 2A, B) không dẫn đến những thay đổi đáng kể trong mối quan hệ phát sinh loài được suy ra và các chủng M. bovis được nhóm trong cùng một nhóm.
Sau khi lập bản đồ 42 đoạn đọc M. bovis mới được giải trình tự với bộ gen tham chiếu của M. bovis AF2122/97, một SNP được sắp xếp với 1816 vị trí đa hình đã được thu được. Hầu hết các SNP (87,1%) nằm trong vùng mã hóa, và các gen bị ảnh hưởng được mô tả theo các nhóm chức năng được thể hiện trong Bovilist (Hình 6A, B). Xét đến tổng số gen trong mỗi nhóm chức năng, các gen trong nhóm "chuyển hóa lipid" biểu hiện nhiều SNP hơn, tiếp theo là "thành tế bào và các quá trình tế bào" và "chuyển hóa trung gian và hô hấp", cho thấy chúng nằm trong quá trình tiến hóa của M. bovis.
Phân tích phân cấp bộ dữ liệu M. bovis từ Bồ Đào Nha (n = 42). Tổng số SNP đã đăng ký và các gen bị ảnh hưởng cho từng loại chức năng (A). Tổng số thay đổi đồng nghĩa và không đồng nghĩa được ghi nhận theo từng loại chức năng (B).
Trên phạm vi toàn cầu, tỷ lệ dN/dS trung bình tốt hơn 1,5, cho thấy áp lực tiến hóa toàn cầu là loại bỏ trạng thái tổ tiên và thể hiện một kịch bản lựa chọn tinh chế tích cực (đa dạng hoặc có định hướng) và/hoặc thoải mái. Trong các nhóm "độc lực, giải độc, thích nghi", "trình tự chèn và thể thực khuẩn" và "protein điều hòa", hơn hai phần ba số SNP không đồng nghĩa (Hình 6B).
Trong tất cả các loại, có những gen có nhiều SNP, dẫn đến tỷ lệ đột biến trung bình (tức là SNP trung bình trên mỗi gen) lớn hơn 1 (Hình 6A). Pks12 (Mb2074c) với 15 SNP và fas (Mb2553c) với 8 SNP có giá trị đột biến cao hơn. Cả hai gen này đều tham gia vào quá trình chuyển hóa axit béo. Gen pks mã hóa polyketide synthase (PKS), một enzyme đa chức năng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lipid thành tế bào vi khuẩn lao74,75. Gen này mã hóa một polypeptide đa chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp mycoketide74,76. Gen fas tham gia vào quá trình tổng hợp axit mycolic. Cả hai gen này đều đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp thành tế bào khi tiếp xúc với vật chủ.
Để nghiên cứu sâu hơn về sự tiến hóa của Mycobacterium bovis, hai bộ gen cụ thể đã được phân tích. Các công trình đã công bố trước đây sử dụng thành phần trình tự và phương pháp phát sinh loài đã xác định các gen được tổ tiên của MTBC tiếp nhận thông qua HGT trước khi đa dạng hóa37,38. Các gen này được liệt kê trong Bảng bổ sung 2. Phân phối SNP của tổng số 77 gen có thể liên quan đến HGT đã được phân tích và 26 vị trí đa hình đã được xác định, trong hầu hết các trường hợp (78%) dẫn đến những thay đổi không đồng nghĩa (NS) (Bảng bổ sung 2). Các nghiên cứu trước đây về bộ gen MTBC đã chứng minh rằng vùng HGT được cho là biểu hiện tỷ lệ SNP NS cao hơn so với phần còn lại của bộ gen. Nếu người ta cho rằng các vùng tái tổ hợp này được tổ tiên của MTBC tiếp nhận và do đó, chúng đại diện quá mức cho các đa hình cổ đại, thì tỷ lệ thay đổi đồng nghĩa dự kiến sẽ cao hơn, vì các thay thế NS dự kiến sẽ bị loại bỏ bởi chọn lọc tiêu cực do những thay đổi axit amin có thể làm thay đổi chức năng của protein. Do đó, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng hậu quả về mặt chức năng có thể bắt nguồn từ việc thay thế các gen giống HGT, phản ánh tầm quan trọng của chúng đối với sự đa dạng di truyền thích nghi có giá trị.
Song song với phân tích này, các gen mã hóa các thành phần của hệ thống 3R (sửa chữa, sao chép và tái tổ hợp DNA) đã được kiểm tra kỹ lưỡng theo danh sách trước đó do dos Vultos và cộng sự (2008)39 công bố. Việc trao đổi các đoạn DNA giống hệt nhau không thể được quan sát trực tiếp, mặc dù nó có thể là một quá trình thường xuyên khi liên quan đến các vi khuẩn có quan hệ họ hàng gần, chẳng hạn như trong trường hợp của tập dữ liệu này; ngoài ra, quá trình này có thể là chìa khóa cho các phương pháp sửa chữa DNA72, do đó đóng vai trò trong tái tổ hợp tương đồng. Tổng cộng 26 vị trí đa hình phân bố bởi 54 gen đã được xác định (Bảng bổ sung 3). Trong tập hợp gen này, những thay đổi NS chiếm khoảng 65% hậu quả, phù hợp với các báo cáo trước đây về các chủng Mycobacterium tuberculosis.
Thời gian đăng: 21-10-2021