Bedankt voor uw bezoek aan Nature. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een nieuwere versie van de browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we sites zonder stijlen en JavaScript.
Genoomsequencing heeft het onderzoek naar infectieziekten nieuw leven ingeblazen en de epidemiologie van ziekten, de pathogenese, de interacties tussen gastheer en pathogeen en het evolutionaire proces dat pathogenen beïnvloedt, onthuld. Het Mycobacterium tuberculosis-complex (MTBC) beschouwt Mycobacterium bovis als een van de dierlijke adaptieve leden die tuberculose (TB) veroorzaken bij landzoogdieren en is een typisch model voor bacteriële evolutie. Net als andere MTBC-leden wordt aangenomen dat Mycobacterium bovis een strikt gekloonde, langzaam evoluerende pathogeen is, en er is duidelijk geen teken van recombinatie of horizontale genoverdracht. In dit werk passen we vergelijkende genomica toe op een dataset van volledige genoomsequenties (WGS) bestaande uit 70 runderen van M. van verschillende afstammingslijnen (Europa en Afrika) om inzicht te krijgen in de genetische diversiteit van runderen van M. Evolutionaire kracht. Drie verschillende methoden worden gebruikt om de tekenen van reorganisatie te schatten. Wereldwijd is een klein aantal recombinatiegebeurtenissen geïdentificeerd en bevestigd door twee onafhankelijke methoden met solide ondersteuning. Niettemin heeft recombinatie, vergeleken met mutaties, een zwakker effect op de diversiteit van M. bovis (algemene r/m = 0,037). Het verschil in r/m gemiddelde verkregen in het klonale complex van Mycobacterium bovis in onze dataset is consistent met het algemene concept dat de mate van recombinatie sterk kan variëren tussen de lineages toegewezen aan dezelfde taxonomische soort. Op basis van dit werk kan recombinatie in Mycobacterium bovis niet worden uitgesloten, dus het zou het onderwerp moeten zijn van verdere inspanningen in toekomstig vergelijkend genomica-onderzoek, waarin WGS van grote datasets van verschillende epidemiologische scenario's over de hele wereld cruciaal is. Een aanvullende analyse werd vervolgens uitgevoerd op de kleinere Mycobacterium bovis dataset (n = 42) van de multi-host TB prevalentie, en meer dan 1.800 loci werden geïdentificeerd, waarvan ten minste één stam een enkelvoudig nucleotide polymorfisme (SNP) vertoonde. De meeste (87,1%) bevinden zich in de coderende regio en de globale verhouding van niet-synonieme veranderingen (dN/dS) van synonieme veranderingen is groter dan 1,5, wat aangeeft dat positieve selectie een belangrijke evolutionaire kracht is die op M. bovis wordt uitgeoefend. Een groter deel van de SNP's werd gedetecteerd in genen die rijk zijn aan functionele categorieën van "lipidemetabolisme", "celwand- en cellulaire processen" en "intermediair metabolisme en ademhaling", wat hun potentieel in de biologie en evolutie van Mycobacterium bovis aantoont. Een nadere blik op de genen in de MTBC-voorouders die vatbaar zijn voor horizontale genoverdracht en die deel uitmaken van het 3R-systeem (DNA-reparatie, -replicatie en -recombinatie) onthult de globale gemiddelde negatieve waarde van Taijima's D-neutrale test, wat wijst op selectief scannen in het verleden. De recente bottleneck na populatie-expansie is nog steeds de belangrijkste evolutionaire drijvende kracht voor de verplichte ziekteverwekker Mycobacterium bovis om de gastheer te bestrijden.
Het Mycobacterium tuberculosis-complex (MTBC) is een van de meest succesvolle taxa van bacteriële pathogenen en een typisch voorbeeld van bacteriële evolutie. De leden ervan vertonen een verrassend hoge nucleotide-identiteit op genomisch niveau (> 99%)1,2. Verschillende MTBC-ecotypen kunnen tuberculose (TB) veroorzaken, een infectieuze granulomateuze ziekte, bij een breed scala aan gastheersoorten, van microzoogdieren tot mensen3,4,5. Momenteel omvat het complex mensen [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] en aan dieren aangepaste pathogenen (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" en "dassie")5,6. M. canettii (ook bekend als "Nodobacter glabrata") De gemiddelde nucleotide-identiteit met de eerder genoemde mycobacteriën bedraagt 98%. Vergelijkend genomisch onderzoek heeft aangetoond dat M. canettii en de rest van MTBC zich onlangs hebben afgesplitst van de gemeenschappelijke voorouder.7 Gezien dit concept noemen sommige auteurs M. canettii Lid van MTBC 8.
MTBC wordt systematisch beschreven als een strikt klonaal complex, en de populatiestructuur wordt duidelijk bepaald door verminderde diversiteit, knelpunten, selectief scannen en genetische drift9,10. Uitgaande van complexe strikt klonale evolutie, zoals ontbrekende polymorfismen, kan dit niet worden hersteld door recombinatie. Gebaseerd op deze premisse zijn de opeenvolgende gebeurtenissen van de genomische deletie van de differentiële regio (RD) en TbD1 (Mtb-specifieke deletie 1-regio) voorgesteld als moleculaire markers van MTBC-evolutie2,5,11. Vergelijkend genomics- en whole genome sequencing (WGS)-onderzoek ondersteunt de indeling van aan de mens aangepaste leden in negen lineages (Mycobacterium tuberculosis L1 tot L4, L7 en L8; en Mycobacterium africanum L5, L6 en L9), lineages L2 tot L4 delen de TbD1-regio2,11,12,13. Bovendien wordt voorgesteld dat aan dieren aangepaste leden een gemeenschappelijke voorouder delen, die wordt gedefinieerd door clade-specifieke deleties in RD7, RD8, RD9 en RD102, 5 en 14.
Horizontale genoverdracht (HGT) en recombinatiegebeurtenissen worden als zeldzaam beschouwd en komen voor in de voorouders van MTBC, in plaats van in de verschillende geschiedenis van het gehele MTBC-lid15,16,17. Twee vroege rapporten van Hughes en medewerkers (2002) en Gutacker en medewerkers (2006) suggereerden dat recombinatiegebeurtenissen kunnen bijdragen aan het vormen van polymorfismen die specifieke loci in M. tuberculosis-stammen markeren18,19. De redenen voor het duidelijke gebrek aan recombinatie in MTBC zijn: (1) het mechanische proces en het verlies van het vermogen van HGT; (2) de zeldzaamheid van HGT-gebeurtenissen; (3) er is geen kans op recombinatiegebeurtenissen in de MTBC-niche14,17. Onlangs hebben enkele onderzoeken naar volledige genoomsequentie (WGS) die werden toegepast op MTBC-stam 20 en Mycobacterium bovis 21 bewijs geleverd voor recombinatie. Dit is de eerste keer dat is aangetoond dat MTBC-stammen vaak kleine DNA-fragmenten uitwisselen, maar vanwege de beperkte variatie in de nucleotide-sequentie worden deze gebeurtenissen nog steeds niet opgemerkt.
Mycobacterium bovis is het meest voorkomende MTBC-lid dat wordt aangetroffen bij vee (voornamelijk rundvee), hoewel het ook kan worden geïsoleerd bij wilde dieren die in de vrije natuur of in een omheining leven4,22,23,24. M. bovis ontwikkelde zich tot vijf belangrijke klonale complexen [Europees 1 (Eu1), Europees 2 (Eu2), Europees 3 (Eu3), Afrikaans 1 (Af1) en Afrikaans 2 (Af2)], afhankelijk van het spoligotyperingsprofiel, specifieke deleties en enkelvoudige nucleotidepolymorfismen (SNP's) 25, 26, 27, 28, 29 in specifieke genen. Deze klonale complexen tonen de diverse structuur van de Mycobacterium bovis-populatie en de associatie ervan met geografische regio's. Bovendien hebben Zimpel en medewerkers (2020) in hun recente WGS-onderzoek een fylogenie ontworpen op basis van de SNP van Mycobacterium bovis, met meer dan 1900 genomen. Dit wijst erop dat er minstens vier verschillende afstammingslijnen zijn (genaamd Lb1, Lb1 en Lb4). Deze komen echter niet volledig overeen met het eerder gedefinieerde klonale complex, hoewel geografische specificiteit ook kan worden bevestigd30. Deze auteurs voerden een differentiële analyse van de fylogenie en moleculaire datering uit, maar bestudeerden geen recombinatie30.
Eerder onderzoek met verschillende moleculaire technieken, zoals spoligotypering, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) en recente SNP-typering, toonde een zekere mate van genetische diversiteit aan tussen M. bovis-stammen 31,32,33, 34,35. De differentiatie van genetische variatie is een belangrijk instrument geworden in de studie van ziekte-epidemiologie, wat nuttig is voor een diepgaand begrip van pathogenese, virulentie en ziekteoverdracht. De opkomst van de WGS-methode biedt de mogelijkheid om de evolutionaire drijvende factoren te onthullen die het genoom van Mycobacterium bovis bepaalt in het proces van aanpassing en persistentie aan verschillende gastheren en epidemiologische scenario's.
In dit werk maken we gebruik van vergelijkende genomische analyses op verschillende Mycoplasma bovis-datasets (n=70), waaronder isolaten van verschillende klonale complexen, om inzicht te krijgen in het evolutionaire proces van Mycoplasma bovis, met name om fylogenetische relaties en recombinatiegebeurtenissen te achterhalen. Als aanvulling op deze analyse werd een subdataset van M. bovis-isolaten (n = 42) verkregen uit een goed gekarakteriseerd gebied met meerdere gastheren voor tuberculose in Portugal 31,36 verder onderzocht om niet-identiteit af te leiden. De balans tussen de relatieve verhouding van sense (dN) tot synonieme (dS) nucleotidesubstituties, evenals de evolutionaire bijdrage van specifieke genomen die in de literatuur worden genoemd, ze zijn 37,38 verkregen door MTBC-voorouders via HGT en coderen gencomponenten van het 3R-systeem (DNA-reparatie, -replicatie en -recombinatie) 39. Kies genen die zijn verkregen via HGT omdat ze oude polymorfismen kunnen vertegenwoordigen, waardoor verwacht wordt dat ze een hoger percentage synonieme veranderingen kunnen bevatten. De genen in het 3R-systeem zijn geselecteerd omdat eerder onderzoek naar M. tuberculosis-stammen algemene negatieve/zuiveringsselecties aangaf die op deze genen werken, en ze mogelijk een belangrijke rol spelen in evolutie 39. Een ander doel van dit werk is het afleiden van het bestaan van reorganisatiegebeurtenissen. Omdat onze dataset uit Portugal alleen het genoom van Europees klooncomplex 2 bevat en de stammen waaraan het klooncomplex niet is toegewezen, hebben we besloten om openbaar beschikbare genoomgegevens op te nemen om uiteindelijk een representatief beeld te krijgen van alle klooncomplexen en de robuustheid en breedte van de resultaten te verbeteren.
42 nieuw gesequencete Mycoplasma bovis-genomen uit de Portugese endemische multi-host tuberculose-scene (details hieronder), die eerder vanuit een epidemiologisch perspectief36 zijn gekarakteriseerd, vormen de kern van dit werk. Aangezien de dataset uit Portugal alleen vertegenwoordigers van de Europese 2-klooncomplexen en stammen zonder aangewezen complexen bevat, zijn openbaar beschikbare data voor sequentiebepaling van het hele genoom toegevoegd om de dataset uit te breiden met alle vertegenwoordigers van de M. bovis-klooncomplexen. Daarom werden in dit werk drie bronnen voor sequentiebepaling van het hele genoom gebruikt: complete/concept-genoomassemblage, maximaal 10 scaffolds opgeslagen in NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 isolaten); opgeslagen in SRA (het Illumina fastq-bestand van het sequentie-leesarchief) dat de complexe diversiteit van M. bovis-klonen vertegenwoordigt (n = 12 isolaten)30; en 42 nieuw gesequencete genomen uit Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guérin) werd uitgesloten van de NCBI-zoekopdracht. M. bovis AF2122/97 wordt doorgaans gebruikt als referentiegenoom voor opname in de dataset. Vanwege de openbare onbeschikbaarheid van de volledige genoomsequentie van het African 1-kloneringscomplex en het beperkte aantal genomen van representatieve stammen van Af2 en Eu1, werden in deze gevallen de originele sequentiegegevens van SRA gebruikt. Het werk van Zimpel en zijn medewerkers (2020) hielp bij de identificatie van het genoom van het eerder genoemde kloneringscomplex en bij de selectie van Mycobacterium bovis voor opname in de dataset. Voor Eu3 wordt slechts één type genoom beschreven (Branger et al., 2020), dus het genoom dat we opnemen is een aparte representatie van het Eu3-complex.
Wereldwijd omvat deze dataset 70 rundersoorten van M. bovis, geïsoleerd uit 8 gastheersoorten, verspreid over 12 landen tussen 1985 en 2016. 36 soorten zijn aangemerkt als Eu2, 7 soorten als Eu1, 1 soort als Eu3, 3 soorten als Af1, 4 soorten als Af2 en 19 zijn niet toe te schrijven aan een klonaal complex (details hieronder). De gedetailleerde informatie (inclusief het toegangsnummer) van Mycobacterium bovis die in deze studie is gebruikt, is weergegeven in tabel 1 en aanvullende tabel 1.
42 recent gesequencete volledige genomen van Mycobacterium bovis afkomstig uit de Portugese hotspots voor dierlijke tuberculose en verspreid gedurende meer dan 12 jaar, vormen het middelpunt van deze studie, aangezien potentiële ziektesystemen bij wilde dieren en vee regelmatig zijn gemonitord 31,36 (Aanvullende figuur 1). Volgens daaropvolgende procedures werden deze stammen geïsoleerd uit runderen (n = 14), edelherten (n = 16) en wilde zwijnen (n = 12) van 2003 tot 2015: de dieren werden verzameld en behandeld volgens de aanbevolen protocolrichtlijnen. De weefselmonsters zijn opgenomen in het OIE Terrestrial Animal Handbook en zijn geënt op Stonebrink en Löwenstein-Jensen pyruvaat vast medium en vloeibaar medium. De culturen worden geïncubeerd bij 37 °C en de groei wordt minstens 12 weken lang eenmaal per week gecontroleerd. De kolonies worden direct bewaard in een glyceroloplossing bij -80 °C. In het selectieve Mycobacterium-medium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) werden de originele gearchiveerde monsters éénmalig in vitro gepasseerd om het DNA van het WGS-programma te verkrijgen. Hiervoor werd de bevroren kweekoplossing verrijkt met 5% natriumpyruvaat en 10% ADS (50 g albumine, 20 g glucose, 8,5 g natriumchloride in 1 l water) op Middlebrook 7H9 bij 37 °C Retrain. Na 4 weken groei werd het medium ververst en werd de kweek regelmatig gecontroleerd totdat groei werd waargenomen. De cellen werden geoogst door middel van centrifugatie, de pellet werd geresuspendeerd in 500 µl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 30 minuten verwarmd tot 99 °C, gecentrifugeerd en het supernatant werd bewaard bij -20 °C tot WGS. Alle procedures worden uitgevoerd in bioveiligheidsfaciliteiten van niveau 3.
De WGS paired-end genoombibliotheek wordt samengesteld met behulp van de unieke index van elk DNA-monster en maakt gebruik van Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 monsters) en HiSeq (2 × 150 pb) (twee isolaten) technologie (Eurofins Genomics, Duitsland) voor sequencing. Gebruik volgens de instructies van de fabrikant de Illumina Genome Analyzer met dubbelzijdige module om het genomische DNA te sequencen en gebruik de Nextera XT DNA Library Prep Kit van Illumina om de bibliotheek samen te stellen.
Rekening houdend met de gegevens die uit de SRA zijn teruggevonden (n = 12), kan de identificatie van het klooncomplex worden gebruikt als metadata voor de corresponderende publicatie 30, 41, 43. Wanneer het volledige genoom wordt beschouwd, met uitzondering van Mycobacterium bovis AF2122/97 en Mycobacterium bovis 3601, die erkende leden zijn van het klonale complex Eu1 en Eu3, respectievelijk 25, 29, is dit hetzelfde als het volledige genoom van Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI-toegangsnummer NC_000962.3). Genoomuitlijning wordt uitgevoerd met behulp van MAFFT (multiple alignment program of amino acid or nucleotide sequence, versie 7.458) en parameter -addfragments48. Zoek vervolgens naar de afwezigheid van verschillende klonale complexen en/of de aanwezigheid van SNP-kenmerken.
De nieuw gesequencete Mycobacterium bovis (n = 42) en de originele reads van het samengestelde genoomontwerp (n = 3) brengen het complex in lijn met het referentiegenoom Mycobacterium tuberculosis H37Rv via de vSNP-pijplijn en de aanwezigheid van de deletie- en/of SNP-kenmerken van verschillende klonen. Er werd een zoekopdracht uitgevoerd.
Verzamel informatie over het ontbreken van kenmerken en/of de aan-/afwezigheid van SNP- en spoligotyperingsprofielen om genomische gegevens toe te wijzen aan het corresponderende klonale complex. Voor de vier conceptassemblages kan het spoligotyperingsprofiel niet worden afgeleid, dus deze zijn opgenomen in de groep "geen complexiteit".
De bioinformatica-workflow die in dit werk wordt gevolgd, begint met de novo-assemblage en mapping en eindigt met een referentiestrategie, met als doel recombinatiegebeurtenissen en specifieke genoompolymorfismen te verkennen. Figuur 1 toont een stroomschema van de gevolgde stappen. Voor recombinatieanalyse worden alle genomen gebruikt om de robuustheid van de gevolgtrekkingen en gerelateerde indicatoren te vergroten.
Om fouten bij het genereren van genoomconsensussequenties te verminderen, hebben we eerst de novo-assemblage uitgevoerd en vervolgens de core-multiple alignments. De Unicycler-pipeline is momenteel beschikbaar op https://github.com/rrwick/Unicycler49 en wordt gebruikt om de novo-assemblage uit te voeren van 54 gesequencete genomen (42 nieuw gesequencete en 12 fastq-bestanden hersteld van SRA). Kortom, vóór de assemblage vanaf nul werd een analyse van de leeskwaliteit uitgevoerd in FastQC versie 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) en Trimmomatic versie 0.36 (opties "Adapters en andere belichtingsspecifieke sequenties uit reads knippen" en "Basen aan het einde van de read knippen, indien lager dan de drempelwaarde van 20" zijn toegepast) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Vervolgens werd SPAdes optimizer49 gebruikt voor de genoomassemblage en Pilon versie 1.1851 voor de optimalisatie na de assemblage. Er werd een conservatieve bridging-modus geselecteerd om onjuiste assemblage te voorkomen, en de k-mer-grootte werd gezocht en geselecteerd tussen 20% en 95% van de leeslengte. Volg de SPAdes-richtlijnen en houd rekening met de leesgrootte, verwijder contigs die kleiner zijn dan 300 bp en stel een grenswaarde van 52 in voor de dekking van 20 leesdieptes. In de de novo-assemblagestrategie werden genomische regio's zoals de zeer repetitieve proline-glutamaat (PE) en proline-proline-glutamaat (PPE) paralogen niet verwijderd.
De kwaliteit van de de novo-assemblage wordt beoordeeld via de QUAST-pijplijn (http://quast.sourceforge.net/quast.html), die de vernieuwing van het contig- en het M. bovis AF2122/97-referentiegenoom (NCBI-toegangsnummer LT708304.1) Mapping vergemakkelijkt (zie aanvullende tabel 1 voor kwaliteitsparameters).
Met behulp van de vSNP-pijplijn (https://github.com/USDA-VS/vSNP) wordt het FASTQ-bestand van de nieuw gesequencete M. bovis uit Illumina-sequencing vergeleken met het M. bovis AF2122/97-referentiegenoom (LT708304.1). Volgens de best practice-aanbevelingen van de Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55 worden standaard filterparameters of variantmassascores toegepast voor herijking. De resultaten worden gefilterd met behulp van de laagste SAMtools-massascore van 150 en AC = 2. Gebruik ook Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) om de metingen te controleren en contaminatie uit te sluiten. De vSNP-pijplijn die in ons werk wordt gebruikt om sequentiestrategieën te mappen, onderzoekt een reeks gedefinieerde SNP's en targets en sluit ook gemengde infectiescenario's uit. De dekking van het gelezen genoom is beter dan 99% (aanvullende tabel 1).
Om mappingfouten en verkeerde SNP's te voorkomen, filtert u een variant in de volgende gevallen eruit: (1) de variant wordt ondersteund door minder dan 20 metingen, (2) de variant wordt gevonden met een frequentie van minder dan 0,9, (3) de variant komt voor in ten minste één stam, maar er zijn ten minste hiaten in een andere stam. De geïntegreerde genomics viewer (IGV) versie 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 werd gebruikt om SNP's en posities met mapping- of uitlijningsproblemen visueel te verifiëren. Omdat de proline-glutamaat (PE) en proline-proline glutamaat (PPE) genen sterk gedupliceerd zijn en deel uitmaken van een multi-gen familie, worden ze gemakkelijk verkeerd begrepen door Illumina-sequencing en mismapping, dus ze hebben de voorkeur De mycobacteriële bioinformatica-workflow verwijderde leden van het tuberculosecomplex bij gebruik van de strategie van mapping naar sequentie om SNP's te bevestigen. Daarom hebben we de PE/PPE-genen en indels uit de analyse gefilterd.
Volgens Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) zijn alle SNP's onderverdeeld in functionele categorieën. De SnpEff-pijplijn (https://pcingola.github.io/SnpEff/) wordt gebruikt om SNP-gevolgen af te leiden (synonieme of niet-synonieme veranderingen). Er is een nieuwe database aangemaakt van het Mycobacterium bovis AF2122/97-genoom (LT708304.1).
De meervoudige kerngenoomuitlijning werd uitgevoerd met Parsnp v1.2, momenteel beschikbaar op https://github.com/marbl/parsnp57, met 69 complete genomen/conceptassemblages (met optie -c) en M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) als referentie. Er werden vier meervoudige kernuitlijningen uitgevoerd: alleen de leden van het Eu2-kloneringscomplex (n = 37), inclusief alle leden van het Europese kloneringscomplex (n = 44), inclusief het knooppunt van het Europese en Afrikaanse kloneringscomplex (n = 51), en inclusief alle Mycobacterium bovis in deze studie (n = 70).
De door Parsnp gegenereerde kernuitlijning wordt gebruikt om de maximum likelihood (ML) fylogenetische boom af te leiden met behulp van CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 met behulp van RAxML, en om 1000 begeleide replicaties uit te voeren.
Er worden drie verschillende algoritmen en bioinformatica-hulpmiddelen gebruikt om parallel te controleren op de aanwezigheid van recombinatiegebeurtenissen: de SplitsTree4-software, de Gubbins-pijplijn (onbevooroordeelde afstamming via recombinatie in nucleotide-sequenties) en de RDP4-software (recombinatiedetectieprogramma, versie bèta 4.101).
De split-decompositiemethode geïmplementeerd in SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 wordt gebruikt om het wortelloze fylogenetische netwerk te berekenen, met behulp van de Phi-test voor statistische verificatie. De significantiedrempel is p = 0,05. De multi-alignment kernanalyse van Parsnp wordt gebruikt als invoer en de split-decompositie als netwerkstandaard wordt gerealiseerd.
Gubbins-pijplijn v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) wordt uitgevoerd met standaardparameters als een andere manier om de impact van recombinatie op Mycobacterium bovis te evalueren. Het in de pijplijn geïmplementeerde algoritme reconstrueert de relevante kloonlijn Het volledige genoom/ontwerp-assemblage van onze dataset en het referentiegenoom (bovine bovid AF2122/97, LT708304.1) zijn wederzijds; en scannen de positie van de SNP op elke tak van de boom om het SNP-cluster te detecteren dat de recombinatiegebeurtenis vertegenwoordigt. De nul van de tak Ga ervan uit dat er geen recombinatiegebeurtenis is, wat betekent dat de SNP's die op de tak voorkomen gelijkmatig verdeeld moeten zijn. De kernmeervoudige uitlijning van Parsnp en de best gescoorde ML-boom van RAxML worden gebruikt als invoerbestanden.
Om de door de Gubbins-pipeline gesuggereerde reorganisatiegebeurtenis te bevestigen, worden de zes algoritmen die in RDP467 zijn geïmplementeerd (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 en SiScan66) onder standaardinstellingen toegepast op de kern van Parsnp's meervoudige uitlijning. We hebben vastgesteld dat ten minste drie van de in RDP4 geïmplementeerde algoritmen consistent een belangrijk signaal moeten aantonen om elke recombinatiegebeurtenis te verifiëren.
Aangezien zowel Gubbins als RDP-software zoeken naar recombinatiesignalen door de meervoudige kernalignmenten te controleren in een tijdsbestek tot 500 bp, en bevestigend dat de inclusie van PE/PPE-genen tijdens de novo-assemblage de gevonden recombinatiesignalen niet zal verstoren, wordt verdere analyse uitgevoerd door middel van homolineariteit. Controleer de nabijheid van het gen dat de recombinatie identificeert. De synlineaire kaart met het volledige genoom werd geconstrueerd met behulp van MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) om lokale genoomtranslocaties of -inversies uit te sluiten. Daarnaast werd het volledige genoom gebruikt om homolineariteitsanalyses uit te voeren op de aminozuursequentie via de SyntTax-webserver (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Een meer diepgaande analyse van de genoomdataset verkregen uit het Portugese multi-host tuberculosesysteem is bedoeld om het polymorfisme van de in de literatuur genoemde genen te controleren. Deze genen zijn 37, 38 en het gen dat codeert voor 3R, verkregen door de MTBC-voorouders via componenten van het HGT-systeem (DNA-reparatie, -replicatie en -recombinatie) 39. Gebruik ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) en DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) om de gendiversiteit en nucleotidediversiteit (π) te berekenen, evenals de invoer van Tajima's D-neutrale testparameters.
Een fylogenetische boom met maximum likelihood (ML) werd verkregen op basis van 69 isolaten van Mycoplasma bovis en referentiegenomen (Figuur 2A). Vergeleken met bomen gebaseerd op één gen of bomen gebaseerd op meerdere loci, maakt deze strategie het mogelijk om krachtigere bomen te genereren die niet de variabiliteit van het gehele genoom vastleggen en daardoor een lager onderscheidingsvermogen tussen soorten vertonen 68,69. De topologische structuur van de ML-boom is doorgaans consistent met de complexe classificatie van klonen. Het genoom van Eu2 is geclusterd in een tak, en het genoom van Af1 is ook geclusterd (Figuur 2A). Het resultaat is ook consistent met de bekende evolutionaire verwantschap van Mycobacterium bovis, dat wil zeggen dat er een groot verschil is tussen het Eu1-lid en de groep bestaande uit alle andere klonale complexen en genomen, maar het klonale complex 30 is niet gespecificeerd. De kleine inconsistentie tussen het klonale complex en de relatie die in de fylogenetische boom wordt waargenomen, kan worden verklaard door het feit dat het klonale complex wordt beschreven op basis van specifieke genomische regio's, terwijl de fylogenetische boom is gebaseerd op meerdere uitlijningen van kerngenomen die het volledige genoom vertegenwoordigen.
De fylogenetische boom met maximale waarschijnlijkheid (GTR) is gebaseerd op de kerngenoomuitlijning van het Mycobacterium bovis-genoom vóór (A) en na (B) verwijdering van de recombinatieplaats. De kleuren van de takken geven het Mycobacterium bovis-klooncomplex weer: Europa 1 is paars, Europa 2 is rood, Europa 3 is blauw, Afrika 1 is oranje en Afrika 2 is groen. De boom is geworteld en op schaal getekend, en de taklengte is gemeten als vervanging voor elke locatie.
Het Mycobacterium tuberculosis-complex wordt beschreven als klonaal geëvolueerd en het meeste bewijsmateriaal dat in de loop der jaren is verzameld, ondersteunt het idee dat aanhoudende HGT- en recombinatiegebeurtenissen niet zullen optreden op het detecteerbare niveau van MTBC15,17,18.
Uit eerder werk is gebleken dat er mogelijk beperkte recombinatie is tussen MTBC-stammen20,21, terwijl anderen er niet in zijn geslaagd meetbare recombinatiegebeurtenissen te identificeren70,71. Bespreek deze kwestie opnieuw met de focus op Mycobacterium bovis, wat verschilt van het eerdere werk dat alleen Mycobacterium tuberculosis beschouwde70,71; of beschouw MTBC als geheel, met bijna geen M. bovis die 20 vertegenwoordigt; of beschouw alleen restrictieve runderfracties. De mycobacteria-dataset in dit werk bevat in totaal 70 stammen, die alle klonale complexen vertegenwoordigen, die worden gebruikt om te screenen op recombinatie. De dataset is geschaald volgens vier cumulatieve niveaus: (1) Eu2-leden, (2) alle Europese klooncomplexleden (d.w.z. Europa), (3) Europees en Afrikaans klooncomplex (Eu + Af) en (4) de volledige gegevenscollecties (inclusief genomen die niet zijn opgenomen in reeds beschreven klooncomplexen).
Om deze hypothese verder te onderzoeken, werd een split-decomposition-netwerk uitgevoerd om de afwezigheid van recombinatiegebeurtenissen tussen genomen te beoordelen. Deze methode kan namelijk de voorouderlijke verwantschap tussen individuen visualiseren en tegenstrijdige fylogenetische signalen weergeven. Alle vier de datasets in de analyse bevestigden het bestaan van lussen in het netwerk (dat wil zeggen gebieden die niet samenkomen in één stamboom), maar de Phi-test heeft geen statistische ondersteuning (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; de gehele dataset p = 0,2451), wat onvoldoende bewijs levert voor het bestaan van reorganisatiegebeurtenissen (Figuur 3A-D).
In Europa 2 genomen (n = 37) (A), Europese genomen (n = 44) (B), Europese en Afrikaanse genomen (n = 51) (C) en de volledige dataset (n = 70) (D).
Na deze analyse, en rekening houdend met de cyclische observaties in alle netwerken, werd het reconstructiealgoritme geïmplementeerd in de Gubbins-pijplijn toegepast om de klonale afstammingslijn te reconstrueren en de schatting van het effect van de recombinatie op het M. bovis-genoom aan te vullen. Leid het cumulatieve aantal recombinatiegebeurtenissen af, waarvan de meeste plaatsvonden in terminale takken (dat wil zeggen, in één enkel genoom) (Tabel 2). Deze indicatoren tonen de consistentie van de gehele dataset en geven aan dat de frequentie van recombinatiegebeurtenissen 200 tot 300 keer zo groot is als die van mutaties. Zodra de rho/theta-parameter die de relatieve snelheden van recombinatie en puntmutaties op de tak weergeeft, tussen 0,0037 en 0,0056 lijkt te liggen (Tabel 3). Onlangs toonde het gepubliceerde werk van de 38 M. bovis-stam een hogere rho/theta-waarde (rho/theta = 0,1) aan dan die verkregen in deze dataset, maar het werk van Patané en collega's gebruikte referentiegebaseerde assemblage om recombinatieparameters af te leiden. Een procedureel detail, als gevolg van de assemblageprocedure, is geassocieerd met de overvloed aan veronderstelde recombinatiegebeurtenissen in de terminale tak.
Vervolgens vertegenwoordigt de r/m-parameter de diversiteitsverhouding van recombinatie en mutatie-introductie, en de gemiddelde waarde ligt tussen 0,025 en 0,037, wat aangeeft dat in vergelijking met mutaties, recombinatie een lagere algehele impact heeft op de genetische diversiteit van M. bovis (Tabel 3)). Voor een uitgebreide vergelijking werd een vergelijkbare methode gebruikt om de r/m-parameter te schatten voor de MTBC-dataset bestaande uit 23 genomen, met een gemiddelde waarde van 0,48620, terwijl voor de 38 M. bovis-dataset van Patané en collega's de gemiddelde waarde 0,98 bleek te zijn. In de eerste studie waren slechts twee van de 23 genomen opgenomen in het werk van M. bovis (M. bovis BCG en de referentiestam), dus de verkregen waarde kan vertekend zijn vanwege de overexpressie van het M. tuberculosis-genoom. In het tweede rapport werden de geanalyseerde Mycobacterium bovis-populaties voornamelijk teruggevonden in de Verenigde Staten en bij vee als gastheren. Daarentegen zijn in onze dataset meer geografische locaties en gastheersoorten vertegenwoordigd, en worden genomen gegroepeerd in verschillende klonale complexen met verschillende populatiegenetische kenmerken ook gebruikt, waardoor een diepere en bredere kennis van de populatie wordt verkregen. De gemiddelde waarde van het verschil r/m verkregen met onze dataset is consistent met het concept dat de mate van recombinatie sterk varieert tussen de lineages toegewezen aan dezelfde taxonomische soort, dus deze resultaten geven aan dat het M. bovis-klooncomplex recombinatieverschillen kan vertonen. De impact is ook zoals gesuggereerd door Didelot & Maiden72. Niettemin zal een aanzienlijke uitbreiding van deze dataset door het opnemen van een groter aantal M. bovis-genomen verdere verduidelijking van dit punt mogelijk maken. Zowel de r/m- als de rho/theta-parameters vertonen variabiliteit tussen takken, en dit resultaat is consistent met rapporten over andere bacteriesoorten72,73.
Om de door de Gubbins-pipeline geïdentificeerde reorganisatiegebeurtenissen te bevestigen, werden ten slotte zes verschillende algoritmen in de RDP4-software gebruikt om verschillende multi-corevergelijkingen onafhankelijk te testen. Wereldwijd werd minder dan de helft van de door Gubbins geïdentificeerde gebeurtenissen bevestigd door RDP4 (tabellen 4 en 5). Gezien de volledige dataset werden drie recombinatiegebeurtenissen bevestigd, twee met betrekking tot interne knooppunten en de andere met betrekking tot één enkel genoom in een terminale tak, waarvoor geen klonale complexen konden worden toegewezen (tabellen 4 en 5). De identificatie van gebeurtenissen in terminale takken kan erop wijzen dat de recombinatie nog steeds gaande is in hedendaagse M. bovis-stammen of dat het resultaat onjuist is70. In deze hypothetische recombinatieregio heeft ongeveer 20% van de posities ongedefinieerde nucleotiden (N), wat het recombinatiesignaal beïnvloedt (aanvullende afbeelding 2). Bovendien beïnvloedt deze regio het rrs-gen, dat codeert voor het 16S ribosomaal RNA waarvan verwacht wordt dat het sterk geconserveerd is. Dit veronderstelde recombinatiesignaal kan dus het gevolg zijn van sequentiefouten of verkeerde uitlijning. Vervolgens werd de volledige genoomuitlijning tussen Mb0003 en Mycobacterium bovis AF2122/97 uitgevoerd en werd het bestaan van ongedefinieerde nucleotiden en SNP's bevestigd. De mogelijke problemen met betrekking tot de verkeerde uitlijning werden dus niet veroorzaakt door de biologische informatie die in dit werk werd geïmplementeerd. Deze informatie kwam aan het licht na het leren van het programma.
Er werden geen hiaten of ongedefinieerde nucleotiden gevonden in de recombinatieregio's van de interne knooppunten (figuren 4 en 5). Wat deze gebeurtenissen betreft, bevat één ervan alleen het Eu2-genoom en beïnvloedt het pks12-gen, dat codeert voor een mogelijke polyketidesynthase; de andere is geregistreerd in het Eu1-genoom en beïnvloedt het narX-gen, dat codeert voor een mogelijke nitraatreductase (tabel 4). Over het algemeen laat de recombinatieanalyse zien dat er een beperkt aantal recombinatiefragmenten is met statistische ondersteuning, en de afgeleide indicatoren geven aan dat de recombinatie een lage impact heeft op de M. bovis-lijn. Het recombinatiesignaal zal naar verwachting laag zijn, maar het is belangrijk om het werkelijke evolutiesignaal te onderscheiden van de achtergrondruis, wat een uitdagende taak is. Om het ruissignaal te verminderen dat werd veroorzaakt door referentiegebaseerde assemblage- en mismatchproblemen 70 en 71, werden alle overige genen, behalve het complete genoom, vanaf nul geassembleerd. De assemblagekwaliteit werd gecontroleerd en gewaarborgd door QUAST-pipelineanalyse (aanvullende tabel 1). Daarnaast werden een reeks aanvullende analyses uitgevoerd om de robuustheid en nauwkeurigheid van het totale onderzoek te garanderen. Daarom werd de sequentiekwaliteit van de narX- en pks12-genen geëvalueerd door middel van read mapping tegen Mycobacterium bovis AF2122/97. De aanbevolen SNP-positie in de recombinatieregio werd bevestigd door toepassing van de criteria die in de methodesectie worden genoemd (minimaal 20 metingen en een veranderingsfrequentie van 0,9). Het polymorfisme van het narX-gen werd volledig bevestigd in de twee genomen (Mb1792361 en Mb7240415; 2,3%) en de genomen van het pks12-genoom: de genen Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 en Mb12. Voor het genoom Mb2043 voldoen echter zes van de acht posities niet aan het criterium voor leesdiepte, omdat de SNP wordt ondersteund door maximaal 17 reads, wat lager is dan de vastgestelde grenswaarde van 20. Daarom kan de recombinatie van zes genomen (8,6%) op deze genoomlocatie worden bevestigd (figuren 4 en 5).
De gedetailleerde visualisatie van de recombinatieregio-uitlijning van de Mycobacterium bovis-dataset beïnvloedt het narX-gen dat codeert voor een mogelijke nitraatreductase. Er werden geen hiaten of ongedefinieerde nucleotiden gevonden in de recombinatieregio van de interne knooppunten. Deze specifieke gebeurtenis is geregistreerd in het Eu1-genoom. De sequentiekwaliteit van het narX-gen werd geëvalueerd door de reads van Mycobacterium bovis AF2122/97 in kaart te brengen. Bevestig de aanbevolen SNP-locatie in het recombinatiegebied door de criteria uit de methodesectie toe te passen (minimaal 20 readings en een veranderingsfrequentie van 0,9). Het polymorfisme van het narX-gen werd volledig bevestigd in de genomen van Mb1792361 en Mb7240415 (2,3%).
Gedetailleerde visualisatie van de recombinatieregio-uitlijning van de Mycoplasma bovis-dataset die het pks12-gen beïnvloedt. Er werden geen hiaten of ongedefinieerde nucleotiden gevonden in de recombinatieregio van de interne knooppunten. Wat betreft de gebeurtenis die het pks12-gen beïnvloedt dat codeert voor een mogelijke polyketidesynthase, bevat dit alleen het Eu2-genoom. De sequentiekwaliteit van pks12 werd geëvalueerd door middel van read mapping van Mycobacterium bovis AF2122/97. Bevestig de aanbevolen SNP-locatie in het recombinatiegebied door de criteria uit de methodesectie toe te passen (minimaal 20 metingen en een veranderingsfrequentie van 0,9). De polymorfismen van de genomen Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 en Mb1960 zijn volledig bevestigd.
PE- en PPE-genen hebben repetitieve regio's die gemakkelijk verkeerd worden geïnterpreteerd door Illumina-sequencing en mismapping. Daarom worden ze meestal alleen verwijderd uit de bioinformatica-workflow van M. tuberculosis-leden wanneer de mapping-naar-sequentiestrategie wordt gebruikt. De inferentie van recombinatiegebeurtenissen die in dit werk wordt toegepast, is gebaseerd op de novo-assemblage zonder PE/PPE eruit te filteren. Wij zijn van mening dat door de implementatie van drie verschillende complementaire methoden en algoritmen via SplitsTree, de Gubbins-pipeline en RDP4-software, de toegepaste strategieën robuust zijn in het verwerken en filteren van de gereorganiseerde regio's die door foutsignalen worden veroorzaakt. Om echter de interferentie van het PE/PPE-gen op de Gubbins- en RDP4-software bij de identificatie van SNP-clusters uit te sluiten, en daarmee de identificatie van de recombinatieregio's waarvan wordt aangenomen dat ze de narX- en pks12-genen beïnvloeden, werd de omgeving van deze genen onderzocht (Aanvullende figuur 3-5). In M. bovis AF2122/97 wordt het narX-gen gescheiden door narK2 en Mb1764c, terwijl pks12 omgeven wordt door Mb2075c en Mb2073c (aanvullende figuur 3-5). De kaart, gegenereerd met behulp van de MAUVE-synlinekaart van het complete genoom, geeft informatie over de conservatie en herschikking van de gensequentie en toont vier collineaire blokken en geen tekenen van genoomtranslocatie of -inversie. Bovendien bewees de complementatieanalyse met de aminozuursequentie de homologie in alle complete genomen en werd er geen PE/PPE gevonden in de aangrenzende regio's van narX of pks12. Voor narX heeft één genoom (Mb0030) een lagere synonymiescore omdat het narX-gen werd geïdentificeerd als twee fragmenten (fragmenten 1891 en 1890). Voor pks12 vertoonden Mb0030 en Mb003, vanwege overeenkomsten, lagere synlineariteitsscores, terwijl pks12 werd geïdentificeerd in respectievelijk twee en drie fragmenten, die verschillende domeinen van het eiwit vertegenwoordigen (aanvullende afbeelding 3-5). Rekening houdend met deze informatie, en met de analyse die Gubbins en RDP4-software uitvoeren, controleren we de meervoudige kernuitlijning van de maximale 500 bp in het venster. We bevestigden dat het PE/PPE-gen het recombinatiesignaal dat narX en pks12 beïnvloedt, niet zal verstoren.
Hoewel de recombinatiesignalen die in deze dataset zijn gedetecteerd als residuaal kunnen worden beschouwd, is het wel zo dat recombinatie bij M. bovis niet kan worden uitgesloten. Daarom is verdere analyse noodzakelijk, waarbij hele genomen uit verschillende epidemiologische scenario's in kaart worden gebracht om tot een belangrijk resultaat te komen.
Vergelijking van de ML-fylogenetische bomen verkregen vóór en na recombinatiecorrectie (Figuur 2A, B) leidde niet tot significante veranderingen in de afgeleide fylogenetische relatie, en de M. bovis-stammen werden in dezelfde groep geclusterd.
Na het in kaart brengen van 42 nieuw gesequencete M. bovis-reads met het referentiegenoom van M. bovis AF2122/97, werd een SNP-alignment met 1816 polymorfe posities verkregen. De meeste SNP's (87,1%) bevinden zich in de coderende regio en de aangetaste genen worden gekarakteriseerd volgens de functionele categorieën die worden weergegeven in Bovilist (Figuur 6A, B). Rekening houdend met het totale aantal genen in elke functionele categorie, vertoonden de genen in de categorie "lipidenmetabolisme" de meeste SNP's, gevolgd door "celwand en celprocessen" en "intermediair metabolisme en ademhaling", wat aantoont dat ze deel uitmaken van de evolutie van M. bovis.
Hiërarchische analyse van de M. bovis-dataset uit Portugal (n = 42). Het totale aantal geregistreerde SNP's en aangetaste genen voor elke functionele categorie (A). Het totale aantal geregistreerde synonieme en niet-synonieme veranderingen per functiecategorie (B).
Wereldwijd is de gemiddelde dN/dS-verhouding beter dan 1,5, wat aangeeft dat de wereldwijde evolutionaire druk bestaat om de voorouderlijke staat te ontmantelen en een positief (gediversifieerd of gericht) en/of ontspannen zuiveringskeuzescenario vertegenwoordigt. In de categorieën "virulentie, detoxificatie, adaptatie", "insertiesequenties en fagen" en "regulerende eiwitten" is meer dan twee derde van de SNP's niet-synoniem (Figuur 6B).
In alle categorieën zijn er genen met meerdere SNP's, wat resulteert in een gemiddelde mutatiesnelheid (d.w.z. de gemiddelde SNP per gen) van meer dan 1 (Figuur 6A). Pks12 (Mb2074c) met 15 SNP's en fas (Mb2553c) met 8 SNP's hebben hogere mutatiewaarden. Beide genen zijn betrokken bij het vetzuurmetabolisme. Het pks-gen codeert voor polyketidesynthase (PKS), een multifunctioneel enzym dat betrokken is bij de biosynthese van lipiden in de celwand van mycobacteriën74,75. Dit gen codeert voor een multifunctioneel polypeptide dat betrokken is bij de synthese van mycoketiden74,76. Het fas-gen is betrokken bij de synthese van mycolzuur. Beide genen spelen een belangrijke rol bij de biosynthese van de celwand in contact met de gastheer.
Om de evolutie van Mycobacterium bovis verder te bestuderen, werden twee sets specifieke genen geanalyseerd. Eerder gepubliceerde werken met behulp van sequentiecompositie en fylogenetische methoden identificeerden genen die door MTBC-voorouders werden verworven via HGT vóór diversificatie37,38. Deze genen staan vermeld in aanvullende tabel 2. De SNP-distributie van in totaal 77 genen die mogelijk gerelateerd zijn aan HGT werd geanalyseerd en 26 polymorfe locaties werden geïdentificeerd, wat in de meeste gevallen (78%) resulteerde in niet-synonieme (NS) veranderingen (aanvullende tabel 2). Eerder werk aan het MTBC-genoom toonde aan dat de veronderstelde HGT-regio een hogere NS SNP-ratio vertoont in vergelijking met de rest van het genoom. Als men denkt dat deze recombinatieregio's werden verworven door MTBC-voorouders en daarom oude polymorfismen oververtegenwoordigen, dan wordt verwacht dat het aandeel synonieme veranderingen hoger zal zijn, omdat NS-substituties naar verwachting worden geëlimineerd door negatieve selectie vanwege aminozuurveranderingen die de functie van het eiwit kunnen veranderen. Onze resultaten geven daarom aan dat de functionele gevolgen mogelijk voortvloeien uit de vervanging van HGT-achtige genen, wat hun belang voor waardevolle adaptieve genetische diversiteit weerspiegelt.
Parallel aan deze analyse werden de genen die coderen voor de componenten van het 3R-systeem (DNA-reparatie, -replicatie en -recombinatie) grondig onderzocht, conform de eerder gepubliceerde lijst van dos Vultos en medewerkers (2008)39. De uitwisseling van identieke DNA-fragmenten kan niet direct worden waargenomen, hoewel het een frequent proces kan zijn wanneer nauw verwante bacteriën betrokken zijn, zoals in het geval van deze dataset; bovendien kan dit proces de sleutel zijn tot DNA-reparatiemethoden72, dus spelen ze een rol bij homologe recombinatie. In totaal werden 26 polymorfe posities geïdentificeerd, verdeeld over 54 genen (aanvullende tabel 3). In deze genenset waren NS-veranderingen verantwoordelijk voor ongeveer 65% van de gevolgen, wat consistent is met eerdere rapporten over Mycobacterium tuberculosis-stammen.
Plaatsingstijd: 21-10-2021